SNT2868-2011 西尼罗病毒病检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６８—２０１１西尼罗病毒病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狑犲狊狋狀犻犾犲犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了国际动物卫生组织（ＯＩＥ）的《诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）（ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ）２．１．２０章和有关行业标准、文献制定，补充了ＲＴＰＣＲ和实时荧光ＲＴＰＣＲ的检测方法。本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邱璐、李健、姜焱、熊炜、周晓黎、蒋静、胡永强。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１西尼罗病毒病检疫技术规范１范围本标准规定了西尼罗病毒病临床诊断和实验室诊断。本标准适用于西尼罗病毒病病原及抗体的检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３临床诊断３．１发病症状人和马感染后，多数不出现症状，部分感染者发生伴有类似流感症状的西尼罗热，少量严重的病例出现高热、剧烈头痛、颈项强直、昏迷、抽搐等中枢神经系统体症，发生西尼罗脑炎，甚至死亡。３．２流行病学西尼罗病毒（ｗｅｓｔｎｉｌｅｖｉｒｕｓ，ＷＮＶ）为单链ＲＮＡ病毒，属黄病毒科黄病毒属。病毒呈球形，基因组编码三种结构蛋白（Ｃ、ｐｒＭ和Ｅ蛋白）与七种非结构蛋白。西尼罗病毒在抗原性上与同属黄病毒的日本乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ｋｕｎｊｉｎ病毒、登革病毒相似，在血清学检测时，易产生交叉反应。西尼罗病毒于１９３７年首次分离，经蚊媒传播可引起人类或动物的西尼罗热及西尼罗脑炎。鸟类、马、人等哺乳动物都是易感动物。其中鸟类是主要的储存宿主。该病在２０世纪５０年代～９０年代都曾有过流行，特别是２０世纪９０年代以后，流行区呈扩大趋势，范围遍及非洲、欧洲、中东、西亚、中亚、大洋洲和北美洲等广大地区。目前我国尚无该病流行的报道，但随着全球气候变暖，疫源地旅行传播以及生物媒介等潜在因素的存在，为西尼罗病毒的传播提供了可能。加之该病毒目前在我国周边国家如印度、俄罗斯南部、东南亚等国已有报道，我国人群普遍缺乏对该病毒的免疫力，一旦传入，将导致严重的公共卫生灾难。４实验室诊断４．１西尼罗病毒犚犜犘犆犚、实时荧光犚犜犘犆犚检测及套式犘犆犚检测４．１．１方法介绍可以进行西尼罗病毒核酸检测。本标准提供的三种核酸检测方法可以根据具体情况选择采用。ＰＣＲ试验的前处理操作可以在ＢＳＬ２实验室进行。在对人、活动物或尸体进行取样时，采样人员应佩戴个人防护设施，穿戴防护衣，佩戴防护口罩、面罩、手套。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１４．１．２设备、材料和试剂４．１．２．１设备、材料４．１．２．１．１ＰＣＲ仪。４．１．２．１．２实时荧光ＰＣＲ检测仪。４．１．２．１．３电泳仪。４．１．２．１．４凝胶成像分析系统。４．１．２．１．５高速台式冷冻离心机。４．１．２．１．６普通台式离心机。４．１．２．１．７匀浆器。４．１．２．１．８微量可调移液器。４．１．２．１．９无ＲＮａｓｅ的离心管、吸头和无ＲＮａｓｅ的玻璃容器。４．１．２．２试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无ＲＮａｓｅ污染的容器（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌）分装。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。４．１．２．２．１裂解液：Ｔｒｉｚｏｌ或其他。４．１．２．２．２异丙醇。４．１．２．２．３犜犪狇ＤＮＡ酶。４．１．２．２．４７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，－２０℃预冷。４．１．２．２．５ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。４．１．２．２．６逆转录酶。４．１．２．２．７ＤＥＰＣ水：用ＤＥＰＣ处理后的水。４．