SNT1151.1-2011 虾桃拉综合征检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５１．１—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２虾桃拉综合征检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊犺狉犻犿狆狋犪狌狉犪狊狔狀犱狉狅犿犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１前言ＳＮ／Ｔ１１５１系列标准共分为六部分：———虾桃拉综合征检疫技术规范；———对虾白斑病检疫技术规范；———斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）诊断方法；———虾黄头病检疫技术规范；———对虾杆状病毒（ＢＰ）检验方法；———对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。本部分为ＳＮ／Ｔ１１５１的第１部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２《对虾Ｔａｕｒａ综合征病毒（ＴＳＶ）逆转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）诊断方法》。本部分与ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２相比，主要技术内容变化如下：———整合和优化ＲＴＰＣＲ检测方法；———新增ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测方法。本部分修改采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）第２．２．４章，并对虾桃拉综合征ＲＴＰＣＲ检测方法进行了整合和优化。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本部分主要起草人：熊炜、张强、刘荭、郑腾、蒋静、李健、邱璐、王巧全、黄忠荣、胡永强。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１虾桃拉综合征检疫技术规范１范围ＳＮ／Ｔ１１５１的本部分规定了虾桃拉综合征ＲＴＰＣＲ和ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测的操作方法。本部分适用于虾桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３概述桃拉综合征（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅ）是一种由桃拉综合征病毒（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＴＳＶ）感染而引起的严重威胁虾养殖的重要疫病，它是世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定的需上报的水生动物疫病。ＴＳＶ几乎能感染所有类型的养殖虾，如：南美白对虾、红额角对虾、褐对虾、白对虾、斑节对虾等，并感染孵化期的虾苗，其致死率高。ＴＳＶ感染有三个明显的阶段：急性期、过渡期和慢性期。在急性期，虾表皮上皮的组织切片中可以看到典型的病理损伤。而在过渡期和慢性期，却没有典型的病理损伤；虾发病死亡主要发生在急性期，急性感染后的幸存者在经过短暂的过渡期后，进入长时间的慢性感染期，处于慢性感染期的虾的淋巴器官终生持续有病毒存在，这些携带有病毒的虾可把病毒水平传播给其他易感虾。病毒学研究证实，ＴＳＶ是一种小的正二十面体无包膜病毒，直径３２ｎｍ，其基因组为单正链ＲＮＡ由１０２０５个核苷酸组成，含有两个大的开放阅读框（Ｏｐｅｎｒｅａｄｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），ＯＲＦ１编码非结构蛋白如解旋酶、蛋白酶和ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶等，ＯＲＦ２编码结构蛋白如衣壳蛋白ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３（其分子量大小分别为５５ｋＤａ、４０ｋＤａ、２４ｋＤａ）。４试剂和材料４．１犜犪狇酶及１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液：犜犪狇酶浓度为５Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．２逆转录酶及１０倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为５０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．３ＲＮＡ酶抑制剂：浓度为４０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．４ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．