- 11.26 MB
- 205页
- 1、本文档共5页,可阅读全部内容。
- 2、本文档内容版权归属内容提供方,所产生的收益全部归内容提供方所有。如果您对本文有版权争议,可选择认领,认领后既往收益都归您。
- 3、本文档由用户上传,本站不保证质量和数量令人满意,可能有诸多瑕疵,付费之前,请仔细先通过免费阅读内容等途径辨别内容交易风险。如存在严重挂羊头卖狗肉之情形,可联系本站下载客服投诉处理。
- 文档侵权举报电话:19940600175。
'海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究目录缩写词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’12中文摘要⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯J一英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯~叶[已I_耋..⋯....⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.⋯⋯⋯.⋯⋯..⋯⋯⋯⋯⋯.·⋯⋯-·⋯⋯..u|了I商..⋯⋯一⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯’⋯⋯’⋯⋯一第一章海洋微生物杂环串联环(拟)肽生物活性研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.8l含噻唑(嗯唑)一噻唑(嚼唑)串联结构单元的环肽⋯:⋯⋯⋯⋯⋯⋯92通过酰胺键串联的杂环串联环肽⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第二章研究目的和设计思路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23第三章海洋天然产物Leuc锄i曲A的全合成研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253.1海洋天然产物Leuc触lideA反合成分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253.2海洋天然产物Leuc删deA全合成研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283.2.1含甲基嗯唑一噻唑串联结构单元的关键中间体4的合成⋯⋯⋯⋯⋯283.2.2多肽片段3和嗯唑5的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353.2.3天然产物Lcuc锄ideA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363.3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37第四章围绕Leuc锄ideA的甲基曝唑一噻唑串联关键结构单元的多样性衍生化及生物活性评价~一初步生物活性小分子的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384.1围绕Leuc锄ideA的甲基曝唑一噻唑串联关键结构单元开展的探索性的结构改造工作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384.2化合物库l和化合物库2中部分化合物的生物活性测试⋯⋯⋯⋯⋯⋯.414.2.1抗流感病毒抑制剂的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424.2.2抗泡疹病毒抑制剂的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯444.2.3抗HIV相关靶点活性化合物的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..44
————中国科学院上海药物研究所博士论文—————————————————————————————————————————二二_∑———二:4.2.4抗乙肝病毒(HBV)抑制剂的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.484.3Leuc躺ideA构象类似物的合成和抗病毒活性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。.494.4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53第五章2.2双杂环串联小分子化合物库的设计、合成及生物活性评价一~高活性抗IIElv抑制剂的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯545.1乙型肝炎病毒及其复制过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯545.2抗乙型肝炎病毒药物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯555.3新型非核苷类抗乙型肝炎病毒抑制剂的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯605.4新型靶向抗乙型肝炎病毒非核苷类小分子化合物库的设计思路⋯⋯⋯605.5阳性化合物的结构分析⋯⋯⋯.⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.615.6多样化的2.2双杂环串联小分子化合物库的合成和活性结果分析⋯⋯625.7化合物结构的进一步优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯775.8高活性抗乙肝病毒化合物的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯785.9构效关系(SAR)总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.795.10化合物156在小鼠体内初步的药物代谢研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.30第六章实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85第七章全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.162参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一165致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172附录1新化合物结构索引⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯174附录2主要中间体化合物结构索引⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯181附录3化合物表征数据一览表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一184附录4发表文章及申请专利目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯190附录5全合成部分化合物图谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191H
AcACVBnB0cIBuCC50CPEDASTDBUDCCDCMDIPEADⅣ队PDMFDMSODMEFmocHBVHOBTHIVHPLC缩写Acet),lAcyclVirBenzyltert.ButoxycarbonyIiso—Bu锣lConc钌删onsofcompoundsrequiredfor50%ex娥onCyopalllice疏ctsDie也yl锄inosul缸砌uoride1,5一diazabicyclo【5.4.0】lllldecen一5-1ene1,3-DicycloheXylcarbodiinlideDiclllorometllaneDiisopfopyl—ethyl一锄i11e4一D岫e唧觚li蛳dineⅣⅣ-Dime也ylforⅡl锄ideDimetllylsulfoxide1,2一DheⅡ10xye也aIle9一FluorenylIIletlloxycarl)onylH印atitisBvims1-Hydroxybellztriaz01eHuIIlaIli删mllllodeficiencyVimsHi曲pe面Hnanceliquidchromato铲aphy乙酰基无环鸟苷苄基叔丁氧羰基异丁基(细胞)半数致死浓度致细胞病变效应三氟二乙基胺硫1,5一二氮杂二环【5.4.0]十一烯.5二环己基碳二亚胺二氯甲烷二异丙基乙基胺N’N.二甲基吡啶MⅣ-二甲基甲酰胺二甲基亚砜甘醇二甲醚9.芴甲氧羰基乙肝病毒l一羟基苯并三唑艾滋病病毒高效液相色谱
中国科学院上海药物研究所博士论文HREI-MShigh-reSol砸0nelec仃oniollizationm鹬s高分辨电子轰击电离质HSV.I,ⅡIAVIC50MeMDCKNANBSNCNMMNTPhSARTHFTFApM印a内砌H唧esSiJllpleXⅥtl】SI,IIInnwmzaAH3N2、,in】}ses(A3Cllilla/l5/90)lnhibitorconc既l恻onatwhicha聊eis50%illllibitedM甜lylMad酢D酊byc柚imkidIleycellsN0t刹V时N.Bromos嗽cinimideNotcalclllalionN-M酬哆I—morl曲olineNottestPh髓ylstmctll陀锄dacti啊tyrel撕蚰s:llipTe灯ahydro如瑚1瑚uoI啦暇如cacidlx10r62谱泡疹病毒I,II甲型流感病毒株H3N2(酶抑制剂的)半数抑制浓度甲基狗肾细胞无活性Ⅳ-溴代琥珀酰亚胺无法计算N一甲基吗啡啉没有测活性苯环构效关系四氢呋喃三氟乙酸(浓度单位)
海洋天然产物Leuc鲫ideA的全合成、结构改造及构效关系研究摘要Leuc觚lideA是从澳大利亚海绵三e“ce肋m打甜咖括中分离而得到的一种天然环肽化合物,由氨基酸及氨基酸衍生物组成:L.亮氨酸,噫唑,L.丙氨酸,甲基嗯唑,噻唑,L.缬氨酸和L.脯氨酸。其中,2,4.甲基嗯唑.噻唑双杂串联结构单元在海洋环肽中是极其罕见的。研究表明,Leuc锄ideA对人源肿瘤细胞株HM02,HepG2,Hu”等显示了中等强度的细胞毒活性。据文献报道,很多含有类似杂环串联结构单元的化合物具有显著的生物活性,例如抗癌药物博来霉素中存在的噻唑.噻唑串联结构单元以嵌入方式与癌细胞DNA作用。Leuc锄idcA中特有的2,4一甲基嚼唑一噻唑双杂串联结构单元,作为一个有吸引力的结构模块,为进一步合理的小分子化合物库的设计及相关药物的研究提供了新的起点。本文以天然产物Leuc眦ideA为研究起点,主要内容包括:1)首次完成Leuca武deA的全合成工作;2)围绕2,4一甲基嗯唑.噻唑双杂串联结构单元进行多样性衍生化合成,建立了结构多样、规模适度的小分子化合物库,病毒水平的活性筛选发现了一系列具有抗流感病毒、抗疱疹病毒(HSV)、抗乙肝病毒(HBV)和抗艾滋病病毒(HⅣ)活性的化合物;3)以发现的抗病毒化合物为新的研究起点,深入地进行构效关系(SAR)研究,首次发现了含有双杂环串联结构单元的小分子非核苷类抗乙型肝炎病毒抑制剂,部分化合物显示了较好的抑制乙肝病毒DNA复制活性(例如化合物156、238),对化合物156初步的体内毒性和药代动力学实验表明,这类化合物具有很高的治疗指数(安全指数),口服吸收良好,显示出良好的应用前景和安全性,为进一步开发新型治疗乙型肝炎病毒的药物奠定了基础。关键词:LeucamideA,全合成,结构改造,抗病毒,乙肝病毒抑制剂
中国科学院上海药物研究所博士论文Fi瑙tT|otalsynthesisofLeucamideAandStructllmlModificationofKeyScalfoIdofLeucamideAWelll明gW钿g(Medic访alChemistr”Leuc锄ideA,abi∞ctiVec)rcbc11l:pta附decom越ningaulliquemixed4,2一bi§hete加屹ycleta勰dc:m画rc∞sis6ngofam曲yloX钇ole觚dthiazoleSl:Il砌Ilitw弱firStisol乏ned蛔n,¨l酬iann谢nes】Ponge三P”cP,|1口,雄矗:,.0哪纽LeucamideAisch甜acterizedbytllepres锄ceofseven锄inoacidsalld甜nil】loacidd喇vedresidues:L-lel且cine,oxazole,L—al铷鱼ine’me_tllyl-‘"xazole,tlliazole,L-Valine,柚dL—proline.Leu锄ideAⅥ粥folmdt0iIl:阀暾mod蹦她lyt11e咖wmoftlle恤ree蛐0rcelllines。HM02,Hep(、2,锄dHI】117.Many∞m]p0髓ds妇}嗍ltocon_lainbish鲫erocycletaIldempairhaver啪址砌y叫entbiological蛐,毗弱Bl锄ycin.hw弱‰dtllata埘bi舐cBl伽乎inint锄lctcd砌lDNAbyb砌iI塔itSbitlliazolemoi哪tomenucleicba∞sinamodetl豫tw舔paItially砷髓cal撕ve柚dpenetr撕ngpositivelycI掰gedmoi舐esdigtalt0thebiⅡliazoleillt0tllem苟orgrove.Theref|0佗,tllemixed4,2一biSl忙t凹ocycleta删l锄pajrexistedinL吼比alIlideAⅨ咄ouratte幽on.o瞰e矗’onStodiScoVeU加vel卸_tiVirali11llibitorSstaned诫tllt11enaturalproductLeuc锄ideA.Asisol盯cⅨ爿:om,mHp锄ticip蕊∞inthisworl【beganwitllatotalsyn廿lesisofLeuc锄ideA.1ks),ll_n比sisservedt0proVidesolidchemicalbacl【ingforc叨s仃uctionof蠡∞usedlibr撕eSof4,2-bishe衄佻yclet锄demd嘶v撕veSconsiStingofmetllyloxazoleandtbiazole.As嘶eSofd嘶VatiVeswereeValuatedfortlleir趾ti-Vimsability,maIlycompoundswerefolmdt0试llib“humaninfluenzaA、rims锄dhe印essimplex访ms(HSV)锄dh啪弛imm瑚砌eficiencyVinls(HIV)aIldhepatitisBVirus4
海洋天然产物LeucamideA的全合成、结构改造及构效关系研究(HBV).B2Lsedon也eseresuhs,maIlyhi曲potentanti-HBVinllibitorsarediscoVered,WIlicharenoVelcheIllicalentitytotallydi仃.erent矗oml(110wn姗cleosidei11llibitors.PreliIlli瑚巧ADMEstudiesi11dicatedmatcompound156,apotentinllibitorofHBVincelIb硒edassay,showed900doralbioaVailabil毋,aIldisbeiIlgtestedinanimalmodelnOW.KeyWord:LeucamideA,Totalsyllthesis,Snuctllremodification,Anti-vims,An_ti—HBVmllibitor5
一中国科学院上海药物研究所博士论文———————————————————————————————————————————————一引言有史以来,病毒性传染病一直是人类健康的主要杀手之一。近几个世纪以来,新发现的传染病有50%以上是病毒性传染病,它来势凶猛,席卷全球,使数以千万人丧失了生命。20世纪后半叶新出现的病毒性出血热和由来已久的病毒性传染病(如流感)造成的死亡人数超过人类历史上任何一种疾病n1。21世纪,人类将面临病毒性传染病的严峻挑战,2003年流行一时的非典型性肺炎(SARS)病毒作为一种新出现的病毒严重的威胁着人类的健康口1;目前爆发的禽流感疫情已经对人类和家禽造成重大的损害嘲:从目前实际情况看,一些老的病毒性传染病,如乙肝、艾滋病等尚未得到有效控制,而埃博拉病毒、交异性冠状病毒、猴痘病毒等传染性极强的病毒引发的疾病又相继出现,病毒性传染病由于没有特效药物控制,一旦爆发流行,后果将会非常严重。人类致病病毒是一种核酸颗粒,结构极为简单,多数缺乏酶系统,只能依赖宿主细胞复制其核酸和蛋白质,然后装配成病毒颗粒而增殖。迄今,全世界已发现的病毒超过3000种,而且薪的病毒还在不断被发现。2002年8月在巴黎召开的世界病毒学大会上,由国际病毒分类委员会提出的第7份报告收录了3600多种病毒,其中使人类致病的病毒有1200多种,分为29个科,7个亚科,53个属“1。当前,发病率高、危害大的病毒主要有流感病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒等。对病毒性疾病的治疗至今仍缺乏专属性强的药物,临床上常用的药物主要有如下几类:抑制病毒复制的抗病毒药;增强机体免疫功能的免疫调节剂;针对临床症状的止咳、镇痛、解热和消炎等治疗药;防止继发感染的抗感染药;预防病毒感染的疫苗及阻断病毒传播的消毒药等。国内外对治疗病毒性疾病新药的研制侧重于开发抗病毒药。目前,有386
海洋天然产物LeucallIideA的全合成、结构改造及构效关系研究个抗病毒药物用于临床【5J。其中,抗人类免疫性缺陷病毒(HⅣ)药物有19个,分别是核苷逆转录酶抑制剂(舢s)(7个)、核苷酸逆转录酶抑制剂(N们I)(1个)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)(3个)、蛋白酶抑制剂(7个)以及病毒进入抑制剂(1个);抗乙型肝炎病毒(HBV)药物有拉米夫定、阿德福韦和最近刚上市的恩替卡韦;临床上用于抗疱疹病毒(HSV)的药物有7个;用于治疗由巨细胞病毒(CMv)感染引起的疾病的药物有7个;抗流感病毒药物有金刚烷胺类药物、流感病毒神经氨酸酶抑制剂、流感病毒受体阻断剂和抗流感病毒反义寡核苷酸等,临床应用的主要为金刚烷胺类药物(2个)和神经氨酸酶抑制剂(2个)。目前已批准的抗病毒药物中,绝大多数是核苷类化合物,在临床运用过程中发现它们主要存在以下缺点:1)细胞毒性;2)长期用药产生的抗药性病毒变异株的出现,需要结构不相关的不同药物来对抗,因此发展非核苷类抗病毒药物成为一个引人注意的方向。海洋天然产物LeucamideA引起了我们极大的研究兴趣:首先,它是全新的天然产物,有必要对它进行全合成研究:其次,Leuc锄ideA中存在一个特异的2,4.甲基嗯唑一噻唑串联结构单元,类似的双五元杂环串联结构在一些已知的活性化合物中也存在(例如抗癌药物博来霉素),它们能够与DN删A以某种特殊的方式结合124l,是产生生物活性的主要原因。因此,我们假设甲基嗯唑一噻唑串联结构单元是天然产物产生抗肿瘤活性的主要原因,围绕该结构单元进行多样性衍生化,建立新型的小分子化合物库,选择一些与DN删A复制相关的疾病模型(特别是一些病毒模型)进行活性测试,以期望发现结构新型的活性化合物。7
