基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究

'论文题目基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究研究生姓名祁慧昕指导教师姓名张洪建专业名称药学硕士研究方向药物代谢动力学论文提交日期2015年5月 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名:期：力 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属^____年_月解密后适用本规定。非涉密论^/论文作者签名：吁续所日期：外-十<导师签名：你cH曰期：>/r.X,^ 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究中文摘要基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究中文摘要目的吉西他滨是一种嘧啶类核苷类似物，通过干扰DNA的合成来发挥抑制肿瘤生长的效应，对多种实体瘤都有治疗作用。目前，吉西他滨在临床上是作为非小细胞型肺癌，乳腺癌和胰腺癌的一线用药，但肝脏和血液中存在的脱氧胞苷脱氨酶会使吉西他滨脱去4’-氨基而失活，导致吉西他滨体内的半衰期减短和生物利用度低。本文通过前药策略在吉西他滨糖环5’-OH连接一系列的磷酸酯长链，通过增加吉西他滨的脂溶性，提高其膜渗透率及口服生物利用度，在体内能够获得更加有效的抑制肿瘤生长的效用。方法通过MTT实验方法，使用11种不同的人癌细胞株中，考察比较吉西他滨和前药的抑制癌细胞生长的作用，从多个前药中选择细胞毒作用最强的候选前药，以及筛选出对吉西他滨前药最为敏感的细胞株，模拟吉西他滨耐药的细胞株，考察化合物-3对耐药株的细胞增殖的抑制作用。建立和优化吉西他滨以及候选前药的定量分析方法，进一步考察候选前药的体外代谢稳定性，候选前药通过癌细胞膜的转运机制，细胞内浓度与其抑制癌细胞生长作用的相关性。体内实验部分，建立非小细胞型肺癌H460的异位移植模型，考察前药经口服给药后对小鼠肿瘤的抑制作用。结果体外部分：5个吉西他滨的前药都能够明显抑制多种癌细胞的生长，其中非小细胞型肺癌细胞（H460，A549），胰腺癌细胞（Panc-1），前列腺癌细胞（PC-3，DU145）和结直肠癌细胞（HCT-116）对前药尤为敏感，化合物-3较其他前药能够更有效的抑制多种癌细胞的生长。化合物-3对上述6个癌细胞中的IC50值均小于1μM，接近吉西他滨的并远低于阳性前药LY2334737的IC50值。在模拟的吉西他滨耐药株中，吉西他滨的IC50值升高了44.5倍，而化合物-3的IC50值仅升高1.3倍。体外代谢结果表明，化合物-3在各种属的血浆中均稳定，且在人肝S9中没有明显的代谢，而化合物-3能够经碱性磷酸酯酶代谢生成活性产物吉西他滨。在4℃和37℃比较化合I 中文摘要基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究物-3进入癌细胞的差异，结果显示在4℃条件下进入细胞的量约为37℃的30%~40%，说明化合物-3可以通过被动扩散和摄取转运体摄取进入细胞。同等条件下，前药进入敏感细胞株的浓度高于不敏感株的浓度，癌细胞内的前药浓度与对各癌细胞生长的抑2制率有着明显的相关性（R=0.89）。口服配方筛选结构表明，1%CMC-Na含0.5%Tween80的混悬剂所获得的化合物-3和吉西他滨的血浆曝露量最高。使用此口服配方，化合物-3每周2次给药（40mg/kg）能够明显抑制肿瘤的生长，2周后，肿瘤生长的抑制率为65.1%（与辅料对照组相比，p<0.01）。与之相比，每周2次腹腔注射80mg/kg吉西他滨盐酸盐，2周后其肿瘤生长抑制率为61.1%（与辅料对照组对比，p<0.01）。结论基于结构设计的前药能够显著抑制癌细胞的生长，最敏感的细胞株为非小细胞型肺癌（A549、H460），前列腺癌（DU-145、PC-3）结直肠癌细胞（HCT-116）。其中化合物-3为抑制强度最佳的前药，该化合物较母药对吉西他滨耐药肿瘤细胞株更加有效。化合物-3可以通过被动扩散和主动转运进入细胞，细胞内浓度与其癌细胞的生长抑制率相关。化合物-3在体外代谢体系中较稳定，和吉西他滨相比，口服生物利用度有较大的提高。药效结果表明，化合物-3具有口服抑制肿瘤生长的活性，药效优于高剂量腹腔注射吉西他滨盐酸盐。关键词：吉西他滨，前药，非小细胞型肺癌，异种移植作者：祁慧昕指导教师：张洪建教授II 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究英文摘要InVitroandInVivoAssessmentofAnti-ProliferationActivityofGemcitabineProdrugsAbstractObjectiveGemcitabineisadeoxycytidine(dCyd)analogwithactivitiesinavarietyofsolidtumors.Despiteofitswideuse,theefficacyofgemcitabineislimitedbyaveryshortplasmacirculationtimeduetodeamination.Inaddition,itsoralactivityislimitedbyloworalbioavailability,duetothesignificantfirst-passeffect.Toovercomethosedeficiencies,wedesignedaseriesofprodrugsandinvestigatedthepossibilityoforaldeliverybyfocusingonmetabolicstabilityandoralbioavailability.MethodThecytotoxicityof5prodrugswastestedin11differenthumancancercelllinesbyusingtheMTTassay,toidentifythemostsensitivecelllinesandpotentcompounds.Anti-proliferationactivitywasalsosimulatedinthegemcitabine-resistantcellline.AsensitiveLC-MS/MSmethodwasdevelopedforthequantitationofbothgemcitabineandproducts,withafocusonmetabolicstabilityandoralbioavailability.Pharmacokineticstudyoftheprodrugandgemcitabinewascarriedoutinnudemicetoevaluateoralformulations.TheantitumoractivityoftheprodrugwasinvestigatedinH460non-smallcelllungcancerxenografts.ResultsInvitrocytotoxicitytestshowedthatallofthegemcitabineprodrugsinhibitedthegrowthofvariouscancercells.Amongthosecancercells,non-smallcelllungcancercells(H460,A549),pancreaticcancercells(Panc-1),prostatecancer(DU145,PC-3),andcoloncancercell(HCT-116)werethemostsensitivecelllines.Compound-3wasfoundtobethemostpotentprodrugandwasthuschosenforfurtherstudies.IC50valuesofcompound-3inthesixsensitivecancercellswereallbelow1μM,comparabletotheIC50valueofgemcitabine.AnalysisrevealedthatIC50valueofgemcitabinecouldincrease44.5timesinthesimulatedgemcitabine-resistantcancercellline,whilecompound-3onlyincreased1.3-fold,suggestingthatcompound-3wouldbeactiveagainstresistantcelllines.Theintracellularconcentrationofcompound-3at4℃and37℃conditionsshowedsignificantdifferences,withintracellularconcentration2-3timeshigherat37℃thanthatIII 英文摘要基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究at4℃,indicatingthatactivetransportmightbeinvolvedinthecompound-3uptake.Theintracellularconcentrationofcompound-3insensitivecelllineswereobviouslyhigherthanthatinlesssensitivecelllinesafterincubatedwithcompound-3,andtherewasagood2correlationbetweenintracellularconcentrationandanti-proliferationactivity(R=0.89).Compounds3andgemcitabineshowedreasonableplasmaexposurein1%CMC-Nacontaining0.5%Tween80suspensionandthisformulationwasfurtherappliedtoinvivoantitumortesting.Itwasfoundthatatanoraldoseof40mg/kgtwiceperweek,compound-3significantlyinhibitedthetumorgrowth(65.1%ascomparedtothevehicle,p<0.01)aftertwoweeks.ThisoralantitumoractivitywascomparabletogemcitabinedosedIPat80mg/kgtwiceperweek.ConclusionStructural-baseddesignleadtoseveralprodrugsthatdemonstratedantiproliferationactivityagainstnumerouscancercelllines,withcompound-3themostpotenprodrugandA549,H460,HCT-116,DU-145,PC-3themostsensitivecancercelllines.Agoodcorrelationwasnotedbetweenintracellularconcentrationofcompound-3anditsanti-proliferationactivity.Basedonsimulation,compound-3showedbetteranti-proliferationactivityingemcitabine-resistantcancercellascomparedtogemcitabine.InH460xenograftmodel,compound-3showedoralactivityagainsttumorgrowth,indicatingthepossibilityofgemcitabine-basedoraltreatmentforvarioustumors.Keywords:Gemcitabine,Prodrug,Non-small-cell-lungcancer,XenograftsWrittenby:HuixinQiSupervisedby:Prof.HongjianZhangIV 