SNT1087-2011 Q热检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１０８７—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２犙热检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犙犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２《牛Ｑ热微量补体结合试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２相比，主要技术变化如下：———增加了病原分离和鉴定；———增加了间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验方法。本标准同等采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ》（２００８版）中第２．１．１２章Ｑ热部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：鄢志强、柯忠哲、马保华、鱼海琼、林志雄、李贺、林宝珍、陈升毅、吕平、刘计亮、朱来华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１犙热检疫技术规范１范围本标准规定了Ｑ热的检疫规范，包括病原分离鉴定、血清学试验，其中血清学试验包括酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验和补体结合试验。本标准适用于进出境牛、羊等易感动物Ｑ热的检疫和诊断。２缩略语下列缩略语适用于本文件。ＱＦｅｖｅｒ：Ｑ热Ｃ．Ｂｕｒｎｅｔｉｉ：伯纳特柯克斯体ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验ＩＦＡ：间接免疫荧光试验ＨＥＬ：人胚肺成纤维细胞ＣＰＥ：细胞致病效应ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素ＲＮＡ：核糖核酸ＯＰＤ：邻苯二胺ＯＤ值：光密度值ＶＢＤ：巴比妥钙镁缓冲液ＬＰＳ：脂多糖３临床症状Ｑ热临床症状及其他信息参见附录Ａ。４检疫方法４．１病原分离和鉴定４．１．１材料准备２细胞培养瓶、２４孔平底细胞培养板、４．１．１．１器材：荧光显微镜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、２５ｃｍ带盖湿盒、组织捣碎机、冷冻离心机。４．１．１．２试剂：４．１．１．２．１无犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗体犊牛血清。４．１．１．２．２人胚肺成纤维细胞（ＨＥＬ）。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１４．１．１．２．３犆．犅狌狉狀犲狋犻犻标准菌株和标准阳性、阴性血清、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻荧光抗体。４．１．１．２．４溶液及细胞培养液：见附录Ｂ。４．１．１．３１日龄～２日龄豚鼠。４．１．１．４链霉素、庆大霉素。４．１．１．５样品：胎盘子叶、肺、肝、流产胎儿皱胃内容物；母畜阴道分泌物、奶样、粪便。４．１．２样品的处理将样品剪碎，在组织捣碎机内捣碎，用含抗生素（链霉素１００μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ和庆大霉素５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）的ＰＢＳ磷酸盐缓冲液制成组织悬液，于４℃作用４ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心后，保留上清液。４．１．３病原分离对无污染的样品，按常规方法培养ＨＥＬ单层细胞，倒去培养液，接种样品组织上清液，每样接种３瓶，每瓶接种１ｍＬ。于３７℃吸附２ｈ后加细胞维持液，封闭、置３７℃二氧化碳箱培养，２４ｈ后逐日在倒置显微镜下观察细胞病变，连续观察２１ｄ犆．犅狌狉狀犲狋犻犻特征性ＣＰＥ（细胞致病效应）：ＨＥＬ细胞空泡化。无ＣＰＥ的盲传２代。如有ＣＰＥ，则待７０％细胞出现ＣＰＥ时收毒，将细胞反复冻融２次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液４℃保存待鉴定。４．１．４培养物的鉴定５／ｍＬ的细胞悬液，加入到２４孔细胞４．１．４．１将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０培养板内，每孔３ｍＬ，封闭、置３７℃二氧化碳培养箱培养。