中国科学院上海药物研究所博士论文第一章海洋微生物杂环串联环(拟)肽生物活性研究进展海洋微生物中蕴藏着巨大的、种类繁多的次级代谢产物。近年来,由于反向}口LC技术、光谱技术、手性技术的发展,从海洋微生物中分离得到了大量的化学结构新颖、生物活性独特的次级代谢产物。一些代谢产物已经作为药物研究的先导化合物或者作为生命科学研究的药理学工具。尤其重要的是,从海洋微生物中发现了一系列高效、低毒的抗肿瘤化合物,目前已有一些化合物进入临床前或临床试验阶段。如以Dide删lillB为代表的海洋环肽已作为抗癌药物进入临床试验网;从海兔及妇施,,口舯腑切分离得到的Dol蒯in10及Dol鼬15合成类似物LUl03793均已进入Ⅱ期临床17】;从加勒比海海鞘(勋纪眺醒i‘加彻嚼删中获得的生物碱EcteiIlassidin743(ET一743)已经入III期临床,可望近年首先进入欧洲市场刚;令人振奋的是,镇痛药zic∞【otide(源于芋螺C锄懈删猡眦譬的肽类毒素)已成功通过ⅡI期临床,并获得FDA批准上市【9l。海洋微生物杂环环(拟)肽是一类分子环骨架上含有噻唑啉、噻唑、嗯唑啉、嚼唑等五元杂环的天然环肽,杂环的串联类型主要有噻唑(嗯唑)一噻唑(嚼唑)串联和噻唑、噻唑啉、嚼唑、曝唑啉等通过酰胺键串联两种类型(图1)。这些环肽由于C端和N端未离子化,使得它能较容易穿过细胞膜,大大降低了体内酶解的速度,提高了生物利用度,更重要的是它们呈现出很强的生理活性,因而备受关注。本文结合海洋微生物杂环串联环肽较为典型的例子,简单综述海洋微生物中新的杂环串联环(拟)肽生物活性研究进展。《心0=ojca功lIe0=嗽OIeOr咖ObneT=Thb拍1.eT=ThiazoleOFThjazo强neFigure1T■em叠in呵pesofheterocyclopeptides
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究l含噻唑(嚼唑)一噻唑(嗯唑)串联结构单元的环肽在过去的十几年中,从海洋微生物中分离得到的含噻唑(嗯唑)一噻唑(曝唑)串联结构单元的环肽主要有含三个嗯唑环直接串联结构单元的环肽、含嗯唑一嗯唑串联结构单元的环肽、含噻唑一嗯唑串联结构单元的环肽和含噻唑一噻唑串联结构单元的环肽。它们显示出很强的生理活性,有些已经成为药理学研究的工具化合物。它们特殊的杂环串联结构已经引起药物化学家和合成化学家的广泛关注。目前,从海洋微生物中分离得到的含三个嗯唑环直接串联结构单元的环肽主要有Ulapu“des、Kabir锄ides、JaSpis锄ides、Mycalolides、,Hali幽g鼬idesmlll(图1.1.1);它们结构复杂(例如UlapualideA的绝对构型在分离得到17年后才得以确定【12J),而且在自然界中极其罕见,从而引起了合成化学家和药物化学家对它们的浓厚兴趣f13】。吣r吨≯狮乏O‰O0№0、小7N弋、脚,桫影疏;。垦!坠&坠&曼z塾坠UlapualideAH0HB.MeOMeAcMeJaspis啪idcAHoHO0MeB.OMeHMeHHaIichondramidcH0MeB.OMe}{MeHHaIishig咖ideAHNH2OMeB.OMeHMeHKabir锄ideACONH2Me0HHCH20Ha—OMeOMeMeMoKabif眦ideBCoNH2MeoHHMea.OMeOHMcMeKabir锄ideCCONH2MeOHHMeⅡ.OMe0MeMeKabif蜘lideDHMeOHHMeQ.OMeOMeMeMcKabir咖ideECOC地MeOHHMcⅡ旬MeOMeMe9
——⋯.中国科学院上海药物研究所博士论文—————————————————————————————二—二二二二_二二_—二:二:.一Fipn1.1.1S打_c钿弛of由ris怯量趵lemacnl汹岱从功能上看,肌动蛋白是这类大环内酯(拟肽)的靶点,它们对肌动蛋白(a幽n)具很强的亲合力和专一性,显示了很强的纤丝切割(鑫l鼬嗽seve]fillg)和单体隔绝(舢删姗lcrseq獬s蛔.illg)活性,使F一肌动蛋白(F.actin)解聚,干扰肌动蛋白丝的动力学过程,晟终导致细胞死亡114】。最近,研究肌动蛋白与&№ideC的复合物的X一射线衍射图像发现(Figl】嘴1.1.2):(1)含三晤唑结构单元的大环内酯(拟肽)与肌动蛋白的亚区域1(subdomain1)相互结合,脂肪链伸入肌动蛋白的亚区域1和亚区域3(s潮omain3)之闻的深度中央裂隙;(2)大环内酯与肌动蛋白凝溶胶蛋白(Gelsol确竞争相同的肌动蛋自结合位点;(3)这类大环内酯毒素切割与覆盖肌动蛋白丝的作用机制与肌动蛋白凝溶胶蛋白的机制类似【l51。基于含有独特的三个嗯唑环直接串联结构单元的大环内酯与肌动蛋白相互作用的原理,设计相关类型的类似物,对治疗肿瘤转移、胆囊纤维质生成、组织梗塞、青光跟以及其它由肌动蛋白细胞骨架调节功能失常引起的疾病将起积极的指导作用ll们。lO
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究翩。爨。垫二罐TriSO×azOleSubunitFigum1.1.2Triso珊zole—con切iningmacml埘etoxinsbindtothesamesiteonactinasgelsoKndomain1.Actinsubdomains1—4a托labeIed.这类环肽显示了极强的细胞毒活性(部分环肽活性如表1.1所示),可以作为新一类抗癌药物研究的起点。!£塑烂望些f垫!!塑型L12lOm埘neleuk锄iacellKBh啪觚印ide咖oidcarcinomceUJasDisamideAJaSDisamideBJ踟i或mlideCHalishi咖ideAUlaDualideAKabir锄ideC一R2钆::影矗3凸々xYR·R2R3&!堡丝(噬!望些2L1210CEMP蹴ll踟dCAHMeD-V甜L广Ilc王卜VaIL.Ilej,O.UZgP批ll珊idcBMeD.PheL.LeuD.舢aL.Ilc2.OP甜eIlamideCMeD.PheL.ValD.AlaL.ne3.2Palen姗idcDMeD-PheL-neD-AlaL-neP纠[cU锄ideEMeD-PheL-ValL·ValI).IlePateIl嘲ideFMeHD.PheL-ValD.VaIL-lk生竖i璺鱼!j竺!璺望i堂!堑坚!堡!型垦:!!!垒:∑型垦:!堡尉舯代2.1.1Stmctu他ofPatelkmidesandAsc柚iacyclamideandC”otoxici时ofPatellamidesA—C从结构上看,这类化合物属于24.氮杂冠。8环肽,含有两个噻唑环,两个噫唑啉环。从生物活性看,该类化合物均具细胞毒活性。Patcll锄idesA—C的活性如图2.1.1所示,PatcllalIlidcD对淋巴自血病细胞有中等强度的细胞毒活性(ED50=ll州);Patell锄ideE对人源实体瘤细胞株具弱抑制性(IC50=125p酌nL):Patella商deF对人源肿瘤细胞株有中等活性(IC50=13灿压)。Ascidiacycl锄ide对由多型瘤病毒(p01yomavinlS)转化而来的PV4培养细胞有很强的致死效应【341。Patell锄ides有很强的金属配合能力。例如,G.Abbenate等人对AscidiaCyclomide前体环肽c[Ile.1h.D—Val一Cys.Ile一11小D.Val.Cys.]、c[Ile—T1lr.D.Ⅳa1)111iaz01e-Ile.nnD.(Vm)TIliaz01e.]及Ascidiacyclomide的构象和金属配合特性进行深入的研究【341,发现c[Ile一1k—D—Val—Cys—Ile.1’llr。D—Val一Cys一]的柔性非常好,存在许多低能量构象,而将它的两个半胱氨酸(Cys)转变17
中国科学院上海药物研究所博士论文成噻唑环,变成环肽c[Ile.11mD.Ⅳa1)11liazole.Ile.11肿D.Ⅳa1)11liazole.],其构象为单一的椅式构象,将环肽c[Ile.n小D.Ⅳalmiazole—Ile.nnD.(Valmiazole.]中的两个苏氨酸(m)进一步转变成曝唑啉环,成为AScidi毵ycl嘶idc,其构象为船式构象。将Ascidi孔yclomide中两个嚼唑啉环水解变成3,3能与钾离子结合形成复合物(图2.1.2);x衍射显示,3通过两个噻唑环与钾离子结合形成复合物,复合物的构象是另~种区别于AscidiaCyclo嘶dc的船式构象。3与环肽c[Ile.11弘D一Ⅳal舯i锄le—Ile.11小D。Ⅳal舯ia加le-]构象不同,主要是少了两个酰胺键。对于AScidi∞yclomide而言,它存在一个船式裂缝,通过噻唑环和噫唑啉环可以和两个铜离子结合(图2.1.2)。酗印n2.1,2P矾I磷nm∞mpk】【of3-nddicoppcrcompI旺ofA辩酬溘cyc姗硒e其它研究也证实,这个船式裂缝可以和一些小分子化合物结合(例如苯、乙醇、水等)。A∞idi犹ycl伽葩de的船式裂缝对金属离子的生物转运和小分子(例如C02)的转移而言,有极其重要的生物学意义。Jaspars等人对Patell锄ideSA,e进行了金属配合选择性研究135l,发现PateII锄ideC在搿+过量的情况下对Cu2+能选择性络合,而对C02+、Ni“、H92十没有络合作用;PatellalnideA对Cu2+选择性络合能力大大弱于Patell锄ideC。经X衍射分析发现,Patell锄ideD构象是扭曲8型,它的两个噻唑环差不多平行,四个跨环N—H⋯o氢键的存在使得构象相当稳定1321。对Patell撇ides18
海洋天然产物Leuc鲫ideA的全合成、结构改造及构效关系研究类化合物进行构象研究发现,这类化合物主要存在三种构象‘3回:(1)船型(Ascidiacyclomide是这类构象的代表)(2)扭曲8型(PatellamideD是这类构象的典型)(3)正方形,它是船型与扭曲8型互为转化的过渡状态。2.22卜氮杂冠一7环肽“ssoclin锄ides1一l0是21.氮杂冠.7环肽类化合物【371。私N≮弋d晶HH警。噍N璀圹&Li鹞∞Iin锄idelD-llcL-ValLIPtle11lia趵le11li锄le>10Li刚诵锄Idc2D.AlaD.IlcL-Phe弧iazoleniazol抽e>lOLissoclin锄ide3L.AlaD.IleL.PheThiazole111iazoline>10Lj翼;Ocli撇ide4D-PhcL.VaIL-PheThia20leThi锄linel1l2LissocI讥锄idc5D.PheL.VaIL-Phe11li∞role11liazoIe.10l5>10Lis∞dilI锄idc6D—PheD.ValL.PheThiazDleThiazoline7LissocIin锄ide7nPheD.ValL—PhenliazoIi∞ThiazoIinc0.06O.04O.08Liss(,cIin锄fde8PheValL-Phe111iazoJenIia趵iine6l8LisSOcliIl硼ide9D-ValL.IleD—PheThi锄leThi北oIineLiss|∞lin锄idc10L-IleD—Pheniazoli雎Thia趵linengⅡre2.2StnctⅡ托ofL妞soclm叠mid鹤andcytotoxici哆ofLissoclmamid懿l~8从结构上看,这一类环肽含有噻唑环,噻唑啉环,以及嚼唑啉.脯氨酸串联结构单元。功能上看,大部分的LisS0cliI瑚:Ilides具有中等细胞毒活性(活性如图2.2所示),Mo疵s等人分离得到了Lissocli衄Ⅱlides9、10,但未报道活性。构效关系研究发现,Lissocli吼mides4,5,6,7,8均由相同的氨基酸序列组成,它们的不同之处在于两个硫原子杂环的氧化态以及氨基酸的绝对构型。比较Lissoclinamide4和Lissoclinamide5的结构和活性的关系(SAR)可以发现将LissoClin锄ide4中的噻唑啉环转换成噻唑环,使得Lissoclinanlide5的活性明显降低。含两个噻唑环的Lissoclinamide5的细胞毒活性明显低于含19
中国科学院上海药物研究所博士论文两个噻睦啉环的Lissocli船lllide7;剩下的三个化合物Lissoclin锄ides4,6,8都存在噻唑和噻唑啉环,但它们在色谱性质和生物活性上存在差别。Wipf小组完成了Lissoclin撇ide7的全合成工作,并对LissoclinaIl:lide7进行了结构和活性分析pn,发现将大环中的曝唑啉环用噻唑啉代替,细胞毒活性明显提高;反之将噻睦啉环用嚷唑啉代替,细胞毒活性明显降低;并且大环的立体化学的改变会影响细胞毒活性。因此,噻唑啉环的存在对活性是非常重要的。Wipf等人对Liss∞lill=ullide7的构象进行研究,发现LiSsodi柏mide7的构象与Patell锄ideD的构象极为相似,是扭曲8型,整个构象由脯氨酸.噫唑啉串联单元形成的Ⅱ型B转角及噻唑啉.D.苯丙氨酸.噻唑啉序列中的9环所决定1311。J郴等人对Lissocl.脚咖idcs9和10进行金属选择性研究,发现Lissocl洫哪idc10在矗+过量的情况下能选择性的与cu2+络合,‘而LissocIin=啦ide9对Cu2+的选择性较差13钔。2.318一氮杂冠-6玮肽BiS缸纰咖i删,cycloxazol洫㈣属于18一氮杂冠一6环肽·R3曰R2计毽憎R/』\HHHN/≮、o。蝌艮Bisb嘲御nideASni姐olillc1.埘比SThia趵li眦L-朋ao=憾趵l证cMeL-ValHBis臼融触妊deBSmIi啦leL.¨艟S1奄ia趵l址L-rAla0lx缸m钿瞎McL..ValHBis臼硼amidcCSThia卸lkL-valSThi拗leL·砧ao:【a刹cHL.ValHBiS仃积啪ideDSThi豳leL.V蚰Oxa刁oleMeL-ValHCvcIoxa趵li眦o0嗽趵Ii北L.valO0】【azoIineL.Val0x犯oli鹏MeL-VaIMel型塑!!!!婴壁j一.—————————————————==—·l_—I_——一Fi卫urc2.3Stmc佃reofBist糟切m沁伪andCyclox叠加linefW髂tie№mide)
海洋天然产物Leuc鲫ideA的全合成、结构改造及构效关系研究从结构上看,BistratamideA含两个噻唑啉环和一个嗯唑啉环;BiStrat锄ideB含一个噻唑环、一个噻唑啉环和一个嗯唑啉环;Bis批l切mideC和H含两个噻唑环和一个嗯唑环;Bis蝴ideD含一个噻唑环、一个噫唑环和一个嗯唑啉环;Bis缸a切mdeE含两个噻唑环和一个嗯唑啉环:Bistr如mideF含一个噻唑环、两个嗯唑啉环、;BiStf舭吼ideG两个嗯唑环和一个噻唑环;Cvcl0Xazoline含三个噫唑啉环。从生物活性上看,Bimata】:llidesA和B对人源MRC5CVl成纤维细胞和T24膀胱癌细胞有较弱的抑制作用(IC50值分别为50p咖L,100肛咖L):Bistr纰嘣desC和D‘对人源结肠癌细胞株(HCT一116)基本上无细胞毒活性(IC50值均为125p鲈nL),但将BiSt均tamideD注入小鼠大脑能使小鼠产生镇静作用:BistratamidesE.H对人源结肠癌细胞株(HCT一116)显示了中等强度的细胞毒活性(Bis订纰吼idesE-H的lC50值分别为7.9p幽啦,28陷/m1,5pg/m1,1.7p酌【111):Cycloxazoline对人源MRC5CVl成纤维细胞和配4膀胱癌细胞有较强的细胞毒活性(IC50值均为0.5p咖L)。这类环肽同样也有很强的金属配合能力。例如Westiell锄ide未于任何金属作用时,它所有的N—H键以及N原子均朝向18元大环中心,噫唑啉环与大环平面几乎平行,整个分子C3对称,这种构象非常适合于金属离子配合;weStiellamide对A矿+、ca2+、ce3+、cu2+、cu+、Fe”、Fe3+、H92+、K+、Li+、N矿、M孑+、Ni2+、zn2+等只有微弱的结合,与Ag+能很好的配位。Ag+一westiell锄ide复合物的x衍射显示一个独特的A助簇,即4个A矿呈扭曲的三角平面排列;正常情况下,A勖簇4个A矿呈四面体或扭曲四方形平面排列。当18元大环与Ag十结合后,经历重大的构象转变,即18元大环基本上向内翻转,边链原来垂直于大环平面翻转成与平面平行,羰基指向环内,噫唑啉环差不多与大环平面垂直【4l】。
中国科学院上海药物研究所博士论文人体内存在各种各样的金属离子,它们在体内承担着特定生理功能;因此,上述环肽独特的生理活性与其强大的金属配合能力可能有密切的联系。海洋微生物独特的生理活性产物己成为重要的海洋药物资源,越来越受到重视。它们生活在高盐、高压、低温、低照的特殊环境中,形成独特的生理活性产物。相当多的海洋微生物与其它海洋生物处于共生、附生、寄生、或共栖关系,可以产生各种各样的物质(如抗生素、毒素、抗病毒物质等)以利于宿主生长代谢或增强宿主的抵抗能力。因此,海洋微生物的代谢产物是药物研究最重要也是最好的天然化合物库,对它们进行深入的药理学和药物化学研究,必能找到高效、低毒、结构相对简单的小分子药物。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究第二章研究目的和设计思路从上述海洋微生物杂环串联环(拟)肽生物活性研究进展可以看出,噻唑(噫唑)一噻唑(嗯唑)串联结构单元存在于许多活性天然产物中,它们具有广谱的抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性,其中不少化合物具有临床应用前景,其关键双杂环串联结构单元可以作为药物研究的基本结构模块。2002年5月Kehmlls等人报道了从澳大利亚海绵中分离得到的海洋天然产物Leuc锄ideA1251,它的甲基嗯唑一噻唑结构单元在源于海绵的环肽中被首次发现,它立即引起本课题组的关注。首先,LeucamidcA的结构新颖,迅速对其进行全合成研究显得极为必要:其次,甲基嚼唑一噻唑串联结构单元可能对Leuc锄ideA的生物活性有着重要的作用,是创建新型小分子化合物库,进行药物化学研究的非常理想的结构模块。因此,本课题组以海洋天然产物LeuC跚ideA为研究起点,制定了以下研究方案(如图2.1):第一,开展Leuc撇ideA的全合成工作,建立其独特的甲基嚼唑一噻唑串联结构单元的合成方法;第二,围绕该关键结构单元,从容易改造的结构位点出发,运用组合化学的思想,快速合成适度规模的新型的小分子化合物库;第三,进行靶向筛选或者选择合理的靶点筛选,期望得到阳性化合物(硫)并总结初步的构效关系(SAR);第四,以得到阳性化合物及初步的构效关系(SAR)为新的起点,重新进行合理的靶向化合物库的设计,运用化合物设计、化学合成、生物活性筛选相结合,以活性指导化合物设计来提高化合物活性的策略,发现针对不同靶点的高效专二的活性化合物。
中国科学院上海药物研究所博士论文圈一一sh锄c2.1研究目标和设计思路
海洋天然产物LeucaIIIideA的全合成、结构改造及构效关系研究第三章海洋天然产物LeucamideA的全合成研究结构上,Leuc唧ideA是一个由氨基酸及氨基酸衍生物构成的七元环肽(如图3),即由L.亮氨酸、噫唑、L.丙氨酸、甲基嗯唑、噻唑、L.缬氨酸、L.脯氨酸构成。文献报道,LeucamideA对人源胃癌细胞株(HM02)、肝癌细胞株(HepG2)以及P53位突变的胃癌细胞株(Hull7)显示出中等强度的抗肿瘤活性。尽管LeucamideA的生物活性未引起人们的特别关注,但其特有的4,2.噻唑、嗯唑串联结构单元与已知活性化合物相似而引起了我们极大的兴趣。首先,我们开展了LeucamideA的全合成研究。LeucamideA(1lHM02G150:5.2瑚加lLHepG2GI∞=5.2IlgfmLHuh7GI∞=5.1蠼r/mLFigu弛3:StructIlMofLeuc叠mideA3.1海洋天然产物LeucamideA的反合成分析纵观Leuc锄1ideA整个分子的结构,要顺利完成全合成工作,需要解决以下要点问题:1)大环关环位置的选择:2)构建甲基嗯唑.噻唑串联结构单元;3)选择合适的保护基。针对这三个要点,我们对LeucamideA作了如下反合成分析(如图3.1所示):≥吣。逡>芦N站摹蕞
中国科学院上海药物研究所博士论文LeucamⅪeA口+6‘5Scheme3.1Ret唧俑e髓can叠b俜iSofL蛐住m翊eA将目标产物分子的1位和3位酰胺键断开,大环分子简化为片端2和片端3;片段2中的酰胺键进一步裂开,得到片段4和片段5;随后,进一步反合成分析发现双杂环串联结构单元片段4可以从已有文献报道的噻唑甲酸6f42—441转化而来。二肽片段3可由简单的保护氨基酸结合而得。对于大环环肽的合成而言,选择合理的关环位置是极其重要的,直接决定着关环反应麓否成功,影响着关环产率的高低。关环位置选择不好将会导致极慢的关环反应速率,容易产生二聚、低聚以及C端氨基酸残基的差向异构化等副反应f45】。选择理想的大环关环位置有以下经验规则可以遵循145】:1)尽量避开空间位阻大的位置,例如N-烷基化的氨基酸、0【,甜双取代的氨基酸以及p位存在取代基的氨基酸(例如缬氨酸、亮氨酸等);2)环肽中如果存在脯氨酸残基,选择该位置关环对大环的形成非常有利,此时第一条经验规则失效,主要原因是由于脯氨酸存在特有的顺式构型(cis)和反式(订aIls)构型,反式构型向顺式构型转变的能垒只有2Kcal艋ol【46】,两种构型互相转变较为容易,非常有利于大环的关环;3)如果环肽中存在D型氨基酸和L型氨基酸,选择该26℃3k戈~◆b钒戈奄≯k2o0』)~F≮o×.一o∥的砂哧≯k