目录第一章序言........................................................................................................................11.1前药简介及其临床应用.............................................................................................11.2前药设计中应用的官能团.........................................................................................11.2.1酯类前药...............................................................................................................21.2.2磷酸酯类前药.......................................................................................................31.2.3碳酸酯和氨基甲酸酯类.......................................................................................31.2.4酰胺类前药...........................................................................................................41.2.5肟类前药...............................................................................................................41.3前药的主要应用.........................................................................................................41.3.1增加药物水溶性...................................................................................................41.3.2改善药物脂溶性...................................................................................................51.3.3增加载体介导的吸收...........................................................................................61.4前药在癌症领域的应用.............................................................................................71.4.1酶激活前药...........................................................................................................71.4.2靶向配体结合前药...............................................................................................81.5结语.............................................................................................................................91.6本课题的研究思路及研究内容.................................................................................9第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究..........................................................112.1实验目的...................................................................................................................112.2实验部分...................................................................................................................112.2.1原料与仪器.........................................................................................................112.2.2细胞以及细胞培养.............................................................................................112.2.3溶液配置和稀释.................................................................................................122.2.4细胞毒性试验.....................................................................................................122.3结果与讨论...............................................................................................................13 2.3.1吉西他滨及前药对癌细胞生长的抑制作用.....................................................132.3.2吉西他滨、LY2334737、化合物-3对多种癌细胞的IC50..............................15第三章化合物-3体外稳定性的研究.............................................................................183.1实验目的...................................................................................................................183.2实验方法...................................................................................................................183.2.1药品与试剂.........................................................................................................183.2.2仪器、色谱、质谱条件.....................................................................................183.2.3溶液的配置与稀释.............................................................................................203.2.4化合物-3在体外代谢体系中的稳定性............................................................203.2.5样品处理及进样.................................................................................................223.3结果与讨论...............................................................................................................233.3.1色谱条件优化.....................................................................................................233.3.2质谱条件优化.....