SNT2870-2011 中肠腺坏死杆状病毒病(BMNV)检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８７０—２０１１中肠腺坏死杆状病毒病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫犪犮狌犾狅狏犻狉犪犾犿犻犱犵狌狋犵犾犪狀犱狀犲犮狉狅狊犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘渤、陈莉莉、宗卉、罗卫、江育林。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１中肠腺坏死杆状病毒病检疫技术规范１范围本标准规定中肠腺坏死杆状病毒病（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌｍｉｄｇｕｔｇｌａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓ，ＢＭＮ）的检测方法，是用临床症状作为初步诊断，压片和组织病理切片作为确诊的检疫方法。本标准适用于中肠腺坏死杆状病毒病的诊断和鉴定，适用于本病的流行病学调查、检疫和监测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３设备、材料及试剂本标准所用试剂除特殊规定外均为分析纯，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。３．１石蜡组织切片机。３．２组织脱水机（使用手工脱水的缸）。３．３石蜡包埋机。３．４切片染色机（使用手工染色所需的缸）。３．５展片所用水浴锅。３．６烘片机。３．７正置显微镜。３．８载玻片、盖玻片等常规组织切片用具。３．９Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ固定液（见Ａ．１）。３．１０石蜡（熔点５２℃～５４℃或５０℃～５２℃）：切片级。３．１１乙醇：包括无水乙醇、９５％乙醇、８５％乙醇、８０％乙醇、７５％乙醇、５０％乙醇。３．１２二甲苯。３．１３盐酸。３．１４氢氧化钠。３．１５苏木素染色液（见Ａ．２）。３．１６伊红染色液（见Ａ．３）。３．１７黏片剂（见Ａ．４）。４诊断方法４．１犅犕犖犞的初步诊断方法对于监测和检测ＢＭＮＶ，最好取幼体和早期的仔虾。临床症状：幼体和仔虾患病后，首先可以看到白浊的中肠腺。随着疾病的发展，白浊化越来越明显，１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１越来越容易辨认。参见图Ｂ．１４．２犅犕犖犞的确诊方法４．２．１压片法用新鲜对虾的中肠腺压片或涂片染色后在暗视野下检查能快速诊断ＢＭＮ病毒感染。将组织置于载玻片上，用解剖刀将样品切碎，盖上盖玻片，在暗视野下观察。４．２．２组织病理学技术４．２．２．１组织固定４．２．２．１．１用Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓＡＦＡ固定液固定欲检查的虾，准备足够的固定液，固定液体积应是欲固定的组织块总体积的１０倍～１５倍。推荐用Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓＡＦＡ固定液，该固定液可迅速固定并减轻对虾的自溶变化，而且其中含的酸性成分可以除去表皮的石灰质。４．２．２．１．２对虾幼体或仔虾，用细网筛或者吸管把所选的幼体或仔虾直接放入固定液。固定１２ｈ～２４ｈ，然后转入５０％～７０％的乙醇中保存。４．２．２．１．３稍大的仔虾和很小的稚虾：用针或尖头镊子切去体表虾壳，把虾直接浸泡在固定液中，固定１２ｈ～２４ｈ，然后转入５０％～７０％的乙醇中保存。４．２．２．１．４更大的仔虾、稚虾和成虾，用注射器往虾头处注入固定液（用量为样品体积的５％～１０％。针头大小根据虾的大小决定，例如对仔虾和小稚虾可用２７号针头）。首先注射中肠腺，要注射２个或多个位点，注射的量要足以使中肠腺变白或橘黄色；然后取出中肠腺浸泡在固定液中，固定１２ｈ～２４ｈ，然后转入５０％～７０％的乙醇中保存。４．２．２．２组织学标本的修整取材４．２．２．２．１从５０％或７０％的乙醇保存液中取出固定好的标本，置于木头或塑料垫板上，根据标本的大小进行修整，确保目标组织能被有效切片。４．２．２．２．２幼体和仔虾：用擦镜纸将个体包好，放于脱水盒中进行脱水，包埋时去除擦镜纸，用热镊子调整标本在包埋器皿中的位置进行包埋。