SNT2863-2011 马脑脊髓炎(东部型和西部型)检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６３—２０１１马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊（犲犪狊狋犲狉狀犪狀犱狑犲狊狋犲狉狀）２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《陆生动物手册（２００９版）第２．５．５章“马脑脊髓炎（东部型和西部型）”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：———细化了免疫荧光试验方法；———细化了逆转录聚合酶链式反应检测方法；———增加了血凝试验内容；———修改了ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的底物作用时间为３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ；———删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、李应国、肖进文、梁成珠、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、周启明。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范１范围本标准规定了东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的病毒分离、免疫荧光试验、ＲＴＰＣＲ试验、血凝抑制试验、ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３缩略语下列缩略语适用于本文件。３．１ＥＥＥ（ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：东部型马脑脊髓炎３．２ＷＥＥ（ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：西部型马脑脊髓炎３．３ＶＥＥ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：委内瑞拉马脑脊髓炎３．４ＷＮ（ｗｅｓｔｎｉｌｅｆｅｖｅｒ）：西尼罗河热３．５ＲＫ１３细胞系（ｒａｂｂｉｔｋｉｄｎｅｙ１３ｃｅｌｌｌｉｎｅ）：兔肾细胞系３．６Ｖｅｒｏ细胞系（ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：非洲绿猴肾细胞系３．７ＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆转录聚合酶链式反应４生物安全要求本标准的病毒分离、免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验，均需在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。实验人员需提前进行ＥＥＥ疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在１∶４０以上。５样品采集５．１试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见Ａ．１．３）。５．２采样数量和类型采样的数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行。样品类型包括：血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１５．３采集方法５．３．１血清样品采集全血１０ｍＬ～１５ｍＬ，提取血清３ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．２脑脊液样品无菌采集脑脊液１ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．３组织样品无菌采取动物脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温４８ｈ内运送到实验室。如果４８ｈ内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。６病原分离鉴定６．１病毒分离６．１．１设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥３０００犵）、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（１．０ｍＬ～１０ｍＬ）及配套枪头。６．１．２试剂和材料６．１．２．１ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞。６．１．２．２ＭＥＭ培养基。６．１．２．３３日龄～５日龄乳鼠。６．１．２．４６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．２．５胎牛血清（无ＢＶＤＶ抗体及其他牛病抗体）。６．１．２．６样品缓冲液，配制见Ａ．１．３。６．１．２．７细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．