海洋天然产物Leuc硼ideA的全合成、结构改造及构效关系研究位置有利于提高关环反应速率‘47】;4)如果关环前体存在分子内氢键,将有利于关环产率的提高p51。.0\/封簧设日妒。‘\NHHN/‘≮O入≮?、。.O\/*~N葛丫N89妯丫∥‘\NH2COoHOR铲}:喝I+R、、’\NHHN—吣氏V,,R匕一S12OR∥:葛+融·LNHHN太。氏V馕LS13&heme3.Z在自然界,特定结构的天然产物有其存在的合理性,从能量角度考虑,可以认为复杂天然产物可能的几个异构体中,能量最低者具有存在的优先性,从化学合成的角度考虑,如果选择合成前体得当,天然产物将优先生成。如图3.2所示:Panenden小组【481将无任何保护基保护的三个氨基杂环酸(8,9,10)以等当量混合,在未加入任何金属离子的条件下,经缩合剂缩合后,得到天然产物7(产率23%)、其位置异构体1l(产率22%)以及其它四个产物(总产率30%)。在金属离子存在下,只生成7和12b,例如,在反应体系中加入CaaBF4)2,化合物7和12b的产率比是2.3:1。这一结果可以说明,无任何保护基的不同结构模块分子在天然条件下通过分子自组装将会优势生成天然产物。&s夕飞厂;:R^O儿,、舻≮一
中国科学院上海药物研究所博士论文因此,在考虑天然产物LeucamideA的最终关环位置时,选择(3)位氨基和(25)位羰基作为最后的关环位置比选择(1)位和(7)位羰基更合适,因为关环前体的氨基和羧基的保护基Boc和’Bu能够同时脱除,游离的氨基和羧基容易通过脯氨酸特有的顺式、反式构型互变调整到有利于大环关环的空间位置,完成关环反应,达到天然产物Leuc硼ideA的低能量状态。3.2海洋天然产物Le∞矾ideA的全合成研究3.2.1含甲基晤唑一噻唑串联结构单元的关键中间体4的合成研究3.2.1.1噻唑、晤畦等五元杂环的生源合成途径噻唑、曝睦等五元杂环广泛存在予海洋天然产物中,它们的形成是经以下生源合成途径实现的(如图3,2.1.1所示)149】:在酶的作用下,含有丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸残基的多肽底物经分子内环化脱水过程产生嚼唑啉或者噻唑啉,然后,它们经氧化过程,分子内脱出一分子氢产生囔唑(噻唑)或者经还原过程,氢化嚼唑啉(或者噻唑啉)产生嚼唑烷(或者噻唑烷)。这三种五元杂环形式均存在于自然界中,杂环化过程不仅改变了肽链的结合方式和电子分布,更重要的是使杂环肽产生了新的生理功能,例如它们可以和蛋白、DNA或者烈A等分子靶点作用,从而产生抗肿瘤、抗病毒、抗菌等生物活性【49J。;呻:、f≤~】三‘最H64.x∞$甜lx=0)一比I心1)‘=s》里【丹】+;\/、7、/1【;一吕J[热】涨嬲f丹]黜㈣o,咖蜘e(X=0)n岫加*晴(X=S)
海洋天然产物Leuc鲫ideA的全合成、结构改造及构效关系研究3.2.1.2小菌素B17的生源合成和其噻唑一嚼唑串联结构片段的化学合成从大肠杆菌(EcD『f)中分离的小菌素B17中存在4,2.噻唑.嗯唑双杂环串联结构单元,与LeucaIIlideA中存在的结构单元极为相似,它的生源合成途径如图3.2.1.2所示【23】:含69个氨基酸残基的多肽McbA在小菌素合成酶(MicrocinSynⅡletaSe)作用下生成含8个杂环的前小菌素B17(proMicrocinB17),接着在水解酶的作用下除去l一26位氨基酸残基,生成成熟的小菌素B17。在小菌素B17中8个杂环(4个噻唑、4个曝唑)由14个氨基酸残基(6个甘氨酸、4个丝氨酸、4个半胱氨酸)转化而来,其中2个甘氨酸一丝氨酸二肽片段转化成嗯唑环G和H,另两个甘氨酸.半胱氨酸二肽片段转变成噻唑环c和D,而甘氨酸一丝氨酸.半胱氨酸三肽片段和甘氨酸.半胱氨酸.丝氨酸三肽片段分别演变成串联嗯唑(A).噻唑(B)结构单元和噻唑(E).嗯唑(F)串联结构单元。1拍镐MELKASEFGV川SVDALKLSRQSPLGVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGSHIIM由BcD.—汀甲●pr嘲ccBl7p∞她。Iys醅tM;croc-nBl7Sch啪e3.2.1.229
中国科学院上海药物研究所博士论文由于小菌素B17强效的抗菌活性与噫唑一噻唑串联结构单元有着密切的联系f23】,这引起了合成化学家的浓厚兴趣,Warner等人对小菌素B17中的噻唑一嗯唑串联结构单元进行了合成研究,其合成路线如图3.2.1.2.1所示【50】:o等J嚣飞蒜J≈1N№¨cr丽蔚雕八兰一cN丽i而鬲蕊∥\≈7Y”’2=三私:飞芦私:飞~-eoH膪^蜣.74%H☆文H★—!L,*、CooRn—R:№,7,9‰)八c00№bc例蜊kR=H"o堕确Y::岔疋单Phw::岔q~——确YN√嘲~f——一”’W“√““、oo№o∞纠w锄er小组从氨基乙腈出发,经H2S硫化得到的硫代甲酰胺化合物16与溴代丙酮酸乙酯在高温回流条件下反应生成噻唑17,接着18与丝氨酸甲酯偶联得到的化合物19在B砒ge路试剂的作用下生成噻唑一嚼唑啉串联的化合物20,最后将嗯唑啉氧化,得到小菌素B17中的4,2一噻唑一嗯唑串联化合物21。整条合成路线最主要的特点是根据杂环合成的生源合成途径高效率的合成了杂环,对我们合成Lc测deA有很高的参考价值,但是在合成噻唑环、嗯唑环时,使用的条件较为苛刻,不利于含有手性中心的杂环的合成。3.2.1.3噻唑、嚼唑的合成方法学研究进展3。2。1。3。1噻唑的合成方法合成噻唑最著名的方法是Hantzsch合成法,它的基本特征是用一个0c一卤代羰基物组份(或等价物)和一个能提供C一2杂原子的三原子体系来合成(如图3.2.1.3.1所示)f5¨。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究后来,Holzapfel小组改良了Hantzsch反应,使其适用于含手性的噻唑的合成(如图3.2.1.3.2所示)【421。HclPoo日Poo日咿·尸_二二一严遨骂墨一..p竺:.型三一№.p‰b“0。0酮Scheme3.2.1.3.2最近,S唧son小组用罗宾逊一盖布利尔(Robinson—Gabriel)环化脱氢法合成噻唑(如图3.2.1.3.3所示)【52】。喇凡H—er<堪弘。%%Lawe鹞On.s陀a驴ntMWhT鼍旧ia墩mBr《汽广忆Scheme3.2.1.3.3Wipf小组发展了聚杂克莱森重排(Polyhetero—CIajs叻Re硼.觚gement)反应合成了2,4一二取代噻唑(如图3.2.1.3.4所示>【531。SR八N№+卧籴R·一H旦RVNVR—S"Scheme3.2.1.3.4从上述例子可知,硫代酰胺是合成噻唑的关键原料,目前,硫化试剂主要有H2S/HCl、P2S5、和Lawesson试剂等【54】。前两种试剂硫化底物反应条件苛卜,\HX/~s铷一幽H,N中●纠$h≥R~N一禽~
中国科学院上海药物研究所博士论文刻,产率低,更重要的是容易使手性底物消旋;Lawesson试剂是非常好的硫化试剂,反应条件温和,能以较高的产率得到产物,并且能保持手性底物的手性。3.2.1.3.2愿睦的合成的方法嗯哇环存在于许多活性天然产物中,发展、丰富嗯唑的合成方法已成为合成化学家的研究热点15sl。目前。有以下合成方法较为典型(如图3.2.1.3.5所示)。D^ST.∞R囟掘p岛悖嘲州R曲竺只硷刚,N—t_卜气∞C00№¨℃∞№R炙m+B,/丫:一R人№+Br,1川“‘麓嚣∥NNc∥N嘞32+o卜竺R啦一⋯峙”\coo№R、;:百R,旦[峄艮】一盹妒悃删Sch啪e3.2.13.5如果要合成4位含酯基的噫疃,方法(1)是最合适,例如化合物22在DAST或者BⅢgress试剂的作用下进行分子内环化脱水生成嗯唑啉23,接着在掣.≥RVoH^嚣.了篮艮Rft钟。火MR
海洋天然产物Leuc绷ideA的全合成、结构改造及构效关系研究DBU和CCl3Br的温和作用下以较高的产率生成嗯唑24【561,该方法在天然产物(+).calyculinA和(一)一calycllliIlB的全合成中得到运用‘57弓91。方法(2)是另一种合成嚼唑的典型方法,将氨基醇与各种类型的酸偶联得到的产物25经Dess—Manin试剂氧化后,得到氨基醛化合物26,然后在三苯基膦、BrCl2CCCl2Br等试剂的作用下得到嗯唑27。当R’的空问位阻很大,用其它方法无法合成嗯唑时,方法(2)能以较高产率得到产物,但是如果产生氨基醛不稳定,产生噫唑的产率将会大大降低【删。该方法在(+)-hennoxaz01eA【6l】、(一)一muscoridef62】、phorboxazoleAf63’等天然产物的全合成中得到运用。方法(3)适用于原料易得的0L一卤代酮29与酰胺28一步合成2,4一二取代噫唑。方法(4)一(6)是合成2,4,5.三取代嚼唑的典型方法【“删,为天然产物的全合成和药物化学研究提供方法学支持。综上所述,丰富的噻唑、嗯唑的合成方法,给我们的全合成的工作提供了许多方法学信息。小菌素B17的生源合成途径以及w锄er小组的关于小菌素B17中噻唑.嗯唑串联结构单元的化学合成工作为我们开展Leuc锄ideA的全合成工作提供了极好的参考资料。3.2.1.4含甲基嚼唑一噻唑串联结构单元的关键中间体4的合成首先,根据MeyerS小组报道的方法【4孤,合成化合物45,反应途径如图3.2.1.4所示:≮删音飞=盖世心;:lH2帖%;:IHB∞"o姒{!l岫∞‘柚.1,c00Bn,co阳音憾H:上孓:H晚蚤×H眦.s厂toH—NHBocY、NHB∞⋯。\—,\hIH晰43I“l弱a>(B∞)20.NaHc03.di0嘎锄e:b)‘即OcocI.№椭.DME:NH3(g):
中国科学院上海药物研究所博士论文将Boc保护的天然缬氨酸4l在N.甲基吗啡啉(NMM)和氯甲酸异丁酯存在下活化羧基,通入干燥的氨气,定量生成化合物42;接着,用LaⅥresson试剂硫化酰胺的羰基氧,生成化合物43;化合物43与溴代丙酮酸乙酯反应生成中间体噻唑啉44,随后,继续加入三氟乙酸酐(TFAA),2,岳二甲基吡啶,生成噻唑4S,两步产率68%。biMc上0:H眈删I酊e[=。:a)uoH.Me(垮n乜0:b)哂uocoa,M瞩一=l-廿矾的哺传№嘲.HcL7%:c)-7如,D^sTIth∞K200》73%:d)∞U。由CCb73%:d)u0H,¨eow心0.schem瞎3.2.1.5将化合物45水解之后,生成的酸6与丝氨酸甲酯盐酸盐偶联得到化合物46;接着,用DAST环化【矧、柱层析分离,得到噻唑一嚼唑啉中间体47;之后用三氯溴甲烷和D叫,将嚷唑啉环转化成嚼唑环刚,顺利合成了化合物48(总产率49%),建立了关键的甲基嗯唑.噻唑串联结构单元的合成的方法。该方法存在以下特点:1)路线短(由45至48共4步反应),2)产率高(由45至48总产率49%),3)可以用不同的氨基酸为原料,改变杂环上的取代基,适用于建立多样化的杂环串联小分子化合物库或者含有类似结构的天然产物的全合成研究。o~一≯k佣妣。卜N~幅6尸≯E
3.2.2多肽片段3和嚷唑5的合成NHFmoc+纵土H053a)队ST.CH2Cb..78oC:thenK2C03.70%:b)B庀C13,D日u.CH2C12.50%.c)AlccI.MeoH,∞%d)DCC.HOBt.CH2C12:e)piperⅪi怕.DMFScheme3.2.2运用常规的多肽合成方法得到化合物49【67l;然后,用DAST成环,生成嗯唑啉50【56】;之后,在DBU和BrCCl3作用下得到嗯唑S1【56】;接着用乙酰氯/甲醇体系温和地脱除Boc保护基【731,得到嗯唑胺5;运用常规的缩合方法得到二肽3。HNro唑八吲B吣H即舡鲥S[~c.洲瓣
中国科学院上海药物研究所博士论文3.2.3天然产物Le∞铷ideA的合成a15,H,c.H吣.D阱。7双:吣呲Meo州H20:c,EDc.3,¨叫孽t.78%:d)TF^。c峨:e"|t町V.嘲ELDMF。Sc■蛐e3.2.3噫唑胺5与化合物4偶联,以78%的产率得到化合物55:最后用常规的水解反应得到三杂串联酸2。随后二肽化合物3与化合物2偶联得到大环关环前体S6a,在三氟乙酸作用下,一步脱去B0c与lBu两个保护基生成化合物56b,晟后在衄TU作用下,以87%的高产率关环得到目标产物,成功地完成了海洋天然产物Le眦aⅡlideA的首次全合成瞄J。一般而言,大环关环产率都很低,反应时间长(一般需要2—3天),而LeuC锄ideA的关环产率有87%,关环反应速率快(10小时完成反应)。根据上述实验结果可以认为,我们选择的关环位置是非常合理的,关环前体化合物56a被一步脱除Boc和tBu基保护基后,产生的化合物S6b不带有任何保护基,有利于关环反应的发生;同时,脯氨酸特有的容易互变的顺式构型和反式构型容易使3位胺基和25位羧基处36
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究于有利的在空间位置,易于生成(3)一(25)酰胺键,达到天然产物Leuc锄ideA的低能量状态。3.4本章小结我们用较为简单的方法,以较高产率得到了甲基嗯唑一噻唑《啾键中间体48,接着又以87%的高产率得到了大环关环产物LeucanlideA,受到了国际同行的关注【68—7列,我们建立的串联杂环的合成方法被认为是合成这类化合物的典型方法【76】。全合成的顺利完成为以后建立多种类型的杂环串联小分子化合物库的工作奠定了良好的基础:首先,能够大量合成2,4.甲基嗯唑.噻唑串联关键中间体48,使下一步围绕其关键结构单元进行多样性衍生化,合成新型小分子化合物库的工作能够顺利进行;其次,在全合成的过程中,积累了~些杂环合成的经验,为进一步合成不同串联方式的杂环,丰富化合物库的多样性,打下了良好的基础。37
中国科学院上海药物研究所博士论文第四章围绕LeucamideA的甲基嚼唑一噻唑串联关键结构单元的多样性衍生化及生物活性评价一初步生物活性小分子的发现Lc柚锄idcA中所含的嚼唑.噻唑串联关键结构单元在海洋环肽中是极其罕见的,一些已知的活性化合物也存在类似的结构单元,是建立新型的小分子化合物库,进行药物化学研究的理想的结构模块。因此,在完成Leuc锄ideA的全合成工作之后,我们利用天然产物的串联杂环关键片断和运用全合成工作发展的串联杂环的合成方法,围绕甲基嚼唑.噻唑关键结构单元进行合理的多样性衍生化,建立了小分子化合物库。4.1围绕Le眦狮id“的甲基晤唑一噻唑串联关键结构单元开展的探索性的结构改造工作对天然产物k懈amideA而言,存在两种杂环串联方式:第一,2,4一甲基嗯唑(B环)一噻哇(A环)直接串联:第二,嚼唑(C环)与2,4一甲基嗯唑(B环).噻唑(A环)串联结构通过酰胺键串联。考虑到杂环串联方式的不同,可能会使化合物产生生理活性差异,同时,为丰富化合物库的多样性,设计了以下化合物库(如图4.1.1所示):1)围绕2,4一甲基噫唑(B环)-噻唑(A环)串联结构单元设计化合物库l;2)围绕2,4一甲基曝唑(B环)、噻唑(A环)、嗯唑(C环)串联结构单元设计化合物库2。Le埘∞盯●;deAScheme4.1.138蚁凡F(S髟NIR2/~岷Lib憎吖1
海洋天然产物LeucalllideA的全合成、结构改造及构效关系研究首先,从合成的天然产物关键中间体出发,在较易改造的氨基和羧基位置引入不同类型的取代基,合成了以下化合物库(如图4.1.2和4.1.3和4.1.4所示)。Scheme4.1.239
中国科学院上海药物研究所博士论文Sch锄e4.1.4合成路线如图4.1.5所示:首先,大量合成化合物48和55;接着,用TFA脱除化合物档和5S中的B0c保护基,分别得到二杂环胺57和三杂环胺91,分别在化合物57和化合物91的胺基上进行酰化反应,合成规模适度、结构较为丰富的化合物库l和化合物库2。之后,选取部分化合物,水解生成相应的羧酸,进一步丰富化合物库的结构多样性。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究舛-%。1∞·103105-106fBuOCOCI。NMMR1CoOH,cH2C12猷№之≮徽章:吒嚣三R1COCI.NaHC03AcOE汗12。(VⅣ1,1)=NHBoc=NH2}EDc。DMAP.R,COOH,4AnloIecularsiE}vesJrDMFT63。78-84.88-90柏,63·髓,76,配,胬]LioH,h^eoH,H20114·""9·卜J‘NMM。lBuoCocl。R,COOH,CH2C1258·62,71·76。85·87R,COCl,NaHC03H20,AcoEt(V~1门)r上2乏4h[慧嚣cTFAE:l;黑激是黑H.0DMFSeheme4.1.S92—93,97-99,"04107-109,113·1144.2化合物库1,2中部分化合物的生物活性测试据相关文献报道【241,一些含类似结构单元的化合物产生生物活性的可能机制是和DNA依NA特定部位结合,据此,我们假设合成的化合物也能与DN删A相互作用,因此选择化合物活性测试的靶点主要集中在与DNA依NA复制相关的模型,例如乙肝病毒(HBV)、流感病毒(InnueIlzaAviruS)、疱疹病毒等病毒模型以及一些与病毒复制相关的分子水平的筛选模型,如HIV整合酶、HⅣ蛋白水解酶,发现了一批有中等强度抗病毒活性的化合物。41
4.2.1抗流感病毒抑制剂的发现选取化合物库l和2中部分化合物进行抗流感病毒筛选,大部分化合物显示了一定的抗流感病毒活性。T.able4.2.1.Ant0洒nu蛐zavirusAacti’rit)randc”otoxicit)rof4"2-biSheterocyck妇ndemderivat如esinMI’CK42
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究从表4.2.1中可以看出,对于化合物库1中的化合物而言,化合物的活性随着氨基位置取代基的体积增大而增强(例如58—61);如果氨基位置连接的是苯甲酰基,苯环上取代基的电子效应会影响化合物的活性,例如苯环上含有吸电子基F的化合物62的活性比苯环上含有给电子基团甲氧基的化合物63的活性弱2倍。比较胺基位含不饱和脂肪酰基的衍生物(64—69)的生物活性,发现66的活性是64的5倍,仅仅是因为“的酰基取代基比64多了一个亚甲基;由于化合物66的不饱和脂肪酰基的末端比65多了两个甲基,66的抗流感病毒的活性比65强7倍;将末端双键处于五元环或者六元环内,化合物的活性有所提高,例如化合物(67,68)的活性优于化合物(“)3倍;化合物69与“的活性差别不大。比较化合物63、68、115、116,发现酸衍生物(115、116)的抗病毒活性比甲酯衍生物(63、68)高2倍,这可能是游离羧酸有利于抗病毒活性的提高。在二杂串联单元上再串联一个嗯唑环,发现对应化合物的活性没有发生明显变化,这说明引入一个嗯唑环对活性影响不大。对于化合物库2中的化合物而言,构效关系(SAR)的变化规律与化合物库l的化合物变化规律一致,即化合物的活性随着氨基位置取代基的体积增大而增强(92.93),将末端双键处于六元环内,化合物95的活性优于化合物96的活性3倍。值得一提的是天然产物LeucamideA没有显示抗流感病毒活性,这可能是LeucamideA的大环骨架中独特的杂环串联构象不利于抗病毒活性,而非环衍生物的杂环串联构象有利于抗病毒活性。
中国科学院上海药物研究所博士论文4.2.2抗疱疹病毒抑制剂的发现针对疱疹病毒的活性筛选结果表明,部分化合物也显示了一定的抗病毒活性,虽然活性不是很理想,但从表4.2.2可以看出,这类化合物能选择性抑制疱疹病毒ll。T叠ble4.2.2A正瘁ⅡSVactM哆of4’2-bisheler吣弦letand啪der.v-tb嚣C鲫pdRCC弛0l咖L)lC铀(纠昏啦)HSV~IHSV一Ⅱ62、≯198’43№溺盈848799l似Leuc啪ideAtl)ACV176.78NA9r7.59l缱.2419s,43707.Il79t75>lOoo106.52NA12.9278.75106.5229337NAlO.5S4.2.3抗⋯V相关靶点活性的化合物的发现研究发现,艾滋病病毒(HIV)感染其他细胞时,不能缺少三种酶【771:逆转录酶、蛋白酶和整合酶,其中,在病毒DNA整合到宿主细胞的DNA的过程中整合酶起了非常关键的作用,因此,整合酶被认为是研究抗病毒药物的非常有吸引力的靶点,备受人们关注。Rn.砂。≯、/l
