SNT2865-2011 尼帕病毒病检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６５—２０１１尼帕病毒病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犖犻狆犪犺狏犻狉狌狊犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验与疫苗标准手册》（２００４版）２．１０．１０条“亨得拉和尼帕病毒病”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、岳志芹、肖西志、邓明俊、谭乐义、辛学谦。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１尼帕病毒病检疫技术规范１范围本标准规定了尼帕病毒病的病毒分离鉴定、电镜观察、免疫组织化学试验、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验等检疫方法。本标准适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３概述３．１尼帕病毒（Ｎｉｐａｈｖｉｒｕｓ，ＮｉＶ）病是一种新出现的人畜共患传染病。尼帕病毒病的病原是副黏病毒科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）成员，能够感染人、猪等多种动物。在猪群内传播迅速，症状却不明显，在人群中有人传人的可能，并且人感染ＮｉＶ之后，死亡率高达４０％～７０％。３．２ＮｉＶ可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，例如母猪首先表现为神经症状，而肉用猪表现为呼吸道症状，此外，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状。３．３人、猫、狗和马也可以感染ＮｉＶ。人感染ＮｉＶ后，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，死亡率很高；狗感染ＮｉＶ后，可出现类似犬瘟热症状；猫感染ＮｉＶ后，死亡率很高；马感染ＮｉＶ后可以出现神经症状，但是死亡率似乎较低。所以在临床诊断时，应注意感染的猪场及其周围人和其他动物的发病情况，注意发病猪场新近是否引进新猪。因尼帕病毒病是可感染人和多种动物的人畜共患传染病，所以处理带有或可能带有此活病毒的样品必须在ＢＳＬ４生物安全实验室内操作。３．４死后剖检发现ＮｉＶ感染猪没有特征性病变，肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部，可见肺小叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显的变化。４病毒分离鉴定４．１试剂、材料与仪器４．１．１试剂与材料：Ｖｅｒｏ细胞或ＲＫ１３细胞、ＥＭＥＭ或其他培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、细胞瓶和各种常规试剂等（见附录Ａ）。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。４．１．２仪器：生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、高速冷冻离心机、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅等。４．２样品采集与处理４．２．１样品采集与运送：无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，４℃保存运送到ＢＳＬ４级生物安全实１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１验。也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在－２０℃。４．２．２样品处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌密闭容器内，加入少量组织培养液和抗菌素，用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加组织培养液，使最终为１０％组织悬液。以１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，小心收取上清液低温保存备用。４．３病毒分离４．３．１将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的Ｖｅｒｏ或ＲＫ１３细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用６０倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。４．３．２加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于３７℃孵育１ｈ。