１．２．２．８５０×ＴＡＥ缓冲液。４．１．３采样、送检和处理４．１．３．１人员样本采集４．１．３．１．１采集来自于疫区的人员、入境可疑人员、申请检验人员的血液。４．１．３．１．２采集怀疑死于西尼罗病人员的血液、脑髓液、组织样品，特别是脑组织和神经组织样品。４．１．３．２动物及产品样本采集４．１．３．２．１采集来自疫区的活动物的血清。４．１．３．２．２采集来自疫区的疑似感染的动物的脑、脊髓、其他组织样品，特别是神经组织样本。４．１．３．３禽鸟和蚊虫样本采集４．１．３．３．１采集来自疫区的贸易鸟、禽类的血清。４．１．３．３．２采集迁徙的鸟类血清。４．１．３．３．３采集来自疫区包装箱内的死鸟、死禽的脑、其他组织样本。４．１．３．３．４采集来自西尼罗疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊虫或以其他方式藏匿的蚊虫样本。特别是库蚊和饱血蚊虫。４．１．３．４来自西尼罗病毒病疫区的交通工具、运输设备的样本采集取样时将棉拭子用无菌ＰＢＳ浸润后，在面积为５ｃｍ２２区域内横直各擦拭１０次，并不断转×５ｃｍ２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１换拭面，然后将拭子棉花端倾入装有ｐＨ７．２～７．４ＰＢＳ液的试管中。４．１．３．５样本的送检和处理４．１．３．５．１采样过程中样本不得交叉污染。样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品，放一个塑料袋，于保温箱中加冰、密封，送实验室。采集或处理的样本在２℃～８℃条件下保存应不超过２４ｈ；若需长期保存，应放置－７０℃冰箱，冻融不超过３次。４．１．３．５．２血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。４．１．３．５．３病毒培养物：用无菌滴管直接吸取至无菌离心管中，编号备用。４．１．３．５．４蚊体、神经或其他组织脏器：取待检样品２．０ｇ置于匀浆器中，加入１０ｍＬＰＢＳ匀浆，然后将组织悬液转入离心管中３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。４．１．３．５．５拭子：将装有拭子的试管在混旋仪上充分混旋提取，挤干拭子，取上清液。试管编号备用。４．１．４操作步骤４．１．４．１引物和探针的设计参见表Ａ．１～表Ａ．３。４．１．４．２样本核酸提取４．１．４．２．１在样本制备区进行。取狀个灭菌的１．５ｍＬ离心管，其中狀为被检样品数、一份阴性、一份阳性对照数量之和，对每管进行编号（阳性对照为ＤＮＡ，无需此步骤）。４．１．４．２．２每管加入１ｍＬ裂解液，然后分别加入４．１．３．５处理后的被检样本、阴性对照、阳性对照各３００μＬ，一份样本换用一个吸头，再加入２００μＬ三氯甲烷，充分振荡均匀（如使用旋涡振荡器，避免振荡过于强烈产生乳化层）。在４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。４．１．４．２．３取与４．１．４．２．１中相同数量的１．５ｍＬ灭菌的离心管，加入４００μＬ预冷的异丙醇，将上步离心后样品及对照的上清液５００μＬ转移至相应的各管，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。－２０℃冰箱静置３０ｍｉｎ。４．１．４．２．４１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，每管加入５００μＬ７５％乙醇，颠倒洗涤。４．１．４．２．５１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，吸去残余液体，室温下干燥５ｍｉｎ。４．１．４．２．６将抽提的ＲＮＡ溶解在２０μＬＤＥＰＣ水中待用。４．１．４．３检测４．１．４．３．１犘犆犚反应体系建议的三种ＰＣＲ检测反应体系参见表Ａ．４～表Ａ．６。每个样本设两个平行，每次反应应带阴性、阳性对照。可以采用两步法进行。４．１．４．３．２反应参数４．１．４．３．２．１普通ＲＴＰＣＲ反应参数：４２℃，６０ｍｉｎ；９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，２０ｓ，５５℃，２０ｓ，７２℃，１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，３ｍｉｎ；２５℃，１５ｓ。４．１．４．３．２．