海洋天然产物Leuc鲫ideA的全合成、结构改造及构效关系研究我们也评价了合成化合物在一些与HIV病毒复制相关的分子水平模型上(例如,HIV整合酶、HIV蛋白酶)的活性,发现化合物84对HⅣ蛋白酶有一定的抑制作用,IC50值为33.3斗咖L,化合物85对HⅣ整合酶有抑制活性(IC50=145.8p∥mL)。为进一步确定化合物85对HⅣ整合酶抑制活性及研究化合物的构效关系(SAR),我们围绕化合物85进行了初步的探索性的结构改造工作(如图4.2.3所示):龇№一、、.?丫No、.≯:屺●50铲-从化合物85的分子结构中可以看到,它的噻唑位置存在中等体积的异丙基,我们尝试通过改变该位点取代基的空间大小来考察对化合物活性影响。因此,引入大体积基团苄基和小体积的氢原子来代替异丙基得到化合物120和化合物12l,并进一步对其进行结构修饰,考察化合物对mV整合酶的抑制活性。合成了以下化合物(如表4.2.3),合成方法如图4.2。3所示:45
中国科学院上海药物研究所博士论文No.RIR2R3125126127128129130BnBlIBnHLHMe/\CNTabk:4.2.3B0c保护的苯丙氨酸在NMM,ClCOo’Bu的作用下形成酸酐,接着通入氨气,得到酰胺132。132在hwe浏l试剂作用下室温反应得到硫代酰胺,再与溴代丙酮酸乙酯直接作用生成134。134在LiOH作用下水解后,与苏氨酸甲酯盐酸盐发生偶联反应得到136。然后通过DAsT成环得到137。DBU脱氢得到化合物138,最后在1rI’A作用下脱去N—Boc保护基得到化合物122。矿≮。≯。。矿≯p。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究9X删土皑H上◇逸H:一◇迅H:~i洲上@JNH眈137猷№厂=。研究发现,当氮原子取代基为正丁基时,化合物(NB—D.NJ)能抑制核糖体中Q.葡糖苷酶I的糖基化过程f971,从丽破坏肝炎病毒糖蛋白的正常折叠和迁移。目前,它在土拨鼠模型上显示抗病毒活性睇一蚓。对于正壬基取代的化合物(NN—D奠u)同样也显示了抗瑚V活性,但是研究发现,它并不抑制a一葡糖菅酶I的糖基化过程,大部分人认为它抑制了病毒包被过程,也有人认为它抑制病毒删A的正常成壳过程【1嗍。德国拜耳公司研饲的二氢嘧啶类化合物Bay4l_4l凹,Bay38—7690和Bay39.5493有很强的体内抑制册V复制的能力,它们抑制HepG22.2.15细胞DNA复制的体外半数有效浓度(EC50)分别为0.05pM,0.15pM,O.03pM。这类化合物的作用机制是通过阻止或干扰病毒的核酸衣壳形成过程来抑制病毒EINA复制【1011,进而阻止下游瑚V基因逆转录、病毒颗粒成熟的一系列过程。它们的出现可能为治疗乙型肝炎提供了新的治疗方案。2,5.吡啶二甲酸衍生物是一类新型的DNA聚合酶抑制剂,分子水平活性
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究测试表明,这一类化合物的活性随取代基的变化而变化,EC50的变化范围是O.001.O.2“M【1021。目前,还没有文献报道这类化合物是否在细胞上存在活性。RobuS协navonc从野漆树(R办淞J”∞已出行P口)的种子中分离而得,对H印G22.2.15有很强的抑制活性,EC50值为0.25州,进一步研究发现,它的作用靶点为DNA聚合酶【1031。将它和Penciclovir和l锄ivudine联合用药进行体外测试,发现它们之间产生了协同作用【1041。当前,发现新型、高效、低毒的抗乙肝药物,需要药学家付出诸多努力。例如,一方面,需要对乙型肝炎病毒及其复制过程有全面的认识,对具体的分子水平的靶点(例如螺旋酶,蛋白酶,聚合酶)的晶体结构能清楚的把握f105】;另一方面,当发现一类全新的抑制剂时,紧接着就需要确定它的作用机制、知道它确切的作用靶点。这些对不同药物之间的联合用药,以提高药物的协同作用是非常有益的【106】磷少◎A。。邺:%k:h5印戳纩白N%^T一1∞.EC∞=2.4.I^lt霉‘n吐龇髓V州i咖伽EC∞;O.25州ag_n虹卸Ⅳ功qAp0Iy帅辨Figure5.2.3Non—NucleosideH】BVantiViralagentsinde、,elopment59氛蛩一眦呲E乱墅一CoHo}lE
中国科学院上海药物研究所博士论文目前已批准的抗乙型肝炎病毒(HBv)药物中,绝大多数是核苷类化合物,在临床运用过程中发现它们主要存在以下缺点:1)细胞毒性;2)长期用药产生的抗药性病毒变异株的出现,需要结构不相关的不同药物来对抗,因此发展非核苷类抗乙型肝炎病毒药物成为一个引人注意的方向。挑日妒%I在对前文中提到的Leuc锄ideA衍生物进行的抗乙型肝炎抗病毒活性测试中,我们发现化合物78有中等强度的抑制船V复制的活性,这为我们进行靶向化合物库设计,开展构效关系研究,发现高活性船V抑制剂提供了新起点。5.4新型靶向乙型肝炎病毒非核苷类小分子化合物库的设计思路从分子结构上看,化合物78完全不同于现有文献报道的非核苷类小分子抑制剂,尤其重要的是,它能较强的抑制腿VDNA的合成,这进一步证实了我们最初的假设。从药物化学角度讲,它可以改造的位点很多,可以进行深入的构效关系研究(SAR),发现新型的高活性的小分子非核苷类抗乙肝病毒抑制剂,找到先导化合物(LeadCompound)。从作用机制角度讲,化合物78是全新的乙肝病毒抑制剂,对其进行深入的构效关系研究,找到高活性的抑制剂,以此为起点,设计合适的工具化合物(或小分子探针),进行作用机制研究,寻找这类抑制剂真正的作用靶点。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究猷R,分‘弧’S髟NRf人NHR3[亘互]眯臼叵习Schcme5.4“)=-ju№尸、S丫Nnr:埯lHL』臣亟巫]’■■■■■■■■■■■■■●■■●■●■●■■■■■■■■■一O僦7:l竺竺竺竺竺竺l"■●■●■■■■■●■■■■■■■■■●●■■■■■■■■■■■■■■●■■一我们的基本思路是以化合物78为研究的起点,通过合理的小分子化合物库的设计,运用化合物设计、化学合成与生物活性筛选相结合,以活性指导化合物设计来提高其活性的策略,寻找不同于目前文献报道的新型非核苷类抗乙型肝炎小分子抑制剂。5.5阳性化合物的结构分析德国拜尔公司开发的Bay39.5493有很强的抑制乙型肝炎病毒复制的能力,实验表明,它能有效的抑制HepG22.2.15细胞的DNA复制(IC50=0.03州)。本课题组发现的化合物78虽然抑制HepG22.2.15细胞的DNA复制的能力不强(IC50=76pM),但是从结构上看,两者存在一定的相似性:首先,Bay39—5493结构中存在噻唑.二氢嘧啶杂环串联结构单元,这与化合物78中存在的甲基嗯唑一噻唑串联结构单元有相似性,不同的是,前者是2.2串联,后者是2-4串联,这可能是两者产生活性差异的一个重要原因;其次,Bay39.5493的二氢嘧啶环上存在甲基和羧酸甲酯取代基,而化合物78同样也存在甲基和羧酸甲酯取代兰磊一贿二一!|奁|【触一竺|基坠一圆抗二
中国科学院上海药物研究所博士论文基:再次,Bay39.5493中存在2.氯_4.氟苄基取代基,而78存在噻酚甲酰基,同为芳基取代基,但是两者的连接位置存在明显的差异,这可能是两者产生明显活性差别的另一主要原因。因此,首先调整五员杂环的串联位置,将2.4串联调整为2.2串联,设计了如图所示的化合物库。Aa确.醇净.{u鹏,=≤s丫No丫盎韬lH山为0啊—捌bh獬lC∞=76IIMⅡ鸭黼&L玉啊哆3sI嗡锄eS.55.6多样化的2-2双杂环串联小分子化合物库的合成和活性结果分析在化合物库3中,杂原子Xl和Yl可以各自为NH、o、S原子,X2和Y2可以各自为N、CH2。从组合的角度看,杂环串联的类型有以下36种:噻吩一噻唑、噻吩一曙哇、噻吩一味唑、噻吩一噻吩、噻吩一呋喃、噻吩一毗咯,睦唑一噻唑、噻唑一曝唑、噻唑一咪唑、噻唑一噻吩、噻唑一呋喃、-噻唑一毗咯,曝唑一噻唑、嚼唑一嚼唑、嚼唑一昧唑、嚼唑一噻吩、嗯唑一呋喃、嚼唑一毗咯,咪唑一噻唑、昧唑一囔唑、咪唑一咪唑、昧唑一噻吩、咪唑一呋喃、咪唑一吡咯,呋喃一噻唑、呋喃一嚼唑、呋喃一咪唑、呋喃一噻吩、呋喃一呋喃、呋喃一吡咯,吡咯一噻唑、吡咯一噫唑、吡咯一咪唑、吡咯一噻吩、吡咯一呋喃、毗咯一吡咯等。杂环串联种类繁多,能非常好的满足化合物库多样性的要求,但是从药物化学研究的实际出发,必须集中力量进行初步的构效关系(SAR)探索,为以后的研究打下扎实的基础。因此,62
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究我们从阳性化合物的结构分析结果出发,结合实际合成方法的可行性,原料的易得性等因素,展开了噫唑一噻唑、噻(吩)唑一噻唑、噻(吩)唑一噫唑、噻(吩)唑一咪唑等串联双杂环化合物的合成工作,考察杂环类型的改变以及杂环上取代基的变化对化合物抗HBV活性的影响,探索这类化合物的构效关系(SAR)。鸭剜载民凸R噙阶+町谢R1R4R2R/q—R2肛147148R。影X一凡声㈣HX鸭钟篇人R:一R3滓∞删’Ⅸ!
中国科学院上海药物研究所博士论文在选择杂环A、B上取代基的类型时,我们首先考虑保持阳性化合物78和化合物脚39-鲋93结构上含有烷基(甲基)和酯基的共性,其次,结合化合物结构多样性的要求,从原料的易得性因素出发,将取代基初步定为:R。为H,Cl—C13烷基,苯基或2.氯,4.氟取代苯基,苄基,(含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的)取代烷基,C2一c6的烯基,卤素原子等;R2为Cl—C2烷氧羰基,羧基,H,(含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的)取代烷基等;R3为H或者烷基:心为H或者烷基、苯基等。5.6.2以№gishi反应为基础的噻唑(秀唑)—噻唑串联化合物库的合成根据策略1,2-2串联小分子化合物的合成可以通过Ne酉幽反应实现,通过以下方法合成化合物(如图5.6.2.1所示):以二氯乙酸乙酯为原料,经Ⅸ眩ens反应【1明,生成2.氨基噻唑153量.e,接着将2.氨基噻唑溴化fllo】,生成2.溴噻唑154叠-e,然后通过Pd催化得Negis】}li偶联反应得到目标产物【1嗍。为增加化合物库的多样性,将部分化合物水解,得到羧酸衍生物161一164。
海洋天然产物LeucamideA的全合成、结构改造及构效关系研究a~阳OfR式删e]卫削飞ZR土町飞yRLJcooMb℃ooMe"53a-O154a-口a)MeQNa,MeOH.RCHO:b)(H2N)2CS:c)CuBr.‘8u0NO.CH3CN.№≯町+B幽飞≥MeOOCN—SH2N人NH2Scheme5.6.2.1H2N飞h\—√詈卧飞℃——————————-l■·~I—.二,,cu%”\√165166167Scheme5.6.2.2溴噻唑167通过以下方法合成(如图5.6.2.2所示):将环己酮165与硫脲、NBS、过氧化苯甲酰反应得到粗产物1“,接着将1“溴化,生成溴噻唑化合物167,然后通过Pd催化得Ne西shi偶联反应得到目标产物160。为在噻唑(B)环中引入Bay39—5493分子存在的2一氯一4.氟苄基,丰富化合物的结构多样性,我们用以下方法合成化合物168a、168b、169a、169b(如图5。6。2.3所示):化合物170经硼烷还原,得到硼酸酯,用PCC氧化得到化合物。◇
中国科学院上海药物研究所博士论文17:2a和172b的混合物11嗍,混合物立即与二氯乙酸乙酯进行Ⅸ嘞s反应,经溴化得到两个2.溴噻唑【¨ol。然后与预先制得的嗯唑锌试剂【111】或者噻唑锌试剂经Pd催化的Ne西幽偶联反应得到目标产物11嗍。gcIaoF由丫上,舟(,扩啪)。^,价H,扩Ha午三性1上叭禽R土、彳RoLJ‰”b)o№甲P,妨f白b砷■啊_}■_州囊黻I■嘲,臼瞳o:埘—响●■一d■md啊珊-k,a七%崎■—,№,—帆RcHo:由吐舢-岱:日cI·甄自lIc帕.a删.艮F护F妨.a)刚,THF:b)P口c附幽,臆咖oft砌and"渤,THFScheme5.6.2.3本合成路线最大的特点是路线短,反应产率高,适合大量制备化合物:但是美中不足的是,产物的多样性受到限制,不能满足建立化合物库多样性的要求,无法满足深入的构效关系(SAR)研究的要求。
海洋天然产物Lcuc啪ideA的全合成、结构改造及构效关系研究5.6.3多样化的2—2串联杂环的合成运用上述方法合成串联杂环化合物库,使化合物的多样性受到限制,不利于深入的构效关系(SAR)研究。为此,本小组摸索出了合成多类型2.2串联杂环的通用方法(如图5.6.3.1所示),它使噻唑.噻唑、噻吩.噻唑、噻唑.嗯唑、噻吩.嗯唑、噻唑.味唑、噻吩.咪唑等串联杂环的合成简单易行。合成过程如下:异氰乙酸乙酯178与酰氯或者酸酐混合,在有机碱的作用下,室温反应,得到嗯唑179【112】:然后,嗯唑179在3M的氯化氢乙醇溶液中开环,生成氨基酮盐酸盐化合物180a.i.随后,将产生的化合物180a.i与相应的杂环羧酸181a.d偶联,得到化合物182a.m;之后,按照合成的需要,改变不同的反应条件,得到不同的杂环串联化合物【n3】:1)将化合物182与Lawesson’s试剂混合,用1rI邛作溶剂,加热回流,以较高产率得到噻唑化合物;2)将化合物182与三氯氧磷混合加热回流,较高产率得到嗯唑化合物;3)将化合物182与醋酸铵、醋酸钠混合,加热至1400C,得到咪唑化合物。∥儿八必R☆必RV个E13wTHFB∞C‘lb.Ha"7量17●"■d弋譬+^☆一黼芯Ⅳo八+^飞’矿一麓鲁=,∞毗帕《,l:‘l瓣’脚’HR馓RNH·^c,№由~1州6C吨℃00日Scheme5.6.3.167军。三二一蜘馓陋液一警圈
中国科学院上海药物研究所博士论文噻唑一噻唑串联化合物噻酚一噻唑串联化合物噻唑一嗯睦串联化合物噻酚一曝畦串联化合物噻酚一味畦串联化合物噻唑一咪唑串联化合物其他咪唑串联化合物
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究化合物208、209的制备如图5.6.3.2所示:将噻(吩)『唑甲酸(化合物211)与化合物212偶联得到化合物213,213经IBX氧化得到的化合物214在NH40Ac作用下得到化合物208、209。∥删+谗211212‘土矿X~土哦Me渊:化合物210的制备如图5.6.3.3所示:将噻唑甲酸与化合物216偶联得到化合物217,217经mX氧化得到的化合物218在NH40Ac作用下得到化合物210。酽+P蹙~I姆_215b—————}C————--H醌≮~a)EDC.DMAP.pyr.dine:b)lBX.DMSO,toluene:c)NaOAc,NH40AcScheme5.6.3.3经一步考察杂环B上4为羧基的重要性,我们又合成了化合物223。用以M0hI6QNH8矾。几纠v∥N《
中国科学院上海药物研究所博士论文下合成方法合成的氨基酮化合物22l(如图5.6.3.4所示)与噻唑-2.甲酸偶联得到化合物222,然后222与POCb反应得到化合物223。人几甜1人LN。1人几MaI酽器w上≤三浙为进一步丰富化合物库的多样性,增加杂环串联的类型,我们用以外的合成了化合物229,为今后合成新型串联杂环结构,继续深入的构效关系研究提供了一条简单易行的合成路线。OH◆cNv火on—:oZH恐5三扩搿:丫三扩:警:1氓la)愀,毗瞎.abC峪呻4Nr日h彘啊哺.噻(酚)畦甲曩.EDCI.D硼妒,DMF.qlB)c.甲苯fD_ISD:d)Pocbsc■a_e5.‘.3.5具体过程如图5.6.3.5所示:以BOC氨基保护的苯丙氨酸为原料合成氨基醛224,然后,氨基醛与异氰乙酸乙酯225通过Ba∞砸ng反应【1141,得到化合物226,接着在n’A作用下,脱除保护基,随后与噻酚甲酸偶联得到化合物227,之后,用mX氧化化合物227上的羟基,生成羰基化合物223,最后,在POcl3作用下,经环化脱氢反应,得到最终产物229。睢台n禽B鹚骖
海洋天然产物Leuc砌ideA的全合成、结构改造及构效关系研究为进一步增加化合物库的多样性,合成了以下含有氯原子的咪唑化合物230一233,考察羧酸甲酯被氯原子代替后,对这类化合物活性的影响。疏ya具体的合成路线如图5.6.3.7所示:将醛234与氰化钾、氯化铵混合,以氨水作溶剂,室温反应,得到氨基氰化合物235,之后氨基氰化合物与噻唑甲酸(噻吩甲酸)偶联,将得到的产物236与三苯氧磷、四氯化碳反应,得到目标产物230.233【1151。R墨:l—R匙N上R皿器足:lR1弋≮‘2342筠船62∞.233『Y根据以上合成方法,我们合成了噻唑.嗯唑、噻唑.噻唑、噻唑.咪唑、噻吩.嗯唑、噻吩.噻唑、噻吩.咪唑等6种类型杂环串联化合物,考察不同杂环串联类型化合物对抑制乙型肝炎病毒复制活性和产生的细胞毒性的情况;同时,受原料限制,只在杂环B上引入了疏水性、亲水性、吸电子性、给电子性以及不同体积大小的取代基,比较化合物之间产生的活性差异,为建立明确的构效关系完成了化合物的多样性衍生化。
中国科学院上海药物研究所博士论文5.6.4化合物活性结果分析R2____l__ll___-l___l_l●●_-__--__--_l-IlI●--__●-II__ll__l-●●NoS虹ucll玳}C州疵时聃媾g册“gDNACC鲍(帅∞口枷∞蹴俩∞唧lic“onlC∞(SDlC轴(SDlC50/lCx(S1)155156157158159160161162163168b岔≮≥臼☆吖、日赫嘟嗽吨甜幻岔眨>《晰℃a鲥盼一、∞●吣r,删6∞58.8(6.75)57.3(6.9)19.4(20.5)6∞67.57c>4.93)21.67p15.4)2.4(>138.8)173.6328.6611.4179。9256.74373l∞33.7l43.53(2.28)2∞.36(1.57)150(4.07)l犯.1(3.36)68.86(2.61)177.5(1.01)37.2(6.9)90(4.86)255(1.1)127.7(2.01)1∞.7(4.34)单浓度lc20=31.32.53(>129.9)单浓度lC34=31.3NC单浓度lc54=12560(7.29)150(1.73)153.1(1.70)71.78(1.4)89.46(1.11)单浓度1C31.s=3.7T-bk5.6.4.1
海洋天然产物LcucamideA的全合成、结构改造及构效关系研究根据表5.6,4.1中显示的数据,可以得到以下初步的构效关系:1)对于噻唑环B而言,5位取代基是异丁基(化合物156),抑制DNA复制的能力是最强的,是化合物169b的3倍,是结构改造的起点化合物78的30倍,在5位引入体积较大的基团(例如苄基)或者引入体积较小的基团(例如H)均使化合物抑制HBVDNA复制的能力降低。2)对于噻唑环B而言,将4位的甲酯衍生物水解成羧酸衍生物,化合物抑制HBVDNA复制的能力会明显变弱,例如,化合物162(CCso=437.3“M,IC50=60pM)与化合物156(Cc50=600uM,Ic50=2.4岫压)相比,活性降低了28倍,毒性有一定程度的提高,这说明,4位酯基取代对抑制船VDNA复制是非常重要的。3)如果将4位具吸电子性的羧酸甲酯被具弱供电子性的烷基取代(例如化合物169),化合物抑制HBvDNA复制的链力消失,这说明杂环B上羧酸甲酯基的存在对化合物的抑制HBVDNA复制活性是非常重要的。4)化合物1碣b在3.7州的浓度下对瑚wDNA显示了31.8%的抑制率,化合物1猡b抑制HBV复制的Ic50值为6,】pM;结构上,它们在杂环B的5位含有2.氯-4.氟.苯基,它是一个体积较大、有较强吸电子能力的取代基,根据目前掌握的数据来看,大体积取代基的存在不利于化合物活性的提高,因此可能是它的吸电子性对化合物活性提高的贡献大大抵消了使活性降低的不利因素,使得化合物168b和169b显示了较强的抑制HBVDNA复制活性,因此需进一步实验确定是否在杂环B上引入强吸电子基团来增强杂环B的缺电子性有利于化合物活性的提高;化合物168b的毒性高于169b,可能是由于氧原子被硫原子取代后增加了化合物的毒性,这需进一步的实验验证。5、}化合物158的抑制HBVDNA复制的活性是化合物155的的8倍,它们结构上的差别仅是氧原子(化合物158)变成亚甲基(化合物155),从这一点