１．２．８ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．１．３操作方法６．１．３．１样品制备组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成１０％悬液，１５００犵，４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。６．１．３．２细胞分离试验用适量ＡＴＶ缓冲液，将培养的ＲＫ１３细胞和（或）Ｖｅｒｏ细胞传代。待细胞长至８０％～１００％，每瓶细胞按１０％体积加入样品悬液，３７℃感作１ｈ～２ｈ后加入细胞维持液，３７℃培养６ｄ～８ｄ，逐日观察细胞病变。每份样品接种ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞各２瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则将细胞反复冻融３次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现７０％～９０％细胞病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验鉴定。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１６．１．３．３鸡胚分离每份样品接种２枚～４枚６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚卵黄囊，０．５ｍＬ／枚，孵化７ｄ。弃２４ｈ内死亡鸡胚，收集２４ｈ后死亡鸡胚，用ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代。６．１．４结果判定６．１．４．１细胞分离试验细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变，判定为阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验。６．１．４．２鸡胚分离试验若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验。６．２免疫荧光试验６．２．１设备和器材二氧化碳培养箱、生物安全（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置荧光显微镜、低温冰箱、超低温冰箱、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管和移液器等。６．２．２试剂和材料６．２．２．１丙酮。６．２．２．２Ｖｅｒｏ细胞。６．２．２．３ＭＥＭ培养基。６．２．２．４０．５％伊文思蓝染色液。６．２．２．５ＥＥＥＶ和ＷＥＥＶ病毒储液。６．２．２．６阴性血清（和一抗来源相同）。６．２．２．７一抗［ＥＥＥＶ抗体和（或）ＷＥＥＶ抗体］。６．２．２．８ＦＩＴＣ标记二抗（ＦＩＴＣ标记物种特异性抗体）。６．２．２．９ＦＩＴＣ标记一抗［ＥＥＥＶ抗体和（或）ＷＥＥＶ抗体］。６．２．２．１０细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．２．２．１１ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．２．２．１２ＰＢＳ溶液，配制见Ａ．３．１。６．２．２．１３封闭溶液（含封闭液１和封闭液２），配制见Ａ．３．２。６．２．２．１４封固溶液，配制见Ａ．３．３。６．２．３操作方法６．２．３．１准备试验６．２．３．１．１加入ＡＴＶ缓冲液，将Ｖｅｒｏ细胞传代到Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，３７℃，５％二氧化碳培养１ｄ～２ｄ。待细胞长至８０％～１００％，取０．１ｍＬ待鉴定的分离培养物感染Ｖｅｒｏ细胞，每个样品接种６支～７支Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，同时设立１支～２支正常培养细胞对照。用ＭＥＭ培养基将ＥＥＥＶ和ＷＥＥＶ病毒储液稀释到１００ＴＣＩＤ５０～１０００ＴＣＩＤ５０后感染Ｖｅｒｏ细胞，作阳性对照。加入适量细胞维持液，３７℃，５％二氧化碳培养。３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１６．２．３．１．２逐日取出一块玻片，ＰＢＳ溶液润洗一次，－７０℃预冷丙酮固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。６．２．３．１．３滴加ＦＩＴＣ标记一抗，３７℃湿盒孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ后，ＰＢＳ溶液润洗一次。６．２．３．１．４用新鲜ＰＢＳ溶液浸泡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，双蒸水润洗１次，空气中干燥，滴加一滴封固溶液，加盖片，用荧光显微镜（４９０ｎｍｏｌ／Ｌ）进行观察。确定出最佳感染效果后，将余下的玻片固定备用。６．２．３．１．５组织冰冻切片，丙酮固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；组织涂片空气中干燥３０ｍｉｎ，丙酮固定。