２荧光ＲＴＰＣＲ反应参数：４２℃，６０ｍｉｎ；９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，１５ｓ，５０℃，１５ｓ，７２℃，３０ｓ，５个循环；９４℃，１５ｓ，５８℃，４０ｓ，４０个循环（每个循环的第二步搜集荧光）。４．１．４．３．２．３套式ＰＣＲ反应参数：３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１第一步反应：７０℃，１０ｍｉｎ；４５℃，４５ｍｉｎ；９５℃，１１ｍｉｎ；９５℃，３０ｓ，５５℃，４５ｓ，７２℃，６０ｓ，３５个循环；７２℃，５ｍｉｎ；２５℃，１５ｓ。第二步反应：９５℃，３０ｓ，５５℃，４５ｓ，７２℃，６０ｓ，３５个循环；７２℃，５ｍｉｎ；２５℃，１５ｓ。４．１．４．３．３普通犚犜犘犆犚和套式犘犆犚产物的电泳检测将５０×ＴＡＥ稀释成工作浓度，配制１．５％琼脂糖溶液，加热溶解，略为冷却后加入溴化乙锭储备液，使溴化乙锭的含量为０．５μｇ／ｍＬ，铺板。取１０μＬＰＣＲ反应产物，加２μＬ上样缓冲液，进行电泳。根据情况，选择恒定电流或恒定电压模式，当溴酚蓝迁移至接近凝胶末端三分之二处时，停止电泳。用凝胶成像系统记录结果。若发现条带的大小与阳性结果一致时，将ＰＣＲ产物进行测序，再与数据库中序列进行比对。４．１．５结果判定４．１．５．１普通犚犜犘犆犚结果判定检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小扩增条带，样品未出现预期条带，则判定样品为阴性。检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现预期大小扩增条带，并且对样品的ＰＣＲ产物进行测序分析，若证实与西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。反之，则判断为阴性。４．１．５．２荧光犚犜犘犆犚结果判定４．１．５．２．１总则可以作为核酸检测的筛选试验。如要确诊，则需要进行普通ＲＴＰＣＲ试验并进行测序，或者其他相关试验完成。４．１．５．２．２荧光犚犜犘犆犚结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。４．１．５．２．３荧光犚犜犘犆犚质控标准阴性对照无Ｃｔ值并且无扩增曲线。阳性校准品应呈现出典型的阳性扩增曲线。如阴性对照和阳性校准品扩增曲线不满足以上条件，此次实验视为无效。４．１．５．２．４判定当样品的Ｃｔ值大于或等于４０，并且未出现扩增曲线，则判断为阴性。当样品的Ｃｔ值小于或等于３０时，同时出现典型的扩增曲线，则判断为阳性。当样品的Ｃｔ值大于３０而小于４０，并出现扩增曲线时，建议复检，复检后的Ｃｔ值仍然小于４０，并出现扩增曲线，可判断为阳性。若Ｃｔ值大于４０，则判断为阴性。４．１．５．３套式犚犜犘犆犚结果判定检测后，阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照在２４８ｂｐ出现扩增条带。如样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，则样品疑似阳性，通过对样品的ＰＣＲ产物进行测序４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１分析，证实与数据库公布的西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。如样品出现的条带大小与阳性对照接近，则实验需从ＲＮＡ提取开始重新进行，最终结果需通过测序最后判定。４．１．５．４结果描述以西尼罗病毒核酸阴性或核酸阳性对结果进行描述。４．２西尼罗病毒抗体捕捉犈犔犐犛犃检测４．２．１检测方法介绍可以对西尼罗病毒抗体进行检测。４．２．２设备、材料和试剂４．２．２．１酶标仪。４．２．２．２洗板机。４．２．２．３可调移液器。４．２．２．４包被缓冲液：０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，ｐＨ７，２，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。４．２．２．５稀释缓冲液或洗液（ＰＢＳＴ）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，ｐＨ７．２，含０．０５％Ｔｗｅｅｎ，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。４．２．２．６封闭缓冲液：以ＰＢＳＴ配制的５％脱脂奶粉溶液，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。４．２．２．