SNT1086-2011 牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１０８６—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１０８６—２００２牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫狅狏犻狀犲犵犲狀犻狋犪犾犮犪犿狆狔犾狅犫犪犮狋犲狉犻狅狊犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１０８６—２００２《胎儿弯杆菌的分离鉴定方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１０８６—２００２相比，主要技术变化如下：———修改了标准名称；———增加了间接荧光抗体检测方法和ＰＣＲ检测方法。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》（２００９版）（ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ２００９）第２．４．５章内容。主要修改如下：———本标准采用了ＯＩＥ规定的病原分离鉴定方法、间接荧光抗体检测方法、ＰＣＲ检测方法；———本标准删除了ＯＩＥ中提到ＥＬＩＳＡ方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：侯艳梅、郭福生、秦贞奎、霍蕾、栾慎顺。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１０８６—２００２。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范１范围本标准规定了牛生殖道弯曲杆菌病的检疫技术要求。本标准适用于牛生殖道弯曲杆菌病病原的分离鉴定，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３缩略语ＴＥＭ：增菌运输培养基ＣＨ：半胱氨酸牛心浸膏培养基ＭＨ：ＭｕｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎ琼脂培养基４设备和材料４．１混合气体（质量比为３．５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８６．５％Ｎ２）。４．２厌氧培养罐。４．３采样棒及吸球。４．４凝胶成像系统。５培养基和试剂见附录Ａ。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求。６病原分离与鉴定６．１样品采集６．１．１公牛包皮垢及精液消毒清洗公牛尿道口后，将采样棒的采样端插入阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液，取出采样棒迅速插入盛有３ｍＬＰＢＳ液的小瓶中吹吸数次后，立即封口。包皮冲洗时，用２０ｍＬ～３０ｍＬＰＢＳ液注入包皮囊内，用力摩擦１５ｓ～２０ｓ后，将注入液体收集到无菌瓶内，立即封口；包皮垢亦可在采精后从假阴道中收集，即用２０ｍＬ～３０ｍＬＰＢＳ液冲洗假阴道获得。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１精液应在无菌条件下采集，采集的精液装入无菌瓶内，立即封口。６．１．２母牛阴道粘液消毒清洗阴门区后，将采样棒的采样端插入阴道，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取阴道粘液，取出采样棒迅速插入盛有３ｍＬＰＢＳ液的小瓶中吹吸数次后，立即封口；也可用无菌注射器连接一根无菌导管将２０ｍＬ～３０ｍＬＰＢＳ液注入阴道腔内，来回抽动冲洗４次～５次，然后将液体收集到无菌瓶内，立即封口；阴道腔冲洗液亦可采用将无菌ＰＢＳ液注入阴道腔内５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ后塞入无菌纱布块吸取的方法而收集。６．１．３流产胎儿、胎盘当有临床症状（参见附录Ｂ）发生流产时，在无菌条件下采集胎盘、胎儿胃内容物、肝及肺等。采集后直接放入运输增菌培养基中，或者放入含１％福尔马林的ＰＢＳ中，用于进行免疫荧光测定。６．１．４样品镜检样品同时涂片做革兰氏染色镜检。６．２样品运输样品采集后，应４℃～８℃保存，并在４８ｈ内送至实验室；或将样品液静置１ｍｉｎ～２ｍｉｎ后，用灭菌注射器吸取２ｍＬ上清液，分别注入两瓶ＴＥＭ中，每瓶１ｍＬ，振荡混匀，４８ｈ内送至实验室。６．３样品处理６．３．１生殖道粘液处理如果不是很粘稠，可以直接接种，或用等体积ＰＢＳ液稀释后接种；如果很粘稠则需要加入等体积的半胱氨酸处理液（１００ｍＬ水中加入０．２５ｇ盐酸半胱氨酸，调ｐＨ７．２后，用滤膜除菌使用），１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ后可用于接种。