SNT2871-2011 猪萎缩性鼻炎检疫技术规范.pdf

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８７１—２０１１猪萎缩性鼻炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊狑犻狀犲犪狋狉狅狆犺犻犮狉犺犻狀犻狋犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（２００９版）（Ｍａｎｕａｌｏｆｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｔｅｓｔｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌａｎｉｍａｌｓ）第２．８．２章制定。主要修改如下：———本标准完全采用了ＯＩＥ规定的病原分离、鉴定方法；———本标准增加了病原的生化鉴定的具体指标；———本标准删除了ＯＩＥ中提到但没有具体步骤的核酸鉴定方法和血清学方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局，中华人民共和国南京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：姜焱、吴晓薇、侯玉峰、方绍庆、刘骏、王凯民、彭小莉、蒋鲁岩、唐泰山、张常印。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１猪萎缩性鼻炎检疫技术规范１范围本标准规定了猪萎缩性鼻炎的病原的临床诊断、分离鉴定、毒素鉴定，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。本标准适用于猪萎缩性鼻炎的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＲ（ｓｗｉｎｅａｔｒｏｐｈｉｃｒｈｉｎｉｔｉｓ）：猪萎缩性鼻炎Ｂｂ（犅狅狉犱犲狋犲犾犾犪ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）：支气管败血波氏杆菌ＮＰＡＲ（ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇａｔｒｏｐｈｉｃｒｈｉｎｉｔｉｓ）：非进行性萎缩性鼻炎ＰＡＲ（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅａｔｒｏｐｈｉｃｒｈｉｎｉｔｉｓ）：进行性萎缩性鼻炎ＰｍＡ：Ａ型荚膜的多杀性巴氏杆菌ＰｍＤ：Ｄ型荚膜的多杀性巴氏杆菌Ｔ＋Ｐｍ（ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ犘犪狊狋犲狌狉犲犾犾犪）：产毒素多杀性巴氏杆菌４犃犚的检疫方法４．１犃犚临床诊断４．１．１ＡＲ的相关资料参见附录Ａ。对仔猪群应检查下列症状：有一定数目的仔猪流鼻液、流泪、鼻塞或咳嗽，但无热，个别鼻液混有血液。一些仔猪发育迟滞、犬齿部位的上唇侧方肿胀。４．１．２对育成猪群和成猪群应检查：ａ）鼻塞，不能长时间将鼻端留在粉料中采食；ｂ）两侧内眼角下方颊部形成“泪斑”；ｃ）鼻部和颜部有如下变形；１）上颚短缩，前齿咬合不齐；２）鼻端向一侧弯曲或鼻部向一侧歪斜；３）鼻背部横皱褶逐渐增加；４）眼上缘水平上的鼻梁变平变宽。ｄ）伴有生长欠佳。４．１．３检疫猪群发现有上列症候群，可以临床上初步诊断猪群有支气管败血波氏杆菌Ｉ相菌的感染或１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１与产毒素性多杀巴氏杆菌的混合感染，需要进行细菌学试验予以确诊。４．２犃犚培养鉴定４．２．１病料采集４．２．１．１根据猪只大小准备棉拭子的长度和粗细，包装密封，高压消毒。４．２．１．２将疑似仔猪仰卧保定，泪斑明显的哺乳猪根据情况采用合适的保定方法，将鼻盘部用７５％的酒精擦净、消毒。