SNT1310-2011 动物结核病检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３１０—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３动物结核病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪狀犻犿犪犾狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３《猴结核皮内变态反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３相比，主要技术变化如下：———修改了标准的名称；———增加了细菌学检查方法；———增加了实时荧光ＰＣＲ方法；———增加了常规ＰＣＲ检测方法；———增加了其他动物结核皮内变态反应试验方法。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版）中２．４．７章“Ｂｏｖｉｎｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ”和２．３．６章“Ａｖｉａｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈茹、许如苏、田纯见、史夏玲、吴晓薇、曾碧健、苏世敏、罗长保、周科、鱼海琼、洪琼华、孙岩松。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１动物结核病检疫技术规范１范围本标准规定了动物结核病的结核菌素皮内变态反应试验、细菌学检查、实时荧光聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和常规ＰＣＲ检测方法的技术要求。本标准适用于进出境牛、猪、猴、禽等动物结核病的检疫和诊断。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＰＤ（ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）：提纯蛋白衍生物，提纯结核菌素ＩＵ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｕｎｉｔｓ）：国际单位ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ）：磷酸盐缓冲液ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷酸三磷酸犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶ＵＤＧ（ｕｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）：尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）：二甲基亚砜ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）：碱基对４生物安全要求样品采集、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守ＧＢ１９４８９的有关规定。５结核菌素皮内变态反应试验５．１器材５．１．１弯剪。５．１．２卡尺。５．１．３注射器：可采用医用玻璃卡介苗注射器、皮试专用连续注射器或１ｍＬ一次性无菌注射器，针头规格为０．５ｍｍ×１０ｍｍ。５．１．４脱脂棉。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１５．２试剂５．２．１灭菌生理盐水。５．２．２牛型ＰＰＤ：根据使用说明将原液用灭菌生理盐水或稀释用水稀释为使用浓度。ＰＰＤ冻干粉稀释：在无菌状态下吸取一定量的灭菌生理盐水或稀释用水，注入冻干粉玻璃瓶中，充分摇匀后使用，应现配现用。５．２．３禽型ＰＰＤ：配制方法同５．２．２。５．２．４人型ＰＰＤ：配制方法同５．２．２。５．２．５７５％酒精。５．３牛结核皮内变态反应试验５．３．１操作方法与结果判定可单独采用牛型ＰＰＤ，也可同时采用牛型ＰＰＤ和禽型ＰＰＤ进行试验。注射部位在颈侧中部上三分之一处或尾根部。３个月以内的犊牛也可在肩胛部进行。应确认注入皮内。颈部术部剪毛，直径约１０ｃｍ，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录，术部应无病变。牛型和禽型ＰＰＤ的注射部位应间隔开，在颈部同侧应间隔约１２ｃｍ～１５ｃｍ，或在不同侧进行。用７５％酒精消毒注射部位，在皮内注入牛型ＰＰＤ或禽型ＰＰＤ，剂量为牛型ＰＰＤ每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量；禽型ＰＰＤ每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量。注射后７２ｈ观察判定结果。仔细观察局部有无发热、肿胀等炎性反应，用卡尺测量皮皱厚度，注射前后同一部位的卡尺测量方向应保持一致。在记录表上作好详细记录。５．３．２单独采用牛型犘犘犇颈部注射。术部注射前后皮厚差大于或等于４ｍｍ，或出现典型炎性反应，判为阳性；皮厚差大于２ｍｍ并小于４ｍｍ，且无典型炎性反应判为可疑；皮厚差小于或等于２ｍｍ，无典型炎性反应，判为阴性。对于已确认感染的牛群，皮试出现任何可触摸或可见的肿胀反应均判为阳性。尾根部注射。出现反应判为阳性，未出现可触摸或可见的炎性反应判为阴性。５．３．３同时采用牛型犘犘犇和禽型犘犘犇注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差大于注射禽型ＰＰＤ部位的皮厚差４ｍｍ以上，或对牛型ＰＰＤ反应为阳性（判定见５．３．２）、并且对牛型ＰＰＤ的反应大于对禽型ＰＰＤ的反应、两者皮厚差在２ｍｍ以上，判为牛型ＰＰＤ皮内变态反应试验阳性；其他情况下，注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差大于注射禽型ＰＰＤ部位的皮厚差１ｍｍ～４ｍｍ，判为牛型ＰＰＤ皮内变态反应试验可疑；注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差与注射禽型ＰＰＤ部位的皮厚差小于１ｍｍ，或注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差小于或等于注射禽型ＰＰＤ的部位，判为牛型ＰＰＤ皮内变态反应试验阴性；对禽型ＰＰＤ的反应大于对牛型ＰＰＤ的反应，二者皮厚差在２ｍｍ以上，判为禽型ＰＰＤ皮内变态反应试验阳性。５．３．