加入维持液置于３７℃继续培养，逐日观察细胞病变（ＣＰＥ），尼帕病毒（ＮｉＶ）一般在３ｄ内出现ＣＰＥ。４．３．３无ＣＰＥ出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养５ｄ～７ｄ。出现ＣＰＥ者，待７０％细胞出现ＣＰＥ时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。４．３．４用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。４．４结果判定检查各种对照试验，细胞对照正常，无ＣＰＥ；阳性对照出现明显的ＣＰＥ，说明试验成立。如果试验组出现明显的ＣＰＥ，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则初步判定为病毒分离阳性；如果分离的细胞培养物能被ＮｉＶ阳性血清中和或被其他方法鉴定，则分离的病毒为ＮｉＶ。５电镜观察５．１试剂、材料与仪器５．１．１试剂与材料：２．５％戊二醛溶液、０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水、显影液、定影液、ＮｉＶ、Ｖｅｒｏ细胞等。５．１．２仪器：扫描电镜、临界点干燥仪、离子溅射镀膜仪、底片扫描仪。５．２操作方法５．２．１用小盖玻片培养接毒的贴壁细胞。５．２．２用０．１ｍｏｌ／Ｌ，磷酸缓冲液（ｐＨ７．２）洗两次。５．２．３固定：用２，５％戊二醛溶液室温于通风橱固定１ｈ。固定完后用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液和蒸馏水充分洗净。５．２．４脱水：洗净后用３５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％乙醇逐渐上升脱水。每级各５ｍｉｎ。５．２．５置换：用乙醇∶乙酸异戊酯（１∶１）混合液及１００％乙酸异戊酯依次置换５ｍｉｎ，最后将样品浸于乙酸异戊酯１５ｍｉｎ。５．２．６临界点干燥：在干燥前先通过放入液体二氧化碳使得仪器压力罐温度降到低于室温１０℃，接着将样品放入小篮中置于罐内。打开进口阀，放入液体二氧化碳，至充满罐的５０％～８０％体积。再升温至２０℃，使得二氧化碳置换乙酸异戊酯２０ｍｉｎ，再升温至４０℃，此时压力应该大于８０ｋｇ／ｃｍ２。保持５ｍｉｎ后，缓慢将二氧化碳气体放出，时间大概２ｈ左右。待压力降到０时，再调节温度至室温，取出样品，暂存干燥器中备用。５．２．７喷镀：将已干燥好的样品用导电胶粘于金属的样台上，再一起置于真空喷镀仪真空罩中，进行喷镀金铂合金镀层，完成后电镜下观察。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１５．２．８电镜观察。５．３结果判定如果电镜观察显示：病灶原生质膜增厚呈头发样，多核细胞突出，核正常。细胞外病毒粒子呈多形性（球形或细长形），大小为５０ｎｍ～５００ｎｍ不等，病毒粒子被有许多表面突起的膜包裹，核衣壳呈各异的螺旋状和人字形，并被囊膜所包被，则可初步判定为ＮｉＶ阳性。６免疫组织化学试验６．１原理免疫组化法用于检测福尔马林固定的组织或细胞，该方法还可以检测存放已久的病料，用于调查以往该病发生的情况。在发病动物的很多组织中都可以检测到该病毒，病料采集范围包括：不同的脑组织、脾脏、肾脏和纵隔淋巴结等。孕畜还应包括子宫、胎盘和胎儿的器官等。６．２试剂、材料与仪器６．２．１试剂与材料：固定液、石蜡、玻片、二甲苯、无水乙醇、胰蛋白酶、脱脂奶粉、兔抗尼帕病毒抗体、酶标二抗、显色液、Ｓｃｏｔｔ’ｓ溶液、Ｈ２Ｏ２、中性封片剂和各种常规试剂等（见附录Ｂ）。６．２．２仪器：切片机和显微镜等。６．３病料处理６．３．１将采集的病料浸入１０倍体积的固定液中固定。７ｄ后更换固定液，再维持一周。６．３．２将选取好的组织块放入新配的固定液中再固定７ｄ，其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断摇荡，以提高固定液的渗透力。６．３．３将固定好的组织块放入流水中漂洗２４ｈ。６．３．４放入下列不同浓度的酒精中脱水：７５％酒精２ｈ→８５％酒精２ｈ→９５％酒精Ⅰ２ｈ→９５％酒精Ⅱ２ｈ→１００％酒精Ⅰ２ｈ→１００％酒精Ⅱ２ｈ。６．３．５放入香柏油和二甲苯中透明：香柏油中１２ｈ→二甲苯Ⅰ１ｈ→二甲苯Ⅱ１ｈ。６．３．６浸蜡：软蜡中放置４０ｍｉｎ；硬蜡中放置２ｈ。６．３．７将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，４℃冷却过夜。６．３．８将石蜡块切成５μｍ厚的切片，用干净的载玻片贴片。６．４操作方法６．４．１脱蜡：依次将切片放入二甲苯二甲苯二甲苯各１ｍｉｎ，无水乙醇无水乙醇７０％乙醇各５ｍｉｎ，然后用流水冲洗。６．４．２将切片置于蒸馏水中漂洗，然后浸入包含０．１％（质量浓度）胰蛋白酶的０．０１ｍｏｌ／Ｌ氯化钙中（用０．１ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠调ｐＨ值至７．８），３７℃放置２０ｍｉｎ，用蒸馏水冲洗。６．