６．３．２包皮或阴道冲洗液处理３５００犵离心浓缩至２５０μＬ接种。６．３．３胎儿胃内容物及胎儿内脏或组织处理胎儿胃内容物可直接接种；胎儿内脏或组织则先用火焰作表面灭菌并用组织匀浆机匀浆后接种。６．３．４胎盘膜处理胎盘膜用ＰＢＳ冲洗后，去除表面污染物，刮取绒膜、绒毛接种。以上处理液接种到增菌运输培养基上。６．４胎儿弯曲杆菌的分离培养６．４．１将已接种样品的增菌运输培养基，置３７℃培养７２ｈ，取出振荡并无菌操作，用接种环分别取一环，划线接种于两个ＭＨ或ＣＨ琼脂平板培养基上，将培养基放置于厌氧培养罐中，充入混合气体，３７℃培养７２ｈ。６．４．２观察ＭＨ、ＣＨ培养基上有无胎儿弯曲杆菌的可疑菌落，如果没有，该样品胎儿弯曲杆菌为阴性。如果有，则将典型或可疑菌落划线于ＭＨ或ＣＨ琼脂平板培养基进行纯培养，方法同６．４．１。胎儿２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１弯曲杆菌在ＭＨ或ＣＨ琼脂平板培养基上的菌落特征为：不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为１ｍｍ～３ｍｍ左右。６．５胎儿弯曲杆菌的鉴定６．５．１筛选试验６．５．１．１取典型或可疑菌落纯培养物做革兰氏染色、运动力观察、氧化酶试验及触酶试验。胎儿弯曲杆菌为革兰氏阴性杆菌，呈螺旋转或“Ｓ”状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽孢和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征性快速螺旋状穿梭运动。６．５．１．２纯培养平板用后应尽快放回混合气体环境，备进一步做生化试验和荧光抗体试验用。６．５．２生化试验６．５．２．１取典型或可疑菌落纯培养物按表１进行生化试验。所有生化试验管均置于混合气体环境中，３７℃培养３ｄ。带胶盖的螺旋管，培养时应将试管盖放松。表１胎儿弯曲杆菌生化反应生长实验药敏实验硫化氢马尿酸过氧化氢３．５％氧化酶菌名（Ｈ２Ｓ）１％萘啶酮酸头孢霉素钠水解酶实验２５℃４２℃１％胆汁氯化钠试验实验甘氨酸３０μｇ／片３０μｇ／片实验（Ｎａｃｌ）胎儿弯曲杆菌胎儿＋－＋ｄ＋＋—ＲＳ－＋亚种胎儿弯曲杆菌性病＋－＋－－＋－ＲＳ－＋亚种注：“＋”———阳性反应；“－”———阴性反应；“ｄ”———反应不定；“Ｒ”———拮抗；“Ｓ”———敏感。６．５．２．２生长试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种到２管巯基乙酸肉汤中，分别置于４３℃和２５℃温箱培养７２ｈ观察结果。如果肉汤上层出现雾状浑浊，说明细菌已生长。６．５．２．３硫化氢（Ｈ２Ｓ）试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种于巯基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长×宽为２０ｍｍ×６ｍｍ的乙酸铅滤纸，观察３ｄ～４ｄ，如见滤纸变黑即为产生Ｈ２Ｓ。６．５．２．４甘氨酸、氯化钠、胆汁生长试验：取典型或可疑菌落纯培养物分别接种于含１％甘氨酸、３．５％氯化钠、１％胆汁的巯基乙酸肉汤中，３７℃培养７２ｈ，如果肉汤上层出现雾状浑浊，说明细菌已生长。６．５．２．５药物敏感试验：用铂金耳挑取典型或可疑菌落的纯培养物，置于１ｍＬ灭菌生理盐水试管中，制成浓度约为１０９个／ｍＬ的菌液，将菌液涂布于ＭＨ琼脂平板上，然后用镊子把含有３０μｇ萘啶酮酸和头孢霉素的滤纸片贴在ＭＨ血平板上，于混合气体３７℃培养４８ｈ～７２ｈ，在药敏纸片周围产生３ｍｍ以上抑菌区为敏感。６．５．２．６马尿酸钠水解试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种于０．４ｍＬ１％马尿酸钠液中制成菌悬液，３５℃～３７℃水浴２ｈ，加入０．２ｍＬ茚三酮试剂，混匀后水浴２０ｍｉｎ观察结果。变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。同时可用１８ｈ～２４ｈ变形杆菌培养物作为阳性对照。３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１６．５．３结果判定凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特征的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌阳性。过氧化氢酶试验、Ｈ２Ｓ试验、１％胆汁生长试验、３．５％氯化钠生长试验和马尿酸水解试验，其中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性的，则判定为胎儿弯曲杆菌阴性。７间接免疫荧光试验７．