................................................................................................243.3.3化合物-3在体外代谢体系中的稳定................................................................253.3.4化合物-3在牛小肠碱性磷酸酯酶中的代谢....................................................27第四章前药癌细胞膜转运机制评价..............................................................................314.1实验目的...................................................................................................................314.2实验方法...................................................................................................................314.2.1原料与仪器.........................................................................................................314.2.2细胞以及细胞培养.............................................................................................314.2.3化合物-3在4℃和37℃条件下的跨细胞膜转运............................................314.2.4癌细胞对化合物-3敏感性与其跨细胞膜转运的相关性................................324.2.5样品处理及进样.................................................................................................324.3结果与讨论...............................................................................................................324.3.1化合物-3在4℃和37℃条件下的跨细胞膜转运............................................324.3.2癌细胞对化合物-3敏感性与其跨细胞膜转运的相关性................................33 第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察.................................................................365.1实验目的...................................................................................................................365.2实验方法...................................................................................................................365.2.1原料与仪器.........................................................................................................365.2.2动物及动物饲养.................................................................................................365.2.3化合物-3不同口服制剂的的动力学的考察....................................................365.2.4吉西他滨和化合物-3生物利用度的试验........................................................375.2.5血浆样品处理及数据分析.................................................................................375.3结果与讨论...............................................................................................................375.3.1化合物-3不同口服制剂的的动力学的考察....................................................375.3.2吉西他滨和化合物-3的口服生物利用度........................................................39第六章化合物-3的体内药效实验.................................................................................436.1实验目的...................................................................................................................436.2实验方法...................................................................................................................436.2.1动物及动物饲养.................................................................................................436.2.2非小细胞型肺癌H460肿瘤模型的建立..........................................................436.2.3化合物-3和吉西他滨对非小细胞型肺癌肿瘤的抑制作用............................436.3结果与讨论...............................................................................................................446.3.1化合物-3和吉西他滨对非小细胞型肺癌肿瘤的抑制作用............................44第七章总结与展望..........................................................................................................487.1总结...........................................................................................................................487.2展望...........................................................................................................................48参考文献..............................................................................................................................50缩略语说明..........................................................................................................................54攻读学位期间发表的论文及专利......................................................................................55致谢..................................................................................................................................56 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第一章序言第一章序言1.1前药简介及其临床应用前药，又称前体药物，它是本身没有活性或者活性很弱，在体内经过化学或生物转化能够生成有具有活性产物的一类化合物。母体药物经过化学结构的修饰，能够在体内经过化学或生物转化后释放有药理活性的母药，从而发挥治疗作用（如图1-1）。前药能够以改善母体药物的理化性质和药代动力学的特性等，克服各种药物的缺点，如药物水溶性差，化学性质不稳定，经口服给药后吸收差，难以透过血脑屏障，毒性[1]或局部刺激大等。此外，前药还可以提高药物的对肿瘤或特定器官的靶向选择性。1867年，第一个前药是由医学家Cahn和Hepp设计的止痛药-乙酰苯胺（Antifeberin®）。乙酰苯胺是乙酰氨基酚的羟化产物，最初并不是作为前药设计的，只是后来才确定了其前药的性质。直至20世纪中期，前药的概念才被提出，Parke-Davis公司在进行改善氯霉素水溶性的研究，合成了氯霉素的前药-氯霉素琥珀[2]酸钠，其具有良好的水溶性。在此之后，前药的研究使用才开始得到发展。据统计，目前全球药品市场中约有10%可以归类为前药。仅在2008年，所有获得批准小分子[3]药物中有三分之一是前药。