４复检判为可疑反应的，于４２ｄ后进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。５．４猴结核皮内变态反应试验５．４．１操作方法由助手对猴进行保定，使其两前肢向背后，用左手抓住猴头部后侧的皮毛，使之不得任意转动。注２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１射部位为上眼睑。用７５％酒精对上眼睑局部消毒，术者左手固定头部，右手持１ｍＬ注射器，针头斜面向上，与上眼睑平行，距睫毛约５ｍｍ，皮内注射０．１ｍＬ牛型ＰＰＤ或人型ＰＰＤ，剂量为牛型ＰＰＤ２０００ＩＵ～２５００ＩＵ，人型ＰＰＤ４０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量。注射后无异常反应，局部有扁豆粒大小的隆起。５．４．２结果判定注射后４８ｈ、７２ｈ观察判定结果。仔细检查注射部位有无热、红、肿等炎性反应，并与对侧正常上眼睑进行对照。上眼睑发红，注射部位肿胀明显，判为阳性；上眼睑轻度发红，无肿胀，判为可疑；上眼睑无反应，判为阴性。５．４．３复检判为可疑反应的，于３０ｄ后在另一侧进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。５．５禽结核皮内变态反应试验５．５．１操作方法家禽可在肉髯皮内注射禽型ＰＰＤ，剂量为每羽０．１ｍＬ，约２０００ＩＵ或按试剂说明书配制的剂量。５．５．２结果判定注射后４８ｈ观察判定结果。注射部位肿胀，出现硬结、扩展至对侧肉髯和颈部的广泛性水肿等炎性反应，判为阳性；注射部位无肿胀等炎性反应，判为阴性。５．６猪结核皮内变态反应试验５．６．１操作方法采用牛型和禽型ＰＰＤ，耳根部皮内注射。牛型ＰＰＤ剂量为每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量；禽型ＰＰＤ剂量为每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量。５．６．２结果判定注射后７２ｈ观察判定结果。注射部位出现明显肿胀等炎性反应，判为阳性；注射部位无反应判为阴性。５．７其他动物结核病皮内变态反应试验羊、鹿等其他大中动物的皮内变态反应试验参照牛的皮内变态反应试验进行。６细菌学检查６．１设备Ⅱ级生物安全柜，恒温培养箱，冰箱（２℃～８℃，－１８℃），离心机（离心力可达２０００犵），显微镜。６．２试剂除特别规定，所用化学试剂为分析纯。溶液与培养基：４％硫酸，３％或４％氢氧化钠溶液，５％～１０％盐酸溶液，氢氧化钠消化液，０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠溶液、安替福民（ａｎｔｉｆｏｒｍｉｎ）溶液、甘油蛋白、萋尼氏（ＺｉｅｈｌＮｅｅｌｓｅｎ）抗酸染色液，对硝基苯甲３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１酸（ＰＮＢ）培养基、ＰＢＳ（１／１５ｍｏｌ／Ｌ）缓冲液、改良罗氏（ＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎＪｅｎｓｅｎ，ＬＪ）培养基、吐温８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水解试验溶液、硝酸盐还原试验溶液、０．２％氨基苯磺胺、０．１％犖甲基盐酸二氨基乙烯、０．１２％尿素溶液、０．１％酚红指示剂、噻吩２羧酸肼（ＴＣＨ）培养基。配制方法见附录Ａ。６．３病料的采集、运送与处理６．３．１病料的采集对于病、死动物，应采集其淋巴结及病变组织器官（如：肝、脾、肺等）作为细菌学检查的材料；对于怀疑有呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核的活畜，应相应采集其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便作为细菌学检查的材料；对于皮内变态反应试验阳性，但尸检无病理学变化的动物，应采集其下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵膈及一些肠系膜的淋巴结作为细菌学检查的材料。６．３．２病料的运送样品应封装在无菌的洁净容器或样品袋内冷藏运送。如当天无法送达实验室的，应予冷冻后运送。当无法提供冷冻条件时，可在病料中加入硼酸，使其终浓度为０．５％，但样品处理保存时间不超过１周。６．３．３病料的前处理６．３．３．１硫酸处理法此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。处理前，病变组织先按常规方法研磨或匀浆制成乳剂。用４％硫酸溶液将痰、尿、粪或病变组织等按１∶５之比例加入混合，然后置３７℃作用１ｈ～２ｈ，经１０００犵离心３０ｍｉｎ，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸处理后，在沉淀物中滴加３％氢氧化钠溶液中和，然后涂片镜检、培养。６．３．３．２氢氧化钠处理法此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。消化处理前，病变组织先按常规方法制成乳剂。将被检的痰、尿、粪便或病变组织按１∶５的比例加入氢氧化钠消化液中，混匀后，３７℃作用２ｈ～３ｈ，然后无菌滴加５％～１０％盐酸溶液进行中和，将样本的ｐＨ调到６．８左右（此时显淡黄绿色），以１０００犵离心１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养。对痰液的消化浓缩还可采用以下处理方法：取４％氢氧化钠溶液５０ｍＬ，０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠５０ｍＬ，犖乙酰Ｌ半胱氨酸０．５ｇ混合。取痰液按１∶２的比例加入上述混合液，作用２４ｈ～４８ｈ，以１０００犵离心１５ｍｉｎ，取沉淀物涂片镜检、培养。６．３．３．３安替福民（犪狀狋犻犳狅狉犿犻狀）溶液处理法此法适用于痰、乳、精液和子宫分泌液等的处理。将被检样品置于试管中，加入３倍～４倍量的１５％～２０％安替福民溶液，充分摇匀后３７℃作用１ｈ，加１倍～２倍量的灭菌蒸馏水，摇匀，１０００犵离心２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养。６．４染色镜检６．４．１涂片先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白，然后吸取处理好的样品滴加其上，涂布均匀。如被检样品为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，滴加二甲苯或乙醚，使其覆盖整个涂片，摇４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１动１ｍｉｎ～２ｍｉｎ脱脂后倾去，再滴加９５％酒精，以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。