５ＲＴＰＣＲ引物：引物浓度均为２０μｍｏｌ／Ｌ；引物有两对，可任选其一使用；引物９９９２Ｆ和９１９５Ｒ为ＯＩＥ推荐引物，其扩增基因片段的大小为２３１ｂｐ，引物ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增的基因片段大小为２９５ｂｐ，其序列如下：上游引物（９９９２Ｆ）：５’ＡＡＧＴＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴ３’下游引物（９１９５Ｒ）：５’ＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ３’上游引物（ＴＳＶＦ）：５’ＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＣ３’下游引物（ＴＳＶＲ）：５’ＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＡＧＧＧＧＡＧ３’１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１４．６ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ引物和探针：引物ＴＳＶ１００４Ｆ、ＴＳＶ１０７５Ｒ和探针ＴＳＶＰ１为ＯＩＥ推荐引物和探针，引物浓度为１５μｍｏｌ／Ｌ，探针浓度为５μｍｏｌ／Ｌ，其序列如下：上游引物（ＴＳＶ１００４Ｆ）：５’ＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＡＴＴ３’下游引物（ＴＳＶ１０７５Ｒ）：５’ＧＧＧＡＧＣＴＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＴ３’ＴａｑＭａｎ探针（ＴＳＶＰ１）：５’ＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣ３’，其５’端和３’端分别标记ＦＡＭ和ＴＡＭＲＡ。４．７随机引物：含有９个碱基的随机序列引物，浓度为５０μｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．８ＤＮＡ相对分子质量标准：适合检测分子量大小５０ｂｐ～５００ｂｐ间的ＤＮＡ片段，－２０℃保存。４．９１０倍电泳上样缓冲液：４℃保存。４．１０ＤＥＰＣ水：自配（见Ａ．１）或购买商品化试剂。４．１１ＥＢ溶液：４℃保存（见Ａ．２）。４．１２Ｔｒｉｚｏｌ试剂：４℃保存。４．１３三氯甲烷：常温保存。４．１４异丙醇：使用前预冷至－２０℃。４．１５７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，使用前预冷至－２０℃。５仪器与设备５．１ＰＣＲ仪：ＡＢＩ９７００或相同性能ＰＣＲ仪。５．２荧光ＰＣＲ检测仪：ＡＢＩ７７００、ＡＢＩ７５００或相同性能荧光ＰＣＲ检测仪。５．３高速台式冷冻离心机：可控温至４℃、离心速度可达１３０００犵以上。６临床症状的诊断虾桃拉综合征的病程有三个明显的阶段：急性期、过渡期和慢性期。在急性期和过渡期，虾表现出独特的外部症状，可据此对该疾病作出初步诊断。在急性期和过渡期，濒死虾体表出现大量的红色色素体，使感染虾全身呈暗淡的红色，而尾扇和游泳足呈明显的红色，用１０倍放大镜观察细小附肢（如末端尾肢或腹肢）的表皮上皮，可以看到病灶处的上皮坏死。濒死虾常漂浮在池塘边或水面，虾壳变软、空肠。急性感染的虾通常在蜕皮时死亡。在过渡期及后期，受感染虾可出现多处随机、不规则、黑色沉着的表皮病灶，这些黑色沉着的斑点是由血细胞累积而成的，该阶段虾可能不会出现表皮变软及红色素扩散，行为和摄食可能会保持正常。成功蜕皮后，病虾从过渡期发展到慢性期。在慢性期，虾几乎没有明显的体症，行为和摄食正常，但病毒在淋巴器官中保持持续感染，可能会终生带毒，可把病毒水平传播给其他易感虾。处于慢性期的虾对正常环境刺激的抵抗力要低于未被感染的虾（如：盐度突然降低）。７采样和样品前处理７．１采样出境检疫采样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池）进行，采样数量根据ＧＢ／Ｔ１８０８８确定。采集送实验室检测的样品可以为稚虾、半成虾和成虾。采集的样品应保持鲜活，０℃～４℃冷藏保存。２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１７．２样品前处理７．２．１随机取５只～１０只新鲜的成虾作为取样标本，采集的部位包括：虾头部的鳃丝、肝胰腺、淋巴器官或血淋巴等组织（可部分或全部采集这些组织）。对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作为样品。７．２．２取鳃丝时，用灭菌过的剪刀去除头部两侧的头胸甲，露出鳃丝，然后用剪刀剪取鳃丝。７．２．３取肝胰腺时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，露出内部的组织器官，其中深褐色的组织为肝胰腺，用剪刀剪取整块肝胰腺组织。７．２．４取淋巴器官时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，暴露出内部的组织器官，在胃的腹侧、肝胰腺的后面，取出白色、呈二裂片状的淋巴器官。