中国科学院上海药物研究所博士论文可以推测在链状取代基的合适位置引入杂原子有利于化合物活性的提高。6)从抑制乙型肝炎s抗原分泌的活性数据可以看出,化合物157(IC50=33.7州)和16l(1C如=37.2pM)的抑制活性是化合物78(IC50=63.5pM)的2倍,而其它化合物的抑制活性没有提高,有些甚至活性降低。7)对于抑制乙型肝炎e抗原分泌的活性而言,化合物156(IC50=21.67pM)和16贴(1C两=2223pM)的抑制活性是化合物78(1C50=57.3pM)的2倍,其它化合物的抑制活性与抑制乙型肝炎s抗原表现出的结果类似,活性没有明显的提高.根据这些结果:一方面,我们合成的双杂环串联小分子化合物对舳VDNA的复制显示了较强的抑制活性,有些化合物(例如l硒、1懿)的抑制活性是阳性化合物钨活性的3l倍,活性有了大幅度的提高,这些结果说明杂环串联的位置改变对化合物活性的影响是非常大的,我们最初的关于这类化合物的作用靶点是病毒的DNA的假设得到了进一步的实验支持;另一反面,它们对乙型肝炎表面抗原没有表现很强的抑制活性,因此,我们确定评价化合物抗舶V活性的主要指标是抑制衄V研忱复制活性数据。HTjI哺eS.6.4.2根据表5.6.4.2中显示的数据:对于化合物230一233面言,将杂环B上的羰基换成氯原子后,化合物的毒性明显增强,抑制耶VDNA复制的能力消失。因此,在杂环B上引入cl原子对化合物的抗病毒活性不利。74a}R《N游屯≤
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究TIbIe5.6.4.375
中国科学院上海药物研究所博士论文根据表5.6.4.3中显示的数据可以看出:1)对于杂环B而言,当X1分别为NH、S、O取代时,化合物的活性呈现逐渐渐低的趋势,例如从化合物l嘶、l蛇、197的抑制活性的差别可以看出,咪唑化合物l卯的抑制阳WDNA复制的能力是最强的,在1.37pM的浓度下以88%的抑制率抑制珊VDNA的复制,噻唑化合物l%在O.4uM的浓度下有2l%的抑制率,曝唑化合物192对}丑BvDNA的抑制活性丧失;2)对于杂环A而言,总体上噻吩化合物的活性比噻唑化合物的活性强,例如化合物l蛄的抑制册VⅨ蛆复制的IC50值为4.8pM,而化合物207在12.4pM的浓度下仅达到40%的抑制率,化合物产生的细胞毒性没有明显的差异;3)杂环B的5位引入不饱和直链取代基对化合物抑制瑚VDNA复制活性的提高不利,例如5位正丁基取代的化合物195有较强的抑制活性(1C50=4.8pM),5位3一烯丁基取代的化合物l”不显示抑制册VDNA复制活性,5位苯基取代化合物2舵同样也没有活性,进~步说明5位存在大体积取代基不利于化合物活性的提高;4)根据目前拥有的数据,B环是囔唑环对化合物的活性不利;5)化合物229是一个噻吩、噫唑、嗯唑三杂环串联的化合物,它的lCso值为11.1洲,虽然它的抑制mⅣDNA复制活性一般,但是为我们进一步的结构优化提供了重要的信息,如果将中间的嚼唑环看成A环,第二个嗯唑环看成B环,而且在B环上有给电子性的乙氧基取代,从目前掌握的构效关系来看,这些因素不利于化合物的活性,但是化合物229,还是显示了较强的抑制皿VDNA复制活性,这可能是杂环A上引入体积较大的有吸电子性质的噻吩基,它的存在可能有利于化合物活性的提高,这一推测需进一步实验验证;6)对于化合物156和l船丽言,甲酯化合物156的活性略低于乙酯化合物183,76
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究但是选择性指数(SI)化合物156(SI>138.8)好于化合物183(SI>90.9)。5.7.化合物结构的经一步优化×2.Y2=cH2,NFjgure5.7.1根据前述总结的初步构效关系,我们将R。和R:基团分别固定为异丁基和羧基乙酯,在R,和心位置引入不同电子效应、不同体积大小的取代基,考察对化合物活性的影响(如图5.7.1所示)。首先,从商品化的苯并噻唑甲酸出发,合成化合物237—239。曲毡Figum5.7.2接着,从易得的噻唑甲酸出发,合成5.甲基.噻唑.2.甲酸,合成方法如图5.7所示【1删。以合成的5.甲基一噻唑.2一甲酸为原料,合成化合物242-2“。/S\一一C00H山n—BuU,CH3I.THF\√S\一,COOH山≮弧n242x:scoOEtFigure5.7.3
中国科学院上海药物研究所博士论文5.8高活性抗HBy化合物的发现1■b_t5.墨从表5.8的数据可以看出,化合物238的抑制册V烈峪复制活性是化合物156的13倍,显示了很强的抑制活性(Ic50=0.】9州),说明前述的多样化衍生化策略达到了预期的效果,进一步证实了上述总结的初步构效关系,为目标小分子化合物库(妣l蒯l岫)的建立打下了很好的基础。比较化合物237.239,可以看出,随着杂环B演变成囔唑、噻畦、味唑,化合物的掷制蕊vDNA复制的能力逐渐增强,侈孽如2勰的抑制舳VDNA复制的lC50为O.19州。而化合物237的IC50为1.32州,化合物239在4脚的浓度下仅有4l,8%的抑制率:对于细胞毒性而言,同样呈增强的趋势,例如化合物239的CCso大于loopM,237的CC50大于88.1}IM,而化合物238的CC50仅为7.5肚M。此外,化合物238抑制册VDNA复制的活性比化合物243强30倍,导致它们的活性差异可能是噻吩环(杂环A)4、5位取代基的不同造成的:化合物2‘13噻吩(A环)的5位只存在小体积的甲基,化合物238噻吩(A环)的4、5位并有苯环。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究目前,在杂环A上引入的取代基类型较少,有必要进一步多样性衍生化,明确A环上取代基的构效关系,发现高效、低毒的抑制剂。5.9构效关系(SAR)总结H@弧扎≮∥、cOoEtLeucamideA(1)Compound78《Lead.“keh旧Compound238NAagainStHBVDNAReplicatjonlC∞=76IlMagajnstHBVD^上ARep艋翰口onIC蚰=O.伯州againstHBVD^阪Repli∞虹On我们通过围绕天然产物LeuC撇ideA关键甲基噫唑一噻唑结构单元进行的多样化衍生化策略成功的发现了化合物78产生了Leuc锄ideA不具备的抗HBV活性,以78为新的研究起点,通过合理的小分子化合物库的设计,运用化合物设计、化学合成与生物活性筛选相结合,以活性指导化合物设计来提高其活性的策略,发现了不同于目前文献报道的新型的高活性非核苷类抗乙型肝炎小分子抑制剂238,并得出以下初步结论:1)Rl取代基需要体积适中的取代基,取代基的优先性顺序为:异丁基>H,正丁基,苄基。2)杂环B上含吸电子基,增加杂环B的缺电子性有利于化合物活性的提高。3)杂环B上4位酯基对保持化合物的活性有利,酯基的丢失或者变成羧基都会使化合物的活性降低。4)在杂环B上引入氯原子使化合物抗病毒活性丧失,细胞毒性显著增加。
中国科学院上海药物研究所博士论文5)XI的优先性顺序为:NH>S>O。6)Yl为S或者O时,对化合物活性影响不大。7)Y2的优先性顺序为:CH2>N。8)在A环上需进一步多样性衍生化,明确A环上取代基的构效关系。I嚣簿新大l黟:器;}oI1____■●____●■■■■_______●■__-1■●■■■●●■■■■●■■■■●■■●●一O号心氤驴心臼日∥N弋OOR.口园囹5.10化合物156在小鼠体内初步的药物代谢研究结果≤三沛Ⅳ[竺当≤三汛n、Coo●瞻、cooH"56"62CC∞>333州CC∞>473.3}IMIC∞=2.4●IMlC∞=∞洲Sl>138.8Sl=7.29分析上述化合物的体外抗乙型肝炎病毒活性数据,我们认为化合物156有较好的抗病毒活性(1C钟=2.4州),有较低的细胞毒性(CC50>333州),有较好的治疗指数(Sl>138.8),因此选取化合物156作进一步的体内活性测试。由于化合物156的结构中存在甲酯基,存在代谢不稳定性因素,可能容易水解变成化合物162,于是,我们首先考察化合物在体外的稳定性,为进一步的体内测试作准备。
海洋天然产物LeucalIlideA的全合成、结构改造及构效关系研究5.10.1化合物156体外稳定性研究首先,为确定化合物的体外稳定性,我们将10脚浓度的化合物156加入没有肝细胞的培养液中,考察化合物在培养液中的稳定性。试验结果如图5.10.1所示。Figu阳5.10.1化合物156(10肛M)在无肝细胞的培养液中的变化从图5.10.1可以看出,化合物156在10州的浓度下,随着时问的推移,在培养液中只检测到化合物156的信号,而且其浓度随时间的变化不大,并且没有发现化合物162的信号,因此,可以得出以下结论:化合物156在培养液中是稳定的。其次,将10州浓度的化合物156加入含正常肝细胞的培养液中,为考察化合物156在体外肝细胞对化合物的代谢状况,试验结果如图5.10.2所示:虽然在l小时时化合物156的浓度不如3小时时的浓度高,但是随后的测试点的浓度逐渐降低,到48小时时,化合物156的信号消失,因此总体上化合物156的浓度随着时问的延长有逐渐变小的趋势;在1小时时,出现化合物156的代
中国科学院上海药物研究所博士论文谢产物162,随着时间的延长,其浓度持续增加,到达24小时时,代谢产物162到达峰值,随后的24小时一直保持该浓度。这些结果表明,化合物156能够进入肝细胞,经细胞代谢后,转化成化合物162后排出细胞外,有力的证明了这类化合物抗病毒活性的真实性,为进一步的体内药代动力学研究提供很好的参考信息。——~———————一~————~—~~i⋯一~~一~~一一~一32.5Hn£\b031.5越.装l0.50O80时间(小时)一~~————⋯~~一~~——。。~———⋯~~~~Figure5·10·2化合物156(10”M)在含肝细胞的培养液中的变化5.10.2化合物156在小鼠体内初步药代动力学研究已完成的小鼠急性毒性试验表明,化合物156在口服给药2g/l【g对,腹腔给药在0.5g/l【g时,未见受试小鼠有异常的毒性等不良反应,无小鼠死亡,显示该化合物口服给药耐受性好,毒性低,具有良好的安全性。为进一步考察化合物156在小鼠体内的代谢情况,我们做了以下初步的药代动力学实验:将化合物156、162按50mg依g、lOmg瓜g剂量给埘Star大鼠灌胃一次,从目内眦取血,测试不同时间点的血药浓度。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究量19uI℃5·ltI.Z·l从表5.10.2.1和5.10.2.2可以看出:化合物156在10mg/l(g的剂量下,在90分钟时血样中出现化合物162,随着时间的延长血样中162的浓度逐渐增加,到8小时时达到峰值,随后血样中162的浓度逐渐降低;化合物162在50m眺g的剂量下,给药5分钟时,血样中出现化合物162的浓度,之后在20分钟、1小时、10小时出现三次峰值,之后化合物162的血样浓度逐渐降低,在该剂量下,化合物162的血样浓度波动较大;以上结果表明,通过口服给药,化合物156易于吸收,在体内被快速代谢成化合物162,化合物162在体内代谢稳定,滞留时间长。
中国科学院上海药物研究所博士论文№un5.10·2.2同时我们比较了化合物162在小鼠体内代谢情况:化合物162在10mg/l(g的剂量下,5分钟时在血样中出现信号,到20分钟时药物浓度达到峰值,随后浓度逐渐降低;在50mg/l【g的剂量下的剂量下,化合物162的血样浓度变化较大,分别在90分钟和8小时时出现两次峰值。上述实验结果表明化合物162口服同样容易吸收,体内代谢稳定,但是在体内滞留时间较长。根据上述的实验结果我们认为,通过口服给药途径,化合物156和162易于吸收;体外试验证实化合物156能被肝脏细胞代谢,这些结果对治疗肝炎来说是非常有意义的。虽然化合物156在体内易于代谢成化合物162,抗肝炎病毒的活性有所下降,但是化合物162的体外抑制HBVDNA复制活性的IC50值为60¨M,还是有一定强度的抗病毒活性,同时极毒试验表明化合物156的毒性很低,因此,有必要对化合物进行深入的体内抗病毒活性研究。
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究第六章实验部分6.1化合物分析测试条件和常规试剂的制备6.1.1分析测试仪器及测试条件:1.1H(300㈣和13C(75Ⅻz)M恹谱用Ⅷ觚Mercury-vX300型傅立叶变换核磁共振仪测定,使用不同氘代溶剂时化学位移的规定内标如下(Table6.1.1):’妇bk6.1.1NM【ItSOI’,蛐tDataChart2.低分辨质谱用S瑚MADZUGCMS.QP7070A型气质联用仪测定,高分辨质谱用MA=I’-71l型质谱仪、APExIII7.0TESLAFTMS质谱仪或者Concept1H系列质谱仪测定。3.HPLC纯度分析采用HPlloos积esLCsystem高效液相分析仪,工作站为HPCh锄Sta缸0nA.06.03,除非特别说明,分析柱为Zorba)【SB.C18f4.6×150mm,5pm),流动相为MeOH/H20体系,流速为1.0幽in,紫外检测波长为254姗,检测温度为室温,进样量为l止。4.元素分析:C、H、N元素分析用Elelne咖ⅧioELIU型元素分析仪,S元素分析采用氧瓶分解后钡盐容量法滴定分析。
中国科学院上海药物研究所博士论文6.1.2普通试剂和常规处理方法:1.所有溶剂均为分析纯试剂(上海化学试剂公司),一般都未经处理直接使用。无水溶劫按标准方法干燥处理,醇类溶剂用现场生成的醇镁干燥,烃类溶剂用金属钠丝干燥,醚类溶剂用无水KOH预干燥后用金属钠丝干燥,二氯甲烷用CaH2干燥,所有无水溶裁在加入干燥剂后回流至少2k,使用前再回流30min蒸出备用。无水DMF和DMSO用无水Mgs04干燥过夜后减压蒸馏得到,保存于活化4A分子筛中备用。吡啶、三乙胺、ⅫⅥM等有机碱以及二氯亚砜和三氯化磷通常都要在使用前蒸馏纯化。其他试剂一般都购自上海试剂公司、吉尔生化(上海)有限公司、深圳迈瑞尔化学技术公司、AIdrich、Acros、Fluka、Me呔、TCl或者L雠ca妣r等试剂公司,有少数试剂承蒙生产厂家馈赠,除非特别说明,这些试剂都未经处理直接使用;自制试剂在使用前一般要经过}i搬确定其结构和大致纯度。2.除说明外,所有反应均在N2或m气等惰性气体保护下进行并用TLC跟踪监测。常规后处理步骤通常是将反应体系用水稀释,用特定有机溶剂萃取3次,合并的有机相依次用lO%稀盐酸或/J和饱和NaHC03(如果需要才使用酸或屠日碱洗涤)、水、饱和食盐水洗涤,有机相用无水Na2S04或无水MgS04干燥后用旋转蒸发仪除去溶剂得到反应粒产品。3.使用的耵℃薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产,型号HSGF254;使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产,型号zcx.11,20阻300目;使用的反向柱层析硅胶为FujiSilySiaCh啪Ltd生产的C18硅胶,型号SⅧl椎20/45。6.1.3常用显色剂的配制方法:1.铝酸铵一硫酸显色剂:镅酸铵209溶于loomL水中,缓慢加入浓硫酸20mL,再加入水稀释至300mL。显色剂具有广泛的适用性。
海洋天然产物Leuc枷ideA的全合成、结构改造及构效关系研究2.磷钼酸一乙醇溶液:磷钼酸的5%乙醇溶液。显色剂具有广泛的适用性。3.Ⅺ渤04稀溶液显色剂:19Ⅺ‰04,l斟aHC03溶于100mL水中。显色剂适用于不饱和烯烃、炔烃、叠氮、等。4.碘蒸气:少许碘置于密闭广口瓶中。显色剂适用于不饱和烯烃、炔烃、磷酸酯等。6.1。4酰卤的一般制备方法:1.草酰氯法:以2.氟苯甲酰氯的制备为例,2.8g2一氟苯甲酸溶于20mLDCM中,加入2.4mL(1.5eq)草酰氯,搅拌均匀后加入l滴DⅧ,室温搅拌过夜,蒸馏除去DCM,减压蒸馏(10蛐)得到2-氟苯甲酰氯2.59。3-氟苯甲酰氯以及4.氟苯甲酰氯按此方法制备。2.五氯化磷法:以丙酰氯的制备为例,10111L(134mm01)丙酸缓慢滴入27g85%的五氯化磷(110lnnlol,1eq)中(迅速产生HCl气体,小心!),待气体产生变缓后,直接蒸馏得到丙酰氯lOg。己酰氯按此方法制备,但产物需减压蒸馏得到。3.氯亚砜法:以环己基甲酰氯的制备为例,13.5InL环己基甲酸溶于20mL苯,冰水浴冷却下滴加二氯亚砜24mL(2eq),滴毕,缓慢升温至沸腾,回流30min,常压蒸馏除去低沸点物质后,减压蒸馏得环己基甲酰氯9g。2.苄氧基乙酰氯1116】和3一甲基一2一丁烯酰氯按此方法制备f1171。4.三氯化磷法:以2,2一二甲基丙酰氯(新戊酰氯)的制备为例,20g新戊酸溶于30mL苯,搅拌下加入19mL三氯化磷(1.1eq),回流1hr,蒸馏得到新戊酰氯19g。2一甲氧基乙酰氯的制备按此方法,但产物需适当减压(60mmHg)得到【¨81。5.三苯基膦.液溴法制备3.甲基一2一丁烯酰溴:27g三苯基膦溶于70mL无水DCM中,冰水浴冷却下缓慢滴加5mL液溴,产生白色固体Ph3PBr2,然后
中国科学院上海药物研究所博士论文边搅拌边滴加3-甲基一2一丁烯酸的DCM溶液(10.8g酸溶于40mLDCM),室温搅拌2llr,反应混合物变为棕黄色溶液,旋蒸除去DCM,加入无水乙醚浸提以除去固体Ph3PO,旋蒸除去乙醚,减压蒸馏(10mmHg)得到3.甲基一2一丁烯酰溴7g。6.1.5噻唑一2一甲酸的制备【119】BrtBuL盯HF,C02/S\,CoDHU鬣将Bu“80mL(1.6M)溶于300mL无水乙醚中,.78℃冷却半小时后,将重蒸的2.溴噻唑(O.14m01)溶于60mL乙醚,逐滴加入(半小时加完),加料完毕后继续反应20分钟,随后通入经浓硫酸干燥的C02气体20分钟,产生白色沉淀,接着升温至_40℃反应20分钟后,再重新降温至一78℃,继续通入C02,半小时后,体系逐渐升至室温,在室温反应l小时。最后,逐渐加入用60mL蒸馏水和5mL浓硫酸混合液淬灭反应,将水相和有机相分离,再在水相中加入浓盐酸,使水相pH=l之后,加入乙醚(3×30111L)洗涤水相,收集水相,放入冰箱冷却过夜,产生白色固体,抽滤,得到固体(12.6g,产率68%)。1HNMR(300MHz,CD30D)54.98他,lH),7.92(d,J=3.OHz"1H),8.02(d,J=3.3Hz,lHl.6.1.6溴代丙酮乙酯的制备‘120l0H~阳竺旦O将重蒸乳酸乙酯73mL(O.65m01)溶于CCl4(800mL)中,分批加入NBS。~父
海洋天然产塑兰!竺呈坚堂垒箜全鱼盛:笙塑墼垄壑塑鏊菱墨婴窒———————————_—_——————●_●_-_—●—_●———_-——●_●_————●——_———_—-————__-———————一一(230g,1.29n101),加热回流10小时,反应过程产生的气体用碱液吸收。将反应液抽滤、浓缩后,减压蒸馏得产品(929,产率72.5%)(60℃一58℃/5mmHg)。1HNMR(300MHz,CDCl3)61.38(t,,=7.2Hz,3H),4.32(s,2H),4.42(q,,=7.2Hz,2H).6.1.7异氰乙酸乙酯的制备‘121-1221HVNH2三,NaN(cH0)2||———’-NaN(GHU)2O三H火鐾~。Et』H6CHOOoHc,如v火oEl善侣O∥从oEta)NaoMe,MeoH:b)日厄H2CooEt,CH3cN.陀订ux:c)KDH.EtoH:d)POCb,EbN,CH2CJ2钠块(20.7g,0.9m01)分批加入200mL无水甲醇中,钠块消失之后,加入甲酰胺(71.7mL),室温反应6小时后,旋转蒸发除去甲醇,得固体869。取二甲酰钠胺(23g,0.24n101)与溴代乙酸乙酯(22.4mL,0.2In01)混合,加入乙腈100mL,回流7小时之后,冷却,抽滤,固体用乙酸乙酯(3×20mL)洗涤,浓缩得化合物245。将245溶于40mL乙醇中,在冰浴条件下,加入KOH(100mg),室温反应5小时后,将乙醇蒸去,得到粗产品246。将粗产品246溶于200mL二氯甲烷中,加入重蒸Et赵(63mL,0.45mm01),冰浴冷却后,用恒压漏斗逐滴加入POCl3(17lnL,O.18l衄01),加料完毕后继续冰浴反应l小时,接着逐滴加入Na2C03(25g)的水(160mL)溶液淬灭反应,之后继续室温搅拌1小时,将反应液用二氯甲烷(3×150mL)萃取,二氯甲烷相经常规干燥后浓缩,将粗产物减压蒸馏后得到化合物178(76℃/5衄:11Hg),(12.59,产率63%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)61.3l(t,,=7.2Hz,3H),4.21(s,2H),4.28(q,/=7.2Hz,2H).