４．２．１．３将灭菌拭子放入鼻腔中，先通过前庭弯曲部，直达鼻道中部，旋转拭子将鼻分泌物取出。４．２．１．４将拭子放入灭菌的空试管中（不要贴壁推进），或将拭子放入非营养性的培养基中（如：磷酸盐缓冲液），样品放在４℃～８℃保存。４．２．１．５解剖猪时，鼻锯和鼻手术部位应用火焰消毒，拭子由鼻中隔插入筛板，采集两侧鼻腔后部的分泌或拭子由声门插入达气管下部，在气管壁旋转拭子取出气管上下部的分泌物。同时在肺门部位采集肺组织，如有肺炎可在病变部采集组织块；也可以用拭子插入肺断面采集肺液和破碎组织。采集的样品２４ｈ内送到实验室接种选择性培养基。４．２．２病原培养４．２．２．１培养基制备用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求。使用改良的Ｋｎｉｇｈｔ培养基；ＫＰＭＤ培养基、改良的麦康凯培养基、改良的ＳｍｉｔｈＢａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ培养基，具体配制方法见附录Ｂ。４．２．２．２病原分离培养所有病料都直接涂抹在干燥的选择性平板上。分离Ｂｂ可以接种于改良的Ｋｎｉｇｈｔ培养基和ＫＰＭＤ培养基；分离Ｐｍ可以接种于改良的麦康凯培养基或改良的ＳｍｉｔｈＢａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ培养基。如采集的样品在４℃～８℃２４ｈ以后运输送到实验室的，接种小鼠来提高Ｐｍ的分离率，再通过相应的细菌镜检和生化反应，鉴定Ｂｂ和Ｔ＋Ｐｍ这两种细菌。４．２．２．３犘犿分离物特性鉴定４．２．２．３．１犘犿一般特性鉴定４．２．２．３．１．１Ｔ＋Ｐｍ改良的麦康凯培养基的可疑菌落特征是菌落直径约１ｍｍ～２ｍｍ，圆整、光滑、隆起、透明，菌落或呈粘液状融合。４．２．２．３．１．２挑取可疑菌落进行革兰氏染色，Ｔ＋Ｐｍ为革兰氏阴性小杆菌，呈两极染色，散在或成对排列。４．２．２．３．１．３在血平板上出现灰白色菌落。具有以下生化特性：ａ）糖管：包括木糖、葡萄糖、甘露糖及果糖产酸，对乳糖、麦芽糖。阿拉伯糖及杨苷不产酸。ｂ）不产生硫化氢。ｃ）氧化酶试验、过氧化氢酶试验以及吲哚试验为阳性。硝酸盐还原试验阳性。４．２．２．３．１．４对分离平板上的可疑菌落，也可先根据三糖铁脲半固体高层小管穿刺生长特点进行筛选。将单个菌落以接种针于斜面中心直插入底层，轻轻由原位抽出，再在斜面上轻轻涂抹，３７℃斜放培养１８ｈ。多杀巴氏杆菌生长特点：沿穿刺线呈不扩散生长，高层变橘黄色；斜面呈薄苔生长，变橘红色或橘红黄色；凝结水变橘红色。轻浊生长，无菌膜；不产气、不变黑。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１４．２．２．３．２犘犿荚膜分型４．２．２．３．２．１犘犿犇株吖啶黄素的鉴定ＰｍＤ株吖啶黄素的鉴定如下：ａ）采用新鲜的牛血琼脂板上的培养物接种到约３ｍＬ的脑心浸液肉汤中，ＰｍＤ株和ＰｍＡ株为阳性和阴性对照；ｂ）３７℃孵育为１８ｈ～２４ｈ；ｃ）离心出现细菌颗粒和弃上清液２．５ｍＬ；ｄ）加入０．５ｍＬ０．１％吖啶黄素的中性溶液。吖啶黄素溶液尽量现配现用，最多保存１周，４℃避光；ｅ）重悬细菌颗粒，在室温下静置孵育；ｆ）５ｍｉｎ后观察是否出现絮状沉淀；ｇ）出现絮状沉淀，说明该菌落为ＰｍＤ株。４．２．２．３．２．２犘犿犃株透明质酸酶的鉴定ＰｍＡ株透明质酸酶的鉴定如下：ａ）制备新鲜牛血清琼脂培养基。ＰｍＡ株和ＰｍＤ株为阳性和阴性对照；ｂ）每株分离株接种到含６％牛血胰酶大豆血液琼脂平板，平行划线，间隔约３ｍｍ～５ｍｍ，每块平板需要新鲜，不能脱水以免产生高浓度的透明质酸；ｃ）同时接种可以产生透明质酸酶的金黄色葡萄球菌株接种于每条划线的直角边；ｄ）接种的平板３７℃孵育２４ｈ，在加湿的环境下可以观察到ＰｍＡ株靠近金黄色葡萄菌株那端生长明显受到抑制，在远离的一端菌落的生长抑制不明显；ｅ）在阳性和阴性的结果成立的情况下，出现生长抑制的菌落为ＰｍＡ株。