７．２．５取血淋巴时，先用１ｍＬ医用注射器吸取５００μＬ柠檬酸盐溶液（见Ａ．３），然后使虾腹部朝上，将针头水平插入正数第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处，然后缓慢吸取血淋巴。７．２．６将采集的样品，按每克样品加入１ｍＬＴＮ缓冲液（见Ａ．４），然后用玻璃匀浆器将样品匀浆。将匀浆液转移至１．５ｍＬ离心管中，４℃、２０００犵离心５ｍｉｎ，吸取上清液备用。７．３阳性对照样品和阴性对照样品的处理鲜活阳性对照样品和阴性对照样品的采样和样品前处理同待检样品，将鲜活样品中取出的组织样品分装后于－７０℃超低温冰箱保存备用。实验前将冷冻组织样品取出，然后按７．２．６进行样品前处理。８犚犖犃抽提及犮犇犖犃模板制备８．１犚犖犃抽提分别取１００μＬ待检样品匀浆上清液，以及ＴＳＶ阳性样品和阴性样品的上清液，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ试剂，用枪头充分吹打２０次～３０次；加入２００μＬ三氯甲烷，涡旋振荡３０ｓ，混匀；１３０００犵离心１５ｍｉｎ；取上层水相，加５００μＬ异丙醇，上下颠倒数次混匀，－２０℃放置２０ｍｉｎ；１３０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，沉淀用１ｍＬＤＥＰＣ水配制的７５％乙醇清洗；８０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，沉淀室温干燥１０ｍｉｎ；加３０μＬＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ沉淀。ＲＮＡ溶液应尽快用于逆转录合成ｃＤＮＡ模板。商品化ＲＮＡ提取试剂盒同样适用于本标准的ＲＮＡ抽提。８．２犮犇犖犃模板制备取１８．５μＬＲＮＡ溶液，加１０倍逆转录酶浓缩缓冲液２．５μＬ、ｄＮＴＰ１μＬ、随机引物（或待扩增引物对的下游引物）１μＬ、ＲＮＡ酶抑制剂１μＬ、逆转录酶１μＬ。混匀后，置ＰＣＲ仪上经４２℃４０ｍｉｎ、７０℃１０ｍｉｎ，即得ｃＤＮＡ模板。如果暂时不进行检测可将ｃＤＮＡ模板保存至冰箱－２０℃。９犚犜犘犆犚检测及结果判定９．１犘犆犚检测体系配制在０．２ｍＬＰＣＲ薄壁管或八联管中，按每个样品１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液２．５μＬ、ｄＮＴＰ０．５μＬ、犜犪狇酶０．５μＬ、ｃＤＮＡ模板２μＬ、上游引物和下游引物（９９９２Ｆ和９１９５Ｒ，或ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ）各０．５μＬ、三蒸水１８．５μＬ配制ＰＣＲ检测体系。阳性和阴性对照样品的检测体系同样配制。３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１９．２犘犆犚检测的反应条件首先９４℃变性２ｍｉｎ，再９４℃３０ｓ、５８℃３０ｓ、７２℃３０ｓ进行４０个循环；然后７２℃５ｍｉｎ；最后２５℃５ｓ。９．３琼脂糖凝胶电泳用０．５倍ＴＢＥ电泳缓冲液配制浓度为１．５％的琼脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）凝胶平板，将该凝胶平板放入水平电泳槽，使缓冲液刚好没过胶面，电泳缓冲液工作浓度为０．５倍ＴＢＥ（见Ａ．５）。在９μＬＰＣＲ产物中加入１μＬ１０倍电泳上样缓冲液，然后加至凝胶平板的样品孔，同时设定ＤＮＡ相对分子质量标准对照。１００Ｖ电压电泳约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达凝胶平板底部时停止电泳。用凝胶成像系统观察并拍摄凝胶图像。９．４检测结果判定９．４．１ＴＳＶ阳性对照的ＰＣＲ产物应扩增出单一条带２３１ｂｐ（经引物对９９９２Ｆ和９１９５Ｒ扩增）或２９５ｂｐ（经引物对ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增）的ＤＮＡ片段，阴性对照不出现该大小ＤＮＡ片段，否则此次试验无效。９．４．２若检测样品的ＰＣＲ产物出现２３１ｂｐ（经引物对９９９２Ｆ和９１９５Ｒ扩增）或２９５ｂｐ（经引物对ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增）的ＤＮＡ片段，则判定桃拉综合征病毒核酸阳性。９．４．３若检测样品的ＰＣＲ产物不出现２３１ｂｐ（经引物对９９９２Ｆ和９１９５Ｒ扩增）或２９５ｂｐ（经引物对ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增）的ＤＮＡ片段，则判定桃拉综合征病毒核酸阴性。１０犚犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚检测及结果判定１０．１犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚检测体系配制在０．２ｍＬＰＣＲ薄壁管或八联管中，按每个样品１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液２．