１制备免疫血清将标准的胎儿弯曲杆菌菌株（胎儿弯曲杆菌性病亚种或胎儿弯曲杆菌胎儿亚种）接种到ＭＨ或ＣＨ琼脂平板培养基（含１０％绵羊血）上，３７℃混合气体培养３ｄ，将菌体收获到ＰＢＳ液中，离心洗涤两次。将胎儿弯曲杆菌悬浮于ＰＢＳ液中，制成浓度为１０１１个／ｍＬ的菌悬液，加入弗氏不完全佐剂后，肌肉注射３月龄兔子，每只２ｍＬ，分４个注射点，每个注射点接种０．５ｍＬ。接种前及接种后每隔一周采血一次，当血清滴度达到１０５或以上时（用胎儿弯曲杆菌血清凝集试验或免疫荧光试验），再静脉注射０．１ｍＬ～１０个／ｍＬ的菌悬液，７ｄ后采血，将不同兔子的血清混合在一起，作为免疫血清。１．０ｍＬ浓度为１０７．２确定工作稀释度用标准胎儿弯曲杆菌培养物涂片检测ＰＢＳ稀释的不同浓度的免疫血清，确定工作稀释度。与待检菌产生明显荧光的最低浓度的２倍，即为工作稀释度。７．３酶标记抗体选用商品羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，按说明书给出的工作浓度使用。７．４样品制备生殖道液体样品（包括胎儿胃内容物、包皮垢冲洗液和阴道粘液）加入５ｍＬ１％福尔马林ＰＢＳ液，２次离心。先在４℃６００犵离心１０ｍｉｎ，取上清液，再在４℃８０００犵离心３０ｍｉｎ，保留１００μＬ上清液，将沉积物溶其中，作为被检样品。７．５间接免疫荧光试验取２０μＬ７．４制备的样品涂布在玻片上。用丙酮经－２０℃３０ｍｉｎ固定，或者用乙醇经１８℃～２５℃３０ｍｉｎ固定，风干玻片后，加入工作浓度的免疫血清，在湿盒中３７℃感作３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ液冲洗玻片３次。再加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，湿盒中３７℃避光感作３０ｍｉｎ。用ＰＢＳ液冲洗玻片３次，每次１０ｍｉｎ。最后用甘油缓冲剂（９０％甘油：１０％ＰＢＳ）封固玻片。盖上盖玻片以防干燥，用荧光显微镜观察。同时用胎儿弯曲杆菌属作为阳性对照，其他弯曲杆菌属作为阴性对照。７．６结果判断产生荧光并且有胎儿弯曲杆菌属典型菌体形态的，判定为胎儿弯曲杆菌阳性（见附录Ｃ）。本荧光试验可以用来鉴定从样品中分离出的胎儿弯曲杆菌菌株，但不能用于菌株亚种的鉴别。８犘犆犚法８．１病料处理按照７．４方法制备被检样品。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１８．２犇犖犃提取使用ＤＮＡ快速抽提纯化试剂盒抽提基因组ＤＮＡ。８．３犘犆犚试验８．３．１引物用于鉴定牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种的引物对：ｑｈ３Ｆ５’ＧＧＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＡＧＡＴ３’ｑｈ４Ｒ５’ＴＡＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＣＧＡＣＡＡＣＴ３’用于鉴定牛胎儿弯曲杆菌性病亚种的引物对：ｑｈＶｅｎＳＦ５’ＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴ３’ｑｈＶｅｎＳＲ５’ＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＴＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＴ３’８．３．２犘犆犚反应体系应用５０μＬ反应体系进行反应。在ＰＣＲ管中，依次加入以下试剂：模板ＤＮＡ２μＬ上游引物（２５ｐｍｏｌ／Ｌ）２μＬ下游引物（２５ｐｍｏｌ／Ｌ）２ｕＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ／μＬ）１μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬｄｄＨ２Ｏ３４μＬ８．３．３犘犆犚反应条件８．３．３．１鉴定牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃／３０ｓ，５８℃／３０ｓ，７２℃／６０ｓ，运行３５个循环；７２℃／１０ｍｉｎ；４℃，保存。８．３．３．２鉴定牛胎儿弯曲杆菌性病亚种：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃／３０ｓ，５８℃／３０ｓ，７２℃／３０ｓ，运行３５个循环；７２℃／１０ｍｉｎ；４℃，保存。８．４犘犆犚产物的检测８．４．１制备１％琼脂糖凝胶。８．４．２加载样品：取１０μＬＰＣＲ扩增产物与５μＬ１０×加样缓冲液混合，ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００相对分子质量标准５μＬ，加入凝胶孔中电泳。１００Ｖ恒压电泳，凝胶成像系统观察电泳结果。８．