SNT1142-2011 马病毒性动脉炎检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１４２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２，ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４马病毒性动脉炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲狏犻狉犪犾犪狉狋犲狉犻狋犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４《从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２《马病毒性动脉炎微量血清中和试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２和ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４相比，主要的技术变化如下：———增加了血液、组织中的病毒分离；———增加了酶联免疫吸附试验方法；———增加了荧光ＲＴＰＣＲ试验方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、郑小龙、李西峰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２；———ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１马病毒性动脉炎检疫技术规范１范围本标准规定了马病毒性动脉炎的病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和荧光ＲＴＰＣＲ试验等方法。本标准适用于进出境马属动物病毒性动脉炎的诊断和检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９—２００８实验室生物安全通用要求３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＲＫ１３：兔肾细胞ＰＢＳ：磷酸盐缓冲生理盐水ＣＰＥ：细胞病变反应ＥＡＶ：马病毒性动脉炎病毒ＴＣＩＤ５０：半数组织感染量ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ：荧光反转录聚合酶链式反应４临床诊断４．１临床特征发病马的临床症状表现不一，一般为发热，精神沉郁，食欲不振，流鼻液，流泪，结膜炎，眼睑水肿，颔下淋巴结肿大，白细胞减少，四肢特别是后肢下端水肿，雄马阴囊及包皮肿胀，妊娠马流产。老龄雌马和营养状况差的马临床症状较重，妊娠马比空怀雌马症状明显。如果妊娠马群发生ＥＡＶ流行，流产率可高达４０％～５９％。４．２判定根据４．１临床检查可作出初步判定，确诊需进行实验室检测。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１５病毒分离鉴定５．１仪器设备超净工作台或生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、蔡氏滤器和微孔滤膜（０．２２）、高压灭菌锅、离心机、超声波破碎仪、微量细胞培养板（９６孔）、微型振荡器、微量可调移液器μｍ（２００）、电子天平、细胞瓶和吸管（１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ）等。μＬ５．２试剂与材料ＭＥＭ培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、１％细胞染色液、７．５％羧甲基纤维素、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）、兔肾细胞（ＲＫ１３）、马病毒性动脉炎病毒（ＥＡＶ）标准病毒株（Ｂｕｃｙｒｕｓ株）和各种常规试剂等，试剂配制见附录Ａ。５．３样品采集与处理５．３．１样品采集与运送无菌采集动物抗凝全血（不宜用肝素作抗凝剂），死胎或活产马驹的脑、心、肺、肝、肾、脾和淋巴结等组织，公马可采集精液。采集的样品应立即放入冰盒中，尽快运送到实验室。如果不能及时送往实验室，组织样品冷冻于－２０℃以下保存（抗凝全血样品４℃保存）。５．３．２样品处理５．３．２．１全血样品的处理：取抗凝血加入２倍～３倍体积红细胞裂解液，混匀静止４ｍｉｎ～５ｍｉｎ，待红细胞完全破碎，１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液除去破碎的红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤，直到红细胞除尽）。加入ＰＢＳ缓冲液，制成白细胞悬液，反复冻融两次，低温（－２０℃）保存备用。５．３．２．２动物组织样品的处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌容器内，加入少量维持液，用灭菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加培养液，制成终浓度为１０％的组织悬液。