４．１．４．２等细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种４．１．３待鉴定上清液，每孔３ｍＬ，每个样品２个孔；另外４．１．３上清液用适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阳性血清中和后接种２个孔，每孔３ｍＬ；阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照２个孔。４．１．４．３置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。４．１．４．４吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔３ｍＬ，封闭、置３７℃二氧化碳培养箱培养１０ｄ。４．１．４．５取出细胞板，ＰＢＳ漂洗，自然干燥后，用－２０℃预冷的丙酮固定３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ，自然干燥。４．１．４．６滴加适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阳性血清，置３７℃作用１ｈ。４．１．４．７滴加适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻免疫荧光抗体（二抗），放进湿盒，３７℃作用２ｈ。４．１．４．８用ＰＢＳ洗３次，倾去液体。４．１．４．９荧光显微镜镜检。４．１．５结果判定阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。阴性对照、空白对照无荧光。没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性。没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则重检；重检后仍荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１如果阳性对照无特异性荧光或阴性对照出现特异性荧光，则试验失败，应该重检。４．２间接免疫荧光试验（犐犉犃）４．２．１材料准备４．２．１．１器材荧光显微镜、保湿培养箱、冲洗盆、微量移液器等。４．２．１．２试剂４．２．１．２．１ＩＦＡ抗原平板诊断板的制备：见附录Ｂ。４．２．１．２．２ＦＩＴＣ标记的兔抗牛（羊）ＩｇＧ：使用时用含０．０１％伊文思蓝的样品稀释液稀释至工作浓度。４．２．１．２．３ＰＢＳ、甘油缓冲液、１％伊文思蓝染色液、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阴性和阳性对照血清。４．２．１．３样品采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌的２ｍＬ离心管内，４℃或－２０℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。４．２．２操作方法４．２．２．１待检血清灭能３０ｍｉｎ（牛：５６℃～５７℃；绵羊、山羊：６３℃），然后用ＰＢＳ作１／４０～１／６４０倍比稀释。４．２．２．２取出事先准备好的抗原诊断板，置室温预温，不要触摸板孔。４．２．２．３每孔滴加２０μＬ稀释度不同的血清，同时做阴性和阳性血清对照，其中一孔，滴加２０μＬＰＢＳ作为抗原对照。４．２．２．４置保湿培养箱３７℃３０ｍｉｎ。反应板用ＰＢＳ冲洗两次，每次１０ｍｉｎ。用ＰＢＳ洗涤，风干。４．２．２．５每孔（包括对照孔）滴加工作浓度的ＦＩＴＣ标记的兔抗牛（羊）ＩｇＧ２０μＬ，于３７℃保湿培养箱中孵育３０ｍｉｎ。用ＰＢＳ洗涤三次，风干后立即用荧光显微镜观察。４．２．３结果判定阳性血清对照孔出现规则形状的特异性强绿色荧光信号，阴性血清对照孔及抗原对照孔无特异性绿色荧光信号，则试验成立，可进行结果判定。待检血清在１／１６０及更高稀释时，有形状规则的特异性绿色荧光信号时，可判定为阳性。待检血清在１／１６０及更高稀释时，没有形状规则的特异性绿色荧光信号时，可判定为阴性。４．３酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）４．３．１材料准备４．３．１．１器材酶标仪、微量酶标反应板、３７℃培养箱、保湿盒、冰箱、８道或１２道微量移液器、微量板振荡器、洗板机等。４．３．１．２试剂犆．犅狌狉狀犲狋犻犻全细胞灭活抗原、酶标结合物、十倍浓度的稀释液（吐温／ＰＢＳ液）、洗涤液、封闭液、双３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１蒸水、四甲基联苯胺（ＴＭＢ）、双氧水、终止液、阳性及阴性对照血清。