４．３将切片放入湿盒内用ＰＢＳ漂洗５ｍｉｎ。洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，每张切片上滴加２００μＬ３％的Ｈ２Ｏ２溶液，室温放置２０ｍｉｎ，然后倒掉Ｈ２Ｏ２，放入ＰＢＳ中漂洗５ｍｉｎ。６．４．４洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，向切片上滴加２００μＬ适当稀释的兔抗尼帕病毒抗体（用包含０．１％脱脂奶粉的ＰＢＳ稀释，每份样品和对照均要设立平行试验），将切片封好置于３７℃孵育１ｈ。６．４．５将切片放入ＰＢＳ中漂洗５ｍｉｎ，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加２滴～３滴酶标二３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１抗，３７℃孵育２０ｍｉｎ。６．４．６将切片放入ＰＢＳ中漂洗５ｍｉｎ，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加显色液，在显微镜下观察染色程度。阳性对照切片染色充分后（通常２ｍｉｎ～５ｍｉｎ），用蒸馏水漂洗终止反应。６．４．７将切片用ＰＢＳ漂洗５ｍｉｎ，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，放入苏木素中复染１ｍｉｎ～３ｍｉｎ，用蒸馏水冲洗，加入Ｓｃｏｔｔ’ｓ溶液，流水冲洗。蒸馏水漂洗切片，用中性封片剂封片。６．４．８显微镜观察６．５结果判定如果镜检切片显示细胞质可见褐色／红色颗粒状着色点，细胞核呈蓝色，则判定为ＮｉＶ阳性。７微量血清中和试验７．１试剂、材料与仪器７．１．１试剂与材料：细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等，标准阳性血清、阴性血清和被检血清经５６℃灭能３０ｍｉｎ备用，Ｖｅｒｏ细胞和尼帕病毒株ＮｉＶ（见附录Ａ）。７．１．２仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、微量细胞培养板等。７．２操作方法７．２．１中和病毒滴度（犜犆犐犇５０）测定７．２．１．１中和病毒制备将保存于液氮中的ＮｉＶ种毒取出置于４℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液作６０倍稀释后，取１ｍＬ接种于长成单层Ｖｅｒｏ细胞的细胞瓶中，吸附１ｈ。先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于３７℃恒温箱中培养３６ｈ～４８ｈ，当５０％～７５％细胞出现ＣＰＥ，即可收获病毒培养液，分装成１ｍＬ后冻存（－７０℃以下）备用。７．２．１．２病毒滴度测定在微量细胞培养板（９６孔）每孔加２５μＬ细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作１０－１，１０－２……－８系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔２５μＬ。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加１０４／１００），置３７℃培养，４８ｈ后初判，７２ｈ终判。２５μＬ病毒稀释液。每孔１００μＬＶｅｒｏ细胞（２．４×１０μＬ如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现ＣＰＥ（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验数据。根据Ｋａｒｂｅｒ法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量ＴＣＩＤ５０）。７．２．２微量血清中和试验７．２．２．１在９６孔细胞培养板上每孔加２５μＬ细胞培养液。第一列四孔作被检血清（毒性）对照，每孔加２５μＬ被检血清，用移液器混匀后弃２５μＬ；第二列四孔，每孔加２５μＬ被检血清，混匀后吸出２５μＬ至第三孔，依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为１∶２、１∶４和１∶８，每一稀释度各四孔。７．２．２．２用病毒稀释液将病毒稀释成工作浓度２００ＴＣＩＤ５０，第一列四孔加病毒稀释液（无病毒）作被检血清（毒性）对照，第二至四列的各孔加２５μＬ稀释的病毒。盖上培养板，轻轻摇匀，放入二氧化碳保湿培养箱（５％二氧化碳）３７℃孵育１ｈ。阴、阳性血清对照（方法同上）。－１、１０－２、１０－３稀释，再加２５μＬ病毒稀释７．２．２．３病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作１０液，每一稀释度各四孔。正常细胞对照，留四孔至八孔，每孔仅加２５μＬ的病毒稀释液，不加血清和病４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１毒。上述每孔加１００μＬＶｅｒｏ细胞，细胞浓度为（２．