以２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收取上清液低温（－２０℃）保存备用。５．３．２．３动物精液的处理：将精液超声波裂解三次（３００ｗ），每次１５ｓ；然后在４℃下２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀精子细胞，取上清液低温（－２０℃）保存备用。５．４病毒分离５．４．１将上述上清液或细胞悬液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的ＲＫ１３细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液作细胞对照，用６０倍稀释的标准病毒接种作阳性对照。５．４．２加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于５％二氧化碳培养箱中３７℃吸附１ｈ。５．４．３加入含０．７５％羧甲基纤维素的培养液，置于５％二氧化碳培养箱中３７℃继续培养，每日在显微镜下观察细胞病变（ＣＰＥ）情况（细胞圆缩、脱离、裂解）。５．４．４如果不出现ＣＰＥ，应盲传２代～３代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养５ｄ～７ｄ后，用细胞染色液（工作液为０．１％福尔马林缓冲结晶紫溶液）染色。观察细胞单层是否细胞壁不完整的死细胞区域。５．５结果判定检查各种对照试验，细胞对照正常，无ＣＰＥ；阳性对照出现明显的ＣＰＥ，说明试验成立。如果试验２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１组出现明显的ＣＰＥ，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则判为病毒分离阳性；如果没有明显的ＣＰＥ，结晶紫染色后，细胞单层出现细胞壁不完整的死细胞区域，也判为病毒分离阳性。５．６病毒鉴定用微量血清中和试验和荧光ＲＴＰＣＲ方法对分离的病毒进行鉴定。６微量血清中和试验６．１仪器设备生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、高压灭菌锅、微量细胞培养板、微型振荡器、吸管（１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ）等。６．２试剂与材料细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等（试剂配制见附录Ａ），标准阳性血清、阴性血清和被检血清经灭活备用（马血清５６℃灭活３０ｍｉｎ，驴、骡血清６０℃灭活３０ｍｉｎ），ＲＫ１３细胞和马病毒性动脉炎病毒（ＥＡＶ）Ｂｕｃｙｒｕｓ株或其他参考毒株。６．３操作方法６．３．１中和病毒滴度（犜犆犐犇５０）测定６．３．１．１中和病毒制备：将保存于液氮中的标准种毒ＥＡＶＢｕｃｙｒｕｓ株取出置于４℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液作６０倍稀释后，取１ｍＬ接种于长成单层ＲＫ１３细胞的细胞瓶中，３７℃吸附１ｈ。然后，先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于３７℃愠温箱中培养３６ｈ～４８ｈ，当５０％～７５％细胞出现ＣＰＥ，即可收获病毒培养液，分装成１ｍＬ后冻存（－７０℃以下）备用。６．３．１．２病毒滴度测定：在微量细胞培养板（９６孔）每孔加２５μＬ细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作１０－１，１０－２……１０－８系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔２５μＬ。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加２５μＬ病毒稀释液。每孔１００μＬＲＫ１３细胞（５×１０４／１００），置３７℃培养，４８ｈ后μＬ初判，７２ｈ终判。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现ＣＰＥ（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验数据。根据Ｋａｒｂｅｒ法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量ＴＣＩＤ５０）。６．３．２微量中和试验６．３．２．１在９６孔细胞培养板上每孔加２５μＬ细胞培养液。第一列四孔作被检血清（毒性）对照，每孔加２５μＬ被检血清，用移液器混匀后弃２５μＬ；第二列四孔，每孔加２５μＬ被检血清，混匀后吸出２５μＬ至第三孔，依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为１∶２、１∶４和１∶８，每一稀释度各四孔。６．３．２．