４．２．２．３．３犘犿抗原分型根据Ｐｍ细胞壁脂多糖的差异可以对抗原进行分型。通过凝胶扩散沉淀试验可以分为１６个亚型，猪体内大部分是３型。由于所需的抗血清不齐全，只有参考实验室和部分诊断实验室提供体抗原分型。４．２．２．３．４多杀性巴氏杆菌毒素的测定体重３５０ｇ～４００ｇ健康豚鼠，背部两侧注射部剪毛，不能伤及皮肤，皮内注射分离株马丁肉汤３７℃３６ｈ（或３６ｈ～７２ｈ）培养物０．１ｍＬ。注射点距背中线１．５ｃｍ，各注射点相距２ｃｍ以上。设阳性及阴性参考菌株和同批马丁肉汤注射点为对照，并在大腿内侧肌注硫酸庆大霉素４万单位（１ｍＬ）。注射后２４ｈ、４８ｈ及７２ｈ观察并测量注射点皮肤红肿和坏死区的大小。坏死区直径１．０ｃｍ左右为阳性，小于０．５ｃｍ为可疑，无反应或仅红肿为阴性。可疑需复试。阳性株对照坏死区直径应大于１．０ｃｍ，阴性株及马丁肉汤对照均为阴性。也可以使牛胚胎肺单层细胞（ＥＢＬ），非洲绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ）细胞或牛鼻甲细胞发生细胞病变；在心脑肉汤中３７℃孵育２４ｈ，离心后过滤上清接种到上述单层细胞中３７℃培养２ｄ～３ｄ，用结晶紫染色后在显微镜下可以观察到病变为毒素阳性，无细胞病变的为毒素阴性。４．２．２．４犅犫分离物的特征鉴定支气管败血波氏杆菌革兰氏阴性菌，形成１ｍｍ～２ｍｍ大小的菌落，在血琼脂培养４８ｈ，通常出现溶血。对氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸、尿素和６．５％氯化钠增长呈阳性反应。一般特性鉴定：ａ）糖管：包括乳糖、葡萄糖、蔗糖在内的所有糖类不氧化不发酵（不产酸、不产气），迅速分解蛋白３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１胨明显产碱，液面有厚菌膜；ｂ）吲哚试验阴性；ｃ）不产生硫化氢或轻微产生；ｄ）甲基红（ＭＲ）试验及维培（ＶＰ）试验均阴性；ｅ）硝酸盐还原试验阳性。分解尿素及利用举酸，均呈明显的阳性反应；ｆ）不液化明胶；ｇ）石蕊牛乳产碱不消化；ｈ）有运动性，在半固体平板表面呈明显的膜状扩散生长，扩散膜边沿比较光滑；但０．０５％～０．１％琼脂半固体高层穿刺３７℃培养，只在表面或表层生长，不呈扩散生长。５综合判定５．１对猪群的检疫应综合应用临床检查、细菌分离鉴定等。５．２检疫猪群诊断有鼻漏带血、泪斑、鼻塞、喷嚏，特别有鼻部弯曲等颜面变形的临床症状，鼻腔检出支气管败血波氏杆菌和（或）产毒素性多杀性巴氏杆菌，判定为传染性萎缩性鼻炎猪群。５．３具有鼻甲骨萎缩病变无论有或无鼻部弯曲等症状的猪，诊断为典型病变猪。５．４检出猪支气管败血波氏杆菌的猪群，判定为猪支气管败血波氏杆菌感染。５．５猪群中检测细菌为阴性、外观健康猪，需隔离并多次复检，才能作最后阴性判定。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１附录犃（资料性附录）疾病简介猪传染性萎缩性鼻炎（ｓｗｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｔｒｏｐｈｉｃｒｈｉｎｉｔｉｓ，ＡＲ）又称慢性萎缩性鼻炎或猪萎缩性鼻炎。于１８３０年最早发现于德国，现已分布于世界养猪业发达的各个国家和地区。１９６４年，我国发生ＡＲ后就在猪群中一直存在并严重影响我国的养猪业。ＡＲ主要是由支气管败血波氏杆菌（犅狅狉犱犲狋犲犾犾犪犫狉狅狀犮犺犻狊犲狆狋犻犮犪，Ｂｂ）和产毒素多杀巴氏杆菌（ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ犘犪狊狋犲狌狉犲犾犾犪犿狌犾狋狅犮犻犱犪，Ｔ＋Ｐｍ）引起猪的一种多发的慢性呼吸道传染病，该病的主要特征为慢性鼻炎，颜面部变形和鼻甲骨萎缩。