５结果判定ＰＣＲ扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶成像系统下观察结果：ａ）当扩增出７６４ｂｐ大小的条带，并经测序与胎儿弯曲杆菌胎儿亚种ＰＣＲ产物序列（参见Ｄ．１）相符，即判定为牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种阳性；ｂ）当扩增出１４１ｂｐ大小的条带，并经测序与胎儿弯曲杆菌性病亚种ＰＣＲ产物序列（参见Ｄ．２）相符，即判定为牛胎儿弯曲杆菌性病亚种阳性。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１附录犃（规范性附录）培养基和试剂的配制犃．１增菌运输培养基（犜狉犪狀狊狆狅狉狋犈狀狉犻犮犺犿犲狀狋犕犲犱犻狌犿，犜犈犕）成牛血清１０００ｍＬ５氟脲嘧啶０．３ｇ放线菌酮０．１ｇ萘啶酮酸３ｍｇ多粘菌素Ｂ１００００００ＩＵ１％煌绿５ｍＬ将各种成分无菌操作加入到成牛血清中，充分混合后分装于２０ｍＬ带胶皮塞（能密闭）的玻璃瓶中每瓶８ｍＬ，然后水浴或在蒸汽中加热２ｍｉｎ～３ｍｉｎ（无压力），使血清凝固，冷却后用灭菌玻璃棒将血清凝块捣碎。最后无菌操作充入混合气体（３．５％Ｏ２，１０％ＣＯ２，８６．５％Ｎ２）。将制备好的ＴＥＭ培养基保存在４℃冰箱中，可使用４个月。犃．２犆犎培养基（犮狔狊狋犲犻狀犲犺犲犪狉狋犫犾狅狅犳犪犵犪狉）（含抗生素）牛心浸液（或牛心粉３０ｇ）５００ｇ胰蛋白胨１０ｇ右旋糖１０ｇ氯化钠５ｇＬ半胱氨酸１ｇ琼脂１２ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ６．９～７．０加热溶解各成分后，１１５℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～５５℃时，无菌加入：多粘菌素Ｂ２ｍｇ新生霉素２ｍｇ放线菌酮２０ｍｇ绵羊血１００ｍＬ混匀，倾注平板。放４℃冰箱保存备用。犃．３犕犎培养基（犕狌犲犾犾犲狉犎犻狀狋狅狀犃犵犪狉）（含抗生素）牛肉浸膏５ｇ酪蛋白水解物１７．５ｇ淀粉１．５ｇ琼脂１５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１ｐＨ７．４±０．２各成分加热溶解，１１５℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～５５℃时，无菌加入：放线酶酮５０ｍｇ多粘菌素Ｂ１００００Ｕ新生酶素５ｍｇ绵羊血５０ｍＬ～１００ｍＬ混匀，倾注平板。４℃冰箱保存备用。犃．４巯基乙酸盐肉汤Ｌ胱氨酸０．５ｍｇ氯化钠２．５ｍｇ右旋糖５．５ｇ酵母浸膏５．０ｇ酪蛋白胰消化物（ＰａｎｃｒｅａｔｉｃＤｉｇｅｓｔｏｆＣａｓｅｉｎ）１５．０ｇ巯基乙酸钠０．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ加热至溶解，调节ｐＨ７．２±０．２，分装于试管中，每管５ｍＬ，１１５℃高压灭菌１５ｍｉｎ，４℃冰箱保存备用。犃．５氧化酶试剂１％盐酸二甲苯对苯二胺水溶液，置棕色瓶中现用现配，－１０℃保存，有效期１周。用于氧化酶试验。犃．６３％过氧化氢（犎２犗２）３０％Ｈ２Ｏ２１０ｍＬ蒸馏水９０ｍＬ装于棕色瓶中，有效期为１周。用于触酶试验。犃．７马尿酸盐水解试验犃．７．１１％马尿酸钠马尿酸钠１ｇ蒸馏水１００ｍＬ犃．７．２水合茚三酮茚三酮３．５ｇ丙酮５０ｍＬ丁酮５０ｍＬ７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１犃．８犘犅犛溶液犃．８．１犃液：０．２犿狅犾磷酸二氢钠水溶液ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ２７．６ｇ，溶于蒸馏水中，最后定容至１０００ｍＬ。犃．８．２犅液：０．２犕磷酸氢二钠水溶液Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ５３．６ｇ，（或Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ７１．６ｇ或Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ３５．６ｇ）加蒸馏水溶解，最后定容至１０００ｍＬ。犃．８．３０．０１犿狅犾磷酸盐缓冲溶液（狆犎７．２）０．２ｍｏｌＡ液１４ｍＬ０．２ｍｏｌＢ液３６ｍＬ氯化钠８．５ｇ用蒸馏水定容至１０００ｍＬ。经１２１℃１５ｍｉｎ高压灭菌，冷却后分装，４℃备用。犃．９１％琼脂糖凝胶琼脂糖１ｇ１×ＴＢＥ电泳缓冲液１００ｍＬ熔化后加入５μＬ１０ｍｇ／ｍＬＥＢ贮存液，使凝胶中ＥＢ终浓度达到０．５μｇ／ｍＬ。犃．１０犜犅犈电泳缓冲液（５倍浓缩液）Ｔｒｉｓ５４ｇＨ３ＢＯ３２７．５ｇＥＤＴＡ２．９２２ｇ去离子水１０００ｍＬ用５ｍｏｌ／Ｌ的盐酸调到ｐＨ８．０。使用时用去离子水稀释至１倍的ＴＢＥ电泳缓冲液。犃．１１１０×加样缓冲液含０．２５％溴酚蓝和４０％蔗糖的水溶液。