２用病毒稀释液将病毒稀释成工作浓度２００ＴＣＩＤ５０，第一列四孔加病毒稀释液（无病毒）作被检血清（毒性）对照，第二至四列的各孔加２５μＬ稀释的病毒。盖上培养板，轻轻摇匀，放入５％二氧化碳保湿培养箱３７℃孵育１ｈ。阴、阳性血清对照（方法同上）。－１、１０－２、１０－３稀释，再加２５μＬ病毒稀释６．３．２．３病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作１０液，每一稀释度各四孔。正常细胞对照，留四孔至八孔，每孔仅加２５μＬ的病毒稀释液，不加血清和病毒。上述每孔加１００μＬＲＫ１３细胞，细胞浓度为（５×１０４／１００）。放入５％二氧化碳培养箱３７℃培μＬ养，４８ｈ用倒置显微镜进行初步判定，７２ｈ后最终判定结果。６．４结果判定６．４．１检查各种对照试验，细胞对照正常，无ＣＰＥ；阴性血清出现明显的ＣＰＥ，表现为细胞圆缩、脱落、３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１裂解：阳性血清无ＣＰＥ，细胞不出现病变。病毒滴度验证时滴度与原测定滴度相差应在０．３１ｏｇ１０范围内，说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。被检血清对照孔不出现病变，说明被检血清无毒性反应。６．４．２在各种对照成立的情况下，检查各个被检血清的ＣＰＥ。如果出现ＣＰＥ比例大于５０％，则判为阴性孔；如果ＣＰＥ比例少于５０％或不出现ＣＰＥ，则判为阳性孔。以中和病毒感染性５０％以上的最大稀释度为该血清的中和抗体效价。６．４．３被检血清孔１∶４为阴性，判该动物为血清学阴性。被检血清１∶４或更高稀释度的孔为阳性，判该动物为血清学阳性。被检血清孔１∶２为阳性，或１∶４孔出现的ＣＰＥ不完全抑制（２５％≤ＣＰＥ≤５０％）时，均判为可疑。出现可疑情况时，应对可疑血清重试一次，最终判定结果以重试为准。如果两次试验均为可疑反应，则该动物视为血清学阳性动物处理。７酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）７．１仪器设备酶标仪、９６孔酶标板、单孔道和多孔道可调微量移液器（１μＬ、５０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）、振荡培养箱等。７．２试剂与材料抗原、标准阳性血清、阴性血清、被检血清、ＰＢＳ、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、Ｈ２Ｏ２和酶标二抗等，试剂配制见附录Ｂ。７．３操作方法７．３．１按照包被抗原所附说明书要求，用包被缓冲液稀释抗原，包被９６孔酶标板，每孔１００μＬ，置４℃过夜。７．３．２倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（ＰＢＳＴ），静置１ｍｉｎ～２ｍｉｎ后倒掉，吸干，重复洗五次。７．３．３加入封闭液，每孔１００μＬ，置３７℃振荡孵育９０ｍｉｎ，按７．３．２洗涤。置４℃冰箱备用。７．３．４被检血清用稀释液１∶２５稀释，每份血清加两孔，每孔１００μＬ，每板均设标准阴、阳性血清（不需稀释）及稀释液对照各两孔，每孔１００μＬ。加样完毕后放３７℃振荡培养箱作用１８ｈ～２４ｈ。７．３．５按７．３．２洗涤。７．３．６每孔加入用稀释液稀释至工作浓度的酶标二抗１００μＬ，置３７℃培养箱作用３０ｍｉｎ，按７．３．２洗涤。７．３．７每孔加入底物溶液１００μＬ，置室温避光反应５ｍｉｎ，从加第一孔开始计时。７．３．８每孔加终止液１００μＬ。在３０ｍｉｎ内测定ＯＤ值。７．４结果判定判定标准：用酶标仪在波长４５０ｎｍ下测定ＯＤ值。当阳性对照ＯＤ值≥０．５，阴性对照ＯＤ值＜０．２，试验成立，否则试验不成立，应重做。当样品ＯＤ值－阴性对照ＯＤ值＞０．２２，判为阳性。当样品ＯＤ值－阴性对照ＯＤ值＜０．１８，判为阴性。当０．１８＜样品ＯＤ值－阴性对照ＯＤ值＜０．２２之间时，判为可疑，应重复试验，若仍为可疑，则判为阳性。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１８荧光犚犜犘犆犚检测方法８．１仪器设备荧光ＰＣＲ检测仪、高速台式冷冻离心机、台式离心机、混匀器、冰箱（２℃～８℃和－２０℃两种）、微量可调移液器（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）及配套吸头、离心管（１．５ｍＬ）。８．２试剂与材料裂解液、三氯甲烷、异丙醇（－２０℃预冷）、７５％乙醇、ＤＥＰＣ水、引物、犜犪狇ＭａｎｏｎｅｓｔｅｐＲＴＰＣＲＭｉｘＲｅａｇｅｎｔｓ试剂盒等（参见附录Ｃ）。除特别说明外，所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无ＲＮＡ酶污染的容器（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌）分装。８．３操作方法８．３．１样品处理参考５．３．２。８．３．２样本ＲＮＡ的提取（按下述方法进行或采用等效的其他ＲＮＡ提取试剂与方法进行）。８．３．２．１取狀个（狀＝样本数＋１管阴性对照＋１管阳性对照）１．５ｍＬ灭菌离心管，作好标记。８．３．２．