[1]图1-1：前药的概念图Figure1-1Asimplifiedrepresentativeillustrationoftheprodrugconcept1.2前药设计中应用的官能团前药设计时，需要保证引入的修饰基团是没有毒性的，并且能够被机体快速的清1 第一章序言基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究除。前药通常将含有羧酸基，羟基，胺，磷酸盐和羰基基团的化合物修饰成酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，酰胺，磷酸酯和肟等。其他不常见的官能团也被应用于前药的设计。[4][5]例如，胺可以衍生为亚胺和N-曼尼希碱，巯基可以衍生成硫醚和硫酯（如图1-2）。[2]图1-2：前药设计中常用的官能团Figure1-2Commonfunctionalgroupsappliedinprodrugdesign1.2.1酯类前药酯类可以修饰含有羟基、羧基、和巯基等官能团的化合物，水溶性的药物的结构中常有羧酸和磷酸，酯类最常应用于掩蔽上述的带电基团，以提高化合物的脂溶性从而增加其膜渗透性。酯类前药的合成较简单，进入体内后，能够被血液、肝脏和其他组织器官中的各[6]种水解酶识别，迅速水解，释放有活性的母药。酯类前药设计最大的挑战是难以预测前药在人体中药物代谢动力学分布，因为羧酸酯酶的活性在不同物种间存在显著的2 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第一章序言[7]差异。烷基酯和芳基酯前药在临床应用方已经有了许多成功的案例，其中最典型的是血[6]管紧张素酶抑制剂，如表1-1所示。含有烷基酯结构的药物在血液中的生物转较缓慢，这导致了这类前药实际的生物利用度常低于预测所得的生物利用度。再举个例子，在人体中，依拉普利能够吸收给药剂量的53%-74%，但其实际的口服生物利用度仅为[8]36%-44%。在某些情况下，双前体药物（pro-prodrug）的应用可以实现快速的生物转化，如β-内酰胺类抗生素中的双前体药物的应用（如表1-1所示）。1.2.2磷酸酯类前药含有羟基、胺官能团的化合物，往往水溶性较差，通过将羟基和胺修饰成磷酸酯来增加化合物的水溶性，提高其水溶解度以增加其口服生物利用度，或用应用于注射给药（如表1-2所示）。磷酸酯前药的合成也相对简单，磷酸酯前药较酯类的化学稳定性好，能够肝脏中磷酸酯酶或小肠刷状缘的作用下转化为母体药物。磷酸酯前药通常被碱性磷酸酯酶水[9]解，与羧酸酯前药不同，磷酸酯前药在不同的物种中有着相似的水解速率。含有双[10]阴离子磷酸盐的前药通常更好的提高了化合物的水溶性。已经有磷酸酯/磷酸盐的注射前药，但目前市场上的的口服磷酸盐前药非常少。磷酸盐前药的离子性很强，导致了通过磷酸酶介导的生物转化不理想，因为母药的水[10]溶性不好，在肠腔内会沉淀析出，导致了药物的吸收和生物利用度降低，所以限制了它的应用。1.2.3碳酸酯和氨基甲酸酯类氨基甲酸酯和碳酸酯前药是通过修饰结构中含有羟基、羧基或胺等官能团的化合物。氨基甲酸酯和碳酸酯前药不同于酯类前药，在酶促反应中，它通常比酯类更稳定，但较酰胺类更易水解。大多数氨基甲酸酯和碳酸酯前药需要酯酶的参与才能完成它们[11]。的生物转化伊立替康（CPT-11）是拓扑异构酶I抑制剂（SN-38）的氨基甲酸酯前药，该结[12]构修饰增加了母药的水溶性。伊立替康能够在肝脏，以及少部分在肿瘤中经羧酸酯[13]酶代谢，生成抗癌药喜树碱，发挥治疗作用。3 第一章序言基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究1.2.4酰胺类前药酰胺类前药通常是衍生自结构中含有氨基和羧基官能团的化合物。在前药的设计中，酰胺类的前药不易经酶代谢，在体循环中较稳定，这也导致了它的应用较局限。酰胺键通常被普遍存在的羧酸酯酶、肽酶或蛋白酶等水解酶代谢。结构中含有酰胺键[14]的药物能够被特定的小肠摄取转运体识别，增加小肠的摄，所以能够增加口服吸收。1.2.5肟类前药肟类前药是结构中含有酮，脒和胍等官能团化合物的衍生物，化合物中缺少羟基、羧基和胺等官能团也可以被结构修饰。肟类前药通常可以被细胞色素P450酶代谢。肟[15]类前药，如脒肟和胍肟的衍生物通常碱性较强，能够提高母药的膜渗透性和吸收。1.3前药的主要应用前药策略可以成功应用于含上述官能团的药物分子中。以下将讲述前药的主要应用：增加原药的水溶性，提高原药的脂溶性，增加经转运载体介导的吸收，靶向给药的应用，以及增长药物的作用时间等。1.3.1增加药物水溶性溶解度是一个化合物理化性质的重要参数，水溶性差对一个有药效的化合物来说是一个严重的问题，前药的设计能够提高其成药性。磷酸酯和酰胺的修饰能够提高药物的水溶性，但应当注意的是磷酸基团的化学稳定性高，往往比母体药物还稳定。在[1,2]生理条件下，磷酸酯前药能被小肠、肝脏和血液中的碱性磷酸酯酶代谢。表1-2列举了磷酸酯前药。4 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第一章序言[1,2]表1-1：前药应用于增加脂溶性和膜透性Table1-1Prodrugsforimprovedpermeability名称官能团结构功能（治疗领域）在肝脏中的酯OO酶作用下转化依拉普利依拉普利拉的为依拉普利Vasotec®,N单乙酯前药N拉，一种血管抗高血压HCOOHO紧张素酶抑制剂O匹氨西林OO在酯酶作用氨苄西林的三NHHNNAlphacyllin®2OO下，生成氨苄甲基乙酰甲酯β-内酰胺抗OS西林，一种β-前药生素内酰胺抗生素经体内经酯酶O奥司他韦O转化，在人体奥司他韦羧酸OTamiflu®中口服生物利的乙酯前药O抗流感N用度提高到HNH280%NH2N在酯酶和磷酸替诺福韦酯替诺福韦的二NO酯酶的作用Viread®（异丙氧羰基NNO下，生成替诺抗病毒氧甲基）酯前OOOP福韦发挥抗病药OOO毒活性O1.3.2改善药物脂溶性尽管水溶性低是导致药物生物利用度低的原因之一，但脂溶性高的化合物也会影响其成药性。为了增加药物的脂溶性，提高膜渗透力，通常将结构中的极性或离子化的官能团酯化。阿德福韦(adefovir)临床应用于治疗乙肝，对于耐拉米夫定的患者有效，但其口服生物利用度仅为12%。阿德福韦酯(adefovirdipivoxil)是Gilead公司开发的阿德福韦的羧酸酯类前药，提高了母药在小肠的吸收，口服阿德福韦酯的生物利用度提高到[3]59%。更多的酯类前药应用于改善脂溶性的例子见表1-1。5 第一章序言基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究[1,2]表1-2：前药应用于增加水溶性，口服生物利用度Table1-2Prodrugsforimprovedaqueoussolubility名称官能团结构功能（治疗领域）NO米普昔芬磷酸米普昔口服后经碱性磷酸酯盐，TAT-59芬的磷酶转化为米普昔芬抗癌药酸酯OHOPOOHOO-Na+OOPO-+Na泼尼松龙磷酸泼尼松HOOH口服后经碱性磷酸酯盐（糖皮质激龙的磷酶转化为泼尼松龙，发素）酸酯挥抗炎抗过敏的作用O快速的经碱性磷酸酯磷苯妥英磷酰胺O酶快速对的转化为苯Pro-dilatin®化的苯O妥因（t1/2:7~15min）较N抗惊厥药妥因HNOPO-Na+苯妥因的水溶性增加O-Na+了1000倍ONO-ONa+PNOO-Na+经过碱性磷酸酯酶转N磷氟康唑氟康唑N化，大大增加了氟康唑Procif®的磷酸N的水溶性，高剂量给予抗真菌酯N静脉注射FF1.3.3增加载体介导的吸收前药的设计原理以特定的膜摄取转运体为靶标，在母药上连接特定的结构，含这[16]些结构的化合物能够被小肠的膜摄取转运蛋白识别，从而增加小肠的吸收。其中应用的最广泛的是多肽转运体这个靶点，因为其在小肠中的分布广，且底物的特异性高。加巴喷丁是经FDA批准的，应用于治疗癫痫和神经痛的药物。加巴喷丁酯（Horizant®）是加巴喷丁的酯类前药，该能够被小肠的钠依赖性多种维生素转运体（SMVT）和单羧酸转运体1（MCT-1）识别，从而增加在小肠的吸收，生物利用度[17]大幅提高。其他一些前药，如前面提到的血管紧张素酶抑制剂依拉普利，抗病毒药伐昔洛韦6 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第一章序言和缬更昔洛韦，和另外一些抗癌药物，如氟脲苷和吉西他滨的酯类前药都是PEPT1的底物。1.4前药在癌症领域的应用近年来，化疗在各类癌症的治疗方面取得了很大的进展。大多数的抗癌药物都是影响肿瘤细胞的增殖达到治疗效果，但是这些药物都有一个共同缺点，就是选择性差，它们不仅杀死癌细胞，对骨髓细胞，肠上皮细胞等正常的细胞也有伤害，不能长期的[18]使用。因此，提高化疗药物的靶向选择性十分重要。肿瘤细胞中一些酶、肽类转蛋白和抗原的表达量远高于正常的细胞。可以针对过[2]表达的蛋白设计靶向抗癌药物，目前的靶向药物主要有以下几类：1)酶激活前药：包括抗体定向酶前体药物疗法（ADEPT）和基因定向酶前药疗法（GDEPT）;2)靶向配体偶联前药：抗体药物偶联物、叶酸药物偶物、肽药物偶联物;3)裂解酶前药;4)转运体相关的前药。以下将主要介绍前两个部分。1.4.1酶激活前药[19]ADEPT和GDEPT这两种方案都是用抗代谢物和烷化剂来作为母体药物。ADEPT和GDEPT的实例分别见表1-3和表1-4。ADEPT的设计原理是应用与肿瘤中过表达的抗原所对应的抗体。前药是特定酶的底物，给药后，经血液循环到达肿瘤，在肿瘤中经该酶代谢转化为有细胞毒性的母[2]体药物，进而杀死肿瘤细胞。安全有效的ADEPT通常有以下的特点：1)水溶性好，且不容易被细胞所吸收；2)药物能够经血液循环迅速到达肿瘤细胞；3)抗体-酶复合物能够结合癌细胞；4)酶固有活性高；5)前药或母药不能抑制该酶的活性；6)酶的免疫原低。7 第一章序言基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究表1-3：ADEPT应用实例Table1-3SeveralapplicationsofADEPT抗体前药母药靶标BW413依托泊苷的磷酸酯依托泊苷结直肠癌L6丝裂霉素C的磷酸酯丝裂霉素C肺腺癌CEM2314头孢菌素硫酸长春碱硫酸长春碱结直肠癌W14苯甲酸氮芥的谷氨酰胺的衍生物苯甲酸氮芥绒毛膜上皮癌表1-4：GDEPT应用实例Table1-4SeveralapplicationsofGDEPT酶前药母药细胞色素P450酶环磷酰胺，异环磷酰胺磷酰胺氮芥，异磷酰胺氮芥胞嘧啶脱氨酶5－氟胞嘧啶，5－氟尿嘧啶5－氟酰胺5－氯丙啶－2,4－二硝基苯甲酰5－氯丙啶－4－羟胺－2－硝基还原酶基亚胺硝基苯甲酰亚胺目前ADEPT中采用的都是非人源性的酶，人源性的酶不能应用于ADEPT，因为会引起前药在到达肿瘤之前，在其他器官就会转化为具有细胞毒性的母药，这会引发系统毒性。但是非人源性的酶可能会诱导人体的免疫反应，这也是其临床应用的局限[20]性。与ADEPT类似，GDEPT的活化需要两个步骤，外源性酶的基因首先要被转运送至肿瘤细胞，再给予无生物活性的前药，在肿瘤细胞中经该酶转化为有细胞毒性的母[21]药。