６．４．２萋尼氏抗酸染色涂片经火焰固定后，滴加苯酚复红染色液，使其覆盖整个涂片。之后，将玻片置于火焰上加热至出现蒸汽但不产生气泡，脱离火焰，保持染色５ｍｉｎ。如热染过程出现染色液干涸，应及时添加，适量补充。充分水洗后滴加３％盐酸酒精脱色液，脱色３０ｓ～６０ｓ，至无色素脱下为止。充分水洗，以骆氏美蓝染色液复染１ｍｉｎ。水洗，吹干，镜检。６．４．３镜检分枝杆菌为抗酸菌，因不被盐酸酒精脱色而染成红色，而其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。在显微镜下，分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长１．５μｍ～５μｍ，宽０．２μｍ～０．５μｍ，在陈旧培养基或干酪性淋巴结内，偶尔可见长达１０μｍ或更长的菌体。６．５分离培养将经过处理的病料接种到改良ＬＪ培养基上，每份样品同时接种２管～４管，在３７℃培养１ｄ后，以熔化的石蜡封口，继续培养至少８周（一般１０周～１２周）。结核分枝杆菌（犕狔犮狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊，犕．狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊）菌落干燥、粗糙，呈白色、黄色或橙色并牢牢附着于培养基中，在ＴＣＨ培养基上生长。牛分枝杆菌（犕狔犮狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犫狅狏犻狊，犕．犫狅狏犻狊）在固体培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆，如在培养基中加入１％的丙酮酸钠可促进其生长，在噻吩２酸肼（ＴＣＨ）培养基上不生长。禽分枝杆菌（犕狔犮狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犪狏犻狌犿，犕．犪狏犻狌犿）在固体培养基上形成湿润、弥漫状、光滑及星光状菌落，在ＴＣＵ培养基上生长。禽分枝杆菌可在４２℃培养生长，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌在４２℃不生长。６．６生化鉴定６．６．１生化特性牛分枝杆菌、结核分枝杆菌和禽分枝杆菌的生化特性。见表１。表１牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和结核分枝杆菌的生化特性生化试对硝基苯ＴＣＨ抗尿素酶硝酸盐耐热接触吐温８０验类型甲酸试验性试验试验还原试验酶试验水解试验牛分枝杆菌－－＋－－－禽分枝杆菌＋＋－－±－结核分枝杆菌－＋＋＋－±注：“＋”表示所有菌株阳性反应；“－”所有菌株阴性反应；“±”多数菌株阳性反应，少数菌株阴性反应。６．６．２对硝基苯甲酸（犘犖犅）试验准备ＰＮＢ培养基１支，ＬＪ培养基１支，每支培养基接种１０－３ｍｇ细菌；３７℃孵育４周，每周观察一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况。牛分枝杆菌、结核分枝杆菌在ＰＮＢ培养基上不生长。６．６．３犜犆犎抗性试验将细菌接种ＴＣＨ培养基和改良ＬＪ培养基，３７℃培养，１周后开始观察，培养８周。能同时在这两５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１种培养基上生长，且菌落符合结核分枝杆菌菌落特征者，判为ＴＣＨ抗性试验阳性；若只能在ＬＪ培养基上生长，而不能在ＴＣＨ培养基上生长，则判为阴性。６．６．４尿素酶试验准备两支试管，试管Ａ加入３ｍＬＰＢＳ（ｐＨ６．７，１／１５ｍｏｌ／Ｌ）和１滴酚红指示剂；试管Ｂ加入用ＰＢＳ（ｐＨ６．７，１／１５ｍｏｌ／Ｌ）配制的０．１２％尿素溶液和１滴０．１％酚红指示剂。挑取细菌约５ｍｇ移置于试管Ｂ中。两支试管均置３７℃培养３ｄ观察结果。Ａ管空白对照不变色，Ｂ管菌液呈红色判为阳性，不变色者判为阴性。６．６．５硝酸盐还原试验挑取细菌约５ｍｇ，置于装有２ｍＬ硝酸盐还原试验溶液的试管中，充分混匀，置３７℃水浴２ｈ，滴加１滴２倍稀释的盐酸，２滴０．２％氨基苯磺胺，２滴０．１％犖甲基盐酸二氨基乙烯，混匀，观察结果。用ＰＢＳ（ｐＨ７．０，１／１５ｍｏｌ／Ｌ）取代硝酸盐还原试验溶液设一管空白对照。结果判定，１ｍｉｎ内呈红色判为阳性；试剂混匀后１ｍｉｎ内颜色无变化判为阴性，空白对照应呈无色或淡的粉红色。６．６．６耐热接触酶试验用生理盐水配制含菌量为１０ｍｇ／ｍＬ的菌液，分装试管，每管０．５ｍＬ，分别置于６８℃水浴２０ｍｉｎ，冷却后缓缓加入０．５ｍＬ过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）和吐温８０混合液（１０％吐温８０加等量３０％Ｈ２Ｏ２），肉眼观察结果。有持续小气泡产生的判为阳性，１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ仍无汽泡产生的判为阴性。６．６．７吐温８０水解试验在装有２ｍＬ吐温８０水解试验溶液的试管中加入含菌量为１０ｍｇ／ｍＬ的菌液０．５ｍＬ，３７℃培养３ｄ～５ｄ后观察结果。如试管内溶液由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性，无颜色变化者判为阴性。７实时荧光犘犆犚检测方法７．１仪器与耗材荧光ＰＣＲ仪，恒温水浴箱，烘箱，台式冷冻离心机（离心力可达１５０００犵），旋涡混匀器，冰箱（２℃～８℃、－２０℃、－８０℃），微量可调移液器（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）及配套带滤芯吸嘴，研钵，微量离心管，ＰＣＲ光学管及管盖。７．２试剂除特别说明，本标准所用化学试剂均为分析纯。７．２．１引物与探针采用无ＤＮＡ酶、无ＲＮＡ酶水将每条引物与探针配制成１００μｍｏｌ／Ｌ储存液，置－２０℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成１０μｍｏｌ／Ｌ工作液，避免多次冻融。荧光ＰＣＲ引物与探针序列见表２。