２加入６００μＬ裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各２００μＬ（每份样本换一个吸头），再加入２００μＬ三氯甲烷，混匀器上振荡混匀５ｓ（不宜过于强烈，以免产生乳化层；也可用手颠倒混匀）。于４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。８．３．２．３另外取狀个１．５ｍＬ灭菌离心管，加入４００μＬ异丙醇（－２０℃预冷）作好标记。吸取上步骤各管中的上清液至少５００μＬ（注意不要吸出中间层），加到相应的管中，颠倒混匀。于１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，轻倒去上清液；然后将离心管倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸的不同地方沾干）：加入６００μＬ７５％乙醇，颠倒洗涤。８．３．２．４于１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，轻轻倒去上清液；然后将离心管倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，不同样品应在吸水纸的不同地方沾干。８．３．２．５４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｓ，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干。每份样本换一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀的一面。室温干燥３ｍｉｎ（不宜过于干燥，以免ＲＮＡ不溶）。８．３．２．６加入２０μＬＤＥＰＣ水，轻轻混匀，溶解管壁上的ＲＮＡ。２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ，在冰上保存备用（注意：此时的ＲＮＡ最易受ＲＮＡ酶降解，请在２ｈ内进行ＰＣＲ扩增，若长期保存应放置在－７０℃）。８．３．３检测８．３．３．１扩增试剂的准备与加样从试剂盒中取出相应的各种试剂，在室温下融化后，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ。每个样品测试反应体系配制见表１。表１荧光犚犜犘犆犚反应体系试剂用量２×ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１５μＬ４０×ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．７５μＬ５ｐｍｏｌ／μＬ引物各４．０μＬ５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１表１（续）试剂用量１０ｐｍｏｌ／μＬ探针０．５μＬＲＮＡ模板１μＬＤＥＰＣ水４．７５μＬ合计３０μＬ将上述扩增试剂加入到９６孔反应板中，盖紧管盖，２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ。８．３．３．２荧光犚犜犘犆犚检测将加好样的９６孔反应板放入定量ＰＣＲ仪中，记录样本摆放顺序。循环条件设置：第一阶段：４８℃３０ｍｉｎ；第二阶段：９５℃１０ｍｉｎ；第三阶段：９５℃１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ，４０个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ｃｔ值判定结果。８．４结果判定８．４．１结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。８．４．２质控标准８．４．２．１阴性对照无Ｃｔ值并且无扩增曲线。８．４．２．２阳性对照的Ｃｔ值应≤３２，并且出现特定的扩增曲线。８．４．２．３如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。８．４．３结果描述及判定８．４．３．１阴性无Ｃｔ值并且无扩增曲线，表明样品中无动脉炎病毒。８．４．３．２阳性Ｃｔ值≤３２，且出现典型的扩增曲线，表明样品中存在动脉炎病毒。８．４．３．３有效原则Ｃｔ值＞３２的样本建议重做。重做结果无Ｃｔ值为阴性，否则为阳性。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１附录犃（规范性附录）病毒分离和微量血清中和试验试剂的配制犃．１抗生素贮存液用灭菌三蒸水配成每毫升含１００００ＩＵ青霉素和１０ｍｇ链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜（０．２２）过滤除菌，分装成２ｍＬ／瓶，－２０℃冻存备用。保存期不超过６０ｄ。μｍ犃．２红细胞裂解液（犜狉犻狊犖犎４犆犾）称取３．７３５ｇ氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）１．３ｇ加水溶解并定容至５００ｍＬ。０．２２μｍ滤膜过滤除菌，４℃保存备用。