４．３．１．３样品采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌２ｍＬ离心管，４℃或－２０℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。４．３．２操作方法４．３．２．１包被抗原：取９６孔平底微量反应板，于各孔加工作浓度的全细胞灭活抗原１００μＬ，封板，置保湿盒内放３７℃培养箱中感作６０ｍｉｎ，再放置４℃冰箱内过夜。４．３．２．２洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔３００μＬ，洗涤三次，每次１ｍｉｎ，在吸水纸上轻拍干。４．３．２．３封闭：每孔加入封闭液１００μＬ，封板后置室温感作３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。４．３．２．４洗板：方法同４．３．２．２。４．３．２．５将血清样品包括对照血清稀释至适当浓度（通常为１／１００），每孔滴加１００μＬ，每个样品加２个孔。对照血清包括阴性、阳性血清。４．３．２．６盖上微量板，置室温感作３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。４．３．２．７洗板：方法同４．３．２．２。４．３．２．８将酶标结合物稀释至工作浓度，每孔滴加１００μＬ。４．３．２．９盖上微量板，置室温感作３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。４．３．２．１０洗板：方法同４．３．２．２。４．３．２．１１每孔加１００μＬＴＭＢ底物溶液，根据产品说明，感作说明书上规定的时间。４．３．２．１２加终止液１００μＬ终止氧化物酶反应。４．３．２．１３用酶标仪在波长４５０ｎｍ下测定ＯＤ值，这些ＯＤ值将用于计算结果。４．３．３结果判定对于商用试剂盒，可根据其提供的值和解释判定。一般情况下，计算待测血清以及阳性和阴性对照血清的平均吸光值［待检血清平均ＯＤ值（Ａｂ）、阳性血清平均ＯＤ值（Ａｂｐｏｓ）和阴性血清平均ＯＤ值（Ａｂｎｅｇ）］。按式（１）计算每份血清的百分比犘（％）：犘＝（Ａｂ－Ａｂｎｅｇ）／（Ａｂｐｏｓ－Ａｂｎｅｇ）×１００％…………………………（１）结果判定如下：犘＜３０％：判为阴性血清。犘在３０％～４０％之间：判为可疑血清，对于可疑血清，需要重新检验，如重新检验结果仍为３０％～４０％之间，则判定为阳性血清。犘＞４０％：判为阳性血清。４．４补体结合试验（犆犉）４．４．１材料准备４．４．１．１器材９６孔Ｕ型底反应板、微量板振荡器、３７℃培养箱、水浴锅、８道或１２道微量移液器、离心机。４．４．１．２试剂ｐＨ７．２巴比妥钙镁缓冲液（ＶＢＤ）、绵羊红细胞、溶血素、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗原、补体、阳性和阴性对照４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１血清。４．４．１．３样品采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，４℃或－２０℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。４．４．２预备试验４．４．２．１溶血素效价的测定４．４．２．１．１溶血素的稀释：取溶血素０．１ｍＬ加ＶＢＤ９．９ｍＬ混匀（如果是等量甘油保存的溶液，取溶血素０．２ｍＬ加ＶＢＤ９．８ｍＬ），制成１００倍稀释的溶血素，再用ＶＢＤ把已经１００倍稀释的溶血素分别稀释成５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００倍稀释的９种溶液。４．４．２．１．２补体的稀释：用ＶＢＤ把补体分别稀释成３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍稀释的８种溶液。４．４．２．１．３致敏红细胞悬液的制备：将不同稀释度（１∶５００～１∶６０００）的溶血素与等量的２％红细胞悬液混合，置３７℃水浴１５ｍｉｎ，作为致敏红细胞。４．４．２．１．４溶血素效价的滴定：采用方阵法在微量板上滴定。如表１所示，１～９列为溶血素稀释度（１∶５００～１∶６０００），ＡＨ行为补体稀释度（１∶３０～１∶１００）。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液５０μＬ，分别滴加于１～９列的各孔中。吸取不同稀释度的补体５０μＬ，分别滴于ＡＨ行各孔中，每孔再加２５μＬＶＢＤ，滴加完毕后，置微量振荡器上混匀，随后置３７℃温箱中感作３０ｍｉｎ后进行初判，置室温２ｈ、水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ或置４℃冰箱中过夜后进行终判。