将固定好的片子密闭、保存于－７０℃备用。６．２．３．２染色６．２．３．２．１直接免疫荧光抗体法每个样品同时做两张片子，分别用封闭液１和封闭液２进行封闭，３７℃湿盒孵育３０ｍｉｎ，滴加ＦＩＴＣ标记一抗，按６．２．３．１．２～６．２．３．１．４进行孵育、洗涤、干燥和观察。６．２．３．２．２间接免疫荧光抗体法滴加一抗，３７℃湿盒孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。ＰＢＳ润洗一次后，再用新鲜ＰＢＳ浸泡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，双蒸水润洗一次，置玻片架上，细胞面向上，滴加ＦＩＴＣ标记二抗，按６．２．３．１．２～６．２．３．１．４进行孵育、洗涤、干燥和观察。用相同比例稀释的阴性血清作阴性对照。注：工作浓度未知的一抗，可以作１∶１０，１∶２０，１∶４０，１∶８０，１∶１６０梯度稀释，作用于阳性对照进行染色。６．２．４结果判定阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无任何特异性荧光，且阴性血清对照无特异性荧光，试验成立；样品呈现特异性荧光，判定为阳性；样品无特异性荧光，判定为阴性。６．３逆转录聚合酶链式反应（犚犜犘犆犚）６．３．１设备和器材生物安全柜、低温冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机（≥１２０００犵）、ＰＣＲ仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪（或ＵＶ灯）、微量移液器（０．５μＬ～１０００μＬ）及配套枪头等。６．３．２试剂和材料试剂。６．３．２．１Ｔｒｉｚｏｌ６．３．２．２２０ｍｇ／μＬ糖原。６．３．２．３１０×ＰＣＲ缓冲液。６．３．２．４２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。６．３．２．５２００ｕｎｉｔｓ／μＬＭＭＬＶ逆转录酶。６．３．２．６１０ｕｎｉｔｓ／μＬ核糖核酸酶抑制剂。６．３．２．７ＷＮ、ＥＥＥ和ＷＥＥ阳性对照。６．３．２．８阴性对照。ＴＭ１）６．３．２．９５ｕｎｉｔｓ／μＬＡｍｐｌｉ犜犪狇ＧｏｌｄＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＤＮＡ聚合酶。６．３．２．１０１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｍｉｘ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）。６．３．２．１１乙醇、异丙醇、三氯甲烷、ＴＡＥ缓冲液、双蒸水（无ＲＮＡｓｅ）、琼脂糖、ＤＮＡ电泳载样缓冲液、１）该聚合酶是ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１ＤＮＡ相对分子质量标准、ＤＮＡ凝胶染色剂。６．３．３操作步骤６．３．３．１犚犖犃提取分别取组织悬液（或血浆、分离培养物）和阴、阳性对照２５０μＬ，加入７５０μＬＴｒｉｚｏｌ。振荡混匀，冰上静置５ｍｉｎ。加入２００μＬ三氯甲烷，旋涡振荡１５ｓ，冰上静置５ｍｉｎ。１２０００犵，２℃～８℃，离心１５ｍｉｎ。取５００μＬ上层液与等体积－２０℃预冷异丙醇混合，加１μＬ糖原，室温静置１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ后，１２０００犵，２℃～８℃，离心１０ｍｉｎ沉淀ＲＮＡ。弃上清液，加入１ｍＬ７０％乙醇，轻轻混匀，保存于－７０℃。临用前，取出保存于乙醇中的样品和对照ＲＮＡ，７５００犵，２℃～８℃离心５ｍｉｎ。弃上清液，将离心管倒扣在灭菌纱布上，室温干燥５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，加入１５μＬ无ＲＮａｓｅ水，溶解ＲＮＡ。６．３．３．２第一轮犚犜犘犆犚按表１配制第一轮ＲＴＰＣＲ反应液。每管加入ＲＮＡ２μＬ，按照逆转录：４５℃４５ｍｉｎ；预变性：９５℃１０ｍｉｎ；３４个循环：９５℃３０ｓ，５８℃４５ｓ，７２℃１ｍｉｎ；补充延伸：７２℃５ｍｉｎ；４℃保温，进行反应。表１第一轮犚犜犘犆犚反应液单位为微升ＷＮＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ试剂ＲＴＰＣＲ多重ＲＴＰＣＲ双蒸水（无ＲＮＡｓｅ）３２．０２８．０１０×ＰＣＲ缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）５．０５．０ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０５．０ｄＮＴＰｍｉｘ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０４．０ＭＭＬＶ逆转录酶（２００ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．１２５０．１２５核糖核酸酶抑制剂（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．１２５０．