内源性的酶不能催化GDEPT中外源性酶催化的特定反应，机体能够提供足够的能量将前药转化为母药。这种酶目前可以分为2类：第一类来源于非哺乳动物，如单纯疱疹中提取的胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶，尿嘧啶磷酸核糖转移酶或水痘带状疱疹[22]病毒等，其缺点是会引起免疫原性反应。第二类是来源于人类的酶，但在肿瘤细胞中没有表达或表达量极低，如细胞色素P450酶，这类酶会导致前药在到达肿瘤细胞前，[23,24]在正常的细胞中会转化为有细胞毒性的母药。1.4.2靶向配体结合前药此类前药将肿瘤特异性的抗体片段或单克隆抗体与抗癌药物结合。抗体与抗原识8 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第一章序言别后将药物运送至肿瘤细胞，该偶联物通过受体介导的胞进入至肿瘤细胞内，活性部分在细胞中释放，发挥细胞毒作用。主要的肿瘤特异性抗原有CD19，CD22，CD33，CD56，MUC16，TAG-72，PMSA，HER-2等。应当注意的某些特定的肿瘤上会过表达特定的抗原，例如，前列腺癌的中PMSA会过表达，而卵巢癌中的MUC16是过表[25,26]达的。麦罗塔（Weyth®），是CD33的单克隆抗体与卡奇霉素的偶联物，经FDA批准用[27]于治疗急性髓细胞性白血病。然而，由于该药具有严重的副作用，在2010年退出了[25]市场。1.5结语前药的策略能够改善母药渗透性,提高生物利用度，解决溶解度、稳定性等问题，延缓其快速的代谢，以及提高药物的组织靶向性。随着前药在市场上占得比重越来愈大,前药的开发已成为药物研发中的不可或缺的一部分。尽管如此，安全有效的肿瘤靶向前药还是很少，前药在这方面的设计还有很大的发展空间。1.6本课题的研究思路及研究内容吉西他滨（Gemcitabine,Gemzar®）是EliLily公司设计发明(结构如图1-4所示)，在1996年经FDA批准进入市场。临床常用其盐酸盐注射剂，该药通过抗代谢作用来[28]发挥抗肿瘤效应，主要作用于DNA合成期。临床上单独给药用于治疗非小细胞型肺癌，胰腺癌，也常与紫杉醇和顺铂联合用药。肝脏和血液中大量存在的脱氧胞苷脱氨酶会使吉西他滨脱去4’-氨基生成无活性的产物，从而导致其体内的半衰期很短（<[29]70分钟），需要持续的静脉给药来维持其细胞毒性作用，而这同时也会增加对身体的毒副作用。水溶性的吉西他滨必须通过特定的核酸转运载体才能进入肿瘤细胞，近年来，多种肿瘤对吉西他滨出现了耐药现象，如乳腺癌和胰腺癌，这种现象被证实[30]了正是由于肿瘤中缺乏核酸转运载体所致。基于吉西他滨结构设计的前药，主要在4-N和5-OH这两个位点进行结构修饰。LY2334737是吉西他滨的口服前体药物（结构如图1-5左所示），在4-N位置上连接了酰胺戊二酸，酰胺键能够减少吉西他滨经胞苷脱氨酶的代谢失活。口服LY2334737，该前药在体循环中的时间长达几个小时，此外，LY2334737经羧酸酯酶逐渐代谢生成9 第一章序言基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究[31]吉西他滨，癌细胞暴露于连续有效的细胞毒性水平。目前处于Ⅱ期临床试验。本课题是在吉西他滨的5元糖环上的5’-OH位置上引入磷酸酯长链基团(如图1-5右所示)，共设计合成了5个吉西他滨前药。该修饰增加了化合物的脂溶性，能够改善化合物的膜通透性，可以直接通过被动扩散进入癌细胞，改变母药吉西他滨的细胞转运机制，在一些缺乏核酸转运蛋白的肿瘤中，脂溶性的前药能够通过被动扩散进入肿瘤，进而抑制肿瘤的生长。本文期望通过口服方式给予磷酸酯前药，能够获得较静脉注射吉西他滨盐酸盐更好的抑制肿瘤生长的疗效。NH2OHHClONNOFHOF图1-4：吉西他滨盐酸盐结构式Figure1-4StructureofgemcitabinehydrochlorideNH2ORHNOOHNNONNOOOFFHOHOFFLY2334737R：长链磷酸酯图1-5：吉西他滨前药的化学结构式Figure1-5Structureofgemcitabineprodrugs10 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究2.1实验目的考察前药在体外抑制癌细胞生长的作用，筛选出抑制癌细胞生长活性最强的前药，以及对前药最为敏感的细胞株。模拟吉西他滨耐药细胞株模型，考察前药及吉西他滨细胞毒性的变化。2.2实验部分2.2.1原料与仪器原料：吉西他滨盐酸（纯度高于99%，上海科佳药检器材有限公司）；LY2334737，系列吉西他滨前药标准品由上海鸿博智源有限公司提供，纯度均高99%；MTT（Sigma-Aldrich，美国）；双嘧达莫（纯度≥99%，上海科佳药检器材有限公司）；二甲亚砜（DMSO，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；0.25%胰酶（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；DMEM（Hyclone，美国）；RPMI-1640（Hyclone，美国）；96孔板（Corning，美国）。仪器：细胞培养箱（型号8000，ThermoScientific，美国）；生物安全柜（BSC-1300IIA2，苏净安泰）；酶标仪（BioTek，美国）；-80℃超低温冰箱（ThermoScientific，美国）2.2.2细胞以及细胞培养人胰腺癌细胞株（Panc-1），乳腺癌细胞株（MCF-7，H47D），非小细胞型肺癌细胞株（A549，H460），前列腺癌细胞株（DU145，PC-3），结直肠癌细胞株（HCT-116），卵巢癌细胞株（SK-OV-3），肝癌细胞株（HepG2），皮肤癌细胞株（A431）和宫颈癌细胞株（Hela）均购自中国科学院上海生命科学院细胞库。H460，DU-145，PC-3，MCF-7，H47D，SK-OV-3用含10%FBS的RPMI-1640培养基，其他细胞使用含10%FBS的DMEM培养基，于细胞培养箱内培养，培养箱内恒定37℃，5%CO2饱和湿度。细胞平均1~2天换液，3~4天传代，根据各细胞的状态而定。11 第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究2.2.3溶液配置和稀释精确称量各前药及吉西他滨的粉末，溶解与DMSO，配置成浓度为10mM的储备液，于-20℃冰箱保存。实验时，按照所需浓度用DMSO及细胞培养液进行稀释，现用现配。MTT使用过滤后的无菌磷酸盐缓冲液配置，浓度为5mg/ml，分装后放置于-20℃冰箱保存，备用。双嘧达莫用水配置为10mg/ml的母液，放置于-20℃冰箱备用。2.2.4细胞毒性试验在11种不同的人癌细胞株中初步测定了吉西他滨系列前药抑制癌细胞生长的活性，以吉西他滨为母药对照，LY2334737作为前药的对照，11种癌细胞分别是人胰腺癌细胞株（Panc-1），乳腺癌细胞株（MCF-7，H47D），非小细胞型肺癌细胞株（A549，H460），前列腺癌细胞株（DU145，PC-3），结直肠癌细胞株（HCT-116），卵巢癌细胞株（SK-OV-3），肝癌细胞株（HepG2），皮肤癌细胞株（A431）和宫颈癌细胞株（Hela）。通过MTT试验检测细胞活性。取对数生长期细胞，消化计数，按3000/孔细胞密度接种96孔板，在培养箱中放置过夜。实验设置空白组（溶剂对照组）、调零组及实验组。吉西他滨和吉西他滨前药先经DMSO稀释成相应浓度的工作液，再经培养液稀释给药，保证每孔的DMSO浓度相同(浓度≤0.5%)。每个化合物设置2个浓度：1μM，20μM。癌细胞与待测药物共孵育72小时后，每孔加入20μLMTT（5mg/mL），在细胞培养箱中继续孵育4小时，移除培养液，加入150μL的DMSO溶解活细胞生成的[32]甲瓒，用酶联免疫检测仪测定每孔在490nm波长处的光吸收值。使用公式OD(对照)-OD(测试样品)/（OD(对照)-OD(调零)）×100%计算每孔的细胞增殖抑制率，每组实验均设置3个复孔。在对前药较敏感的癌细胞中，进一步考察吉西他滨和最优前药及对照前药（LY2334737）的半数抑制浓度（IC50）。以1μM，20μM的抑制结果做参照，选定一系列浓度，母液经DMSO稀释至各浓度的工作液，以化合物-3在A549中的IC50为例，1μM的抑制率约50%左右，所以选择的浓度点为：50μM、20μM、5μM、2μM、1μM、0.5μM、0.2μM、0.05μM、0.02μM。工作液浓度：10mM、4mM、1mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、0.04mM、0.01mM、0.004mM，工作液进一步经细胞培养液稀释，加入96孔板。共孵育72小时。其余步骤与上文一致，使用公12 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究式OD(测试样品)（/OD(对照)-OD(调零)）计算每孔的细胞活力。使用Prism.5（GraphPadSoftwareInc.，美国）计算各化合物对不同癌细胞的IC50值，计算方法如下：选择Nonlinearregression（非线性回归）Dose-response-inhibition（剂量-效应-抑制）log(inhibitor)vsresponse-variableslope。[30]吉西他滨能够进入细胞，依赖于核酸转运载体：hENT和hCNT，其中hENT1是介导吉西他滨摄取最重要的核酸转运载体，已有文献报道，细胞膜上缺乏核酸转运蛋白会引起吉西他滨的耐药，若细胞膜中的该核酸转运载体的表达量降低，会严重影[33,34]响吉西他滨的治疗效果。在吉西他滨结构基础上连接长链的磷酸酯，增强吉西他滨的脂溶性，这可能会改变细胞对前药的摄取机制。本文使用hENT1的抑制剂-双嘧达莫，构建模拟的吉西他滨耐药细胞株模型。选用非小细胞型肺癌构建模拟耐药株，取对数生长期细胞，消化计数，按3000/孔细胞密度接种96孔板，在培养箱中放置过夜。实验前，在细胞中预先加入hENT1抑制剂双嘧达莫（4μg/ml）或空白溶剂，放置细胞培养箱孵育30min，随后加入一系列浓度的化合物-3和吉西他滨，72小时后测定IC50值的变化，实验步骤及计算方法均与上文相同。2.3结果与讨论2.3.1吉西他滨及前药对癌细胞生长的抑制作用表2-1所示的结果是在1μM浓度下，吉西他滨、阳性前药LY2334737及5个前药对10种不同癌细胞生长抑制的结果。由表可知，前药对大多数癌细胞的生长都有着明显的抑制作用，其中非小细胞型肺癌（H460，A549），前列腺癌（PC-3，DU145），胰腺癌（Panc-1）和结直肠癌（HCT-116）这六种癌细胞株对前药的敏感性较好，1μM浓度的抑制率几乎超过50%，接近母药吉西他滨，而LY2334737的药效并不强。前药对乳腺癌细胞株、卵巢癌细胞株、表皮癌的抑制强度不如非小细胞型肺癌、胰腺癌和结直肠癌。由结果可知，前药的敏感度有着明显的细胞选择性。