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１表２荧光犘犆犚引物与探针序列类别核酸序列上游引物：５’ＣＧＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＣ３’结核分枝杆菌下游引物：５’ＣＧＡＴＴＧＧＡＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣ３’探针ａ：５’ＦＡＭＴＡＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＴＡＧＣＣＡ３’ＢＨＱ１上游引物：５’ＡＣＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＧ３’牛分枝杆菌下游引物：５’ＧＧＣＴＡＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＡＧＡＴＡＴＣＣ３’探针ａ：５’ＦＡＭＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＧＣＣＧＴＡＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡ３’ＢＨＱ１上游引物：５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＡＧＧ３’禽分枝杆菌下游引物：５’ＣＣＡＣＡＣＴＣＧＧＴＣＧＧＧＴＴＣ３’探针ａ：５’ＦＡＭＣＣＡＴＡＣＣＧＣＴＡＣＴＣＣＴＧＴＣＧＴＣＧＣＡ３’ＢＨＱ１ａ探针５’端标记的报告荧光基团及３’端标记的淬灭基团可根据荧光ＰＣＲ仪设备等具体情况另行选定。７．２．２犇犖犃提取液含１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，２００μｇ／μＬ蛋白酶Ｋ。可采用等效商品化试剂。７．２．３溶液柠檬酸钠磷酸缓冲液，柠檬酸钠缓冲液，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，４％氢氧化钠溶液，４％硫酸溶液，０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．６ＰＢＳ。配制方法见附录Ａ。７．２．４７０％乙醇用新开启的灭菌双蒸水配制，－２０℃预冷。７．２．５荧光犘犆犚反应缓冲液含５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３），２．５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁，５％ＤＭＳＯ，５％甘油。可采用等效商品化试剂。７．２．６其他试剂犜犪狇酶，ＵＤＧ酶，ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ），无水乙醇，ＴｒｉｔｏｎＸ１００，异丙醇，三氯甲烷，灭菌双蒸水。７．３采样７．３．１采样工具采样工具需采用（１２１±２）℃／０．１ＭＰａ，１５ｍｉｎ高压灭菌并烘干，或经１６０℃干烤２ｈ灭菌。７．３．２血样用无菌注射器或真空采血管，自无菌动物静脉采血，无菌分离血清。用无菌注射器或真空采血管，自无菌动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ。每６ｍＬ血液加１ｍＬ抗凝剂。条件允许时，应优先采集全血，以更有利于富集菌体。７．３．３奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。７．３．４痰液动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集：采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检。７．３．５组织器官采集动物下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官（如：肝、脾、肺等）。７．３．６粪便采集混有粘液、血液、粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部（约３０ｃｍ）取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。７．３．７样品的保存和运输待检样品在２℃～８℃保存不应超过２４ｈ；－２０℃保存不超过３个月；－８０℃以下长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。７．４样品处理７．４．１样品前处理７．４．１．１血样前处理取１ｍＬ～２ｍＬ全血样品，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液；加等体积灭菌双蒸水充分振荡，１５０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，若红血球裂解不完全，应采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置－２０℃贮存备用。取１ｍＬ～２ｍＬ血清样品，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，加１ｍＬ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．６ＰＢＳ，充分振荡混匀，１５０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置－２０℃贮存备用。７．４．１．２奶样前处理取１０ｍＬ奶液，加１００μＬＴｒｉｔｏｎＸ１００，振荡混匀，２５００犵离心２０ｍｉｎ；弃上清液，取沉淀，加１ｍＬ０，０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．６ＰＢＳ，充分振荡混匀；将沉淀悬浮液移入微量离心管，１５０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置－２０℃贮存备用。７．４．１．３痰液的前处理在痰液样品中加入２倍～４倍体积４％氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置３０ｍｉｎ，间或振荡混匀，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量４％氢氧化钠溶液直至液化完全）；１５０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，加１ｍＬ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．６ＰＢＳ，充分振荡混匀，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，重复本步骤１次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置－２０℃贮存备用。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１７．４．１．