１２５ＴＭＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄＤＮＡ聚合酶（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．２５０．２５第一轮ＲＴＰＣＲ引物组合（见Ｂ．２）３．０６．０注：表中所列均为１个反应的量。６．３．３．３第二轮犘犆犚反应按表２配制第二轮ＰＣＲ反应液，取第一轮ＲＴＰＣＲ产物１．５μＬ做模板，按照预变性：９５℃１０ｍｉｎ；３４个循环：９５℃３０ｓ，５８℃４５ｓ，７２℃１ｍｉｎ；补充延伸：７２℃５ｍｉｎ；４℃保温，进行反应。表２第二轮犘犆犚反应液单位为微升ＷＮＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ试剂ＰＣＲ多重ＰＣＲ双蒸水（无ＲＮＡｓｅ）３４．０３０．０１０×ＰＣＲ缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）５．０５．０ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４．０５．０５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１表２（续）单位为微升ＷＮＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ试剂ＰＣＲ多重ＰＣＲｄＮＴＰｍｉｘ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０２．０ＴＭＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄＤＮＡ聚合酶（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．５０．５第二轮ＰＣＲ引物组合（见Ｂ．２）３．０６．０注：表中所列均为１个反应的量。６．３．３．４电泳取ＰＣＲ产物，用２％～３％琼脂糖凝胶，在１０Ｖ／ｃｍ～１５Ｖ／ｃｍ条件下电泳３０ｍｉｎ～５０ｍｉｎ。６．３．４结果判定阳性对照ＥＥＥＶ扩增出１４０ｂｐ条带，ＷＥＥＶ扩增出３３５ｂｐ条带，ＷＮＶ扩增出２４８ｂｐ条带，阴性对照无任何可见扩增，试验成立。待检样品若出现同阳性对照大小一致的扩增条带，应将扩增产物回收、测序确定。７血清学检测７．１血凝抑制试验７．１．１设备和器材Ｕ型血凝板、冷冻离心机、移液器（８孔道和单孔道）及配套枪头。７．１．２试剂和材料７．１．２．１阳性血清，由指定单位提供。７．１．２．２阴性血清，由指定单位提供。７．１．２．３抗原，由指定单位提供。７．１．２．４２５％白陶土溶液（用硼酸盐缓冲液ｐＨ９．０配制）。７．１．２．５硼酸盐缓冲液（ｐＨ９．０），配制见Ａ．４．１。７．１．２．６ＤＧＶ缓冲液，配制见Ａ．４．２。７．１．２．７红细胞：采集公鹅血，用ＤＧＶ洗涤３次，最后重悬于ＤＧＶ溶液中成７％悬液。存放于４℃备用。临用前将用硼酸盐缓冲液作１∶２４稀释。７．１．２．８血清样品：５６℃灭活３０ｍｉｎ，取０．１ｍＬ待检血清加０．４ｍＬ２５％白陶土溶液，混匀，置于３７℃作用３０ｍｉｎ，３０００犵离心５ｍｉｎ，取上清液备用。７．１．３操作方法７．１．３．１犎犃试验将抗原用硼酸盐缓冲液作１０倍稀释，４℃放置１ｈ。在血凝板的第１孔～第１２孔加入０．０５ｍＬ硼酸盐缓冲液；吸取０．０５ｍＬ稀释后的抗原加入第１孔，混匀；从第一孔吸取０．０５ｍＬ混匀后的抗原加入第２孔，混匀后吸取０．０５ｍＬ至第３孔，依次倍比稀释至第１１孔。从第１１孔吸取０．０５ｍＬ弃之。每６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１孔加入０．０５ｍＬ工作浓度的公鹅红细胞，室温孵育４５ｍｉｎ～６０ｍｉｎ后观察结果。以红细胞发生完全凝集的最高稀释度作为病毒抗原的１个血凝素单位（１ＨＡ）。配制８单位抗原用于ＨＩ试验。７．１．３．２犎犐试验ＨＩ试验程序见表３。除第１孔外，血凝板的第２孔～第１０孔，每孔加入０．０２５ｍＬ硼酸盐缓冲液。第１孔和第２孔各加入０．０２５ｍＬ血清样品，混匀后从第２孔吸取０．０２５ｍＬ血清加入第３孔，依次倍比稀释至第８孔，混匀后从第８孔吸取０．０２５ｍＬ，弃去。第９孔和第１０孔不加血清，第９孔为血凝素对照，第１０孔为稀释液对照。除第１０孔外，每孔加入８单位抗原０．０２５ｍＬ，４℃，过夜（或２２℃～２４℃，反应１ｈ）。每孔加入０．０５ｍＬ工作浓度的鹅红细胞悬液，３７℃，３０ｍｉｎ后判定结果。每次试验设立阳性和阴性血清对照。表３犎犐试验程序单位为毫升孔号１２３４５６７８９１０稀释倍数１／５１／１０１／２０１／４０１／８０１／１６０１／３２０１／６４０血凝素对照稀释液对照硼酸盐稀释液血清８单位抗原０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５—４℃，过夜（或２２℃～２４℃，反应１ｈ）红细胞０．０５反应３７℃，３０ｍｉｎ举例—————＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—７．１．４结果判定阳性血清对照ＨＩ滴度误差不超过一个滴度，阴性对照ＨＩ滴度小于１／１０，试验才为有效；待检血清的ＨＩ滴度在１／１０～１／２０之间为可疑，大于１／４０为阳性，小于１／１０为阴性。可疑样品重复试验后仍大于１∶１０的判为阳性。７．２犐犵犕捕获犈犔犐犛犃７．２．