４×１０４／１００）。放入二氧化碳保湿培养箱（５％二μＬ氧化碳）３７℃培养，４８ｈ用倒置显微镜进行初步判定，７２ｈ后最终判定结果。７．３结果判定７．３．１检查各种对照试验，细胞对照正常，无ＣＰＥ；阴性血清出现明显的ＣＰＥ，表现为多个细胞发生融合，形成合胞体，最后细胞脱落、裂解；阳性血清无ＣＰＥ，细胞不出现病变。病毒滴度验证时滴度与原测定滴度相差应在０．３ｌｏｇ１０范围内，说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。被检血清对照孔不出现病变，说明被检血清无毒性反应。７．３．２在各种对照成立的情况下，检查各个被检血清的ＣＰＥ。如果出现ＣＰＥ，则判为阴性孔；如果不出现ＣＰＥ，则判为阳性孔。以完全中和病毒感染性（即不出现ＣＰＥ）的最大稀释度为该血清的中和抗体效价。７．３．３如被检血清孔１∶４为阴性，判该动物为血清学阴性。如被检血清１∶４或更高稀释度的孔为阳性，判该动物为血清学阳性。如被检血清孔１∶２为阳性，则该动物判为可疑。出现可疑情况时，应对可疑血清重试一次，最终判定结果以重试为准。如果两次试验均为可疑反应，则该动物视为血清学阳性动物处理。８酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）８．１试剂、材料与仪器８．１．１试剂与材料：ＰＢＳ、病毒抗原、细胞对照抗原、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、Ｈ２Ｏ２、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清等（见附录Ｃ，参见附录Ｄ）。８．１．２仪器：酶标仪、９６孔酶标板、振荡培养箱等。８．２操作方法８．２．１将病毒抗原和细胞对照抗原用ＰＢＳ１∶１０００稀释，将稀释后的抗原加入９６孔板中，１、３、５、７、９和１１孔滴加病毒抗原，２、４、６、８、１０和１２孔滴加细胞对照抗原。置于３７℃振荡培养１ｈ或４℃过夜，每孔５０μＬ。８．２．２倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（ＰＢＳＴ），静置１ｍｉｎ～２ｍｉｎ后倒掉，吸干，重复洗三次。８．２．３加入封闭液，每孔１００μＬ，置３７℃振荡孵育３０ｍｉｎ。８．２．４用ＰＢＳＴ洗板三次（同上）。８．２．５按照８．２．３每孔加入１００μＬ准备好的待检血清，各缓冲液对照孔加入１００μＬＰＢＳ（含５％鸡血清和５％脱脂奶粉），置３７℃静止１ｈ。８．２．６用ＰＢＳＴ洗板三次（同上）。８．２．７用含１％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ稀释酶标抗体，混匀后除底物对照孔外每孔加入１００μＬ，底物对照孔加入１００μＬ含１％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ。置３７℃静止１ｈ。８．２．８用ＰＢＳＴ洗板三次（同上）。８．２．９每孔加入１００μＬ底物溶液，置室温（１８℃～２２℃）静止１０ｍｉｎ。８．２．１０每孔加入１００μＬ的１ｍｏｌ／Ｌ硫酸终止反应。８．２．１１将板置于酶标仪上，在４５０ｎｍ波长条件下读取光吸收值。８．２．１２每次试验设立强阳性、弱阳性、阴性血清、各缓冲液对照孔和未感染病毒的细胞抗原对照孔。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１８．３结果判定犗犇比值计算见式（１）：待检血清ＮｉＶ抗原孔犗犇值犗犇比值＝…………………………（１）待检血清细胞对照抗原孔犗犇值当犗犇比值大于２．０，ＮｉＶ抗原犗犇值大于０．２０时为阳性。当犗犇比值大于２．０，ＮｉＶ抗原犗犇值小于０．２０时为阴性。当犗犇比值在２．０～２．２之间为可疑。ＥＬＩＳＡ可疑或阳性血清用中和试验进行验证。９综合判定９．１病毒分离、电镜观察结果均为病原初步诊断，需要进一步应用免疫组织化学试验或血清中和试验进行确证。９．２ＥＬＩＳＡ结果为血清学初步诊断，需要应用血清中和试验进行确证。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１附录犃（规范性附录）病毒分离培养基和试剂的配制犃．１抗生素贮存液用灭菌三蒸水配成每毫升含１００００ＩＵ青霉素和１０ｍｇ链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜（０．２２）过滤除菌，分装成２ｍＬ／瓶，－２０℃冻存备用。保存期不超过６０ｄ。μｍ犃．２细胞消化液（０．０２％犈犇犜犃）ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸二钠）０．２ｇ氯化钠８．０ｇ氯化钾０．２ｇ磷酸氢二钠１．１５ｇ磷酸二氢钾０．２ｇ加三蒸水至１０００ｍＬ，充分溶解，分装成小瓶，１１５℃高压灭菌１０ｍｉｎ，４℃冷藏备用。保存期不超过９０ｄ。犃．３细胞培养液和细胞维持液细胞培养液：含１０％灭能的无菌胎牛血清（ＦＢＳ）的ＥＭＥＭ培养基。细胞维持液：含２％灭能的无菌胎牛血清（ＦＢＳ）的ＥＭＥＭ培养基。细胞培养液和细胞维持液均用微孔滤膜（０．