表１溶血素效价滴定判定举例表溶血素稀释比例补体稀释比例１∶５００１∶１０００１∶１５００１∶２０００１∶２５００１∶３０００１∶４０００１∶５０００１∶６０００１∶３０－－－－－－－＋＋１∶４０－－－－－－－＋＋１∶５０－－－－－－－＋＋１∶６０－－－－－－－＋＋１∶７０－－－－－－９０％＋＋＋１∶８０－－－－－－＋＋＋＋１∶９０－－－＋＋＋＋＋＋＋＋１∶１００－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋注：＋＋为５０％溶血；＋为７５％溶血；－为１００％溶血。４．４．２．１．５溶血素效价的判读：对比标准溶血孔（见附录Ｃ）进行，在最小量的补体存在下，能使９０％红细胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血素，测定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表１的测定结果为，补体在１∶７０稀释时，发生９０％溶血的最少溶血素为１∶４０００，该１∶４０００为一个单位溶血素。两个单位溶血素为１∶２０００。４．４．２．２补体效价的测定４．４．２．２．１补体的稀释：用ＶＢＤ把补体分别稀释成３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍稀释的８种溶液。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１４．４．２．２．２使用两个单位溶血素，制备致敏红细胞悬液。４．４．２．２．３补体效价测定：在微量板上１～８列为１∶３０～１∶１００稀释的补体，各稀释度按表２中定量添加，再以ＶＢＤ补充至每孔５０μＬ；接着每孔滴加２５μＬ的抗原后，再滴加５０μＬ２％致敏红细胞悬液，充分振荡混匀后，置３７℃温箱中感作３０ｍｉｎ后进行初判，然后置室温２ｈ、水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ或置４℃冰箱中过夜后进行终判。表２补体效价测定补体体积补体稀释比例μＬ１∶３０１∶４０１∶５０１∶６０１∶７０１∶８０１∶９０１∶１００Ａ５０５０５０５０５０５０５０５０Ｂ４０４０４０４０４０４０４０４０Ｃ３０３０３０３０３０３０３０３０Ｄ２０２０２０２０２０２０２０２０Ｅ１０１０１０１０１０１０１０１０Ｆ００００００００４．４．２．２．４补体效价的判读：对比标准溶血孔（见附录Ｃ）进行，取３０μＬ补体呈现９０％溶血，２０μＬ补体呈现７５％～９０％溶血时补体的最高稀释度作为补体的效价。在正式试验时补体用量为２５μＬ，如表３的测定结果，１∶７０的补体２５μＬ为一个单位补体，试验时用两个单位补体，则１∶３５补体２５μＬ为两个单位补体。表３补体效价判定举例表补体体积补体稀释比例μＬ１∶３０１∶４０１∶５０１∶６０１∶７０１∶８０１∶９０１∶１００５０－－－－－－＋＋４０－－－－－－＋＋＋３０－－－－９０％＋＋＋＋＋２０－－－－＋＋＋＋＋＋＋＋１０－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋０＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋注：＋＋＋＋为０％溶血；＋＋＋为２５％溶血；＋＋为５０％溶血；＋为７５％溶血；－为１００％溶血。４．４．２．３抗原效价的确认或测定４．４．２．３．１根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需测定，则在确认抗原效价后按说明稀释使用；如需测定，则按下列步骤进行。４．４．２．３．１．１用ＶＢＤ将抗原依次作１∶５０、１∶１００、１∶２００、１∶４００稀释。４．４．２．３．１．２用ＶＢＤ将阳性血清依次作１∶１０、１∶２０、１∶４０、１∶８０稀释。４．４．２．３．１．３标准阴性血清不作稀释。４．４．２．３．１．４按表４建立试验。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１表４抗原测定表抗原稀释度红细胞成分及稀释度血清对照抗原对照补体对照１∶５０１∶１００１∶２００１∶４００对照抗原２５２５２５２５０２５００１∶１０／μＬ２５２５２５２５２５０００阳１∶２０／μＬ２５２５２５２５２５０００性血１∶４０／μＬ２５２５２５２５２５０００清１∶８０／μＬ２５２５２５２５２５０００１∶１０阴性血清／μＬ２５２５２５２５２５０００２单位补体／μＬ２５２５２５２５２５２５２５０ＶＢＤ／μＬ０００００２５５０７５４℃感作１２ｈ～１８ｈ后置室温１０ｍｉｎ致敏红细胞／μＬ５０５０５０５０５０５０５０５０３７℃感作３０ｍｉｎ后进行初判，然后置室温２ｈ，水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，或４℃冰箱过夜后进行终判４．