１设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、３７℃温箱、酶标仪（４０５ｎｍ）、单道微量移液器（１μＬ～２０μＬ和２０μＬ～２００μＬ）、多道微量移液器（２０μＬ～２００μＬ）及配套枪头、９６孔微量反应板。７．２．２试剂和材料７．２．２．１ＡＢＴＳ底物溶液。７．２．２．２捕获抗体（羊抗马ＩｇＭ抗体）。７．２．２．３辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗（２Ａ２Ｃ３）。７．２．２．４正常组织抗原，由指定单位提供。７．２．２．５ＥＥＥ和ＷＥＥ病毒抗原，由指定单位提供。７．２．２．６阳性血清（血清ＯＤ４０５ｎｍ值不小于０．６），由指定单位提供。７．２．２．７阴性血清（血清ＯＤ４０５ｎｍ值小于０．２），由指定单位提供。７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１７．２．２．８包被液、磷酸盐缓冲溶液、封闭液和ＰＢＳＴ溶液，配制见Ａ．５。７．２．２．９检测样品：血清和（或）脑脊液。７．２．３试验步骤７．２．３．１样品准备：用ＰＢＳＴ溶液将阴阳性血清和被检血清１∶４００倍稀释；脑脊液做１∶２倍稀释。７．２．３．２包被：用包被液稀释捕获抗体至工作浓度，每孔１００μＬ加至９６孔微量反应板，密封后置湿盒中４℃静置１４ｈ。包被好的微量反应板４℃可保存４５ｄ。注：每批捕获抗体应通过试验滴定以确定其最佳包被浓度。７．２．３．３封闭：取７．２．３．２包被好的微量反应板，弃去孔内液体，每孔加入３００μＬＰＢＳＴ溶液进行洗涤，重复３次。每孔加入３００μＬ封闭液，室温封闭６０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ，弃去孔内液体，同前洗涤３次。７．２．３．４参照表４，进行试验布局。表４犈犔犐犛犃试验布局１２３４５６７８９１０１１１２Ａ犅犾犪狀犽犅犾犪狀犽Ｓ１ａＳ１ａＳ２ａＳ２ａＳ３ａＳ３ａＳ４ａＳ４ａＳ５ａＳ５ａＢ犅犾犪狀犽犪犅犾犪狀犽犫Ｓ１ｂＳ１ｂＳ２ｂＳ２ｂＳ３ｂＳ３ｂＳ４ｂＳ４ｂＳ５ｂＳ５ｂＣＳ６ａＳ６ａＳ７ａＳ７ａＳ８ａＳ８ａＳ９ａＳ９ａＳ１０ａＳ１０ａＳ１１ａＳ１１ａＤＳ６ｂＳ６ｂＳ７ｂＳ７ｂＳ８ｂＳ８ｂＳ９ｂＳ９ｂＳ１０ｂＳ１０ｂＳ１１ｂＳ１１ｂＥＳ１２ａＳ１２ａＳ１３ａＳ１３ａＳ１４ａＳ１４ａＳ１５ａＳ１５ａＳ１６ａＳ１６ａＳ１７ａＳ１７ａＦＳ１２ｂＳ１２ｂＳ１３ｂＳ１３ｂＳ１４ｂＳ１４ｂＳ１５ｂＳ１５ｂＳ１６ｂＳ１６ｂＳ１７ｂＳ１７ｂＧＳ１８ａＳ１８ａＳ１９ａＳ１９ａＳ２０ａＳ２０ａＳ２１ａＳ２１ａ犘犆犪犘犆犪犖犆犪犖犆犪ＨＳ１８ｂＳ１８ｂＳ１９ｂＳ１９ｂＳ２０ｂＳ２０ｂＳ２１ｂＳ２１ｂ犘犆犫犘犆犫犖犆犫犖犆犫注：Ｂｌａｎｋ为空白对照，ＰＣ为阳性血清对照，ＮＣ为阴性血清对照，Ｓ为检测样品；ａ为正常组织抗原组，ｂ为病毒抗原组。一块９６孔微量反应板可检测２１个未知样品。７．２．３．５加入稀释后的待检样品、阳性血清、阴性血清，空白对照孔用ＰＢＳＴ代替，每孔５０μＬ，３７℃、孵育９０ｍｉｎ～１０５ｍｉｎ。７．２．３．６同前洗板３次。加入用ＰＢＳＴ稀释的病毒抗原和正常组织抗原，Ａ１和Ａ２孔加入５０μＬＰＢＳＴ，作无抗原对照。混匀，置湿盒中４℃孵育１４ｈ～２８ｈ。７．２．３．７同前洗板３次。每孔加入５０μＬＰＢＳＴ稀释的辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗，３７℃、湿盒中孵育９０ｍｉｎ～１０５ｍｉｎ。７．２．３．８同前洗板３次。每孔加入５０μＬ底物溶液，混匀、封口后在室温避光孵育３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ。７．２．３．９用酶标仪测定ＯＤ４０５ｎｍ值。７．２．４结果判定７．２．４．１有效性判定分别计算阳性血清对照病毒抗原孔和阴性血清对照病毒抗原孔的平均ＯＤ４０５ｎｍ值，用阳性对照的平均ＯＤ４０５ｎｍ值除以阴性对照的平均ＯＤ４０５ｎｍ计算Ｐ／Ｎ值。Ｐ／Ｎ值≥２．０试验成立。７．２．４．２阳性临界值的计算阳性临界值等于两个阴性血清对照病毒抗原孔的平均ＯＤ４０５ｎｍ值再乘以２。７．２．４．３结果判定被检样品的ＯＤ４０５ｎｍ值大于或等于阳性临界值，判定为阳性；被检样品的ＯＤ４０５ｎｍ值小于阳性临界８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１值，判定为阴性；若同一样品病毒抗原孔产生的ＯＤ４０５ｎｍ值大于阳性临界ＯＤ４０５ｎｍ值，但正常抗原孔的ＯＤ４０５ｎｍ值大于病毒抗原孔的ＯＤ４０５ｎｍ，试验为非特异性反应，需重新试验。７．３蚀斑减数中和试验（犘犚犖犜）７．３．１设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、水浴锅、二氧化碳培养箱、倒置式光学显微镜、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、微量移液器（５０μＬ～２００μＬ）（及配套枪头）。７．３．２试剂和材料７．３．２．１试剂ＥＭＥＭ培养基、１０×Ｅａｒｌｅ’ｓＢＢＳ缓冲液，胎牛血清（ＦＢＳ）（无ＢＶＤＶ、ＶＥＥ、ＥＥＥ和ＷＥＥ抗体，并经辐照处理）、制霉菌素Ｂ、庆大霉素、碳酸氢钠溶液、中性红和铺板溶液（溶液Ⅰ和溶液Ⅱ），配制见Ａ．６。７．３．２．２材料Ｖｅｒｏ细胞、病毒储液（ＥＥＥ，ＷＥＥ，ＶＥＥ）、阳性血清（分别抗ＶＥＥ，ＥＥＥ和ＷＥＥ）、阴性血清、待检样品［血清和（或）脑脊液］、玻璃移液管、离心管、细胞培养瓶。