犃．３细胞消化液（０．０２％犈犇犜犃）ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸二钠）０．２ｇＮａＣｌ８．０ｇＫＣｌ０．２ｇＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ１．４５ｇＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ加三蒸水至１０００ｍＬ，充分溶解，分装成小瓶，１１５℃高压灭菌１０ｍｉｎ，４℃冷藏备用。保存期不超过９０ｄ。犃．４细胞培养液和细胞维持液细胞培养液：含１０％灭能的无菌胎牛血清（ＦＢＳ）的ＥＭＥＭ培养基。细胞维持液：含２％灭能的无菌胎牛血清（ＦＢＳ）的ＥＭＥＭ培养基。细胞培养液和细胞维持液均用微孔滤膜（０．２２μｍ）过滤除菌，分装成小瓶，４℃保存备用。保存期不超过６０ｄ。使用时加１％抗生素贮存液（终浓度为每毫升ＥＭＥＭ培养基含１００ＩＵ和１００μｇ），并用７．５％碳酸氢钠溶液调ｐＨ值至７．０～７．２。犃．５５％结晶紫贮存液２５ｇ结晶紫粉溶解于４７５ｍＬ纯乙醇，再定容至５００ｍＬ，过滤除去结晶。犃．６１％细胞染色液５％结晶紫贮存液１００ｍＬ、生理盐水（０．８５％氯化钠）３７５ｍＬ、福尔马林（含４０％甲醛）２５ｍＬ混匀，分装成５ｍＬ一瓶，４℃保存备用。保存期不超过９０ｄ。７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１犃．７７．５％羧甲基纤维素羧甲基纤维素粉７．５ｇ溶解于１００ｍＬ双蒸水，充分搅拌混匀，１２１℃高压１５ｍｉｎ，分装成５ｍＬ一瓶，４℃保存备用。保存期不超过３０ｄ。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１附录犅（规范性附录）犈犔犐犛犃试验试剂的配制犅．１包被缓冲液ＮａＨＣＯ３１．４６ｇＮａ２ＣＯ３０．９７ｇＨ２Ｏ５００ｍＬ溶解后置于４℃冰箱。犅．２磷酸盐缓冲液（犘犅犛）Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ２．９０ｇＫＨ２ＰＯ４０．２ｇＮａＣｌ８．０ｇＫＣｌ０．２ｇ先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至１０００ｍＬ，ｐＨ为７．４。犅．３洗涤液（犘犅犛犜）ＰＢＳ１０００ｍＬ，吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬ，混匀。犅．４封闭液ＰＢＳ１０００ｍＬ，加５ｍＬ鸡血清和５ｇ脱脂奶粉，溶解混匀。犅．５底物溶液犅．５．１称取柠檬酸（Ｃ５Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ）１０．５ｇ，先加适量的双蒸水，完全溶解后加入双蒸水定容至１０００ｍＬ，配成０．０５ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸溶液。犅．５．２称取１０ｍｇ３，３’５，５’四甲基联苯胺（ＴＭＢ）溶于２ｍＬＤＭＳＯ中，取２００μＬ溶液加入到１０ｍＬ０．０５ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓冲液（ｐＨ５．０）中，用前再加入２μＬ３０％（体积分数）Ｈ２Ｏ２，即成底物溶液。犅．６终止液：２犿狅犾／犔硫酸浓硫酸２２．２ｍＬ水１７７．８ｍＬ９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１附录犆（资料性附录）荧光犚犜犘犆犚试剂犆．１犜犪狇犕犪狀狅狀犲狊狋犲狆犚犜犘犆犚犕犻狓犚犲犪犵犲狀狋狊试剂盒组成２×ＭａｓｔｅｒＭｉｘ４０×ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ犆．２引物Ｐ１：５’ＡＴＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＴＡ３’Ｐ２：５’ＣＣＡＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＴ３’犆．３探针双标记探针的５’端标记报告基因ＦＡＭ（羧基荧光素），３’端标记淬灭基团ＴＡＭＲＡ（羧基四甲基罗丹明），其序列为：５’ＦＡＭＴＡＡＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＣＴＡＭＲＡ３’。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２２４１１／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马病毒性动脉炎检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１４２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２１千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６２２定价１８．００元'