４．２．３．１．５抗原效价的判读：对比标准溶血孔（见附录Ｃ）进行，当血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔出现１００％溶血，而红细胞对照孔不出现溶血且红细胞全部沉于孔底时判定抗原效价。以与阳性血清各稀释度发生完全抑制溶血的最高稀释度为一个单位抗原，正式试验使用２单位抗原。４．４．３正式试验标准阳性血清和标准阴性血清使用前用ＶＢＤ作１∶１０稀释，５６℃水浴灭能３０ｍｉｎ；待检血清使用前用ＶＢＤ作１∶１０稀释，灭能３０ｍｉｎ（牛：５６℃～５７℃；绵羊、山羊：６３℃）。按表５建立正式试验。表５补体结合试验正式试验操作表待检血清成分及稀释度阳性血清阴性血清抗原对照补体对照红细胞对照试验孔对照孔１∶１０待检血清／μＬ２５２５０００００１∶１０阳性血清／μＬ００２５００００１∶１０阴性血清／μＬ０００２５０００２单位抗原／μＬ２５０２５２５２５００２单位补体／μＬ２５２５２５２５２５２５０ＶＢＤ／μＬ０２５００２５５０７５４℃感作１２ｈ～１８ｈ后置室温１０ｍｉｎ致敏红细胞／μＬ５０５０５０５０５０５０５０３７℃感作３０ｍｉｎ后进行初判，然后置室温２ｈ，水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，或４℃冰箱过夜后进行终判７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１４．４．４结果判定４．４．４．１先观察对照管结果。当阳性血清孔和红细胞对照孔出现１００％抑制溶血，阴性血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔及待检血清对照孔均出现１００％溶血时判定待检血清结果。４．４．４．２对比标准溶血孔（见附录Ｃ）进行，对待检血清管进行判定，并作如下记录：＋＋＋＋表示９０％以上抑制溶血；＋＋＋表示７５％以上抑制溶血；＋＋表示５０％以上抑制溶血；＋表示２５％以上抑制溶血；－表示１００％溶血。４．４．４．３判定标准：待检血清１∶１０稀释时小于５０％抑制溶血为阴性。在进出境动物的检疫中，对判定标准有规定的按规定执行。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１附录犃（资料性附录）疾病概述犃．１犙热（犙犉犲狏犲狉）Ｑ热是由伯纳特柯克斯体（犆．犅狌狉狀犲狋犻犻）引起的一种人畜共患病，人感染后表现急性和慢性两种病型，急性通常表现为自限性发热、肺炎、肉芽肿型肝炎；慢性型表现为病人瓣膜受损的心内膜炎，慢性型并发症病人若没有合适的抗生素治疗，会导致死亡，孕妇感染后引起早产或胎儿生长缓慢，自发性流产或死亡。Ｑ热对母牛、母羊和山羊能诱发流产以及早产、死亡、子宫炎和不育等繁殖紊乱。犃．２病原Ｑ热病原体为伯纳特柯克斯体，为一种革兰氏阴性的专性细胞内寄生菌，能在吞噬细胞的吞噬溶酶体内旺盛生长，过去被分类为立克次氏体。然而基于１６ＳＲＮＡ序列的基因进化分析表明犆．犅狌狉狀犲狋犻犻与原菌门ａ亚门的立克次氏体属的亲缘关系较远。目前犆．犅狌狉狀犲狋犻犻被分类为原菌门ｒ亚门、军团菌目、柯克斯体属、柯克斯体科。最近，已完成了犆．犅狌狉狀犲狋犻犻的全基因组测序，证实其分类地位与立克次氏体不同，犆．犅狌狉狀犲狋犻犻科形成小而致密的、在环境中高度稳定的芽孢状体，这非常有利于其传播。这种特性使得犆．犅狌狉狀犲狋犻犻存在发育循环变异体：人细胞变异体（ＬＣＶ）、小细胞变异体（ＳＣＶ）和小浓缩体（ＳＤＣ）。ＳＤＣ和ＳＣＶ是细胞外存活的感染性粒子。另一个特点是犆．犅狌狉狀犲狋犻犻具有２种抗原形式：致病性抗原Ⅰ相，见于被感染的人和动物；非致病性抗原Ⅱ相，存在于卵内和体外培养。经鸡胚或细胞传代过程中，该菌发生脂多糖（ＬＰＳ）变异：Ⅰ相菌细胞具有全长ＬＰＳＯ一链，体外传代变为截段的ＬＰＳＯ一链，成为Ⅱ相菌时则切除了ＬＰＳ。这种ＬＰＳ变异是由染色体的不可逆缺失所致，细菌则不能从Ⅱ相变回Ⅰ相。由于该病原体抵抗力强、具有极大的危险性，因此操作活病原体应在符合ＯＩＥ要求的３级生物安全实验室中进行。犃．３流行病学Ｑ热是一种人畜共患病。Ｑ热感染主要是通过吸入干燥的气溶胶颗粒、接触感染动物及其生殖组织而传播。摄入感染主要是通过饮、食未经消毒处理的、甚至经巴氏消毒的奶品。Ｑ热在人间传播罕见，但接生时暴露、性接触和输血均可传播。动物可经消化道、呼吸道、垂直传播和性传播而感染，节肢动物主要是蜱螨可传播Ｑ热。病原可在动物体内持续感染，经奶、粪便、尿排出病原，有时血液带菌。病原大量存在于生殖排出物（胎盘、羊水和胎儿），未孕动物传播风险较少。