７显色液：ＡＢＴＳ（３乙基苯并噻唑６磺酸），可以选择其他的底物。４．２．２．８ＩｇＭ抗体：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．２．２．９ＷＮＶ标准阳性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．２．２．１０ＷＮＶ标准阴性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．２．２．１１ＷＮＶ病毒或标准抗原：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．２．２．１２阴性对照抗原：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．２．２．１３ＨＲＰ标记的黄病毒或ＷＮＶ的单抗：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．２．３采样、送检和处理按４．１．３中有关血清采集的内容进行。４．２．４操作步骤４．２．４．１在ＥＬＩＳＡ反应９６板上包被经过稀释的ＩｇＭ抗体（稀释度依据生产商或方法建立方提供的建议而确定），１００μＬ／孔，在４℃湿盒中包被过夜。包被后的板可以存放数周。４．２．４．２以２００μＬ／孔～３００μＬ／孔的量，用ＰＢＳＴ洗板３次～５次。４．２．４．３加入封闭缓冲液，３７℃下孵育６０ｍｉｎ。重复４．２．４．２。４．２．４．４用ＰＢＳＴ稀释待检血清、ＷＮＶ阳性血清、ＷＮＶ阴性血清，稀释浓度依据方法和试剂盒可有差异。４．２．４．５将稀释完成的血清以５０μＬ／孔～１００μＬ／孔加入到包被好的板中，３７℃下作用１ｈ～１．５ｈ。每一样本应做复孔，共做４份复孔（在后面的步骤中，２孔加ＷＮＶ标准抗原，２孔加阴性对照抗原）。４．２．４．６重复４．２．４．２。４．２．４．７加入用ＰＢＳＴ稀释好的病毒抗原及阴性对照抗原，每孔的加样量与血清加样量等同。４．２．４．８４℃湿盒中反应过夜。４．２．４．９重复４．２．４．２。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１４．２．４．１０用ＰＢＳＴ稀释ＨＲＰ标记的黄病毒或ＷＮＶ单抗（稀释度依据生产商或方法建立方提供的建议而确定），加入板中，加液量与血清及病毒加液量一致，３７℃下作用１ｈ。４．２．４．１１重复４．２．４．２。４．２．４．１２每孔加入显色液，加液量与血清及病毒加液量一致，室温或３７℃下作用３０ｍｉｎ。４．２．４．１３加入１ｍｏｌ／Ｌ的硫酸终止反应。用酶标仪在４０５ｎｍ（根据底物）下测定ＯＤ值。４．２．５结果判定待检样品的ＯＤ值（加ＷＮＶ标准抗原）为阴性对照ＯＤ值的２倍或以上、并且为待检样品的ＯＤ值（加阴性对照抗原）的２倍或以上，判断为ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ阳性。可采用等效的试剂盒方法或其他建立的ＥＬＩＳＡ方法中的判定标准判定，但事先应经过验证实验。４．３蚀斑减少中和试验（犘犚犖）４．３．１方法介绍可以对西尼罗病毒抗体进行检测。４．３．２设备、材料和试剂４．３．２．１二氧化碳培养箱。４．３．２．２离心机。４．３．２．３可调移液器。４．３．２．４ｖｅｒｏ细胞。４．３．２．５ｖｅｒｏ细胞培养基：ＤＭＥＭ或ＭＥＭ培养基。４．３．２．６胎牛血清。４．３．２．７培养基添加用抗生素（终浓度青链霉素１００Ｕ／ｍＬ；链霉素１００μｇ／ｍＬ）。４．３．２．８无菌ＰＢＳ（无钙、镁离子）。４．３．２．９０．２５％胰酶ＥＤＴＡ。４．３．２．１０细胞维持液：ＭＥＭ培养基中添加４％的胎牛血清及双抗。４．３．２．１１ＷＮＶ标准毒株：用含１０％豚鼠补体的培养基稀释到工作浓度。４．３．２．１２ＷＮＶ阳性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．３．２．１３ＷＮＶ阴性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。４．３．２．１４２％琼脂：配制后高压待用。４．３．２．１５２×不含酚红的含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的ＭＥＭ维持液溶液。４．３．２．１６０．４５％碳酸氢钠。４．３．２．１７溶液Ⅰ：２×不含酚红的含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的ＭＥＭ溶液＋４％胎牛血清＋双抗。４．３．２．１８营养琼脂：等量预热的２％琼脂糖与溶液Ⅰ混合而成，实验开始前新鲜配制。４．３．２．１９０．