２２μｍ）过滤除菌，分装成小瓶，４℃保存备用。保存期不超过６０ｄ。使用时加１％抗生素贮存液（终浓度为每毫升ＥＭＥＭ培养基含１００ＩＵ和１００μｇ），并用７．５％碳酸氢钠溶液调ｐＨ值至７．０～７．２。７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１附录犅（规范性附录）免疫组织化学试验试剂配制犅．１固定液１０％福尔马林生理盐水固定液的配制：氯化钠８．５ｇ，蒸馏水９００ｍＬ，４０％福尔马林１００ｍＬ，混匀即可。犅．２显色液将２ｍｇ３氨基９乙基咔唑溶于２００μＬ二甲基甲酰胺中，加入１０ｍＬ０．０２ｍｏｌ／Ｌ醋酸缓冲液，调ｐＨ值为５．０，再加入５μＬＨ２Ｏ２（３０％，质量浓度）混匀，现用现配。犅．３犛犮狅狋狋’狊溶液碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）３．３６ｇ硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）７３．９４ｇ加双蒸水至１０００ｍＬ，充分溶解，分装成小瓶，１１５℃高压灭菌１０ｍｉｎ，４℃冷藏备用。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１附录犆（规范性附录）犈犔犐犛犃试验试剂的配制犆．１磷酸盐缓冲液（犘犅犛）磷酸氢二钠２．１３ｇ磷酸二氢钾０．２ｇ氯化钠８．０ｇ氯化钾０．２ｇ先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至１０００ｍＬ，ｐＨ为７．４。犆．２磷酸盐缓冲液吐温（犘犅犛犜）洗涤液ＰＢＳ１０００ｍＬ，吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬ，混匀。犆．３封闭液ＰＢＳ１０００ｍＬ，加５ｍＬ鸡血清和５ｇ脱脂奶粉，溶解混匀。犆．４底物溶液犆．４．１称取柠檬酸（Ｃ５Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ）１０．５ｇ，先加适量的双蒸水，完全溶解后加入双蒸水定容至１０００ｍＬ，配成０．０５ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸溶液。犆．４．２称取１ｍｇ３，３’５，５’四甲基联苯胺（ＴＭＢ）溶于１０ｍＬ柠檬酸磷酸盐缓冲液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．０），用前再加入２μＬ３０％（体积分数）Ｈ２Ｏ２，即成底物溶液。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６５—２０１１附录犇（资料性附录）犈犔犐犛犃抗原制备与样品前处理犇．１病毒抗原制备犇．１．１在滚瓶中培养Ｖｅｒｏ细胞直至单层，每瓶保留５ｍＬ培养液，其余倒掉。在ＢＳＬ４实验室条件下将ＮｉＶ病毒接种到Ｖｅｒｏ细胞。犇．１．２３３℃旋转滚瓶３０ｍｉｎ以吸附病毒，然后每瓶加６０ｍＬ细胞培养液，３３℃继续旋转４８ｈ。犇．１．３用预冷的０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗涤病毒感染的细胞一次，每瓶刮取细胞，收集到５ｍＬ～１０ｍＬ预冷的ＰＢＳ中。犇．１．４将收集的细胞转移至５０ｍＬ离心管中，４℃３００犵离心５ｍｉｎ，倒掉ＰＢＳ，用预冷的ＴＮＭ重悬细胞，每瓶大约０．５ｍＬＴＮＭ。犇．１．５加ＮＰ４０裂解液至１％，用移液器吹打５次～１０次以裂解细胞。犇．１．６４℃６００犵离心１０ｍｉｎ。犇．１．７轻轻地将上清液移入一个新管中，添加乙二胺四乙酸至１．５ｍｏｌ／Ｌ。补加ＴＮＥ至１０ｍＬ，进行分装，－８０℃冷冻并用６千赫γ射线照射，并存于－８０℃备用。犇．２细胞对照抗原制备在滚瓶中培养Ｖｅｒｏ细胞直至单层，用预冷的ＰＢＳ洗涤单层细胞，刮取细胞，每瓶收集到５ｍＬ～１０ｍＬ预冷的ＰＢＳ中。后面的步骤同上Ｄ．１．４～Ｄ．１．７。犇．３样品前处理犇．３．１在Ⅱ级生物安全柜内，用含０．５％（体积分数）ＴｒｉｔｏｎＸ１００和０．５％（体积分数）吐温２０的ＰＢＳ在９６孔板上１∶５稀释待检血清，将板封好放入５６℃水浴３０ｍｉｎ灭活。犇．３．２将２２．５μＬ灭活血清与等量用ＰＢＳ１∶１００稀释的细胞对照抗原混合，置于１８℃～２２℃孵育３０ｍｉｎ。犇．３．３每孔加４０５μＬ封闭液，使血清最终稀释度为１∶１００，置于１８℃～２２℃孵育３０ｍｉｎ，备用。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２５６８２／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准尼帕病毒病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８６５—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２１千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６６６定价１８．００元'