家养反刍动物被认为是主要的贮存宿主，但猫、犬、家兔、鸟等也有报道带菌，均可导致人类感染。犃．４临床症状牛患Ｑ热的症状有流产、死胎或弱犊、胎衣不下、子宫内膜炎和不育。小反刍兽患Ｑ热常伴发畜群突然流产，紧接着无并发症康复，但感染则持续多年或终生。绵羊、山羊、牛主要呈无症状带菌，但在分娩时排出大量病原菌，并在分泌物和排泄物中间歇排菌。猫、兔、鸟等家养动物均易感，是人与动物的可能传染源。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１犃．５检疫及诊断根据临床症状和流行病学作出初步诊断，确诊则需要依靠实验室检查。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１附录犅（规范性附录）溶液配制犅．１细胞培养液ＭＥＭ培养基，加入１０％无犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗体犊牛血清（５６℃，３０ｍｉｎ灭活），含青霉素２００ＩＵ／μＬ，链霉素２００ＩＵ／μＬ，抽滤除菌，置４℃保存备用。犅．２细胞维持液ＭＥＭ培养基，加入２％无犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗体胎牛血清（５６℃，３０ｍｉｎ灭活），含青霉素２００ＩＵ／μＬ，链霉素２００ＩＵ／μＬ，抽滤除菌，置４℃保存备用。犅．３细胞分散液胰酶２．５０ｇ乙二胺四乙酸二钠０．２０ｇ无钙镁离子ＰＢＳ１０００ｍＬ混匀抽滤除菌，置４℃保存备用。犅．４磷酸盐缓冲液（０．０１犿狅犾／犔、狆犎７．４，犘犅犛）氯化钠８．０ｇ氯化钾０．２ｇ十二水磷酸氢二钠２．９ｇ磷酸二氢钾０．２ｇ三蒸水１０００ｍＬ将上述成分依次溶解、混匀、分装、高压灭菌（６８．９４ｋＰａ１５ｍｉｎ）。犅．５包被缓冲液（０．０５犿狅犾／犔、狆犎９．６碳酸盐缓冲液，犆犅犛）碳酸钠１．５９ｇ碳酸氢钠２．９３ｇ氯化钠８．３０ｇ加三蒸水至１０００ｍＬ犅．６犘犅犛犜溶液（含０．０５％吐温２０的０．０１犿狅犾／犔、狆犎７．４的犘犅犛）吐温２００．５ｍＬ加０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４的ＰＢＳ至１０００ｍＬ１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１犅．７终止液（２犿狅犾／犔硫酸）的配制浓硫酸２２．２ｍＬ去离子水１７７．８ｍＬ犅．８阿氏液葡萄糖２．０５ｇ柠檬酸钠０．８ｇ柠檬酸０．０５５ｇ氯化钠０．４２ｇ去离子水１００ｍＬ将上述成分依次溶解、混匀、分装、高压灭菌（６８．９４ｋＰａ１５ｍｉｎ）。犅．９生理盐水氯化钠０．８５ｇ去离子水１００ｍＬ犅．１０犐犉犃诊断板的制备用细胞分散液消化人胚肺成纤维细胞（ＨＥＬ），用细胞营养液稀释成５×１０４细胞／ｍＬ，犆．犅狌狉狀犲狋犻犻标准株，加到９６孔细胞培养板的１、２、４、５、７、８、１０、１１列各孔内，每孔１００μＬ。将细胞培养板置３７℃５％二氧化碳恒温培养箱中培养１０ｄ，弃去培养液，每孔加入预冷的丙酮１００μＬ，将此细胞培养板置于－２０℃冰箱备用。１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１附录犆（规范性附录）标准溶血孔配制犆．１血红蛋白溶液的制备：取２％绵羊红细胞悬液１．０ｍＬ，加入装有７．０ｍＬ蒸馏水的试管内，充分振荡，使红细胞全部裂解，再加入２．０ｍＬＶＢＤ，充分混合。犆．２０．２％绵羊红细胞悬液的制备：取２％绵羊红细胞悬液１．０ｍＬ，加入ＶＢＤ９．０ｍＬ。犆．３按表Ｃ．１配制不同溶血度的标准溶血管，并充分振荡均匀。表犆．１标准溶血管配制表溶血度成分０％１０％２０％３０％４０％５０％６０％７０％８０％９０％１００％血红蛋白溶液／ｍＬ００．１０．２０．３０．４０．５０．６０．７０．８０．９１．００．２％绵羊红细胞悬液／ｍＬ１．００．９０．８０．７０．６０．５０．４０．３０．２０．１０犆．４从标准溶血管配制表的各管中分别取１２５μＬ加入微量板的对应孔，轻摇混匀后静置，待红细胞全部沉淀于孔底后用于试验判读的对照。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２７８０１／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犙热检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１０８７—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．２５字数２７千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８６定价２１．００元'