中国科学院上海药物研究所博士论文6.1.82一溴噻唑锌试剂的制备【108J《r町鱼型-《r动Br活化锌粉的制备:将锌粉(100g)倒入2%稀盐酸(250mL)中,剧烈搅拌20分钟,除去溶液,加入2%稀盐酸(2×loomL)洗两遍,每次10分钟,然后依次用水洗涤(3x200mL)三遍,无水乙醇洗涤三遍(3×70mL),无水乙醚洗涤三遍(3x70111L),最后除尽乙醚得活化锌粉。2一溴噻唑锌试剂的制备:将重蒸2.溴噻唑(1eq)逐滴加入回流的锌粉(1.1eq)THF混合物中,加料完毕,继续回流2小时,冷却,留待下一步反应用。6.1.9亚硝酸叔丁酯的制备‘123176g(1.1eq)NaN02和200mL水置于取500mL三口瓶中,冰盐浴冷却,将20mL水、27.2mL浓硫酸以及91.4mLlBuOH混合溶液经恒压逐滴加入,保持反应体系在O℃,直至溶液分层,用分液漏斗除去水相,得到产品(产率66%)。≮00H音飞=彘能Hz|;=IH795%;:IHBoc1(x,%|;:lHBoc‘4041,c00Et42COOEt音怂H:土毫∑蚤童二s厂t‘oH厂==(NHBocY\NHB0c⋯。\、/\NHR^产a)(Boc)20.NaHC03,dioxane:b)‘BuOCOCI.NMM.DME:NH3(g);
海洋天然主物兰!竺磐翌!垒塑全全堕:笙塑堕垄垄塑塾茎墨堑窒将L.缬氨酸(11.7g,100IIun01)溶于二氧六环(400mL)和水(400mL)混合溶剂中,加入NaHC03(33.6g,400mm01),搅拌15分钟后,加入∞oc)20(28.3g,130咖oI),室温搅拌24小时后,用6N的盐酸淬灭反应,经乙酸乙酯(3×300mL)萃取、饱和氯化钠溶液(3×50mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩等操作步骤,得化合物4l(20.6g,产率95%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)6O.94(d,J=6.6Hz,3H),1.01(d,,=6.6Hz,3H),1.45(s,9H),2.20(m,1H),4.24(m,1H),4。98(m,1H).将Boc保护的天然缬氨酸(4.34g,20m01)溶于50lnLD地中,冰盐浴冷却10分钟后,依次加入N一甲基吗啡啉(m心厦)(4.8mL,4.4蚴01)、氯甲酸异丁酯(1BuOCOCl)(2.6lnL,20IIlIn01),室温反应20分钟后,再次冰盐浴冷却,通入用Cao干燥的NH3半小时,然后升至室温反应30分钟,最后加入150mL水淬灭反应,经氯仿(3x100mL)萃取、饱和氯化钠溶液(3×30mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩等操作步骤,得到化合物42(3.98g,产率100%)。1HNMR(300MHz,CDCb)6O.94(d,/=6.6Hz,3H),O.99(d,,=6。6Hz,3H),1.45(s,9H),2.21(m,lH),3.95(m,1H),5.03眠1H),5.43(br’1H),5.93(br’l竭.将化合物42(3.98g,18.4mmoI)溶于40mL无水DME中,室温N2保护下加入Lawesson’s试剂(7.72g,9.2Hlnl01),TLC跟踪反应,反应完成之后,浓缩反应液,然后经二氯甲烷(200mL)稀释,用5N氢氧化钠溶液调节溶液的pH=8,分离有机相,水相用二氯甲烷(2x50mL)萃取,合并后的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤,MgS04干燥,浓缩,柱层析分离等步骤,得到化合物43(4.2g,产率76%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)60.94(d,J=6.9Hz,3H),1.00(d,,=6.9Hz,3H),1.45(s,9H),2.20(m,1H),4.25(m,1H),5.02(m,1H).
中国科学院上海药物研究所博士论文用五硫化二磷制各硫代甲酰胺:将P2S5(4.44g,20nun01)与Na2C03(1.06g,10mm01)混合,加入40mL无水THF,室温搅拌1小时后,冰浴冷却,接着加入化合物42(1.66&7.7姗o1)的nⅡ溶液(20mL),反应1小时后,升至室温反应12小时。加入lN磷酸钾溶液淬灭反应,经乙酸乙酯(3x300mL)萃取、饱和氯化钠溶液(3×50mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩、柱层析分离等操作步骤,得到化合物43(消旋体)(O.814g,产率35%)。1瑚呱依(300MHz,CDCl3)6O.97(t,J=6.6Hz,6H),1.43(s,9H),2.19(m,1H),4.18(m,1H),5.26(d,J=8.7Hz,7.62(br,1聊,7.89(br,1H)。将化合物43(4.2g,】4mm01)溶于65mL无水DME中,加入KHC03(9g,80mm01),室温搅拌十分钟后加入溴代丙酮酸乙酯(3.8mL,30mm01),继续室温搅拌40分钟。在冰浴条件下,将2,6一二甲基吡啶(9.85mL,75删舯I)加入三氟乙酸酐(TFAA)(5.55mL,40mm01)的DME(10mL)溶液,然后,将混合液转移至上述反应液中,转移完毕后,继续冰浴反应40分钟,然后升至室温反应,TLC跟踪反应,反应完成之后,浓缩反应液,粗产物经乙酸乙酯(200mL)稀释、2N盐酸(2x50mL)洗涤、饱和NaHC03洗涤、水洗涤、饱和氯化钠溶液洗涤、无水Mgs04干燥、浓缩、柱层析分离等操作步骤,得到化合物45(2.19,产率68%)。‘㈣(300MHz,CDCl3)6O,90(d,了=6.9Hz,3H),O.98(d,/=6.9Hz,3H),1.40化-,=7,2Hz,3H),1.45(S,9H),2.44(m,Hn4.41(q,J=7.2Hz,2H),4.89(m,1H),5.28(m,Ⅲ),8.07(s,1H).6.2.2甲基唔唑一噻唑串联结构单元的关键中间体4的合成将化合物45(1.64g,5I啪01)溶于乙醇(20mL)/水(5mL)混合溶剂中,冰浴冷却,分批加入“oH(483mg,n.5mm01),TLC跟踪反应,反应完成之后,浓缩反应液,用5N盐酸调节反应液的pH=2,先后经EtOAc(3×50mL)
海洋天然产物huc撇ideA的全合成、结构改造及构效关系研究萃取、饱和氯化钠洗涤、无水MgS04干燥、浓缩等操作步骤,定量得到化合物6。1HNMR(300MHz,CDCl3)6O.93(d,,=6.6Hz,3功,0.99(d,J=6.9也,3H),1.45(s,9均,2.4l(m,1功,3.76眠1H),4。90(m,1均,5.31(d,,=7.2Hz,lH),8.20(s,lH).bi≈气c三甚∞洲土广4546laL一6蜗e[二8:::ea)LjOH.MeO卜l,卜bO:b)’鼬ococI.NMM:L加啪ni帕Mee哪.HcI.79%:c)一780c,DAsT.竹硷nK2c03,73%:d)DBu,B疋C13,78%:d)u0H,Meol岍{20.将噻唑酸6(1.5g,5InIn01)溶于50mL的,mF中,冷却至.30℃后,依次加入N.甲基吗啡林(NMM)(1.24mL,11.2mm01),氯甲酸异丁酯(O.7ll儿5.4nHn01),反应10分钟后,加入苏氨酸甲酯盐酸盐(0.9l&5.36mm01),继续反应lO分钟,随后逐渐升至室温,在室温反应10小时后,加入150mL水淬灭反应,反应液用乙酸乙酯(3x100mL)萃取,经水(3×40mL)洗涤、饱和氯化钠溶液(3×20mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩有机相、柱层析分离等操作步骤,得到化合物46(1.64g,产率79%)。1HNMR(300Ⅻz,CDCl3)6O.93(d,J。6.9Hz,3H),1.00(d,/26.9Hz,3H),1.28(d,,=6。6Hz,3H),1.46(s,9H),2.34-2.39(2H),3.80(s,3H),4.44(m,lH),4.77(dd,,=2.4Hz,9.0Hz,lH),4.86(m,lH),5.18(br,lH),7.93(d,J=8.7№,1H),8.04(s,1H).将化合物46(1.64g,3.95mm01)溶子50mL二氯甲烷中,反应温度稳定在.78℃后,逐滴加入DAST(0.67mL,5.12nun01),加料完毕后,继续在.7893o弋≯ko~一≯k
中国科学院上海药物研究所博士论文℃下反应,TLC跟踪反应,反应完成后,加入固体K2C03(I.95g,14.1mm01)淬灭反应。将反应液倒入饱和NaHC03溶液(100mL)中,用CH2C12(2×100mL)萃取,经饱和氯化钠溶液(3×50mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩等操作步骤,得到化合物47(1.09g,产率73%)。1HM咖(300MHz,cDCl3)6O.88(d,,=6.6Hz,3H),O.95(d,,=6.9Hz,3H),1.40(d,L,=6.3Hz,3H),1.42(s,9H),2.43(m,lH),3.76(s,3H),4.89(m,1H),4.98(d,J=lO.2Hz,lH),5.09(m,lH),5.35(d,-,=8.4Hz,1H),7.9l(s,1H).将化合物47(514mg,1.3日llIl01)溶于20mL二氯甲烷中,冰浴冷却lO分钟后,依次加入DBU(0.22mL,1.42lIlInoJ)、三氯溴甲烷(O.17mL,1.7lIlIll01),室温反应lO小时,之后加入饱和氯化铵溶液(50mL)淬灭反应,经EtOAc萃取、饱和氯化钠溶液(3×30mL)洗涤、无水Mgs04干燥、柱层析分离等操作步骤,得到化合物48(400mg,产率78%)。1HNMR(300MHZ"CDCl3)60.92(d,J=6.9Hz,3H),O.99(d,J=6.9Hz,3H),1.45(s,9聊,2.44(m,lH),2.72(s,3H),3.93(s,3H),4.92(111"l均,5.30(br,lH),7.99(s,lH);uCM瓜(75瑚z,CDCl3)612.O,17.2,19.3,28.2,33.3,51.9,57.9,80.0,120.O,128.3,142.8,155.1,155.3,156.3,162.5,173.9;【Q】D_36.0(cO.60,CHCl3);El锄entalAnalysisforC18H2sN305S(%):Cald:C54.67,H637,N10.63,S8.】l;Found:C54.64,H6|22,N10,59.S6.22,将化合物48(400mg,1.0lmm01)溶于甲醇(10mL)/水(3mL)混合溶剂中,冰浴冷却lO分钟后,分批加入LiOH(150mg,3.6岫01),TLC跟踪反应,反应完成之后,浓缩反应液,用5N盐酸调节反应液的pH=2,经乙酸乙酯(3×300mL)萃取、饱和氯化钠溶液(3×50mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩等操作步骤,定量得到化合物4。1HNMR(300MHz,CDcl3)60.93(d,
海洋天然产物Leuc栅ideA的全合成、结构改造及构效关系研究,=6.3Hz,3H),0.99(d,J=6.3Hz,3H),1.44(s,9H),2.43(m,1H),2.71(s,3H),4.90(m,lH),5.37(m,1H),6.10(br,1H),8.02(s,lH);13CNMR(75MHz,CDCl3)612.2,17.2,19.2,28.2,33.2,57.9,80.1,120.4,128.2,142.6,155.2,155.4,157.I,165.6,174.oI6.2.3曝唑胺的制备NHB0c~o一0COOMe49将B0c保护的丙氨酸(3.78g,20删抛1)溶于50mL的n{F中,冷却至一30℃后,加入N.甲基吗啡林(m似)(4.87mL,44Imn01),氯甲酸异丁酯(2.76mL,2lmm01),反应10分钟后,加入丝氨酸甲酯盐酸盐(3.28g,2lInm01),随后室温反应,TLC跟踪反应进程,反应完成之后,加入150舶L水淬灭反应,经乙酸乙酯(3x100mL)萃取、水洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水MgS04干燥、浓缩有机相等操作步骤,得到化合物49(6.46g,98%)。1阳、『m(300MHz,CDCl3)61.39(d,,=7.2Hz,3H),1.44(s,9H),3.05(br,1H),3.80(s,3H),3.96(m,2H),4.12(m,1田,4饼(m,1均,5.01仳l砷,6.91(d,,=6.3魄lH).酬埘00№的50将二肽49(2.75g,9.4耻n01)溶于50rIlL二氯甲烷,控制反应温度在一78℃后,逐滴加入DAST(1.49mL,11.4n埘01),加料完毕后,继续在.78℃下反应,TLC跟踪反应,反应完成后,加入固体K2C03(1.95g,14.1Hun01)淬灭反应。将反应液倒入饱和NaHC03溶液(100mL)中,经CH2C12(2×100mL)萃取、饱和氯化钠溶液(3×50mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩等操作步骤,eM0OC丫HN0丫%m土∞B
——一...中国科学院上海药物研究所博士论文—————————————————————————————————二—二.二一二二-二_一.=::得到产品50(2.19,产率82%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)61.22(s,9№,1.23(d,,=6.6Hz,3H),3,58(s,3H),4.26—4.40(m,3H),4.30—4.35(m,lH),5.36(br"lH).删≯移渊e——洲卜$蝴e鞠5"将化合物卯(900mg,3.4l姗01)溶于36mL二氯甲烷中,冰浴冷却后,依次加入DBU(0.55mL,3.7曲肿1)、三氯溴甲烷(O.44mL"4.4mmo】),然后室温反应lO小时,加入饱和氯化铵溶液(50n1L)淬灭反应,经ROAc(3×sOmL)萃取、饱和氯化钠洗涤、无水MgS仉干燥、柱层析分离等操作步骤,得到化合物5l(408mg,产率50%)。1Ⅷ弧依(300MH2,CDCl3)6137.噻唑.4.基)。嗯唑·4一羧酸甲酯(化合物79)(产率57%)1HNMR(300MH乙CDCl3)50.69(d,.歹=6.6Hz,3H),0.73(d,,。6.9Hz,3H),2.20(m,1H),2.56(S,3H),3.77(s,3H),5.17(dd,J=6.6Hz,8.7Hz,1H),6.65(m,lH),6.78(d,/=8.4Hz,1H),6.91(d,扣8.7Hz,1H),7.15(m,l岣,7.29(m,2H),7.37(Ill’l固,7.67(d,J=7.5Hz,1H),7.7l(s,1l{),7.86(dd,‘,=1.5Hz’8.1Hz,1H),10。02(s,1H).2一(2一{l一【(3一叔丁氧甲酰胺基)一毗啶一2-甲酰胺基】一2一甲基一正丙基).噻唑.4.基)-5一甲基.嗯唑4一羧酸甲酯(化合物加)(产率68%)1HN姆(3∞姗&,∞C13)61.Ol(d,.,=6.9H弓,6H),1.46(s,9H),2.67(m,lH),2.69(s,3H),3.90(s,3H),109
——.中国科学院上海药物研究所博士论文5.33(dd,J=9.3Hz,6Hz,lH),7.38(dd,,=8.7Hz,4.5Hz,1H),8.15(dd,J=4.5Hz,1.5Hz,lH),8.82(dd,,=8.7Hz,1.2Hz,lH),9.05(d,,=9.3Hz,lH),11.01(s,1H);¨CNMR(75MHz,CDCl3)612.1,17.5,19.6,28.1,33.1,51.9,56.3,80.8,120.1,126.9,127.6,128.3,131.5,139.O,140.7,143.1,152.9,155.1,156.4,162.5,167.0,172.9.5一甲基一2一{2一【2一甲基一1一(3,4,5一三甲氧基一苯甲酰胺基)一正丙基]-噻唑一4一基)一嗯唑一4一羧酸甲酯(化合物81)(产率80%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.01(d,,=6.6Hz’3H),1.07(d,J=6.9Hz,3H),2.57(m,1H),2.72(s,3H),3.87(s,3H),3.92(s,9H),5.40(dd,-,=8.7Hz’7.2Hz,1H),6.99(d,,=8.4Hz,lH),7.13(s,2H),8.0l(s,1H).2.{2.【1一(2一羟基.苯甲酰胺基).2一甲基一正丙基】一噻唑.4-基}-5一甲基-曝唑一4一羧酸甲酯(化合物82)(产率50%)1HNMR(300眦CDCl3)61.00(d,,=6.9Hz,3H),1.07(d,J=6.6Hz,3H),2.52(m,1H),2.73(s,3H),3.94(s,3H),5.40(dd,.,=8.4Hz,7.2Hz,lH),6.90化-,=7.5Hz,1H),6.99(d,,=8.4Hz’1H),7.22(d,J=8.7Hz,1H),7.42(t,J=7.5Hz,1H),7.53(d,,=7.8Hz,1H),8.02(s,1H).2.{2.【1.(2.氨基.苯甲酰胺基)-2.甲基一正丙基】一噻唑一4一基)一5一甲基一嗯唑4一羧酸甲酯(化合物83)(产率65%)1HMⅥR(300MHz,CDCl3)61.03(d,J=6.6Hz,3H),1.04(d,-,=6.9Hz"3H),2.55(m,lH),2.73(s,3H),3.94(s,3H),5.42(dd,,=8.7Hz,6.3Hz,1H),6.69(d,J=8.1Hz,lH),6.71(d,J=6.9Hz,lH),6.83(d,J=8.4Hz,1H),7.23(d,,=7.5Hz,1H),7.45(d,J=6.9Hz,1H),8.01(s,lH).2.【2.(1一{【2I(1.叔丁氧甲酰胺基-2-甲基一正丙基)一噻唑_4-甲酰基】-胺基)一2一甲基.正丙基).噻唑_4一基】.5.甲基.嗯唑4.羧酸甲酯(化合物84)(产率70%)1HNMR(300MHz’CDCl3)60.94(d,J=6.9Hz,3H),1.01~1.06(9H),1.45(s,9H),2.39(m,1H),2.66(m,lH),2.73(s,3H),3.94(s,3H),4.90(m,1H),5.15(m,1H),5.36(dd,,=9.OHz,6.9Hz,lH),7.93(d,J=913Hz,lH),8.0l(s,1H),8.04(s,lH).1lO
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究5.甲基.2.(2.{2.甲基.1.【(2.甲基.噻唑.4-甲酰基).胺基】-正丙基)一噻唑一4一基)-噫唑4.羧酸甲酯(化合物88)(产率75%)1HNMR(300MHz,CDCl3)6O.97(d,,=6.6Hz,3H),1.03(d,/=6.6Hz,3H),2.51(m,1H),2.73(d,,=2.7HZ,6H),3.94(s,3H),5.37(dd,J=9.3Hz,,=9.6Hz,1H),7.97(s,1H),$.00(s,lH).2.(2.{l一【(2一溴.噻唑.4一甲酰基)一胺基】-2一甲基-正丙基).噻唑-4一基)一5一甲基-嗯唑.4.羧酸甲酯(化合物89)(产率75%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.02(d,,=7。8Hz,3H),1.03(d,~,=6.9Hz,3均,2.56(m,1H),2.72(s,3H),3.92(s,3H),5.35(dd,J=9.0Hz,,=9.OHz,1H),7.84(dd,J=9.3Hz,1均,8.00(s,1H),8.07(s,1H).2.(2一{1吨(2,5一二溴一噻唑-4一甲酰基)一胺基】.2一甲基.正丙基)一噻唑一4一基).5一甲基.嗯唑.4.羧酸甲酯(化合物90)(产率60%)1H套球压R(300MHz,CDCl3)61.02(d,J=6.6Hz,3H),1.03(d,J=6.9比3H),2.60(m,1№,2.73(s,3H),3.93(s,3聊,5.35(dd,J=9.OHz,J=9.0Hz,lH),7.87(dd,‘,=9.OH乙1H),8.Ol(s,1H).6.3.1.4化合物115—119的制备".|5将化合物63(27mg,0.063nlIIl01)溶于MeOH/H20(0.8mUO.2mL)中,冰浴冷却lO分钟后,加入LiOH(26mg),TLC跟踪反应,反应完成后,浓缩后的反应液经水(6mL)稀释、稀盐酸酸化、EtoAc(50mL)萃取、饱和氯化钠洗涤、MgS04干燥、浓缩溶剂等操作步骤,得化合物n5(25mg,产率loo%)。1HNN瓜(300~毗z,CDCb)61.02(d,,=6.6Hz,3H),1.07(d,J=6.9Hz,3H),