５％中性红溶液：ｐＨ７．４，高压或过滤除菌。４．３．２．２０覆盖琼脂：营养琼脂＋中性红溶液（终浓度０．００３％）。４．３．３采样、送检和处理按４．１．３中有关血清采集的内容进行。４．３．４操作步骤４．３．４．１病毒培养见４．４．３在７０～８０％细胞出现ＣＰＥ后，反复冻融２次～３次，－８０℃备用。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１４．３．４．２蚀斑形成单位（犘犉犝）测定接种前用ＰＢＳ冲洗细胞，弃冲洗液，然后接种。用细胞维持液以１０倍量稀释病毒，共７个稀释度，接种于长满单层ｖｅｒｏ细胞的９６孔培养板上，每个稀释度接种８孔，１００μＬ／孔，对照组只加细胞维持液，在３７℃二氧化碳孵箱中吸附１ｈ～２ｈ，每１５ｍｉｎ摇动一次，弃病毒液，并用ＰＢＳ冲洗，弃液。以１００μＬ／孔加入营养琼脂于上述培养板中，３７℃二氧化碳培养箱中孵育３ｄ～４ｄ，再以１００μＬ／孔加入覆盖琼脂，１２ｈ～２４ｈ后观察细胞病变，计算ＰＦＵ（每毫升病毒原液的蚀斑数）。然后稀释１００ＰＦＵ／５０μＬ的病毒工作液，稀释液含１０％豚鼠补体。４．３．４．３蚀斑减少中和试验被检血清试验前在５６℃灭活３０ｍｉｎ。待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清用细胞维持液做倍量稀释，稀释后体积５０μＬ，加入等体积１００ＰＦＵ／５０μＬ的病毒悬液，混匀，３７℃作用１ｈ～１．５ｈ，然后将混合液接种到长满单层ｖｅｒｏ细胞的９６孔培养板上，１００μＬ／孔，每个稀释度接种５孔～８孔，于３７℃二氧化碳培养箱中作用１ｈ～２ｈ，弃液，加入营养琼脂１００μＬ／孔，３７℃二氧化碳培养箱中孵育３ｄ～４ｄ，再以１００μＬ／孔加入覆盖琼脂，１２ｈ～２４ｈ后观察细胞病变，计数蚀斑形成数量。４．３．５结果判定待检样本中和效价大于１∶１０，判定为阳性。４．４西尼罗病毒分离４．４．１方法介绍可以对西尼罗病原进行分离。再通过其他实验对病原进行进一步鉴别。４．４．２设备、材料和试剂４．４．２．１二氧化碳培养箱。４．４．２．２离心机。４．４．２．３可调移液器。４．４．２．４倒置显微镜。４．４．２．５均质机、匀浆器、超声裂解器。４．４．２．６细胞培养板。４．４．２．７滤器（０．４５μｍ）。４．４．２．８ｖｅｒｏ细胞。４．４．２．９ｖｅｒｏ细胞培养基：ＤＭＥＭ或ＭＥＭ培养基。４．４．２．１０胎牛血清。４．４．２．１１细胞维持液，培养基中添加３％的胎牛血清及双抗。４．４．２．１２培养基添加用双抗（终浓度青链霉素１００Ｕ／ｍＬ；链霉素１００μｇ／ｍＬ）。４．４．２．１３无菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２～ｐＨ７．４无钙、镁离子）。４．４．２．１４０．２５％胰酶ＥＤＴＡ。４．４．３采样、送检和处理按４．１．３中有关内容进行。７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１采集样本后，应在２４ｈ内送达实验室进行检测。为保证分离效果，储存时应尽量保持在－８０℃以下。在条件允许范围内尽可能保证在最低温度下运送样本。血液样本直接冻融２次～３次，用含１０％胎牛血清的ＰＢＳ稀释１０倍，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液用滤器过滤后备用。脑髓液样本用含１０％胎牛血清的ＰＢＳ稀释５倍～１０倍，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液用滤器过滤后备用。用于病毒分离的组织样本需在预处理时，在ＰＢＳ中加入１０％的胎牛血清，初步粉碎后，冻融几次，用超声裂解仪裂解，上清液离心过滤后备用。４．４．４操作步骤将处理好的样本０．１ｍＬ接种到形成良好单层的Ｖｅｒｏ细胞的细胞培养板中，每个样本接种４孔，放置于３７℃二氧化碳培养箱吸附１ｈ，去除干预的样本，加入细胞维持液，继续放入３７℃二氧化碳培养箱培养５ｄ，每日观察细胞病变（ＣＰＥ），详细记录。４．４．５结果判定若５ｄ内未出现细胞病变，则收取培养物盲传３代继续培养观察，仍未出现ＣＰＥ的样本，病毒分离判定为阴性。若出现典型的细胞病变，则进一步采用ＲＴＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ或蚀斑减少中和等试验进行鉴定。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１附录犃（资料性附录）西尼罗病毒犚犜犘犆犚、实时荧光犚犜犘犆犚、套式犘犆犚引物探针及反应体系表犃．