４组织样品前处理方法取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按１∶５的比例加入柠檬酸钠磷酸缓冲液（例，１ｇ组织样品，加入５ｍＬ缓冲液），充分研磨；加等量４％氢氧化钠溶液，继续研磨５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，使组织液化；移入离心管，充分振荡，７５℃温浴０．５ｈ～１ｈ；取上清液（避免吸取粗渣），１５０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，加等量０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．６ＰＢＳ，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，重复本步骤１次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置－２０℃贮存备用。７．４．１．５粪样前处理取粪样１ｇ～２ｇ，按１∶５的比例加入４％硫酸溶液（例１ｇ粪样，加５ｍＬ液体）充分振荡混匀，室温静置０．５ｈ～１ｈ；取上层约３ｍＬ液体（避免吸取粗渣），５０００犵离心１ｍｉｎ，取上清液，１５０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，加等量０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．６ＰＢＳ，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，重复本步骤１次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置－２０℃贮存备用。７．４．２核酸提取在上述已完成前处理的样品（沉淀物）中加入５０μＬ～１００μＬＤＮＡ提取液，充分振荡混匀，５６℃温浴３０ｍｉｎ，９８℃～１００℃加热１０ｍｉｎ，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，１２０００犵离心５ｍｉｎ，取上清液，直接用于ＰＣＲ或贮存于－８０℃备用（适用于除粪样外的其他样品）。其中粪样样品还应进行以下步骤：加入等体积异丙醇（－２０℃预冷），颠倒混匀，放置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；４℃，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，加３倍体积７０％乙醇（４℃预冷），振荡洗涤；４℃，１５０００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，室温干燥５ｍｉｎ；加入５０μＬ无ＤＮＡ酶、无ＲＮＡ酶水，混匀、溶解核酸，直接用于ＰＣＲ或贮存于－８０℃备用。可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。７．５实时荧光犘犆犚检测７．５．１对照设立从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品做为阳性对照，也可将适量灭活病原菌添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。７．５．２扩增试剂准备采用２５μＬ反应体系，含以下组分：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁，０．２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，上、下游引物各０．２μｍｏｌ／Ｌ，探针０．１μｍｏｌ／Ｌ，５％ＤＭＳＯ，５％甘油，０．４ＵＵＤＧ酶，１Ｕ犜犪狇酶，５μＬ模板。取出荧光ＰＣＲ反应缓冲液等试剂，室温融化（犜犪狇酶、ＵＤＧ酶除外），瞬时离心后置冰上，根据上述体系、按每个反应２０μＬ的用量配制荧光ＰＣＲ预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水补足，需配制的荧光ＰＣＲ预混反应液数量＝样品个数＋对照个数＋１。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后在每个ＰＣＲ光学管中分装２０μＬ。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１７．５．３加模板在已分装有荧光ＰＣＲ预混反应液的ＰＣＲ光学管中每管分别加入５μＬ样品或对照的核酸模板，混匀，盖上管盖，放入荧光ＰＣＲ检测仪内，记录样品放置顺序。７．５．４荧光犘犆犚扩增反应结核分枝杆菌、牛分枝杆菌荧光ＰＣＲ反应条件设定：第一阶段：５０℃２ｍｉｎ，９５℃４ｍｉｎ，１个循环；第二阶段：９５℃１０ｓ，６０℃４５ｓ，４０个循环，荧光收集设置在６０℃退火延伸时进行。禽分枝杆菌荧光ＰＣＲ反应条件设定：第一阶段：５０℃２ｍｉｎ，９５℃４ｍｉｎ，１个循环；第二阶段：９５℃１０ｓ，６５℃３０ｓ，４０个循环，荧光收集设置在６５℃退火延伸时进行。荧光素设定：报告荧光（ＲｅｐｏｒｔＤｙｅ）设定为ＦＡＭ（或按探针实际标记的荧光基团设定），淬灭荧光（ＱｕｅｎｃｈＤｙｅ）设定为Ｎｏｎｅ，校准荧光（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄｙｅ）设定为Ｎｏｎｅ。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。７．５．５分析条件设定和结果判定综合分析仪器给出的各项结果，基线（ｂａｓｅｌｉｎｅ）以仪器给出的默认值作为参考，阈值（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪音情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。７．５．６质控阴性对照和空白对照应无Ｃｔ值，阳性对照的Ｃｔ值应≤３０，且呈现Ｓ型典型扩增曲线。否则，此次实验视为无效。７．５．７荧光犘犆犚结果分析及判定在质控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定：检测结果呈现无Ｃｔ值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光ＰＣＲ阴性反应。阳性反应结果判定：检测结果呈现Ｃｔ值≤３５、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光ＰＣＲ阳性反应。对于３５＜Ｃｔ值＜４０的样品，应重新取样进行重复检测。如果重复检测的Ｃｔ值＜４０，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。