中国科学院上海药物研究所博士论文2。67(m,lH),2.75(s,3H),4.07(s,3H),5.54(dd,J=7.8Hz,J=4.8Hz,1H),7.04(d,J=8.4Hz,1H),7.11(dt,J=7.8Hz,1H),7.48(td,,=6.9Hz,/=1.8Hz,1H),7.99(s,lH),8.22(dd,/=7.8Hz,,=1.8Hz,1H),8.75(d,/=8.1Hz,1H).uCNMR(75MHz,CDCl3)612.5,17.6,19.8,33.3,56.4,57.3,111.7,120.8,121.1,121.7,128.1,132.8,133.5,142.9,155.5,157.5,157.9,165.3,165.6,174.5.同样方法合成以下化合物:2.{2.【1.(2.环戊.1.烯.乙酰胺基)-2.甲基一正丙基】-噻唑.4一基)-5一甲基一嚷唑一4-羧酸(化合物116)(产率98%)1HNMR(300MH童,CDCl3)6O.94(d,J=6.6Hz,3H),0.97他J=6.9Hz,3H),1.88一1.99(m,2H),2.31—2.33(m,2H),2.37—2.44(m,2印,2.4矗2.53(m,lH),2.75(s,3H),3.14(s,2H),5.24(dd,/。9,DHz,6.3Hz,1H),5.67(m,9.0Hz"1功,7.98(s,1H).5.甲基.2.(2一{2.甲基.1一f(噻吩一2-甲酰基)I氨基】一正丙基)-噻唑4一基)·嘿唑一4一羧酸<化合物117)(产率99%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.01(d,,=6.6Hz,3H),1.08(d,J=6,6Hz,3脚,2.54(m,1H),2.76(s,3岣,5.38(dd,,=7.2Hz,9.0Hz,lH),6册(d,,=9.3如1H),7.】0(dd,/=3.6Hz,4.8№,】H),7.5l(d,,24.8Hz,1H),7.64(d,J亍3.6Hz,lH),7.98(s,lH).2.{2一【1.(2.羟基一苯甲酰胺>.2.甲基一正丙基]一噻唑.4一基)一5·甲基一嚼唑4一羧酸(化合物118)(产率96%)1HNMR(300MHz,CDCl3)6O.99(d,J=6.6Hz,3H),1.08(d,J=6.3Hz’3H),2.55(m,lH),2.75(S,3H),5.38(m,lH),6.87(m,1H),6。97(2H),7.38—7.53(2H)’7.59(d,/=7.8Hz,1H),8.01(S,1H).2.【2.(1.环戊甲酰胺基.2.甲基.正丙基).噻唑4.基】.5.甲基.囔唑4-羧酸(化合物119)(产率98%)1HNMR(300MHz,cDCl3)6o.97(d,J=6.6HZ,6H),1.60.1.89(8H),2,44(m,lH),2.62(m,1H),2.75(s,3H),5.26(dd,,=9.OHz,6.3Hz,1H),6.26(d,,=8.1Hz’1H),7.97(s,lH).112
6.3.2含噻唑、甲基嚼唑、嚼唑三杂环串联结构单元化合物库的制备6.3。2.1化合物92—93、97—99、104、107—109、113—114的制备NHNaHC03昏QAm{20114将化合物91(20m函0。05mm01)与N棚C013(42mg,O.5mm01)混合,加入H20瓜0Ac(0.2mL/0.8mL)后,加入苯甲酰氯(6皿,0.075Imn01),室温反应,TLC跟踪反应,反应完成之后,反应液经EtOAc(20mL)稀释、水(3x20mL)洗涤、饱和氯化钠溶液(3×20mL)洗涤、MgS04干燥、浓缩溶剂、柱层析分离等操作步骤,得化合物114(20mg,产率75%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)61.01(d,‘,=6.9Hz,3固,1.05(d,J=6.9Hz’3H)’1.68(d,J=6.9Hz,3H),2.59(m,lH),2.7』(s,3H),3.88(s,3H),5.46(m,1蛾5.49(m,1H),6.97(d,J=8.7Hz,lH),7.41·7.54(m,4H),7.8l一7.83(m,lH),7.82(d,,=6.9Hz,1H),7.87(s,1H),8.17(s,1H).”CNMR(75MHz,CDCl3)611.8,18.1,19.5,19.6,33.4,42.5,52.2,56.7,120.O,127.1,128.6,129.5,131.8,133.2,133.8,143.O,144.1,153.8,154.1,161.0,161.4,165.2,167.1,172.7.2-【l一({2一【2一(1一胺基一2.甲基一丙基)一噻唑一4一基】-5-甲基-嚼唑4一甲酰基)一胺基)一乙基】.嗯唑.4一羧酸甲酯(化合物91)(产率95哟!HNMR(300岫CDCl3)6O.84(d,,=6.6Hz,3H),O.94(d,J=6.6Hz,3H),1.63(d,~厂=6.9Hz,3H),1.83∽2均,2.24(m,2固,2.65(s,3m,3.83(s,3H),4.17(m,1H),5.44(m,1H),7.50(d,l,28.7Hz,lH),7.83(S,l均,8.13(s,lH).同样方法合成以下化合物:2一【l一({5一甲基一2一【2-(2一甲基·l一丙酰胺基一丙基)-噻唑4-基】-嗯唑·4一羧基).胺基).乙基}嚼唑一4一羧酸甲酯(化合物92)(产率89%)‘HNm(300MHz,CDCb)113倘臼+
一一.中国科学院上海药物研究所博士论文——————————————————————————————————————一一.:.一6O。94(d,J=6.9Hz"3H),O.95(d,J=6.9Hz,3H),1.70(t,J=7.2Hz"3H),2.30(q,J=7.2Hz’2均,2.43(m,1H),2.70(S,3H),3.89(s,3H),5.24(dd,J=8-Hz,6.6Hz,1H),5.49(m,lH),6.32(d,/=8.7Hz,1H),7.53(d,J=8.7Hz,lH),7.85(s,1H),8.17(s,lH);uCM“R(75MHz,CDCl3)69.7,11.8,17.6,19.4,19.5,29.6,33.3,42.5,52.2,56.1,119.9,129.5,133.2,142.9,144.1,153.8,154.2,161.0,161.4,165.2,172.9,173.5.2·(1一【(2·{2一【l一(环己酰基一胺基)-2一甲基一丙基】一噻唑-4-基).5.甲基.曝唑.4一甲酰基)一胺基】一乙基).嗯唑-4一羧酸甲酯(化合物93)(产率85%)1HNMR(3∞MHz,CDCl3)60.93(d,‘,=6.9Hz’3H),O。95(d,,=6.6Hz,3H),1.26(m,4H),1.50(m,2H),】.68(d,,=7.2Hz,3均,】.77(m,2均,1.88(m,2H),2.20(m,1均,2.47(m,1哦2.70(s,3娜,3.88(s,3如5.24(dd,J=9.OHz,6.OHz,1均,5.49(m,l蛾6.25(d,了=9.OHz,1H),7.53(d,,=8.7Hz,1H),7.84(s,1均,8.17(s,1H);”CNMR(75MHz,CDCl3)611.8,17.6,19.5,25.5,25,6,29,3,29.8,33.2,42.5,45.4,52.2,55.9,119.8,129.5,133.2,1429,144.0,153.8,154.2,161.O,161.4,165.2,173.4,175.8.2.(1.【(2.{2一【1一(2一氟一苯甲酰胺基)一2一甲基一丙基1-噻唑.4一基)一5一甲基一噫唑一4一甲酰基)一胺基]-乙基).嚼唑4.羧酸甲酯(化合物97)(产率88%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.02(d,,=6.9Hz,3H),1.04(d,,=6.9Hz,3H【),1.68(d,‘,=7.2Hz,3H),2.64(m,1岣,2.70(s,3H),3.88(s,3H),5.46—5.54(m,2H),7.15(ddd,J212.0Hz,8.IHz,O.6Hz,lH),7。26(td,歹=7.5l{z,1.2Hz,lH),7.38(dd,J:13.2Hz,8.7Hz,1H),7.45—7.5l(m,1H),7.52氐
中国科学院上海药物研究所博士论文2H),4.34(q,J=7.2Hz,2H),4.94(d,J=1.2Hz,1H),5.00(dd,J=1.2Hz,18.3Hz,lH),5.77(m,l岣,7.74(s,1H).5一(2一羧基.乙基)-嗯唑.4一羧酸乙酯(化合物179e)(产率70%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.38(t,J=7.2Hz,3H),2.73(t,J=7.5Hz,2H),3.35(t,J=7.5Hz,2H),4.36(q,J=7.2Hz,2均,4.86眠lH),8.15(s,1H).5.苯基.曝唑4羧酸乙酯(化合物179f)(产率78%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.39化.,=7.2Hz,3H),4.40(q,J=7.2Hz,2H),7.43—7.48(3H),7.90(s,1H),8.04一,8.07(2H).5.正十三烷基.嚼唑_4一羧酸乙酯(化合物1799)(产率60%)1HNMR(300●‘MHz,CDCb)6O.87也-,=6.9Hz,3H),1.27(23H),1.39(t,J=6.9Hz"3H),1.68(m,2H),3.04(t,,=7.5Hz,2H),4.37(q,J=7.2Hz,2H),7.74(s,1H).5.异丙基.嗯唑_4一羧酸乙酯(化合物179h)(产率76%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.30(d,~,=6.9Hz,6H),1.40(t,,=7.2Hz,3H),3.81(m,1H),4.38(q,,=7.2Hz,2H),7.74(s,lH).5.正丙基.嚼唑_4一羧酸乙酯(化合物179i)(产率60%)1H№(300MHz,CDCl3)60.93化.,=7.2Hz,3H),1.35(t,J=7.2Hz,3H),1.69(tq,J=7.5Hz,7.5Hz,2H),3.99(t,,=7.5Hz,2H),434(q,J=7.2Hz,2H),7.73(s,lH);EI—MS(m应):191(M’.3MHC卜E10H17:哺1一哟将3MHCl/EtOH溶液(10mL)加入含有化合物179a(930mg,4.6mm01)的烧瓶中,45℃反应10小时后,冷却至室温,浓缩溶剂,得到产物180a(650mg,产率65%)。1HNMR(300MHz,D20)6O.92(d,,=6.6Hz,3H),O.96(d,J=6.6Hz,3H),1.35(t,J=7.2Hz’3H),2.18(m,l均,2.8l(d,,=6.6Hz,2H),4.40(q,,=7.2Hz,2H).140
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究用相同方法合成以下化合物180b-1809:2.胺基.3一羰基.庚酸乙酯盐酸盐(化合物18%)(产率65%)1HNMR(300MHz,D20)6O.91(t,J=7.2Hz,3H),1.33一1.39(5H),1.62(m,2H),2.93(m,2H),4.40(q,了=7.2Hz,2H)..、2一胺基一3习蕨基.庚一6.烯酸乙酯盐酸盐(化合物18℃)(产率76%)1H》iMR(300M毗,D20)61.32(t,J=7.2Hz,3均,2.37(t,J=6.9Hz,2H),2.93(ddofABXsyStem,,=6.6Hz’18.6Hz,1均,3.09(ddofABXsystem,,=7.2Hz,18.6Hz,1fI),4.36(q,,=7.2Hz’2均,4.93—5.08(2H),5.84(m,1均.2一胺基一3一羰基.苯基.丙酸乙酯盐酸盐(化合物180d)(产率72%)1HNMR(300Ⅷ{z,D20)61.14(t,,=7.2Hz,3H),4.27(q,,=7.2Hz,2H),4.75(s,1H),7.63—7.79(3因,7.32—7.88(1均,8.16—8.20(2H).2一胺基.3.羰基.十六酸乙酯盐酸盐(化合物180e)(产率70%)1HNMR(300iMⅡ{Z,D20)60.87(3田,1.34(26H),1.63(br,2H),2.90(m,2H),4.39(q,,=6.9Hz,2均.2一胺基.3一羰基-4.甲基.戊酸乙酯盐酸盐(化合物180f)(产率74%)1HNl娜己(300Ⅻz,D20)61.10(d,J=6.6Hz,3H),1.22(d,J=7.5Hz,3功,1.32(t,,=7.5Hz"3田,3.34(m,l均,437(q,J=7.5Hz,2码.2一胺基.3{诙基-己酸乙酯盐酸盐(化合物1809)(产率74%)1HNMR(300MHz,D20)60.9l(t,/=7.2Hz"3H),1.34(t,,=7.2Hz,3H),1.62(tq,了=7.2Hz,7.5Hz,2H),2.83(ddofABXsystem,,=7.2Hz,18.OHz,1H),2.96(ddofABXsystem,,=7.5Hz,18.0Hz,1H),4.38(q,,=7.2Hz,2H).6.6.2.2化合物182a一182q的制备(以化合物182a的制备为例)甜c掣人V。B—N№.Ha18"a坚《≯H82a将噻唑甲酸(10Qmg,0.77删n01)、化合物18la(258mg,l。2mm01)、EDC14l
中国科学院上海药物研究所博士论文(148mg,O.77mm01)、Dl订AP(20mg,0.16mm01)、分子筛混合,加入DMF(2mL),然后加入吡啶(55此),TLC跟踪反应,反应完全后,反应液经乙酸乙酯稀释(50mL)、水(15mL×2)洗涤、饱和食盐水(20mL×2)洗涤、MgS04干燥、浓缩、柱层析分离等操作步骤,得到化合物182a(167m&产率70%)。‘HNⅣ口R(300MHz,CDCl3)6O.92(d,,=6.9Hz,3H),0.96(d,,=6.9Hz,3H),1.31化J=7.2Hz,3H),2.25(m,1H),2.64(d,,=6.3Hz,2H),4.29(q,d=7.2Hz,2H),5.36(d,J=6.9Hz,lH),7.59(d,.,=3.0Hz,lH),7.92(d,J=3.OHz,1),8.30(d,,=6.3Hz,lH).3.羰基.2.【(噻吩.2.甲酰基)-胺基】.庚.6烯酸乙酯(化合物墙2b)(产率75%)1H№腮(300瑚z,CDCl3)61.28n,=7.2Hz,3H),2.4l(m,2哟,2.86(m,2H),4.26(q,J=7.2Hz,2均,4.96呻,lH),5.02(dd,J=1.5Hz,17.4Hz,lH),5.38(d,,=6.3Hz"1哪,5.78(m,lH),7.07(dd,J=3.9Hz"4.8Hz,1H),7.20(d,J=6.0Hz,1均,7.50(d,,=4.8Hz,lH),7.60(dd,J=1.2llz,3.9Hz,1H);El·MS(蚴295(M+)3.羰基.2.【(噻吩.2.甲酰基).胺基】一己二酸一1-乙酯一6一甲酯(化合物182c)(产率60%)1HNⅦ己(300MHz,CDCl3)61.32(t,,=7.2Hz,3H),2.66(t,-,=6.3Hz,2H),2.99(ddofABs)俘tem,J=6.3HZ,18.6Hz,lH),3.15·(ddofABsystem,,=6.6Hz,18.6Hz,lH),3.65(s,3H),4.30(q,J=7.2Hz,2H),5.43(d,J=6.3Hz,lH),7.07(dd,,=3.9Hz’4.5Hz,l功,7.20(d,,=5.1Hz,1H),7.5l(d,-,=4.5Hz,1H),7.60(d,J=3.6Hz,1H).3.羰基一2一【(噻唑.2一甲酰基)一胺基卜己二酸.1.乙酯-6-甲酯(化合物182d)(产率58%)1HNMR(300MHz,CDcl3)61.33(t,,=7.2Hz,3H),2.68(t,.,=6.6Hz,2H),3.00(ddofABXsystem,J=6.9Hz,18.9Hz,1H),3.17(ddofABXsystem,,=6.6Hz,18.6Hz,lH),3.67(s,3H),4.33(q,J=7.2Hz,2H),5.45(d,J。7.2Hz,1H),7.60(d,.,=3.OHz,lH),7.92(d,J=3.OHz,lH),8.32(d,J=6.3Hz,lH).3.羰基.2.【(噻唑.2一甲酰基)一胺基】-庚酸乙酯(化合物182e)(产率65%)’HNMR(300MHz,CDCb)60.90(t,,=7.2Hz,3H),1.30(t,,=7.2Hz,3H),1.32(m,142
海洋天然产物LeucamideA的全合成、结构改造及构效关系研究2H),1.60(m,2H),2.71(ddofABXsystem,,=7.2Hz,17.4Hz,1H),2.79(ddofABXsystem,,=7.8Hz,17.4Hz,1H),4.29(q,,=7.2Hz,2H),5.39(d,J=6.9Hz,lH),7.59(d,了=3.3Hz,1H),7.9l(d,了=3’3Hz,lH),8.30(d,‘厂=6。6Hz,1H).3.羰基.2.[(噻酚.2.甲酰基)-胺基】-庚酸乙酯(化合物182f)(产率70%)1HNMR(300MHz,CDa3)60.91(t,/=7.2Hz,3H),1.31(t,-,=7.2Hz,3H),1.35(m,2H),1.62(m,2}I),1.76(m,2H),4.27(q,/=7.2Hz,2均,5.19(d,,=6.9Hz,1H),7.09(dd,,=3.6Hz,5.1Hz,lH),7.18(d,歹=6.OHz,lH),7.50(dd,J=1.2Hz,5.1Hz,lH),7.68(dd,J=112Hz,3.6Hz,lH).3一羰基一2一[(噻唑一2一甲酰基)-胺基】.己酸乙酯(化合物1829)(产率78%)1HNMR(300MHz,CDCl3)6O.92(t,,=7.2Hz,3均,1.30(t,,=7.2Hz,3H),1.67(m,2H),2.72(m,2H),4.28(q,J=7.2Hz"2H),5.38(d,了=6.9Hz,lH),7.59(d,歹23.OHz,lH),7.90(d,,=3.OHz,l功.3.羰基.2.[(噻唑.2.甲酰基)-胺基】-十六酸乙酯(化合物182h)(产率60%)1HNMR(300MHz,CDCl3)60.87化,=6.9Hz,3均,1.24(20聊,1.3l(t,,=7.2Hz,3H),1.64(m,2H),2.75(m,2均,4.29(q,了=7.2Hz,2均,5.39(d,J=6.9Hz,1H),7.59(d,J=3.3Hz,1H),7.92(d,/=3.0Hz,1H),8.30(d,J=6.6Hz,1H).5一甲基一3一羰基一2一f(噻吩-2一甲酰基)一胺基】一己酸乙酯(化合物182i)(产率70%)。HNMR(300MHz,CDCl3)6O.90(d,,=6.6Hz,3H),O.95(d,J=6.6Hz,3H),1.30(t,/=7.2Hz,3竭,2.2l(m,lH),2.64(d,/=6.6Hz,2H),4.27(q,,=7.2Hz,2H),5.35(d,√=6.6Hz,1H),7.08(dd,,=3.6Hz,5.1Hz,lH),7.19(也J=6.3Hz,1H),7.50(dd,J=1.2Hz,5.1Hz,1H),7.6l(dd,J=1.2Hz,3.6Hz,1H).3.羰基-3-苯基一2·f(噻吩.2一甲酰基)-胺基】-丙酸乙酯(化合物182j)(产率68%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.15(t,J=7.2Hz,3H),4.19(q,‘,=7.2Hz,2H),6t35(d,J=7.5Hz,1H),7.10(dd,,=3.6Hz,5.1Hz,lH),7.40(也J=7.2Hz,1H),7.40一7.6l(3H),7.64—7.66(2H),8.15—8.17(2H).3一(2-氯-4一氟一苯基)-3一羰基一2-【(噻吩一2一甲酰基).胺基】一丙酸乙酯(化合物182k)(产率58%)1HNMR(300MHz,CDCl3)51.14(t,J=7.2Hz,3H),4.22(q,/27。2Hz,2H),6.35(d,/=7’2HZ,lH),7.14—7。34(2H),7.42(d,‘,=6.3Hz,143
中国科学院上海药物研究所博士论文1H),7.40—7.61(4H).3-羰基.2一【(噻吩.2.甲酰基).胺基].十六酸乙酯(化合物1821)(产率60%)‘HNMR(300MHz,CDCl3)(产:率50%)60.87(t,J=6.9Hz,3H),1.16-1.33(24H),1.6l(4H),2.77(m,2H),4.29(q,J=7.2Hz,2H),5.39(d,J=6.6Hz,lH),7.09(dd,,=3.9Hz,4.8Hz,1均,7.19(d,J=6.3Hz,lH),7.51(dd,,=1.2Hz,4.8Hz,1H),7.61(dd,J=1.2Hz’3.9Hz"1H).3-羰基一2.【(噻唑一2-甲酰基)一胺基】-己酸乙酯(化合物182m)(产率68%)1HNMR(300MHz,CDCl3)60.93(t,J=7.2Hz,3H),1.29(t,J=7.2Hz,3H),1.67(m,2H),2.72(m,2H),4.25(q,J=7.2Hz,2H),5.37(d,,=6.9Hz,1H),7.10(dd,,=3.6Hz,4.8Hz,1H),7.53(dd,,=1.2Hz,4.8Hz,1均,7.62(dd,J=1.2Hz,3.6Hz,1H).4.甲基.3.羰基.2一【(噻吩.2.甲酰基)-胺基】一戊酸乙酯(化合物182n)(产率78%)1HNMR(300~Ⅱ{z,CDCl3)61.15(d,J=6.9Hz,3H),1.25(d,J=6.9Hz,3H),1.32(t,,=7.2Hz,3H),3.15(m,lH),4.29(q,J=7.2Hz,2H),7.09(d,J=4.5hz,1H),7.19(br,1H)’7.52(d,-,=4.8Hz,1H),7.61(d,^,=3.3Hz,1H),6.6.2.3化合物194—209、238、243的制备(以化合物207为例)NH·Ac"Na0AcH吣"8ae207将化合物182e(88mg,O.3mg)与醋酸铵(NH40Ac)(1.2g,15mm01)、醋酸钠(NaOAc)(2.55g,30mm01)混合,加热至130℃,TLC来跟踪测定反应的完成程度,随后冷却至室温,经水稀释、乙酸乙酯萃取、浓缩柱层析分离等操作步骤,得到化合物207仁5mg,产率31%)。1HM订R(300MHz,CDCl3)60.93(t,J=7.2Hz,3H),1.39—1.46(m,5H),1.69(m,2H),2.99(t,,=7.8Hz,2H),438(q,J=7.2Hz,2H),7.42(d,J=3.0Hz,lH),7.83(d,J=3.OHz,1H).用同样方法合成以下化合物194—207:5一丙基一2一噻吩.基.1H.咪唑一4.甲酸乙酯(化合物194)(产率37%)1HNMR144ONH0止7NS一/毡