４．２．２．２．３小于３ｃｍ的幼虾：用单面刀片或解剖刀沿幼虾的中线右侧将标本纵剖两半。取包含中线的左侧进行脱水，包埋时纵切面向下包埋。４．２．２．２．４大于３ｃｍ的幼虾或亚成年虾：用单面刀片或解剖刀从对虾的头胸和腹节连接处切断，再将头胸沿中线右侧纵剖两半。取包含中线的左侧，切去步足８０％的长度，剔除胃内容物；如果头胸长度大于１ｃｍ，切取包含胃部和肝胰腺部分的１ｃｍ以下的部分；如果厚度大于０．５ｃｍ，削去高出０．５ｃｍ的部分，再从不含中线的右侧头胸部斜切下鳃区，将切取的含中线左侧头胸部和切下的鳃区放入同一个脱水盒中进行脱水，包埋时将含中线左侧头胸部的纵切面向下，鳃区的纵切面向上，前后对错放入同一个包埋器皿中包埋。４．２．２．２．５大于８ｃｍ的虾，参照大于３ｃｍ的虾进行修整，按照长宽不超过１ｃｍ×１ｃｍ、厚度不超过０．５ｃｍ的要求，针对目标组织进行修整。４．２．２．３组织脱水用梯度乙醇逐步脱水。流程如下：７０％乙醇（２ｈ）→８０％乙醇（２ｈ）→９０％乙醇（９０ｍｉｎ）→９５％乙醇（４５ｍｉｎ）→９５％乙醇（４５ｍｉｎ）→１００％乙醇（３０ｍｉｎ）→１００％乙醇（３０ｍｉｎ）。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１４．２．２．４组织透明１／２二甲苯＋１／２乙醇混合液（３０ｍｉｎ）→二甲苯（３０ｍｉｎ）→二甲苯（３０ｍｉｎ）。４．２．２．５浸蜡与包埋将透明好的材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍１ｈ～２ｈ，再先后移入２个熔化的石蜡液中浸渍３ｈ左右，浸蜡应在高于石蜡熔点３℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中，待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。通常石蜡采用熔点为５２℃～５４℃或５０℃～５２℃，可根据季节及操作环境温度来选用。４．２．２．６切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切成４μｍ～６μｍ厚的切片，对每个石蜡包埋块至少切取两块不连续的切片。４．２．２．７展片在４０℃的水浴锅中展片，用涂有黏片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于４５℃烘片２ｈ。４．２．２．８切片脱蜡及犎犈染色室温低于２５℃时，应将贴有切片的载玻片置于３０℃～４０℃的干燥箱内加温后，再尽快转入二甲苯中脱蜡；或者将二甲苯稍加温而脱蜡，两法均可使切片脱蜡彻底。脱蜡后，入无水乙醇洗去二甲苯成分，为防止脱片，再按以下步骤进行梯度乙醇至水：二甲苯→二甲苯→１／２二甲苯＋１／２乙醇混合液→１００％乙醇→９５％乙醇→８５％乙醇→７０％乙醇→５０％乙醇→３０％乙醇→苏木素染色液→０．０１％盐酸→０．０１％氢氧化钠→蒸馏水→３０％乙醇→５０％乙醇→７０％乙醇→８５％乙醇→伊红染液→９５％乙醇→１００％乙醇→１００％乙醇→１／２二甲苯＋１／２乙醇混合液→二甲苯→二甲苯。４．２．２．９封片滴加２滴中性树胶封片。４．２．２．１０镜检明视野显微镜下观察。５结果判定５．１压片法：暗视野显微观察患病仔虾的中肠腺上皮细胞中的核，由于核中有大量病毒颗粒增加了折射和衍射特性，所以通过暗视野显微镜观察患病虾的中肠腺上皮细胞，可见到直径１０μｍ～３０μｍ、白色、轮廓清晰的圆形或长椭圆形的细胞核。用１０％福尔马林固定组织块也能看到相似的结果，参见图Ｂ．２。５．２ＨＥ染色后，在普通显微镜（明视野）下观察。感染了ＢＭＮＶ的虾的中肠腺上皮细胞核呈明显肥大，比正常的要大２倍～５倍。并伴随进行性坏死。在不正常细胞核里可看到染色质向四周迁移、甚至核破裂。但是看不到任何包涵体（参见图Ｂ．３、图Ｂ．４）。而ＢＰ和ＭＢＶ感染后会产生大量明显的三角形和圆形的包涵体。３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１附录犃（规范性附录）试剂配制犃．１犇犪狏犻犱狊狅狀’狊犃犉犃固定液９５％乙醇３３０ｍＬ福尔马林２２０ｍＬ冰醋酸１１５ｍＬ蒸馏水（海水）３３５ｍＬ犃．２苏木素染色液（犎牔犈染色用）木素０．５ｇ醋酸２０ｍＬ铵明矾２５．０ｇ蒸馏水５００ｍＬ碘酸钠０．１ｇ犃．３伊红染色液（犎牔犈染色用）８０％乙醇１００ｍＬ伊红０．１ｇ犃．４黏片剂明胶２ｇ热水１５ｍＬ溶解后加入苯酚、甘油混匀，在棕色瓶中室温储存。