否则判为荧光ＰＣＲ阴性反应。必要时，对初次检测呈荧光ＰＣＲ阳性反应的样品进行重复检测。８常规犘犆犚检测方法８．１仪器与耗材ＰＣＲ仪，ＰＣＲ反应管，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统或紫外透射仪，其余同７．１。８．２试剂８．２．１２×ＰＣＲ反应液含０．１Ｕ犜犪狇Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／μＬ，ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ各５００μｍｏｌ／Ｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ８．３），１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，３ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。可采用等效商品化试剂。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１８．２．２ＰＣＲ扩增引物序列牛分枝杆菌引物：上游引物ＣＳＢ１：５’ＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＣＴＴＧＴＧＡ３’；下游引物ＣＳＢ２：５’ＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＡ３’。结核分枝杆菌引物：上游引物与牛分枝杆菌上游引物相同，为ＣＳＢ１；下游引物ＣＳＢ３：５’ＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡ３’。禽分枝杆菌引物：第一对引物：上游引物：ＣＭＡ１：５’ＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣ３’；下游引物：ＣＭＡ２：５’ＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＡＣＣ３’。第二对引物：上游引物：ＣＭＡ７：５’ＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＧＡＴＣＴＡＣ３’；下游引物：ＣＭＡ８：５’ＡＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣ３’。８．２．３灭菌双蒸水。８．２．４ＤＮＡ标准相对分子质量（１００ｂｐ～１ｋｂ）。８．２．５电泳试剂：Ｇｏｌｄｖｉｅｗ或其他等效核酸染料，Ｔｒｉｓ乙酸（ＴＡＥ）电泳缓冲液，２％琼脂糖凝胶，配制方法见附录Ａ。８．３采样与样品处理操作方法同７．３、７．４。８．４犘犆犚扩增反应８．４．１犘犆犚扩增试剂准备取出２×ＰＣＲ反应液、引物（１０μｍｏｌ／Ｌ），在室温下融化，瞬时离心５ｓ后置冰上。每个ＰＣＲ反应按表３配制ＰＣＲ反应混合液（需配制反应液数量＝样品个数＋对照个数＋１）。采用其他等效商品化ＰＣＲ反应试剂，ＰＣＲ反应液等试剂用量按试剂说明书。表３犘犆犚反应混合液配制试剂２×ＰＣＲ反应液ＰＣＲ引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）灭菌双蒸水用量２５μＬ每种引物１μＬ补足水至４５μＬ将以上ＰＣＲ反应试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后在每个ＰＣＲ管中分装４５μＬ。可根据需要选择进行牛分枝杆菌、结核分枝杆菌单重或二重（同时检测上述两种分枝杆菌）ＰＣＲ检测、以及禽分枝杆菌二重ＰＣＲ检测。对于牛分枝杆菌／结核分枝杆菌二重ＰＣＲ检测，每个ＰＣＲ反应混合液中加入ＣＳＢ１引物、ＣＳＢ２引物、ＣＳＢ３引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ；对于禽分枝杆菌二重ＰＣＲ检测，每个ＰＣＲ反应混合液中加入ＣＭＡ１引物、ＣＭＡ２引物、ＣＭＡ７引物、ＣＭＡ８引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ。８．４．２加模板在已分装有ＰＣＲ反应混合液的ＰＣＲ管中分别加入已提取好的样品或对照核酸５μＬ，充分混匀，盖上管盖。８．４．３犘犆犚扩增检测将ＰＣＲ管放入ＰＣＲ仪。反应条件设定：牛分枝杆菌、结核分枝杆菌单重或二重ＰＣＲ检测：第一步，９４℃３ｍｉｎ；第二步，９４℃２０ｓ，５５℃２０ｓ，７２℃３０ｓ，３５个循环；第三步，７２℃１ｍｉｎ。禽分枝杆菌二重ＰＣＲ检测：第一步，９４℃３ｍｉｎ；第二步，９４℃２０ｓ，６５℃３０ｓ，３５个循环；第三步，７２℃１ｍｉｎ。１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１８．５电泳检测犘犆犚扩增产物采用２％琼脂糖凝胶，采用Ｇｏｌｄｖｉｅｗ或其他等效核酸染料。设ＤＮＡ相对分子质量对照，５Ｖ／ｃｍ～８Ｖ／ｃｍ电泳１ｈ，置紫外透射仪或凝胶成像系统仪上观察，拍照记录检测结果。８．６质控阴性对照应无特异扩增产物，阳性对照应有分子量相符的特异扩增产物。否则，此次实验视为无效。８．７结果分析及判定牛分枝杆菌ＰＣＲ特异扩增产物分子量为１６８ｂｐ，结核分枝杆菌ＰＣＲ特异扩增产物分子量为２６３ｂｐ，禽分枝杆菌２条特异ＰＣＲ扩增产物分子量分别为２０２ｂｐ、４２７ｂｐ。电泳结果，对于牛分枝杆菌、结核分枝杆菌单重或二重ＰＣＲ检测，样品呈现１６８ｂｐ特异扩增产物，判为牛分枝杆菌阳性；样品呈现２６３ｂｐ特异扩增产物，判为结核分枝杆菌阳性；对于禽分枝杆菌二重ＰＣＲ检测，样品呈现２０２ｂｐ和（或）４２７ｂｐ特异扩增产物，均判为禽分枝杆菌阳性。样品无特异扩增产物，判为阴性。８．８犘犆犚检测结果的确证必要时，对ＰＣＲ扩增产物进行测序确证。将所测得的序列与标准序列（参见附录Ｂ）进行比较，序列吻合（扩增区全序列比对同源性达９５％以上）表明确证为阳性。１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１附录犃（规范性附录）溶液与培养基的配制犃．１４％硫酸量取２０ｍＬ浓硫酸，加入到５００ｍＬ双蒸水中，混匀。常温贮存。犃．２３％和４％氢氧化钠溶液３％氢氧化钠，称取３ｇ氢氧化钠，加入到８０ｍＬ双蒸水中，充分溶解后补足体积至１００ｍＬ。４％氢氧化钠，称取４ｇ氢氧化钠，加入到８０ｍＬ双蒸水中，充分溶解后补足体积至１００ｍＬ。常温贮存。犃．３５％～１０％盐酸溶液量取浓盐酸５ｍＬ～１０ｍＬ，与９０ｍＬ～９５ｍＬ双蒸水混匀。常温贮存。犃．４氢氧化钠消化液氢氧化钠３８ｇ钾明矾２ｇ０．４％溴麝香草酚蓝５ｍＬ加蒸馏水至１０００ｍＬ０．４％溴麝香草酚蓝的配制：称取０．４ｇ溴麝香草酚蓝溶于１００ｍＬ蒸馏水中。