表2-2所示的是在20μM浓度的结果，各化合物对癌细胞生长的抑制率随着浓度的增加而增高，浓度依赖性十分明显，证实癌细胞的死亡是由药物的作用所致。13 第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究表2-1吉西他滨，LY2334737和系列前药对各癌细胞生长抑制率（1μM）Table2-1.Gemcitabine,LY2334737andprodrugsanti-proliferationactivityindifferentcelllinesat1μMTumorLungProstatePancreasBreastColonOvarianCervicalCelllineA549H460PC-3DU145Panc-1MCF-7H47DHCT-116SK-0V-3HelaGemcitabine58.8±6.692.5±0.263.6±6.651.1±1.860.4±5.235.9±2.345.7±5.279.3±5.815.7±3.916.8±3.0LY233473713.9±8.950.8±2.52.0±8.6-4.610.0±10.5-6.45.5±10.52.8±7.4-13.5±8.6-15.0±20.7Compound-162.7±3.575.8±0.862.9±6.78.4±12.361.7±2.844.4±2.218.1±2.861.7±4.26.5±6.316.4±8.1Compound-254.5±5.978.5±2.062.0±2.713.1±7.844.9±4.144.7±5.321.6±4.143.1±13.4-2.8±10.12.1±27.4Compound-361.2±10.582.6±0.473.1±2.061.6±4.858.0±6.048.2±0.331.5±6.067.1±8.028.7±1.76.4±7.9Compound-451.9±7.979.5±2.467.7±2.356.0±6.266.9±0.641.9±3.636.7±0.657.8±3.920.2±1.816.9±7.6Compound-530.4±12.485.9±1.451.3±5.844.6±4.264.8±5.744.7±3.236.9±5.759.7±2.71.1±14.2-3.0±26.2表2-2吉西他滨，LY2334737和系列前药对各癌细胞生长抑制率（20μM）Table2-2.Gemcitabine,LY2334737andprodrugsanti-proliferationactivityindifferentcelllinesat20μMTumorNSCLCProstatePancreaticBreastColonOvarianCervicalCelllineA549H460PC-3DU145Panc-1MCF-7H47DHCT-116SK-0V-3HelaGemcitabine87.8±1.294.4±0.286.9±0.784.2±2.375.2±3.656.6±2.486.6±3.683.8±1.877.1±3.940.6±16.4LY233473762.8±3.089.9±0.754.0±6.60.3±5.952.3±8.146.6±4.152.1±8.166.4±5.810.5±10.310.0±4.6Compound-176.9±1.691.8±0.579.2±4.278.5±1.076.8±5.048.0±3.649.8±5.074.8±5.949.1±4.852.3±1.3Compound-264.7±0.889.1±0.780.2±2.681.0±0.959.4±15.455.0±1.948.5±15.474.3±6.044.0±5.237.2±7.3Compound-375.9±0.592.5±0.894.0±1.481.7±1.586.4±3.347.9±4.059.2±3.372.4±1.145.9±2.972.1±0.7Compound-475.7±0.791.7±0.584.2±3.784.3±2.471.0±6.649.2±2.163.6±6.675.2±2.357.5±0.537.9±2.3Compound-583.5±0.693.3±0.684.4±0.582.5±2.378.5±4.851.0±3.877.0±4.882.1±2.164.5±1.635.9±6.114 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究图2-1是将不同化合物在1μM的浓度下对10种癌细胞的生长抑制率取平均值，有图可知，各化合物对癌细胞抑制的强弱：吉西他滨>化合物-3>化合物-4>化合物-1>化合物-5>化合物-2>LY2334737。化合物-3在1μM的细胞毒性作用接近母药吉西他滨，较其他4个前药对大多数癌细胞生长的抑制作用更为明显，所以选择化合物-3作为最优前药，作进一步考察。GemcitabineCompound-3Compound-4Compound-1Compound-5Compound-2LY23347370204060AVEinhibition%at1μM图2-1吉西他滨、LY2334737和前药对10个癌细胞的生长抑制百分比的平均值（1μM）Figure2-1Averageinhibitionrateofgemcitabine,LY2334737andprodrugsin10cancercelllines2.3.2吉西他滨、LY2334737、化合物-3对多种癌细胞的IC50随后在上文提及的6个敏感细胞株：H460、A549、HCT-116、DU145、PC-3、Panc-1中进一步测定吉西他滨，LY2334737和化合物-3的IC50值，结果如表3-3所示。化合物-3在这6种癌细胞中的IC50值均小于1μM，在A549、Panc-1、DU145、HCT-116细胞中，化合物-3与吉西他滨的IC50值相近（在同个数量级上），且明显小于LY2334737，与上部分实验结果很好的对应，在前列腺癌细胞PC-3中，化合物-3的IC50值明显小于吉西他滨，结果提示，在前列腺癌中，化合物-3可能会有优于吉西他滨的治疗效果。在H460中，化合物-3的IC50值高于吉西他滨，前药的设计思路是化合物-3能够水解为活性代谢产物吉西他滨，从而抑制癌细胞的生长，在临床，吉西他滨是非小细胞型肺癌的一线用药，所以非小细胞型肺癌是我们关注的重点。15 第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究表2-3吉西他滨，LY2334737和化合物-3在6个癌细胞中的IC50值Table2-3IC50valuesofgemcitabine,LY2334737andcompound-3in6cancercelllinesIC50(μM)CancercelllineGemcitabineLY2334737Compound-3Lung-3-1H4609.9*10±0.011.6±0.863.0*10±0.20-1-1A5496.0*10±0.2913.9±10.11.7*10±0.08Pancreas-1Panc-11.64±2.20>1009.8*10±2.7Prostate-1-2PC-32.5*10±0.1327.1±7.62.5*10±0.03-1-1DU1454.4*10±0.7551.2±5.71.7*10±0.19Colon-1-1HCT-1162.2*10±0.154.2±1.12.8*10±0.13在H460细胞中加入核酸转运载体的抑制剂-双嘧达莫，模拟耐药细胞株，考察吉西他滨和化合物-3的细胞毒活性的变化，如图2-2所示的是Prism5拟合的IC50曲线，化合物-3在含（黑色虚线标记）或不含（黑色实线标记）抑制剂的情况下，IC50曲线几乎重合，而吉西他滨在有抑制剂（红色虚线标记）情况下的IC50曲线较没有抑制剂（红色实线标记）的IC50曲线明显右移。如表3-4所示的是IC50值的计算结果，吉西他滨组有/无抑制剂的IC50的比值是44.5，而化合物-3的IC50比值仅为1.3。实验结果说明吉西他滨发挥疗效十分依赖转运载体，抑制hENT1载体的活性，吉西他滨的细胞毒作用明显降低，但有无hENT1抑制剂的存在对化合物-3发挥抑制癌细胞的生长作用几乎没有影响。间接说明化合物-3的跨细胞膜转运不依赖hENT1载体，或hENT1介导的药物转运不是最主要的进入癌细胞的方式，化合物-3可以应用于对吉西他滨耐药的肿瘤的治疗。16 基于吉西他滨结构改造的前体药物的体内外抗癌活性研究第二章前药在体外抑制癌细胞生长作用的研究120Compound-3+hENTinhibitorCompound-3100Gemcitabine+hENTinhibitor80Gemcitabine6040Absorbance%200-20246Log(Conc.)图2-2吉西他滨和化合物-3在含/不含双嘧达莫对癌细胞浓度依赖曲线Figure3-2Dose-response-inhibitionofcompound-3andgemcitabineinH460with/withoutthepresenceofDipyridamole表2-4吉西他滨和化合物-3在含/不含双嘧达莫的H460中的IC50值Table2-4IC50valuesofgemcitabineandcompound-3inH460with/withoutthepresenceofDipyridamoleCompound-3GemcitabineDipyridamole+-+-IC50（nM）70.2±6.0554.5±8.75420.8±5.869.45±49.32R0.9970.9690.9740.909吉西他滨及5个系列前药能够显著抑制多种癌细胞的生长，非小细胞型肺癌细胞（H460、A549），胰腺癌细胞（Panc-1），结直肠癌细胞（HCT-116）对前药尤为敏感，化合物-3较其他前药能更有效的抑制癌细胞的生长。在耐吉西他滨癌细胞株中，化合物-3能发挥较吉西他滨强的细胞毒性作用。17 第三章化合物-3体外稳定性的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第三章化合物-3体外稳定性的研究3.1实验目的建立分析吉西他滨和化合物-3的LC-MS/MS分析方法，考察化合物-3在体外代谢体系中的稳定性，化合物-3代谢生成吉西他滨的机制。3.2实验方法3.2.1药品与试剂HumanLiverS9（人肝S9，BDBioscience，美国）；Humanlivercytosol（人肝胞质，BDBioscience，美国）；Alkalinephosphatase（牛小肠碱性磷酸酯酶，Sigma-Aldrich，美国）；人血浆（100mL，Gibico）；比格犬和大鼠血浆自制；磷酸二氢钠，磷酸氢二钠（国药集团）；DMHA（N’N-二甲基己胺，Sigma-Aldrich，美国）；地西泮（纯度>99%，上海科佳药检器材有限公司）。去离子水由上海和泰Master-S超纯水机制备；甲醇（色谱纯，Merck，德国）；乙腈（色谱纯，Merck，德国）；甲酸（Sigma-Aldrich，美国）。