１普通犚犜犘犆犚检测引物扩增片断大小引物ｂｐ正向引物（ＷＮＶＥＦ）：５’ＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＧＣ３’２１９反向引物（ＷＮＶＥＲ）：３’ＣＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧ５’表犃．２实时荧光犚犜犘犆犚检测引物探针扩增片断大小引物和探针序列ｂｐ正向引物（ＴＷＮＥＦ）：５’ＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴ３’反向引物（ＴＷＮＥＲ）：３’ＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧ５’６７犜犪狇ｍａｎ探针（ＴＷＮＥＰ）：５’ＦＴＧＣＣＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＰ３’表犃．３套式犚犜犘犆犚检测引物扩增片断大小引物ｂｐ第一步：正向引物：５’ＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＣ３’４４５反向引物：３’ＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴＴＣ５’第二步：正向引物：５’ＧＣＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＣＴＡＡＡＧ３’２４８反向引物：３’ＣＴＡＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＴＧＣＣＡ５’表犃．４犚犜犘犆犚反应体系加样量名称贮备液浓度终浓度μＬＲＴＰＣＲ缓冲液５×１×１０硫酸镁２５ｍｍｏｌ／Ｌ１ｍｍｏｌ／Ｌ２ｄＮＴＰｓ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ４正义引物５０μｍｏｌ／ｌ１μｍｏｌ／Ｌ１反义引物５０μｍｏｌ／ｌ１μｍｏｌ／Ｌ１逆转录酶５Ｕ／μＬ０．１Ｕ／μＬ１ＤＮＡ聚合酶５Ｕ／μＬ０．１Ｕ／μＬ１９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６８—２０１１表犃．４（续）加样量名称贮备液浓度终浓度μＬ模板——１０ＤＥＰＣ水——２０总体积——５０表犃．５实时荧光犚犜犘犆犚反应体系加样量名称贮备液浓度终浓度μＬＲＴＰＣＲ缓冲液５×１×１０硫酸镁２５ｍｍｏｌ／Ｌ１ｍｍｏｌ／Ｌ２ｄＮＴＰｓ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ４正义引物２５μｍｏｌ／Ｌ１μｍｏｌ／ｌ２反义引物２５μｍｏｌ／Ｌ１μｍｏｌ／Ｌ２逆转录酶５Ｕ／μＬ０．１Ｕ／μＬ１ＤＮＡ聚合酶５Ｕ／μＬ０．１Ｕ／μＬ１探针５μｍｏｌ／Ｌ０．１μｍｏｌ／Ｌ１模板——１０ＤＥＰＣ水——１７总体积——５０表犃．６套式犚犜犘犆犚反应体系浓度／５０μＬ（反应体系）第一步第二步１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ２．０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２２．０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２０．８ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．８ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２５ＵＭＭＬＶ逆转录酶１．２５Ｕ犜犪狇１．２５ＵＲＮａｓｅ抑制剂３７．５ｐｍｏｌ第二步正义引物１．２５Ｕ犜犪狇３７．５ｐｍｏｌ第二步反义引物３７．５ｐｍｏｌ第一步正义引物３７．５ｐｍｏｌ第一步反义引物样品加样量２μＬ样品加样量１．５μＬ（为第一步ＰＣＲ反应产物）１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２８６８２／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准西尼罗病毒病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８６８—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２１千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６６３定价１８．００元'