将氢氧化钠和钾明矾先溶解于适量蒸馏水中，再加入０．４％溴麝香草酚蓝溶液后，补加蒸馏水至１０００ｍＬ。混匀，常温保存备用。犃．５０．１犿狅犐／犔柠檬酸钠溶液称取２９．４ｇ柠檬酸钠（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ·２Ｈ２Ｏ），溶入１Ｌ蒸馏水中，分装，采用（１２１±２）℃／０．１ＭＰａ，高压灭菌１５ｍｉｎ，室温储存。犃．６安替福民溶液犃．６．１溶液犃的配制碳酸钠１２ｇ漂白粉８ｇ蒸馏水８０ｍＬ将碳酸钠和漂白粉溶于蒸馏水中，混匀即可。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１犃．６．２溶液犅的配制氢氧化钠１５ｇ蒸馏水８５ｍＬ将氢氧化钠溶于蒸馏水中。使用前，将Ａ、Ｂ两液等量混合，再用蒸馏水稀释成２０％后使用。溶液配制后应存放于棕色瓶内。犃．７甘油蛋白鸡蛋白２０ｍＬ甘油（丙三醇）２０ｍＬ水杨酸钠０．４ｇ将上述成分混匀。犃．８萋尼氏抗酸染色液的配制犃．８．１苯酚复红染色液取碱性复红饱和酒精溶液（每１００ｍＬ９５％酒精加３ｇ碱性复红）１０ｍＬ，５％（质量浓度）苯酚溶液９０ｍＬ，两者混合均匀后，用滤纸过滤。犃．８．２３％盐酸酒精脱色液取盐酸３ｍＬ，９５％酒精９７ｍＬ，混匀。犃．８．３骆氏美蓝染色液甲液：美蓝０．３ｇ，９５％酒精３０ｍＬ。乙液：０．０１％氢氧化钾溶液１００ｍＬ。取０．０１ｇ氢氧化钾，溶于１００ｍＬ蒸馏水中。将甲乙液混匀。犃．９改良犔犑培养基无水磷酸二氢钾２．４ｇ硫酸镁０．２４ｇ柠檬酸镁０．６ｇＤＬ天门冬素（ＤＬＡｓｐａｒａｇｉｎ）３．６ｇ甘油（丙三醇）１２ｇ马铃薯淀粉３０ｇ新鲜鸡卵液１０００ｍＬ（约３０个鸡蛋）２％孔雀绿水溶液２０ｍＬ蒸馏水６００ｍＬ将磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸镁、甘油和蒸馏水混合，加热溶解。将马铃薯粉加入上述溶液内，随加随搅拌，水浴煮沸１ｈ。鸡蛋用７５％酒精消毒外壳后，打开，将蛋清和蛋黄充分搅匀，４层纱布过滤。待上述加马铃薯粉的盐溶液冷却至５０℃时，加入鸡蛋液和２％（质量浓度）孔雀绿溶液，并充分搅匀。分装于试管中，８０℃灭菌３０ｍｉｎ后，３７℃培养４８ｈ，若无杂菌污染即可使用。配好的培养基，可在４℃保存４周。１４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１改良罗氏培养基有商品化干粉培养基，可按其使用说明配制。犃．１０对硝基苯甲酸（犘犖犅）培养基称取５００ｍｇ对硝基苯甲酸，用１０ｍＬ二甲基亚砜溶解；配制ＬＪ培养基时，按每升培养基添加５００ｍｇ对硝基苯甲酸的比例添加到培养基溶液中。ＰＮＢ培养基有商品化培养基，可按其使用说明配制。犃．１１犘犅犛缓冲液（１／１５犿狅犾／犔）甲液（１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠溶液）：称取磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）２３．８７ｇ，加双蒸水溶解，定容至１０００ｍＬ。１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，４℃保存。乙液（１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钾溶液）：称取磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）９．０７ｇ，加双蒸水溶解，定容至１０００ｍＬ。１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，４℃保存。将甲液和乙液按３∶２的比例混合，即为ｐＨ７．０的ＰＢＳ缓冲液。将甲液和乙液按２∶３的比例混合，即为ｐＨ６．７的ＰＢＳ缓冲液。犃．１２吐温８０水解试验培养基１／１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０磷酸盐缓冲液１００ｍＬ吐温８００．５ｍＬ０．２％中性红溶液２ｍＬ将吐温８０和０．２％（质量浓度）中性红溶液加入磷酸盐缓冲液中，混匀，１１２ｋＰａ灭菌２０ｍｉｎ。分装于试管中，每管２ｍＬ。冷却后存放于４℃可保存２周。犃．１３硝酸盐还原试验溶液１／１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０磷酸盐缓冲液１００ｍＬ硝酸钠８５ｍｇ将硝酸钠加入磷酸盐缓冲液中，溶解后，１１２ｋＰａ灭菌２０ｍｉｎ，分装于试管，每管２ｍＬ。犃．１４０．２％氨基苯磺胺称取０．２ｇ的氨基苯磺胺，用蒸馏水溶解，定容至１００ｍＬ。犃．１５０．１％犖甲基盐酸二氨基乙烯称取０．１ｇ的犖甲基盐酸二氨基乙烯，用蒸馏水溶解，定容至１００ｍＬ。犃．１６０．１％酚红指示剂称取０．１ｇ酚红置研钵中，缓慢滴加４％氢氧化钠溶液，边加边磨，并不断吸出已溶解的酚红液，直至完全溶解，加蒸馏水至１００ｍＬ，经粗滤纸过滤后使用，室温保存。１５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１犃．１７０．１２％尿素溶液尿素０．１２ｇ蒸馏水１００ｍＬ将尿素溶于水中，用０．２２μｍ滤膜过滤除菌，４℃保存。犃．１８犜犆犎培养基ＬＪ培养基１００ｍＬＴＣＨ１ｍｇ将改良ＬＪ培养基水浴煮沸，加入ＴＣＨ后，充分搅匀。分装于试管中。８０℃灭菌３０ｍｉｎ后，３７℃培养４８ｈ，若无杂菌污染即可使用。犃．１９柠檬酸钠磷酸缓冲液先配制ｐＨ６．８磷酸缓冲液：Ａ液（０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠溶液）：称取磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）１５．６１ｇ，加双蒸水溶解，定容至５００ｍＬ。Ｂ液（０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液）：称取磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）３５．８２ｇ，加双蒸水溶解，定容至５００ｍＬ。分别量取５１ｍＬＡ液，４９ｍＬＢ液，混合即成１００ｍＬｐＨ６．８磷酸缓冲液。称取２．８４ｇ柠檬酸钠（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ·２Ｈ２Ｏ），加入到１００ｍＬｐＨ６．８磷酸缓冲液中，充分溶解。（１２１±２）℃／０．１ＭＰａ高压灭菌１５ｍｉｎ，贮存于４℃。犃．２０柠檬酸钠缓冲液柠檬酸５．３ｇ柠檬酸钠１５ｇ葡萄糖１６．２ｇ称取上述试剂，溶解于蒸馏水，定容至１Ｌ，混匀。（１２１±２）℃／０．１ＭＰａ，高压灭菌１５ｍｉｎ，贮存于４℃。犃．２１０．５犿狅犾／犔犈犇犜犃（狆犎８．