５μＬ、ｄＮＴＰ０．５μＬ、犜犪狇酶０．５μＬ、ｃＤＮＡ模板２μＬ、上游引物和下游引物（ＴＳＶ１００４Ｆ和ＴＳＶ１０７５Ｒ）各０．５μＬ、ＴａｑＭａｎ探针（ＴＳＶＰ１）０．５μＬ、三蒸水１８μＬ配制ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测体系。同时，设置不含ｃＤＮＡ模板的空白对照、ＴＳＶ阳性对照和阴性对照。１０．２犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚检测的反应条件首先９５℃变性２ｍｉｎ；再９５℃１５ｓ、６０℃１ｍｉｎ进行４０个循环，并在该过程的第二步收集荧光信号。１０．３检测结果判定１０．３．１空白对照、ＴＳＶ阳性对照和阴性对照，其扩增曲线应满足如下条件：———空白对照和阴性对照Ｃｔ值＞３８；———阳性对照出现典型的阳性扩增曲线，且Ｃｔ值≤３５。否则此次实验视为无效。１０．３．２若检测样品的Ｃｔ值＞３８，则判定桃拉综合征病毒核酸阴性。１０．３．３若检测样品的Ｃｔ值≤３５，且出现典型扩增曲线，则判定桃拉综合征病毒核酸阳性。１０．３．４若检测样品的３５＜Ｃｔ值≤３８，或虽然Ｃｔ值≤３５但扩增曲线不显著，则应对样品进行复检；若复检后，Ｃｔ值≤３８则判定桃拉综合征病毒核酸阳性；若复检后，Ｃｔ值＞３８则判定桃拉综合征病毒核酸阴性。４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１１１综合判定１１．１临床症状只能作为初步诊断的参考，应进一步采用ＲＴＰＣＲ方法或其他方法进行确诊。１１．２对ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测阳性的样品，应进一步采用ＲＴＰＣＲ方法或其他方法进行确诊。１１．３经ＲＴＰＣＲ检测扩增出的目的大小ＤＮＡ片段，应通过核酸序列测定，并与标准参考序列（参见附录Ｂ）比对进行确诊。５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１附录犃（规范性附录）试剂配制犃．１犇犈犘犆水每升三蒸水中加入１ｍＬＤＥＰＣ，用力摇匀，使ＤＥＰＣ充分混匀在水中，３７℃放置１２ｈ，再经１２１℃１５ｍｉｎ高压灭菌备用。犃．２犈犅溶液称取溴化乙锭（ＥＢ）粉末，用蒸馏水配制成浓度为１０ｍｇ／ｍＬ的ＥＢ溶液，４℃保存备用。使用时，每１００ｍＬ琼脂糖凝胶溶液中，加入５μＬＥＢ溶液。犃．３１０％柠檬酸盐溶液１０ｇ柠檬酸钠加９０ｍＬ蒸馏水溶解，于容量瓶中定容至１００ｍＬ，经１２１℃１５ｍｉｎ高压灭菌后备用。犃．４犜犖缓冲液每升蒸馏水中加入Ｔｒｉｓ碱２．４２ｇ、氯化钠２３．３８ｇ，用盐酸调ｐＨ值至７．４，经１２１℃１５ｍｉｎ高压灭菌后备用。犃．５犜犅犈电泳缓冲液首先每升蒸馏水中加入Ｔｒｉｓ碱５４ｇ、硼酸２７．５ｇ、ＥＤＴＡ２．９ｇ，用５．０ｍｏｌ／Ｌ的盐酸调ｐＨ值至８．０，配制５倍ＴＢＥ电泳缓冲浓缩液作为储备液。再将该储备液用蒸馏水进行１０倍稀释，制备成工作浓度０．５倍的ＴＢＥ电泳缓冲液备用。６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．１—２０１１附录犅（资料性附录）犚犜犘犆犚扩增的虾桃拉综合征病毒核酸片段序列犅．１引物９９９２犉和９１９５犚扩增的基因序列ＡＡＧＴＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＣＣＣＡＡＴＣＡＣＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＧＴＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＧＡ犅．２引物犜犛犞犉和犜犛犞犚扩增的基因序列ＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＡＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴＡＴＣＧＣＡＣＣＣＴＡＴＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴＣＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＴＴＧＧＴＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＡＡＧＡＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＡＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＴＴＣ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２１１５１１／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准虾桃拉综合征检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１５千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６２３定价１６．００元'