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１附录犅（资料性附录）疾病简介牛生殖道弯曲杆菌病是由专嗜牛生殖系统的胎儿弯曲杆菌引起的。胎儿弯曲杆菌包括胎儿和性病两个亚种，为革兰氏阴性杆菌，具有一端或两端鞭毛结构，不形成芽孢，一般不形成荚膜，有动力，呈“Ｓ”状或螺旋状弯曲。其生化特性为不发酵碳水化合物、氧化酶试验阳性、还原硝酸盐、不分解尿素、不液化明胶，ＶＰ、ＭＲ试验阴性，对１％牛胆汁有耐受性，ＤＮＡＧ＋Ｃ比例是３０～５０。本菌微需氧，在含有３．５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８６．５％Ｎ２的混合气体环境中生长良好，在１０％绵羊血ＣＨ琼脂平板培养基上纯培养形成淡灰色半透明的薄面纱样菌落。最适生长温度为３７℃，在４２℃不生长。对链霉素、氯霉素、四环素、红霉素敏感，而对青霉素、杆菌肽、多粘菌素Ｂ、新生霉素、三甲氧苄氨嘧啶（ＴＭＰ）有抵抗力。病原菌主要通过自然交配传播，慢性带菌公牛精液中存在胎儿弯曲杆菌性病亚种，经人工授精可造成该疾病扩大蔓延的危险。胎儿弯曲杆菌胎儿亚种通常在牛的肠道可分离到，与性病亚种相比较，其致病性较弱，但可引起牛散发性流产，试验感染青年母牛，病原持续存在几周、十几个月甚至更长。牛生殖道弯曲杆菌病的诊断主要依据从公牛、母牛或流产胎儿体内取样，做病原分离鉴定、ＰＣＲ实验或根据其特异性免疫反应而确诊。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１附录犆（规范性附录）胎儿弯曲杆菌形态图图犆．１免疫荧光抗体染色胎儿弯曲杆菌形态图１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８６—２０１１附录犇（资料性附录）胎儿弯曲杆菌犘犆犚产物序列犇．１胎儿弯曲杆菌胎儿亚种犘犆犚产物序列（７６４犫狆）ＴＡＧＣＴＡＣＡＡＴＡＡＣＧＡＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＣＴＴＡＣＧＧＣＧＴＣＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＴＴＡＴＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＡＣＣＣＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＡＡＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＧＣＧＣＣＡＡＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣＣＣＡＴＡＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＣＧＣＴＡＴＡＴＡＧＴＡＧＧＴＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＡＡＣＧＣＡＴＡＴＴＡＴＡＧＴＡＧＣＴＡＴＡＡＴＡＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＴＴＡＴＧＡＡＣＧＴＴＡＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＣＡＴＡＡＡＴＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＧＴＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＴＴＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＴＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴＴＡＣＧＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＡＣＣ犇．２胎儿弯曲杆菌性病亚种犘犆犚产物序列（１４１犫狆）ＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＡＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣＧＡＴＣＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２６８０１／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１０８６—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２３千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８２定价１８．００元'