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１附录犅（资料性附录）中肠腺坏死杆状病毒病犅．１中肠腺坏死杆状病毒（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｍｉｄｇｕｔｇｌａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＢＭＮＶ）是一种有囊膜的杆状病毒，大小约为３１０ｎｍ×７２ｎｍ。在分类上属Ｃ型杆状病毒，即不产生包涵体的核型杆状病毒。而对虾杆状病毒（ＢＰ）和斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）则是能在细胞核里分别产生三角形和圆形核型包涵体的Ａ型杆状病毒。虽然这三种病毒的靶器官均是肝胰腺和中肠腺。但由于虾感染ＢＭＮＶ后肝胰腺变白浊而不透明，且肥大的核里没有包涵体，因此从组织病理上很容易把它们区分开。ＢＭＮＶ可引起健康的日本对虾幼体大量死亡。人工感染可使斑节对虾、中国对虾和短沟对虾生病。该病主要危害幼体（尤其是糠虾幼体）、仔虾（主要是ｐ２到ｐ１２）和稚虾，有时也感染成虾。感染病毒的幼体８ｄ～９ｄ的累计死亡率为７０％～１００％。生病时水温一般是１９℃～２９℃。带病毒的亲虾是该病的主要传染源，病毒可随中肠腺上皮细胞的坏死而被排出体外，释放于水中而成为新的传染源。健康虾摄食病虾后即被感染。犅．２该病主要流行于亚洲。１９７１年在日本首次报道了ＢＭＮ的流行，目前该病被认为是日本对虾苗种场的主要疾病。日本和韩国养殖及野生的日本对虾中都已发现有中肠腺坏死杆状病毒，菲律宾、澳大利亚和印度尼西亚曾报道在斑节对虾体内也发现了ＢＭＮＶ。犅．３从１９９５年到２０００年的世界动物卫生组织（ＯＩＥ）公布的水生动物疾病名录中，均将该病列为重要的甲壳动物病害，但由于该病的流行范围等原因，自２００３年起ＯＩＥ已将该病从水生动物的疾病名录中删除。虽然该病流行范围小，但主要集中在亚洲，感染该病能引起多种对虾幼体大规模的死亡，并且近几年东南亚地区仍有该病发生。近年来中国水产品贸易不断加大，其中甲壳动物的贸易量也在迅猛增加，使该病传播和流行的机率也大大增加。因此，建立该病的检疫规程对于保护我国对虾养殖业并确保贸易安全仍然显得十分重要。在２００５年农业部发布的第５３号令中还将该病列为三类疫病。犅．４根据ＯＩＥ的诊断手册所推荐的检测方法，根据临床症状，即可以看到白浊不透明的肝胰腺和中肠腺。并且随着疾病的发展，白浊化越来越明显来进行初步诊断。而确诊可以用印片法在暗视野下观察，或者用组织病理学方法制备石蜡切片并染色后在光镜下观察虾的肝胰腺上皮细胞，能看到有肥大且没有包涵体的核（比正常的核要大２倍～５倍）来完成。－６的氯，２５×１０－６的碘、氯化苯甲烃胺犅．５对用消毒剂杀ＢＭＮＶ效果的研究显示，该病毒可被５×１０（苄烷胺）、氯化苄甲乙氧胺和０．５％的福尔马林灭活。但上述浓度的溶液对于对虾幼体有毒性，因此没有一种消毒剂能实际用于虾卵孵化中清除ＢＭＮＶ感染。用清洁海水清洗无节幼体或受精卵以清除粪便是生产无ＢＭＮＶ虾苗的较好方法。图Ｂ．１为患ＢＭＮ的日本对虾苗在暗视野的光镜下观察，箭头是呈白浊的坏死肝胰腺。图Ｂ．２为感染了ＢＭＮＶ的对虾苗中肠腺压片的暗视野照片，可见白色、轮廓清晰的圆形或长椭圆形的肥大的上皮细胞核。图Ｂ．３为被ＢＭＮＶ感染的虾苗肝胰腺切片。坏死的上皮细胞的细胞核肿大。几乎占据了整个细胞。图Ｂ．４为高倍放大的切片。在细胞核里看不到细胞核。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７０—２０１１图犅．１图犅．２图犅．３图犅．４６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售２０１１—２８７０／犜犛犖中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中肠腺坏死杆状病毒病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８７０—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１３千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６７３定价１６．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载'