哺乳仔猪感染本病后，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓，饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡。Ｔ＋Ｐｍ和Ｂｂ感染猪后损害呼吸道的正常结构和功能，使机体抵抗力降低，导致其他病原继发性感染，诸如支原体、嗜血杆菌、流感病毒、猪生殖呼吸道综合征病毒等引起猪呼吸道综合征，增加猪的死淘率。由Ｔ＋Ｐｍ引起或与其他因子共同感染引起的应称为进行性萎缩性鼻炎（ＰＡＲ）。而由Ｂｂ广泛存在，对猪的生长影响轻微，称为非进行性萎缩性鼻炎（ＮＰＡＲ）。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１附录犅（规范性附录）培养基的制备犅．１改良的犓狀犻犵犺狋培养基琼脂（ｐＨ７．２～７．４）２％脱纤牛血０．２％克林霉素５μｇ／ｍＬ庆大霉素０．７５μｇ／ｍＬ将琼脂水浴加热充分溶化，加入１５％氢氧化钠溶液约２ｍＬ，校正ｐＨ至７．２～７．４，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，凉至５５℃后在无菌的条件下加入脱纤牛血，克林霉素和庆大霉素，立即充分摇匀，倒平板。干燥后使用或４℃保存，１周内使用。犅．２犓犘犕犇培养基琼脂（ｐＨ７．２～７．４）２％脱纤牛血０．２％杆菌肽３．７５Ｕ／ｍＬ克林霉素５μｇ／ｍＬ两性霉素Ｂ２．２５μｇ／ｍＬ将琼脂水浴加热充分溶化，加入１５％氢氧化钠溶液约２ｍＬ，校正ｐＨ至７．２～７．４，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，凉至５５℃后在无菌的条件下加入脱纤牛血，杆菌肽、克林霉素和两性霉素Ｂ，立即充分摇匀，倒平板。干燥后使用或４℃保存，１周内使用。犅．３改良的麦康凯培养基蛋白胨１．７％眎胨０．３％猪胆盐（或牛，羊胆盐）０．５％氯化钠０．５％琼脂１．７％乳糖１．０％葡萄糖１．０％０．０１％结晶紫水溶液１．０％０．５％中性红水溶液０．５％呋喃唑酮２０μｇ／ｍＬ蒸馏水加至１０００ｍＬ将蛋白胨、眎胨、胆盐和氯化钠溶解于４００ｍＬ蒸馏水中，校正ｐＨ７．２。将琼脂、乳糖、葡萄糖、结晶紫和中性红加入５００ｍＬ蒸馏水中，加热溶解，将两液合并并加蒸馏水至１０００ｍＬ，分装于烧瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，在无菌的环境中按２０μｇ／ｍＬ比例加入呋喃唑酮。干燥后使用或４℃保存，６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８７１—２０１１１周内使用。犅．４改良的犛犿犻狋犺犅犪狊犽犲狉狏犻犾犾犲培养基蛋白胨１．７％琼脂１．７％青霉素２０μｇ／ｍＬ呋喃唑酮２０μｇ／ｍＬ庆大霉素０．５μｇ／ｍＬ将琼脂和蛋白胨水浴加热充分溶化，加入１５％氢氧化钠溶液约２ｍＬ，校正ｐＨ至７．２～７．４，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，凉至５５℃后在无菌的条件下按照比例加入青霉素、呋喃唑酮、庆大霉素，立即充分摇匀，倒平板。干燥后使用或４℃保存，１周内使用。标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售２０１１—２８７１／犜犛犖中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪萎缩性鼻炎检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８７１—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１５千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６７２定价１６．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载'