海洋天然产物Leuc啪ideA的全合成、结构改造及构效关系研究(300MHz,CDCb)60.95(t,,=7.5Hz,3H),1.7l(m,2H),2.87(m,2H),4.32(q,J=7.2Hz,2H),7.05(m,1均,7.30(m,1H),7.51(驰1H).5.丁基-2。噻酚.2.基.1H.咪唑-4.甲酸乙酯(化合物195)(产率30%)1阳州R(300NⅡ{z,CDCl3)6O.72(t,了=7.2Hz,3H),1.16(t,J=7.2Hz,3H),1.17(m,2H),1.42(m,2H),2.71(t,J27.5Hz,2H),4.12(q’J27.2Hz,2H),6.85(dd,J=3.9Hz,4.8Hz,1岣,7.14(dd,,=1.2Hz,5.4Hz,1H),7.36(d,J=3.6Hz,1H).uCNMR(75MHz,CDCl3)613.4,13.8,22.2,25.9,31.6,60.1,124.4,125.6,126.5,127.5,132.2,142.2,144.6,162.7;HPLC纯度97.2%.⋯5.戊基.2.噻酚.2.基.1H.咪唑.4.甲酸乙酯(化合物196)(产率34%)1HNMR(300MHz,CDCl3)60.87(t,J=6.9Hz,3H),1.28一1.43(m,7H),1.67(m,2H),2.91(t,,=7.5Hz,2均,4.35(q,,=7.2HZ,2H),7.06(dd,,24.2Hz,lH),7.34(d,,=3.9Hz"1H),7.49(d,,=3.3Hz,1H);HPLC纯度98.5%.、5.异丁基.2.噻酚-2.基.1H.咪唑.4.甲酸乙酯(化合物197)(产率38%)1Hm稂(300蛐乜CDCl3)60.95(d,,=5.7Hz,6均,1.35(t,,26.9Hz,3H),2.08(m,l娜,2.83衄,2均,4.34(q,歹=6.9№,2H),7.26(d,,=0.6Hz,1H),7.34(d,歹=3.6Hz,l川,7.57(m,1H).5.异丙基.2.噻酚.2.基.1H。咪唑.禾甲酸乙酯(化合物198)(产率30%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.25一1.34(m,9H),3.69(m,1H),4.33(q,/=7.2Hz,2均,7.03(dd,J=3.9Hz,1H),7.30(d,,=4.5Hz,1H),7.53(d,,=3.3Hz,lH).5.丁.3-烯一2.噻酚一2一基一lH-咪唑.4.甲酸乙酯(化合物199)(产率31%)1HNMR(300MHz,CDCl3)61.10(t,,=7.2Hz,3H),2.65(t,,=6.9Hz,2H),3.28(t,J=7.5Hz,2均,4.28(q,J=7.2Hz,2H),4.99(dd,J=O.6Hz,10.2Hz,l岣,5.11(d,,=16.8Hz,lH),5.97帆lH),7.05(dd,J=3.9Hz"4.5Hz"lH),7.47(d,-厂=5.1Hz,1H),7.78(d,,兰3.0Hz,1H);HCNM限(75MHz,CDCl3)614,70,27.84,34.43,60.43,115.57,125.9l,127.66,128.60,131.90,135.25,138.80,145.OO,147.63,162.42.2.噻酚.2.基.5.十三烷基一lH.咪唑.4.甲酸乙酯(化合物200)(产率32%)1H145
中国科学院上海药物研究所博士论文NMR(300MHz,CDCl3)60.87(3H),1.2一1.60(22H),1.40-1.69(4H),2.87(2H),4.37(q,,=6.9Hz,2H),7.09(m,lH),7.26(m,】H),7.46(m,1H).5一(2一氯一4一氟一苯基)一2一噻吩一基一1H一咪唑一4一甲酸乙酯(化合物201)(产率35%)‘HNN球(300MHz"CDCl3)51.42(t,J=7.2Hz,3H),4.22(q,歹=7.2Hz,2H),7.02(ddd,.,=lO名Hz,8.1I{z,2.4Hz,lH),7.10(dd,/=4.8}Iz,3.6Hz,lH),7.18(dd,J=8.7Hz,2.7Hz,1H),7.40(dd,J=5.4Hz,1.2Hz,lH),7.45(dd,J=6.3Hz,2.4Hz,1H),7.64(d,J=3.3Hz,1H);EI-MS(,蚴:350(M_).5.苯基。2一噻吩.基.1H.咪唑.4.甲酸乙酯(化合物202)(产率36%)1HNMR(300MHz,CDCl3)51。19QJ=6.9Hz,3H),4.24(q,J=6.9Hz,2H),7.01(m,lH),7.3l(5H),7.58(d,-,=3.3Hz"1H),7.74(m,lH).5一异丁基-2一噻唑-2.基.1H-咪唑-4.甲酸乙酯(化合物203)(产率37%)1HNMR(300MHz’CDCb)50.86(d,J=3.3Hz,6H),1.34化J=7.2Hz,3H),1.94(m,lH),2.79(d,-厂=7.2Hz,2H),4.33(q,J=7.2Hz,2H),7"39(d,J=3.3Hz,lH),7.78(d,/=3.3Hz,1H).5.异丁基.2.噻唑乏一基.1H.咪唑-4.甲酸乙酯(化合物204)(产率33%)1HNMR(300M【Hz,CDCl3)61.26(d,‘,=6.9Hz,6H),1.39(t,J=7.2Hz,3H),3.87(m,l田,4.38(q,-,=7.2魄2鼢7.37《d,歹=3.3Hz,lH),7.75(d,歹=3.3Hz,1H).5.丙基.2一噻唑-2.基。lH一咪唑_4一甲酸乙酯(化合物205)(产率25%)1HNMR(300MHz,CDCl3)6O.98(t,J=7.2Hz,3H),1.40(t,,兰72Hz,3H),1.75(m,2H),2.92(t,,=7.5Hz,2H),4.39(q,J=7.2Hz,2H),7.43(d,,=3.3Hz,1H),7.84(d,,=3.3Hz"lH).2.噻唑.2一基.5.十三烷基一1H一咪唑4-甲酸乙酯(化合物206)(产率28%)1HNMR(300~m乙CDCl3)6O.93(t,J=7.2Hz.3H),1.39(t,,=7.2Hz,3H),】.43(m,2H),2.99(t,J=7,5Hz,2H),7.43(d,J=3Hz,1H),7.83(d,,=3Hz,lH).2一苯并[4,5】噻吩乏一基一5.异丁基一咪唑-4一甲酸乙脂(化合物238)(产率4l%)1删R(300MHz,CDCl3)6O.80(d,J=6.6Hz,6H),1.23(t,J=6.9Hz,3H),1。89(m,1H),2.66(d,J=7.2Hz,2H),4.19(q,J=7.2Hz,2H),7.16·7.19(2H),146
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究7.60—7.67(3H);1jCNMR(75MHz,CDCl3+CD30D)614.0,22.1,29.1,29.5,60.3,121.9,122.2,123.9,124.5,125.0,127.6,128.7,131.0,132.3,139.8,141.8,163.4.5.异丁基.2.(5.甲基.噻吩.2.基).咪唑.4.甲酸乙脂(化合物243)(产率32%)1HNMR(300MHz,CDC】3)6O.90(d’,=6.6Hz,6H),1.31(t,‘厂=7.2Hz,3H),2.01(m,1H),2.46(s,3H),2.78(d,,=7.2Hz,2H),4.30(q,,一7.2Hz,2H),6.67(d,J=3.6Hz,1H),7.37(d,,=3.6Hz,1H).6.6.2.4化合物208—209的制备(以加8的制备为例)/S、/CooH埘2"b—--——-"21伯X=N214bX=CH2a————●卜C————-●‘213H2∞X=Na)EDc.DMAP.pyrⅫ舱:b)IBx’DMSo^ol∞憾:c)№oAc斛‰OAc将化合物2ll(640mg,5删n01)、化合物212(848mg,5舢01)、EDC(1.15g,6删舯1)、D1儿业(122mg,l锄01)、分子筛混合,加入DⅧ(10mL),然后加入吡啶(O.76n1L),TLC跟踪反应,反应完全后,乙酸乙酯稀释(150mL),先后经水(50mL×2)洗涤、饱和食盐水(50mL×2)洗涤、MgS04干燥、浓缩、柱层析分离操作步骤,得到化合物213(400mg,产率82%)。将213(255m岛lmm01)溶于DMS0/甲苯(5II幽mL),加入mX(200mg)室温反应,TLC跟踪反应,反应完全后,用饱和NaHC03(10mL)、Na2S203(10mL)溶液淬灭反应,用乙酸乙酯稀释反应液,先后经水(50mL)洗涤、饱和食盐水洗涤、MgS04干燥、浓缩操作步骤,得到化合物214a(210mg,产率87%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)62.44(s,lH),3.85(s,3H),5.41(d,J=6.3Hz,1H),7.10(dd,,=3.6Hz,4.8Hz,lH),7.14(br,1H),7。53(dd,J=1.2Hz,4,8Hz,lH),7.62(dd,,=147一删洲V扩
中国科学院上海药物研究所博士论文1.2Hz,3.6HZ,1H).将化合物214a(120m&O.5姗01)、NH40Ac(19)、NaOAc(0.5g)混合,熔融状态下反应5小时后,冷却至室温,依次经水(10mL)稀释、Et0Ac(20mL)萃取、饱和氯化钠溶液(3×10mL)洗涤、无水MgS04干燥、浓缩、柱层析分离等操作步骤,得到化合物2惦(37mg,产率35%>。‘HNMR(3∞MH乙cDcl3)52.53(s,3H),3.80(s,3H),6.96(dd"J=3.6,5.1Hz,lH),7.25(dd,-厂=1.2Hz,5.4Hz,lH),7.58(dd,J=1.2Hz,3.6Hz,1H);¨CNMR(75MHz,CDCl3)612.7,51.7,124.0,126。4,127.3,128.1,132.1,141.3,142.5,163.O;EI—MS∞以):222口订’].3一羰基.2一【(噻唑.2一甲酰基).胺基】.丁酸甲酯(化合物214b)(产率70%)1HNMR(300M】眩,CDCl3)62.44(s,3H),3.84(s,3H),5.42(d,J=6.9Hz,1H),7.6l(d,J=3.3Hz,1l现7.92他‘,=2.7Hz,1H),8.29(br,1H).5.甲基-2.噻唑.2一基.1H.昧唑4甲酸甲酯(化合物209)(产率35%)1HNMR(300MHz’CDCl3)62.56(s,3H),3.88(S,3H),7.4l(d,,=3.3H乙lH),7.80(d,了23.OHz,lH);bC№纠喂(75MHz,CDCl3)612.8,51.9,121.O,126.O,140.8,143.1,l58.5,162.7,178.O;EI.MS(m/z):223(M+).6.6.2.5化合物210的制备、Na2S203(10mL)溶液淬灭反应,用乙酸乙酯稀释反应液,先后经水(50mL)、饱和食盐水洗涤,浓缩,以石油醚/乙酸乙脂(体积比3:1)柱层析分离得到化合物218(53mg,产率62%)。将化合物218(53mg,O.17mm01)、NH40Ac(1酚、NaOAc(O.5曲混合,熔融状态下反应5小时后,冷却至室温,依次加入水(10mL)、EtoAC(20mL),有机相经饱和食盐水洗涤、MgS04干燥、浓缩,得到化合物210(15mg,产率30%)1HNMR(300MHz,CDCl3)63.81(s,3H),7.07(dd,,=4.8Hz,3.9Hz,1H),7.36(5H),7.58(d,J=3.3Hz,l均,7.80(dd,,=5.4Hz,2.4Hz,1H);¨CNMR(75MHz,CDCl3)651.8,126.4,127.2,127.7,127.9,128.8,129.O,129.3,131.7,132.6,143.2,161.5;EI-Ms(珊,z):284【M十】.6.6.2.6化合物183—188、237、242的制备(以1¨为例)j一&0丫、:1八争。.‰J。火一久IH107舻:弋6。3.2。1108o6.3,2.1《y、。』早2√r”鹋3丫H2啪0\少N火八/\V。凡JH109姒0。6.3.2.11lO学沁6.3.2.39。。√g≯oo㈣r≈~砖够1ll鲈:≮6.3.2.3112Mk6.3.23≯。q易。‰o≯o。。。七∞斗:b>“113学沁6.3.2.1114妒屯6.3.2.1支姻一爵。kJ^一115乒y—6.3.1。4116o,V。o∽6.3.1.4k‘、=‘晕。忡R}MX妞H117≯甲c蝴6’3.1.4“8扣6.3.1.4k=.:’一一.$。9H‰}M119I6.3.1.4120捧6.4o/≮r一。“扛H一RS口_jv“ooJ岫斗≈屺177
中国科学院上海药物所博士论文12l龇。6.412406.4,=可妒跏3\(二,一、酿:蛹H屯J125龋6.4126蜗6.4闩一魄《b127E譬、一6.4128o6.4尸、含』一文b尸气,岔X:kH蚴129fO6.41306.4仑~d~,段,“尸fpH飞k§、矿Ho斗☆协139舭。工6.5140∥她6.5r”固Q。“0:如太o旷uH141O6.5142≥≯J6.5≮7y。,事;≯一H矿。囝t—o。足/、,尸H143杏U6.5145aM。o6.5,:拐≯”警丫。日YrⅣ、广~。。。夕145b龋弋6.5145c≯≮玛6.59Z、3f。.L丫、№J丫、一~‘——)ocj’145d◇pJ6.5145e智寸、6.5只嘲”叼殳≯02.-},£。’_*l——IDC一’178
155(≯护6.6.1.2156<献6.6.1.2h。占D翻知157臼禽D6.6.1.2158e九r油6.6.1.2℃ooM●℃O油159命硷6.6.I.2160令幻6.6.1.2kmCooH6.6.1.3162C∞H6.6.1.3161。s∥入~《s∥从、LNⅦ163翕盯℃6.6.1.3164命☆6.6.1.3℃㈣b∞H6.6.1.4168a6.6.1.4168b℃o№t。1甘p’a6.6.1.4169b口、6.6.1.4169a锄对汀寸b蝴183疏n6.6.2.6184≤:河r、6.6.2.6000日℃OOB185蝌幽76.6.2.6186≤!晰6.6.2.6、boo日℃OOEt187配y一6。6.2.6188岔口q3坳6.6.2.6、Coo日、c00Et189心扩6.6.2.7190翕☆吖6.6.2.7℃OOB℃OOEt191鼠y—6.6.2.7192岔☆^r6.6.2.7COO氐C∞El193《咿6.6.2.7194令☆~6.6.2.3、cooEt诋195<"扩6.6.2-3196<"△~一6.6.2.3℃oo臼eooEt197、:H:厂×6.6.2.3198台☆人6.6.2.3CooEt。口∞H6.6.2.3200泔蜘6.6.2"3199《:Hy一妇℃Oo日179
中国科学院上海药物所博士论文201Ha丫丫‘6.6.2.3202H6.6.2.3台☆人J泔“b嗍203H6.6.2.32046.6.2.3疏n甜\cDo日‰H6.6.2.3206H6.6.2.3205令妒C扩bo∞妇H6.6.2.3208H6.6.2.4207≤:汛扩一泔CoDBbo㈨209H6.6.2.4210C坷r~6.6.2.5∞bo呐223《浙6.6.2.7229∞6.6.2.7分≯2306.6.2.823lH6.6.2.8咐‘醣yaoPh232H6.6.2.82336.6.2.8<:兀℃眈237魄6.6.2.6238H6.6.2.3嫩239院6.6.2.7242飞晰6.6.2.6C00日243H6.6.2.3244飞晰6.6.2.7飞晰℃00日COoB180
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究附录2主要中间体化合物索引2O3唑叫父∥:南∞3r式V№。4麟H5rcIH.H2N7\一‘庐0沁NN∥\入№/Meo——≮U45户00E【460eooMo,:Iig弋S蟛N\,,人NHBoc、jIY、NHB∞I47查乙49BocH哩H1N丫co淞,=≤o\Hs9NV慨l50,5l|BocHN一一\BocHN,一\矿穹够厂Meo弋№or飞..U54NHFm∞134O唑№卜垭t,=l能文∑135O136卜0HJ户H/==(k,c。一S蟛N,=《“纩飞j∞二\一/、、,“NH日oc‘181
中国科学院上海药物研究所博士论文137“138一一~∽二议153a叱N、fsy,\/\153bH2NNs扩\<黻co眺N弋c00Me】53c酬飞℃153dH2N≮spo\岛义c删e153e州飞≮。。№154aBr\/S、,/\八‰≮渊e154b叶飞s扩\<154cBr、/SVBzN弋C00№‰之c0鳓e154d154e卧硷一e~s、。/\/0、麓≮:。溅179a钮弋179b扩℃OoB、c00H179c.^.^^/179d”敞、舷t℃00B179e,0、./\删179f禽盹‰卫C∞BC00B1799/Qyc,3H17179h.渊岔人℃00日COO日】79i钮~180a人姒泪、℃oo日NH2.HcloO180co0180b\一人。kt≮/\人.八oEl啊b¨a¨叱.什cl180do180eo0摊c,。№7人po日N心.HcI180fO1809O0√V阳/\八,八oEt‘^*七.}IcINH2.Ha182
海洋天然产物Leuc锄ideA的全合成、结构改造及构效关系研究182b矿gj\c。。B182a酽2:人co矗182co吣厂Vcoo№182do吣入/c00Me∥2:人coo&《矿2:人cooEt182eo卟/\182f暖¨c’凸ou∞一
_r=L”r~"pi罟‘eyf蠹j等』譬÷L;{l8.i6‘,.645S30SOl7.2S0一S.516jS.q86:三兰曼兰三兰三三曼i三三三兰。一5.483j一一5,4S9一一~5.27S——⋯——\\一S.262j~S.2354.938—38822,S9——2.50l22222222。22。。t一2.473—一2014—1.6837,】,6ES~!.431j一:.2S0/一j.22S??rI·2Q3_二二=====三三三三;三;裂/~1.B038.3800.S06O.8540846—0e23∞■》z口》∞口】_=o口钳:一、,m二.,t,c一∞a协。口co;o#一*”=c一≥=、飞誓’l;。4净器:广。黼_>~1i1,,11jTⅧ:1{1』}tT¨11111l‘f_{’;{10。ll_:{Ij;:∞N叭m扯¨;io.oHo.馈岱、Hr●●LH.奄∞^.(}【j”.幔”A、oo|3口fTI
f?l:{i_01w鸟一(心一{·j:;∞j』∞幺{’10∞二‘盎‘ofj’7\,,o“≥一一z、∥拿Q声≥>}l{’一;1≥≮~黑fD?09d}6e2560j82ei4.eI2,0.93S—.393Z2兰兰羞兰j三i三三薰蚤兰釜兰墨一‘乇~t‘8044l420⋯1.£《7】、日47——⋯一一一——i.2^7{;,,广|事c时矾~醴黼澈一=一
:譬葛基F?毛。。。≥二口∽心o℃V·、’:no嚣o∞R一■叫它r}乳∞∞舒∞(二∽蕾H一嚼£0譬《≯Xo岛000pH瞄鸳∞oZ0■譬々0§宵mo厶ouo_”:三!o三!瞄%^『;,70昏《\::f=∞咭¨¨(j()o\努一-c)oo≮叫。《喇o=JX譬曙∞opz一瞄H”一q叼∥Ⅻ2~—叶.王∽州嚣S\互芝一∞讲\£≯zo叫:叶国j蔫卜owm坼卜心p∽=三一芦ouqp¨o=L~一卜,,芦■一!玺t=一鬟.≯∞nm∞¨{}wUm∞N∞一二}∞o“o只!ioo(二oooAoot二I二jo∞oc辩十o,~∽.争∞
一:0ZS0e-一i5i2}?-.:Sj:30⋯⋯⋯⋯乞;一“j删==::=;9.1S?7.^z:?0n0一:{:.±:2⋯j0:7l一。一一:,n{?一:,2S3:,:zC⋯一.?i40i;,一i2.0l‘{h。.:;一.。-“~,,j¨,jj¨;.jj,"_._T.{-≮、一0I,{,●::。苌。l_40≈。1_00∞lI。。耋N口'
您可能关注的文档
- cht100齿轮效率实验台数控系统及机械结构改造和升级
- 世博建设大厦结构改造信息化监测方法研究
- 公路路网结构改造工程项目管理办法(试行)
- 北京新燕莎金街购物广场加装6-7层步行梯结构改造工程钢梯施工方案
- 存款计息及账户结构改造方案说明文档2011-5-6终结版
- 天然产物vbe-1衍生物的结构改造及抗肿瘤活性研究
- bcl-2蛋白抑制剂z24结构改造物的设计、合成与筛选
- 基于新天地8号高层建筑结构改造加固优化设计研究
- 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究
- 我国国有独资商业银行股权结构改造研究
- 某高层建筑的结构改造与加固设计
- 基于材料特性的工业建筑遗产主体结构改造研究
- 基于结构改造的最小流量循环阀噪声控制研究
- 旧水泥混凝土路面结构改造的设计与计算分析
- 电除尘器流场模拟及结构改造
- 神经氨酸酶抑制剂—紫檀素的合成及其结构改造
- 钢筋混凝土结构改造施工中加固方法优选研究
- 填料塔填料支承结构改造设计