０）称取１８６．１ｇＥＤＴＡ，加入到８００ｍＬ蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调ｐＨ至８．０，定容至１Ｌ，分装后（１２１±２）℃／０．１ＭＰａ，高压灭菌１５ｍｉｎ，室温贮存。犃．２２０．０１犿狅犾／犔狆犎７．６犘犅犛先配制Ａ液、Ｂ液：Ａ液（０．２ｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４溶液）：称取一水合磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ）２７．６ｇ，或二水合磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）１６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１３１．２ｇ，溶于蒸馏水中，定容至１０００ｍＬ。Ｂ液（０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４溶液）：称取十二水合磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）７１．６ｇ，或二水合磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）３５．６ｇ，溶于蒸馏水中，定容至１０００ｍＬ。称取１７ｇ氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取１３ｍＬＡ液加Ｂ液８７ｍＬ，用蒸馏水定容至２Ｌ。犃．２３犜犃犈电泳缓冲液１０×ＴＡＥ的配制：Ｔｒｉｓ４８．４ｇ冰乙酸１１．４ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ２０ｍＬ或ＥＤＴＡ３．７２ｇ加水定容至１Ｌ。使用时，用蒸馏水稀释１０倍即为１×ＴＡＥ电泳缓冲液。犃．２４２％琼脂糖凝胶称取２ｇ琼脂糖粉，加入１００ｍＬ１×ＴＡＥ电泳缓冲液，加热溶解，冷却至６０℃，加５μＬＧｏｌｄｖｉｅｗ或其他等效核酸染料，混匀。１７ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１０—２０１１附录犅（资料性附录）常规犘犌犚扩增产物核酸序列犅．１牛分枝杆菌犘犆犚扩增产物序列ｔｔｃｃｇａａｔｃｃｃｔｔｇｔｇａａｇｔａｇｔａａｔｇｔｇｃｇａｇｃｔｇａｇｃｇａｔｇｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃａａａａａｔｔａｃｃａａｔｇｇｔｔｔｇｇｔｃａｔｇａｃｇｃｃｔｔｃｃｔａａｃｃａｇａａｔｔｇｔｇａａｔｔｃａｔａｃａａｇｃｃｇｔａｇｔｃｇｔｇｃａｇａａｇｃｇｃａａｃａｃｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｇｃｃｔａｃａａｃｇｇｃｇｃｔｃｔｃｃ犅．２结核分枝杆菌犘犆犚扩增产物序列ｔｔｃｃｇａａｔｃｃｃｔｔｇｔｇａａｇｔａｇｔａａｔｇｔｇｃｇａｇｃｔｇａｇｃｇａｔｇｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｃａａａａａｔｔａｃｃａａｔｇｇｔｔｔｇｇｔｃａｔｇａｃｇｃｃｔｔｃｃｔａａｃｃａｇａａｔｔｇｔｇａａｔｔｃａｔａｃａａｇｃｃｇｔａｇｔｃｇｔｇｃａｇａａｇｃｇｃａａｃａｃｔｃｔｔｇｇａｇｔａｃｃｔｇｃｇｃｔｔｇｃａｇａｇａｔｃａａａｔａｇｇｇｃｇｃａｔｇｇｇｔｃａｇｃａｔａｇｔａｃａｇｇｔｃｇｔｃｇｃｇｃａｔｃｔｔｔｇａｔｇｃａｔｃｇｇａａｔａａｇａｔｇｔｃａｇｇｃａａｔｔａａａａｇａｇａａｇｃｃａｃｇｇｃｇａｃｔ犅．３禽分枝杆菌犘犆犚扩增产物序列犅．３．１引物对犆犕犃１／犆犕犃２对应的扩增产物序列ｇｔｔｇｔｔｇｃｔｔｇａａａｇｇａａｔｇｇｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃｇｔｔｔｔｇｇａｃｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃａｃｔｇａｔｔｇａｇａｔｃｔｇａｃｇｃｇｔａｃｔｃｇａｔｇａｃｇｃｔｇｃｔｃｔａａｇｇａｃｃｔｇｔｔｇｇｃｇｇｇｇｔｔｇｔｃｃｇｃｇｇｇｇａｃｔｇｃｇａｃｇａｃａｇｇａｇｔａｇｃｇｇｔａｔｇｇｃｃｇａａｃｃｃｇａｃｃｇａｇｔｇｔｇｇｇｔｇｇｇｔａｔｃｇａｃｇｔｃｇｇｔａａｇｔｃｃａｃｔｃａｔｃａｔｇｃｇ犅．３．２引物对犆犕犃７／犆犕犃８对应的扩增产物序列ｇｃｃｇｃｃｇａａａｃｇａｔｃｔａｃｃａａｇｃｃｔｔｇａｔｃｇａｃｇｃｇｇａｇｔｔｇａｃｃｇｃｇｔｔｃａｔｃｇｇｇｇｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｔｇａｇｃｇｃａｃｃｇａｇａｃｃｃｇｃｔｃｃａａｔｃａｇｃｇｃａａｃｇｇｃｔｃｇｃｇｔｃｃｇｃｇｃａｃｇｃｔｇｔｃｃａｃｇｇｔｃｇｃａｇｇｇｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｇｃｇｇａｔｔｃｃｃａａｇｃｔｇｃｇｃａｃｃｇｇｇｔｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｇｇｃｇｔｔｇｔｔｇｇａｇｃｇｇｃｇｔｃｇｃｃｇｇｇｔｃｇａｔｃａｇｔｇｃｔｔｇｔｔｃｇｃｇｇｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｇｃｃｔａｃｃｔｇｃａｃｇｇｃａｃｃｔｃｃａｃｃｃｇｃａａｇｇｔｃｇａｃｇａｔｃｔｇｇｔｃａａｇｇｃａｃｔｇｇｇｔａｃｃｇａｔａｃｃｇｇｇａｔｃｔｃｃａａａａｇｃｇａｇｇｔｃａｇｃｃｇｇａｔｃｔｇｃａａａｇａｃｃｔｃｇａｃａｃｃｇａｇｇｔｃｇｃｇｇｃｃｔｔｃｃｇｇｇａｃｃｇｇｃｃｇｔｔｇｇｇｔｇａｔｃａｇｃｇｃｔｔｔｃｃｇｔａｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃｇａｃｇｃｃａｃｃｔ１８ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２０１３１／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准动物结核病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１３１０—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．５字数３６千字２０１１年１２月第一版２０１１年１２月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８９定价２４．００元'