７．３．３操作步骤７．３．３．１病毒抗原的工作浓度确定７．３．３．１．１病毒接种用ＥＭＥＭ无血清培养基将病毒储液从１０－１到１０－８梯度稀释后，每个梯度取０．２ｍＬ液体和０．２ｍＬＥＭＥＭ（含２０％ＦＢＳ）混合，３７℃孵育７５ｍｉｎ～８０ｍｉｎ。每个稀释度各接种两瓶Ｖｅｒｏ细胞，０．１ｍＬ／瓶，３７℃孵育１ｈ～２ｈ。７．３．３．１．２铺板计数将铺板溶液Ⅱ置于５６℃水浴３０ｍｉｎ后转移到４７℃水浴，同时将铺板溶液Ⅰ置于４７℃水浴。铺板前１５ｍｉｎ配制铺板溶液：将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ等体积混合，置于４７℃水浴备用。弃去感作病毒液，每瓶加铺板溶液６ｍＬ，水平放置１５ｍｉｎ，待琼脂自然凝固后，３７℃倒置培养２ｄ～３ｄ。逐日观察每个稀释度的蚀斑形成情况。取最接近１００ｐｆｕ（蚀斑形成单位）的稀释度，按式（１）折算为１００ＰＦＵ／０．１ｍＬ的稀释度（犡）。用该稀释度作为病毒储液的工作浓度。（ＰＦＵ／０．１ｍＬ）×（稀释度）＝（１００ＰＦＵ／０．１ｍＬ）×（犡）……………（１）７．３．３．２细胞准备将Ｖｅｒｏ细胞传于２５ｃｍ２细胞瓶中，待细胞长满备用。若同时检测ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ和ＶＥＥＶ，每次试验至少需１８瓶细胞作试验对照：３瓶用作细胞对照，６瓶用作感染工作浓度病毒对照（每种病毒－１工作浓度病毒对照（每种病毒１瓶），６瓶用作ＥＥＥ、ＷＥＥ、ＶＥＥ阳性血清对照２瓶），３瓶用作感染１０（每种病毒做两瓶：一瓶加１∶１０稀释血清，一瓶加１∶１００稀释血清）。每份样品，若同时做ＶＥＥ、ＥＥＥ和ＷＥＥ鉴别，需用６瓶细胞：每种病毒用２瓶，一瓶加１∶１０稀释血清，一瓶加１∶１００血清。７．３．３．３血清样品的稀释７．３．３．３．１无菌吸取０．２ｍＬ待检样品和阳性血清加入０．８ｍＬＥＭＥＭ（含１×抗生素）中做１∶５稀９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１释后，取０．１ｍＬ稀释液加到０．９ｍＬ的ＥＭＥＭ（含１×抗生素）中，使得血清稀释度为１∶５０。样品和对照血清，５６℃灭活２５ｍｉｎ～３５ｍｉｎ。取１．５ｍＬ离心管若干，如下分装：———待测样品和阳性血清：每种病毒，各取１∶５稀释和１∶５０稀释的血清０．２ｍＬ分别加入不同的离心管中；———病毒对照：每种病毒，取３支管，每支加入０．２ｍＬＥＭＥＭ培养基（２０％ＦＢＳ）。２支做工作浓度病毒对照，１支做１０－１工作浓度病毒对照；———细胞对照：只含０．２ｍＬＥＭＥＭ培养基（１０％ＦＢＳ）。７．３．３．３．２将配制好的样品和对照置冰盒中，备用。７．３．３．４中和反应７．３．３．４．１按７．３．３．１．２准备工作浓度病毒液（１００ＰＦＵ／０．１ｍＬ）。取０．２ｍＬ工作浓度病毒液加至－１工作浓度病毒液（１０ＰＦＵ／０．１ｍＬ）。１．８ｍＬＥＭＥＭ中，制备成１０７．３．３．４．２取０．２ｍＬ工作浓度病毒液加入到７．３．３．３．１分装的待检血清和阳性血清中，稀释血清至－１工作浓度病毒液加入到７．３．３．３．１的病１∶１０和１∶１００；取０．２ｍＬ稀释好的工作浓度病毒液和１０毒对照中；细胞对照不添加病毒液。分别混匀，３７℃孵育７５ｍｉｎ～８０ｍｉｎ后转移到冰盒中备用。７．３．３．５接种弃去细胞培养液，取７．３．３．４．２反应后的混合物０．１ｍＬ加至７．３．３．２准备的细胞单层，使混合液均匀布满整个细胞表面。细胞对照加０．１ｍＬＥＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）。３７℃孵育１ｈ～２ｈ，每隔２０ｍｉｎ摇动一次细胞瓶。７．３．３．６铺板按照７．３．３．１．２的方法进行铺板。待琼脂自然凝固，３７℃、５％二氧化碳倒置培养２ｄ～３ｄ，观察结果。７．３．４结果判定－１工作浓度病毒对照相对于工作浓度病毒对照蚀斑减少９０％±５％；阳性血清对照在７．３．４．１１０１∶１０和１∶１００两个稀释度均无蚀斑出现，或蚀斑数在１０个以内；细胞对照组无任何病毒蚀斑，细胞生长良好，则试验成立。７．３．４．２若样品出现较多蚀斑，数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的２０％（及以上），判定为阴性；若样品蚀斑数相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的１０％～２０％，判定为可疑；若无可见病毒蚀斑，或蚀斑数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的１０％（及以内），判定为阳性。８结果报告８．１病原分离鉴定在病毒分离中任一试验为阳性，且ＲＴＰＣＲ和（或）免疫荧光试验为阳性，就可判定为马脑脊髓炎（东部型或西部型）病原分离鉴定阳性。否则，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）病原分离鉴定阴性。８．２血清学检测在血凝抑制试验和病毒蚀斑减数中和试验中，任一试验结果为阳性，判定为马脑脊髓炎（东部型或西部型）抗体阳性。否则，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）抗体阴性。