3.2.2仪器、色谱、质谱条件仪器：岛津（Shimadzu，日本）高效液相系统：LC-20AD型输液泵，DGU-20A3脱气机，，CTO-20A型柱温箱，Sil-20A型自动进样器CBM-20A控制器；ABSCIEX4000Qtrap质谱仪：Turbo电喷雾离子源（ESI）；平行震荡仪，高速低温离心机（ThermoScientific，美国）。质谱条件：本课题使用API4000Qtrap配备电喷雾离子源（ESI），化合物-3和吉西他滨都是经正离子模式检测。扫描方式为多反应监测（MRM）；扫描时间为100ms。基本质谱参数设置如下：雾化气为55psi；辅助加热气设定为55psi；碰撞气为8psi；气帘气30psi；离子喷雾电压为4500V；离子源温度为450℃；气体供应均为高纯氮气，纯度>99.9%。表3-1为吉西他滨和化合物-3的母子离子对及相应的去簇电压和碰撞能。地西泮是吉西他滨的内标，化合物-3的内标是其结构类似物化合物-2。18 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第三章化合物-3体外稳定性的研究表3-1吉西他滨和化合物-3及相应内标离子对质谱参数Table3-1MSparametersforselectediontransitionsofgemcitabine,compound-3andinternalstandardsAnalytesParentions(m/z)Productions(m/z)DP(V)CE(eV)Gemcitabine264.2112.06724Diazepam285.2193.27631Compound-3652.5344.19326Compound-2640.5246.011233色谱条件：化合物-3使用的色谱柱为VenusilXBPC18柱（2.1mm×50mm，5μm粒径；天津博纳艾杰尔科技有限公司，中国）；柱温设置为40℃；流速0.3mL/min；流动相A为含5mMDMHA（甲酸调pH至6.8）的UP水，流动相B为乙腈；设置的梯度洗脱的条件见表3-2；单个样品分析时间为6min。表3-2化合物-3液相梯度信息Table3-2.Mobilephasefordetectionofcompound-3Time(min）%MobilePhaseB1.0101.5904.5904.6106.0Stop吉西他滨和内标使用VenusilMPC18柱(150×2.1mm，5μm粒径；博纳艾杰尔科技有限公司，中国)分离；柱温为40℃；流速设置为0.2mL/min；流动相A为含5mM乙酸铵的UP水，流动相B为甲醇；液相梯度洗脱的条件见表3-3；单个样品分析时间为8min。19 第三章化合物-3体外稳定性的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究表3-3吉西他滨液相梯度信息Table3-3.MobilephasefordetectionofgemcitabineTime(min）%MobilePhaseB0.551.0953.5953.658.0Stop3.2.3溶液的配置与稀释化合物-3和吉西他滨的储备液配置如上章节所述，肝胞质和肝S9稳定性试验的底物浓度均选用1μM，血浆稳定性的底物浓度选用500nM，碱性磷酸酯酶底物浓度选用10μM，化合物-3储备液经乙腈稀释至各浓度的工作液，备用。3.2.4化合物-3在体外代谢体系中的稳定性在不同物种血浆中的稳定性取不同基质的血浆247.5μL，化合物-3经乙腈稀释至50μM，加入2.5μL的底物启动反应，在37℃水浴中孵育不同的时间，时间点：0，1h，2h，4h，6h，8h。在各时间点取25μL样品，加入四倍体积（100μL）的乙腈（含内标100ng/ml）中终止反应。人肝S9中的稳定性[35]参考文献，按表3-4依次在试管中加入各反应组分，其中肝S9浓度为1mg/ml，底物化合物-3浓度1μM，加入底物启动反应，以卡巴折伦作为阳性对照，底物浓度为1μM，考察酶的活性，在37℃水浴中孵育不同的时间，时间点：0，10，20，30，45，60min。在各时间点取样品25μl，并立即加到四倍体积（100μL）的乙腈（含内标100ng/ml）中终止反应。人肝胞质中的稳定性[35]参考文献，按表3-5依次在试管中加入各反应组分，其中肝胞质浓度为2.5mg/ml，底物化合物-3浓度1μM，加入底物启动反应，在37℃水浴中孵育不同的时20 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第三章化合物-3体外稳定性的研究间，时间点：0、10min、30min、1h、2h、4h。在各时间点取样品25μl，并立即加到四倍体积的乙腈（含内标100ng/ml）中终止反应。牛肠黏膜碱性磷酸酯的代谢稳定性由化合物-3裸鼠体内动力学结果可知（详见第5章节），口服化合物-3后，代谢生成了吉西他滨，但是前药代谢生成吉西他滨的机制尚不清楚，在第一章节中介绍，磷酸酯类前药很多是经碱性磷酸酯酶代谢，而化合物-3是吉西他滨的磷酸酯前药，为验证这一猜想，建立碱性磷酸酯酶体外代谢体系，考察化合物-3在该体系中的代谢。时间依赖实验实验共设置3组：1）正常组，2）加抑制剂组，3）阴性对照（即不加酶组）参[36]考文献，按表3-6依次在试管中加入各反应组分，其中酶蛋白浓度为0.1mg/ml，加入10μM化合物-3启动反应，在37℃水浴中孵育不同的时间，反应时间点：0、5min、10min、15min、30min、60min。在各时间点取样品25μl，并立即加到四倍体积的含混合内标的乙腈中终止反应。酶浓度依赖实验按表2-4加入各反应组分，酶蛋白浓度分别为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2mg/ml，加入加入10μM化合物-3启动反应，在37℃水浴中孵育反应时间为30min和60min，取样品25μl，并立即加到四倍体积的含混合内标的乙腈中终止反应。化合物-3酶促动力学考察按表2-4加各反应组分和辅助因子，其中蛋白浓度为0.1mg/ml，底物浓度分别为5，10，20，50，100，200μM，加入底物启动反应，在37℃水浴中孵育反应时间为60min，取样品25μl，并立即加到四倍体积的含混合内标的乙腈中终止反应。酶促动力学参数的计算使用Prism5（GraphPadSoftwareInc.，美国）计算主要的酶促动力学参数。根据Michaelis-Menten公式（公式2-1）进行计算。公式中，Vmax表示最大反应速率；Km表示反应速率为最大酶促反应速度（Vmax）一半时的底物浓度。(公式2-1)21 第三章化合物-3体外稳定性的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究表3-4化合物-3体外人肝S9孵育体系Table3-4.Incubationsystemofcompound-3inHumanliverS9SystemStockingconcFinalconcVolume(L)PB200mM100mM100Water88HumanliverS920mg/ml1mg/ml10Carbazeran/Compound-3100M1M2Thetotalvolume200表3-5化合物-3体外人肝胞质孵育体系Table3-5.Incubationsystemofcompound-3inHumanlivercytosolSystemStockingconcFinalconcVolume(L)PB200mM100mM100Water73Humanlivercytosol20mg/ml2.5mg/ml25Compound-3100M1M2Thetotalvolume200表3-6化合物-3体外牛肠黏膜碱性膦酸酯酶孵育体系Table3-6.Incubationsystemofcompound-3inalkalinephosphataseSystemStockingconcFinalconcVolume(L)Tris-HCl10mM192/194MgCl2100mM1mM2ZnCl220mM0.1mM1Compound-31mM10M2Inhibitor3mM30M0/2ALP2mg/ml0.1mg/ml1Thetotalvolume2003.2.5样品处理及进样样品经乙腈沉淀蛋白，于平行震荡仪涡旋2min，在4℃，13000rpm离心10min，取上清进行LC-MS/MS分析，进样量为10μl。22 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第三章化合物-3体外稳定性的研究3.3结果与讨论3.3.1色谱条件优化化合物-3的LC-MS/MS方法，选用VenusilXBPC18柱，方法考察初期，尝试多种常用的流动相，但由于化合物-3结构中含有长链磷酸酯，与色谱柱结合比较牢固，难以洗脱。在流动相中加入5mMDMHA，甲酸调pH至6.8（色谱柱的pH范围：2~8）。该流动相可以增强化合物-3的洗脱，能够在合适的时间出峰。如图3-1所示的是化合物-3的典型色谱图。选用化合物-2作为化合物-3的内标，化合物-3和内标的出峰时间分别为3.6-3.7min和3.5-3.6min。两者的结构比较相似，在尝试了不同的梯度条件后，化合物-3与内标仍未实现基线分离，评价两个化合物离子信号，发现化合物-3和内标的离子对不存在交叉干扰，且标准曲线的线性范围良好（1nM~5000nM），所以确定该液相方法为化合物-3的定量方法。图3-1化合物-3及内标的典型色谱图Fig.3-1.Representativechromatogramsofcompound-3andinternalstandards吉西他滨的LC-MS/MS方法，选用VenusilMPC18柱，由于吉西他滨的极性较大，在普通的C18柱中几乎不保留，所以选用150mm色谱柱，低流速，以及在流动相中添加5mM的乙酸铵来增加吉西他滨的保留时间。如图3-2所示的是吉西他滨的典型色谱图，吉西他滨和内标的保留时间分别为4.7-4.8min和5.8-5.9min。该方法峰形、相应信号、分离度、稳定性均良好。经考察后选用该方法为吉西他滨的定量方法。23 第三章化合物-3体外稳定性的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究图3-2吉西他滨及内标的典型色谱图Fig.3-2.Representativechromatogramsofgemcitabineandinternalstandards3.3.2质谱条件优化本实验中，化合物-3和吉西他滨均选择ESI源，在正离子模式下进行检测。通过+母离子扫描，化合物-3和内标（化合物-2）均产生明显的加氢母离子[M+H]，针对该母离子进行子离子的扫描，生成相应的碎片离子，化合物-3和化合物-2的定量离子对分别是m/z640.5→246.0和m/z652.5→344.1，对离子对的CE、DP等质谱参数进行优化，化合物-3的子离子质谱图见图3-3(A)。