若同一动物的血清和脑脊液的ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的结果均为阳性，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）阳性，否则，需进一步试验。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１附录犃（规范性附录）试剂配制犃．１采样用试剂犃．１．１犘犅犛／犅犛犃溶液配制磷酸氢钠１．１９ｇ磷酸二氢钠０．２２ｇ氯化钠８．５ｇ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）７．５ｇ混合前三种药品，加双蒸水至１Ｌ，用氢氧化钠溶液调节ｐＨ至７．８。加入ＢＳＡ，溶解后过滤除菌。４℃保存。犃．１．２抗生素溶液青霉素Ｇ钾（１５８６Ｕ／ｍｇ）１５．７７ｇ硫酸链霉素５０ｇ加水至１Ｌ，溶解后过滤除菌。分装后－２０℃保存。犃．１．３样品缓冲液在采集组织样品前，取抗生素溶液０．２ｍＬ加入１００ｍＬＰＢＳ／ＢＳＡ溶液。４℃保存。犃．２病原分离用试剂犃．２．１犕犈犕细胞生长液和维持液按照ＭＥＭ培养基说明书配制，通过添加氢氧化钠或盐酸溶液调节ｐＨ值至６．９和７．２两个梯度，前者用于ＲＫ１３细胞培养，后者用于Ｖｅｒｏ细胞培养；并添加胎牛血清制备８％和１２％两种不同血清浓度的培养基，前者作为细胞生长液，后者作为细胞维持液。犃．２．２犃犜犞缓冲液氯化钠８．０ｇ氯化钾０．４ｇ右旋葡萄糖１．０ｇ碳酸氢钠０．５８ｇ胰蛋白酶０．５ｇ二乙胺四乙酸二钠０．２ｇ５％酚红０．４ｍＬ加双蒸水８００ｍＬ，用氢氧化钠溶液调节ｐＨ到７．２，定容至１Ｌ。过滤除菌。分装、保存于－２０℃。１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１犃．３免疫荧光试验用试剂犃．３．１犘犅犛溶液氯化钠８．５０ｇ磷酸氢钠１．３３ｇ磷酸二氢钠０．２２ｇ加水至９００ｍＬ，用氢氧化钠溶液调节ｐＨ至７．２，定容至１Ｌ，１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌，室温保存。犃．３．２封闭溶液犃．３．２．１封闭液１将ＦＩＴＣ标记病毒特异性抗体储液用无菌ＰＢＳ稀释至工作浓度的２×；取１体积的（未稀释）阴性血清（和标记抗体来源于相同种属的动物）和１体积的ＦＩＴＣ标记病毒特异性抗体溶液（２×）等体积混合。犃．３．２．２封闭液２将ＦＩＴＣ标记病毒特异性抗体储液用无菌ＰＢＳ稀释至工作浓度的２×；取１体积的（未稀释）非标记病毒特异性抗体（和标记抗体来源于相同种属的动物，且最好为同一批次）和１体积的ＦＩＴＣ标记病毒特异性抗体溶液（２×）等体积混合。犃．３．３封固溶液甘油／ＰＢＳ溶液（１∶１，体积比），１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌后室温保存。犃．４血凝抑制试验用试剂犃．４．１硼酸盐缓冲液（狆犎９．０，含０．４％犅犛犃）１．５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠１６０ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ硼酸（Ｈ３ＢＯ４）２００ｍＬ１．０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠４７ｍＬ加水至１．８Ｌ，用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液或０．５ｍｏｌ／ＬＨ３ＢＯ３调节ｐＨ到９．０，定容至２Ｌ。每升硼酸盐缓冲液加入４ｇ牛血清白蛋白。犃．４．２犇犌犞（犇犲狓狋狉狅狊犲犵犲犾犪狋犻狀狏犲狉狅狀犪犾）缓冲液犃．４．２．１犃液明胶０．６００ｇ二乙基巴比妥酸（巴比妥）０．５８０ｇ犃．４．２．２犅液巴比妥钠０．３８０ｇ无水氯化钙０．０２０ｇ氯化钠８．５００ｇ１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１葡萄糖１０．０００ｇ硫柳汞（Ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌｐｏｗｄｅｒ）０．１００ｇ七水硫酸镁０．１２０ｇ分别用２５０ｍＬ和７５０ｍＬ水溶解配制Ａ液和Ｂ液。混合Ａ液和Ｂ液，１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌后室温保存。犃．５犈犔犐犛犃试验用试剂犃．５．１包被液无水碳酸钠０．３８６ｇ无水碳酸氢钠０．７６ｇ蒸馏水２００ｍＬ用５ｍｏｌ／Ｌ盐酸将ｐＨ调至９．６±０．０５，４℃保存，１周内使用。犃．５．２磷酸盐缓冲溶液（犘犅犛）氯化钠８．５ｇ磷酸二氢钠０．２２ｇ磷酸氢二钠１．１９ｇ加水９００ｍＬ，用盐酸将ｐＨ调至７．２±０．１，定容至１Ｌ，１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌后室温保存。犃．５．３犘犅犛犜溶液０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ１．０Ｌ吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬ犃．５．４封闭液脱脂奶粉５．０ｇＰＢＳ：Ｔｗｅｅｎ２０１００．０ｍＬ混匀、溶解后于４℃储存，１周内使用。犃．６蚀斑减数中和试验用试剂１）犃．６．１犈犕犈犕培养基（犕犻狀犻犿狌犿犈狊狊犲狀狋犻犪犾犕犲犱犻狌犿狑犻狋犺犈犪狉犾犲’狊狊犪犾狋狊）ＭＥＭｗｉｔｈＥａｒｌｅ’ｓ盐９．６１ｇＥｄａｍｉｎｔｙｐｅＳ５．０ｇ（单独溶解于１００ｍＬ水中）丙酮酸钠１０．０ｍＬＬ谷氨酰胺１２．０ｍＬ碳酸氢钠１．５ｇ将ＭＥＭｗｉｔｈＥａｒｌｅ’ｓ盐、丙酮酸钠、Ｌ谷氨酰胺及碳酸氢钠混合后，加入溶解的ＥｄａｍｉｎｔｙｐｅＳ，加双蒸水至１Ｌ。用２ｍｏｌ／Ｌ盐酸调节ｐＨ至７．０～７．２，过滤除菌。临用前按要求加入胎牛血清。２）犃．６．２０．１％中性红中性红（６５％ｄｙｅｉｎｐｏｗｄｅｒ）０．１５１ｇ１）、２）市售可用。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１加双蒸水至１００．０ｍＬ，１１５℃，１０ｍｉｎ，高压灭菌（或过滤除菌）。４℃避光保存。犃．６．３７．５％碳酸氢钠溶液准确称取７５ｇ碳酸氢钠，加入９２５ｍＬ双蒸水，定容至１Ｌ。犃．６．４铺板溶液配制配制见表Ａ．１。表犃．１铺板溶液配制表液体单位为毫升（固体单位为克）终体积／含量１００１５０２００２５０３００４００５００６００７００８００１０００ａＥａｒｌｅ’ｓＢＢＳ缓冲液（１０×）１０１５２０２５３０４０５０６０７０８０１００灭菌双蒸水３４５１６８８５１０２１３８１７０２０４２３８２７２３４０胎牛血清２３４５６８１０１２１４１６２０溶庆大霉素（５０ｍｇ／ｍＬ）０．１０．１５０．２０．２５０．３０．４０．５０．６０．７０．８１液Ⅰ制霉菌素Ｂ（１ｍｇ／ｍＬ）０．０５０．０７０．１０．１２０．１５０．２０．２５０．３０．３５０．４０．５０．１％中性红（注意避光）１１．５２２．５３４５６７８１０ＮａＨＣＯ３（７．５％）（最后加）３４．５６７．５９１２１５１８２１２４３０制备方法配制完毕后，过滤除菌低熔点琼脂／ｇ１１．５２２．５３４５６７８１０溶液灭菌双蒸水５０７５１００１２５１５０２００２５０３００３５０４００５００Ⅱ制备方法１２１℃，１０ｍｉｎ高压灭菌ａ市售可用。１４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８６３—２０１１附录犅（规范性附录）犚犜犘犆犚引物犅．１引物列表引物列表见表Ｂ．１。表犅．１引物列表病毒第二轮产物长度第一轮引物（５’３’）第二轮引物（５’３’）名称ｂｐＷＮＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＣＷＮＣＧＣＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＣＴＡＡＡＧＷＮＶ２４８ＷＮＢＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＡＣＡＣＴＷＮＤＣＣＡＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＴＥＥＥＡＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＴＴＧＡＣＥＥＥＣＧＧＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧＡＥＥＥＶ１４０ＥＥＥＢＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＡＧＴＡＴＴＧＥＥＥＤＣＧＧＡＴＧＴＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＡＷＥＥＡＴＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＧＷＥＥＣＣＴＣＡＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＧＴＣＡＷＥＥＶ３３５ＷＥＥＢＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＷＥＥＤＡＧＴＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＡＧＣ注：Ｂ引物和Ｄ引物均为下游引物，Ｃ和Ｄ引物在Ａ和Ｂ引物的内侧。犅．２引物的使用在多重ＲＴＰＣＲ中引物浓度：将合成的引物溶解于无ＲＮａｓｅ水中，至２５ｐｍｏｌ／μＬ。对于普通ＲＴＰＣＲ，每条引物加１．５μＬ，对于多重ＲＴＰＣＲ（ｍＲＴＰＣＲ）每条引物加１．０μＬ。为了方便试验，可以将引物预先混合在一起。引物组合见表Ｂ．２。表犅．２引物组合检测对象第一轮ＲＴＰＣＲ引物组合第二轮ＰＣＲ引物组合ＷＮＶＷＮＡ、ＷＮＢＷＮＣ、ＷＮＤＥＥＥＶＥＥＥＡ、ＥＥＥＢＥＥＥＣ、ＥＥＥＤＷＥＥＶＷＥＥＡ、ＷＥＥＢＷＥＥＣ、ＷＥＥＤＷＮＶ、ＥＥＥＶ和ＷＥＥＶＷＮＡ、ＷＮＢ、ＥＥＥＡ、ＥＥＥＢ、ＷＥＥＡ、ＷＥＥＢＷＮＣ、ＷＮＤ、ＥＥＥＣ、ＥＥＥＤ、ＷＥＥＣ、ＷＥＥＤ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２３６８２／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８６３—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．２５字数３１千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６６２定价２１．００元'