[37]参考文献，吉西他滨采用正离子模式检测，我们同时考察了正离子和负离子模+式下Q1的信号，正离子模式较负离子模式的响应强，所以选用[M+H]峰，吉西他滨和相应的内标的离子对分别是m/z264.2→112.1和m/z285.2→193.2，对离子对的CE、DP等质谱参数进行优化。图3-3(B)是化合物-3子离子的质谱图。24 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第三章化合物-3体外稳定性的研究(A)(B)+图3-3（A）化合物-3、（B）吉西他滨的[M+H]的子离子质谱图+Fig.3-3.Productionmassspectraof[M+H]ionsof(A)Compound-3,(B)Gemcitabine3.3.3化合物-3在体外代谢体系中的稳定在各种属血浆，人肝S9及人肝胞质中的稳定性化合物-3作为吉西他滨前药的代表，其在不同物种血浆中的稳定性结果如图3-4（A）所示。在37℃水浴的条件下，化合物-3在不同物种的血浆中均十分稳定，在大鼠血浆，比格犬血浆和人血浆中8h的剩余量分别是103.3%，109.8%和129.7%。剩余量超过100%的原因可能是在37℃水分的蒸发导致的。由实验结果可知化合物-3在25 第三章化合物-3体外稳定性的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究血浆中较稳定，样品处理的稳定性得到保障。肝胞质中包含了胆固醇硫酸基转移酶和醛氧化酶等代谢酶，化合物-3在肝胞质中的稳定性如图3-4（B）所示，4小时仅代谢了约20%，且代谢的量不受酶浓度的变化而变化，蛋白浓度为1mg/ml时，4h也是代谢了约20%（数据没有展示），猜测可能是非特异性的吸附导致剩余量的降低。（A）150RatplasmaDogplasmaHumanplasma10050%Remaining00246810Time(h)（B）120Livercytosol9060%Remaining300012345Time(h)（C）26 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第三章化合物-3体外稳定性的研究120Carbazeran100Compound-3806040%Remaining200020406080Time(min)图3-4化合物-3在（A）血浆，（B）肝胞质，（C）肝S9中的稳定性Fig.3-4.Stabilityofcompound-3in(A)plasma,(B)Humanlivercytosol,(C)HumanliverS9肝S9是混合功能氧化酶(mixedfunctionoxidase,MPO)系统，包含了CYP酶、UGT酶、水解酶（CES1，CES2等）、醛氧化酶等。化合物-3在肝S9中的稳定性结果如图3-4（C）所示，阳性对照卡巴折伦在1h内代谢了90%，保证了肝S9的活性。而化合物-3在1h剩余量达95%，几乎没有降解，提示化合物-3可能不是经肝脏代谢。3.3.4化合物-3在牛小肠碱性磷酸酯酶中的代谢时间依赖实验探针底物磷苯妥英能够在该体系中代谢，生成代谢产物苯妥英，该体系能够成功应用于之后的实验。化合物-3在碱性膦酸酯酶中的代谢结果如图3-5和表3-7所示，在37℃水浴的条件下，酶与底物共孵育60min后，3组的化合物-3的剩余量分别是48.9%，62.4%和53.5%。仅从化合物-3的清除结果比较，3组的化合物-3的剩余量没有明显的差异，同时测定代谢产物吉西他滨，结果如图3-6和表3-4所示，只有第一组吉西他滨的生成量随着孵育时间呈线性上升，加碱性磷酸酯酶抑制剂和不加酶的两个实验组并没有明显的吉西他滨的生成。实验结果说明化合物-3能够经碱性磷酸酯酶代谢生成活性代谢产物吉西他滨。27 第三章化合物-3体外稳定性的研究基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究表3-7化合物-3在碱性磷酸酯酶的稳定性Table3-7.Stabilityofcompound-3inalkalinephosphatase%Compound-3RemainingTime(min)(-)Inhibitor(+)Inhibitor(-)ALPAVESDAVESDAVESD0100.011.3100.05.6100.04.7590.512.091.510.089.512.61085.15.787.49.379.00.31572.06.286.78.071.27.63063.07.172.44.674.03.86048.94.762.47.953.57.8120(-)Inhibitor(+)Inhibitor90(-)Negativecontrol6030%Compound-3remaining0020406080Time(min)图3-5化合物-3在碱性磷酸酯酶的稳定性Fig.3-5.Stabilityofcompound-3inalkalinephosphatase表3-8化合物-3代谢生成的吉西他滨Table3-8.Producedgemcitabinebycompound-3Producedgemcitabine(nM)Time(min)Group1Group2Group3AVESTD0HCT-116>PC-3>MCF-7>A549>H47D>HepG2。化合物-3在1μM浓度下对各癌细胞抑制百分比：H460>PC-3>HCT-116>A549>MCF-7>H47D>HepG2（详见表2-1），将两个变量做Pearson相关性分析。结果如图4-3所示，p<0.01，相2关系数R值为0.89，两者之间有着很好的相关性。H460和PC-3中24h细胞内的浓度降低，这部分的化合物-3能够被代谢为吉西他滨或吉西他滨磷酸盐发挥作用，将细胞内外的浓度相加可以间接说明被代谢了的化合物-3的量。与细胞内相对应是细胞内的浓度，结果如图4-2（B）所示。随着时间逐渐降低，在24h，H460细胞外的浓度剩余22.1%，而HepG2细胞外则剩余68.2%。结合细胞内和细胞外的数据，H460在细胞内被代谢了约60%，而HepG2只代谢了不足30%。33 第四章前药癌细胞膜转运机制评价基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究这组结果提示我们几个信息：1）化合物-3可以通过摄取或被动扩散进入细胞，2）进入细胞中的化合物-3的量可能与各癌细胞不同的敏感性相关。3）化合物-3在各癌细胞内的半衰期较长。同时还测定了吉西他滨的细胞内和细胞外的浓度，但是测定的细胞内的浓度几乎都小于20nM，这可能是由于生成的吉西他滨能够迅速的经脱氧胞苷激酶磷酸化生成吉西他滨磷酸盐，有文献报道生成的吉西他滨磷酸盐在细胞中会经脱氧胞苷酸脱氨酶[30]代谢失活。(A)(B)图4-2化合物-3与不同癌细胞孵育不同时间后（A）细胞内和（B）细胞外的浓度（nM）Fig.4-2.(A)Intracellularand(B)Extracellularconcentration(nM)ofcompound-3afterincubatedwithdifferentcelllinesaftervarioustimepoints34 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第四章前药癌细胞膜转运机制评价图4-3化合物-3进入细胞内的浓度百分比与对癌细胞抑制率的相关性Fig.4-3.Correlationofintracellularcompound-3withanti-proliferationactivity化合物-3可以通过被动扩散和主动转运的途径进入细胞，而癌细胞内的化合物-3的浓度可能与各癌细胞对其敏感性的不同相关。与吉西他滨相比，化合物-3在各癌细胞中的半衰期较长。35 第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察5.1实验目的考察化合物-3在动物体内的动力学特性，考察评价不同的口服制剂，为体内药效学的实验提供信息。5.2实验方法5.2.1原料与仪器原料：PEG400（分析纯，国药集团）；HS15（Solutol，Sigma-Aldrich，美国）；24孔板（Corning，美国）；仪器：超声波清洗仪（KS-120EI，宁波海曙科生超声设备有限公司）；其余实验材料与仪器见上述章节。5.2.2动物及动物饲养裸鼠（Balb/cathymicnu+/nu+），雄性，体重18~22g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物饲养于苏州大学SPF实验楼，经过12小时明暗交替的环境饲养。常规进食，饲料经辐照灭菌，饮用水经过酸化。5.2.3化合物-3不同口服制剂的的动力学的考察经过考察，化合物-3能够溶解于EtOH:PEG400:TPGS:F68=5%:55%:10%:25%（口服配方1），DMSO:HS15:PBS=5:15:80（口服配方2），同时考察另一个混悬配方：1%CMC-Na含0.5%Tween80。在同一剂量（20mg/kg）考察三个口服配方。精确称量化合物-3，按上述各配方配置成2.0mg/mL的溶液，给药体积10mL/kg，设置取血时间点0.167h、0.5h、1h、2h、4h、8h。实验前，裸鼠禁食过夜，裸鼠经口服灌胃给药后，按时间点经眼眶后静脉丛取血（约100μL）置于EDTA化的EPo管中。全血在30min内转移至离心机，在4C条件下，以13,000rpm的转速离心10o分钟后，取上清液得到血浆，血浆立即转移至－80C贮藏。给药4小时后，动物恢复供食供水，实验结束后，对动物实施安乐死（劲椎脱臼）。36 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察5.2.4吉西他滨和化合物-3生物利用度的试验将24只雄性裸鼠随机分为4组，每组6只，分为吉西他滨盐酸盐口服组，吉西他滨盐酸盐静脉注射组，化合物-3口服组及化合物-3静脉注射组。实验前，接受口服的小鼠需禁食过夜，给药剂量设置为20mg/kg，给药体积设置为10mL/kg，实验当天，准确称量吉西他滨盐酸盐和化合物-3固体样品，吉西他滨盐酸盐以生理盐水配置成2.0mg/mL（去除盐之后的实际浓度）的溶液。化合物-3按DMSO：HS15：PBS=5:15:80的比例配置为2.0mg/mL的溶液。裸鼠经口服灌胃或尾静脉给药。分别于0.167h、0.5h、1h、2h、4h、8h时经小鼠眼眶静脉丛取血（约100μL），全血置于含EDTA的EP管中。按上节步奏所述离心，储藏血浆。5.2.5血浆样品处理及数据分析血浆样品的处理：取25μL血浆样品（根据样品浓度，可选用空白血浆稀释），加入100μL内标后（吉西他滨内标：地西泮；化合物-3内标：化合物-2），涡旋2mino混合沉淀血浆蛋白，随后于4C离心机以13,000rpm转速离心10min，取出上清液，经LC-MS/MS方法定量。各时间点血浆浓度用WinNolin软件（6.2.1版本，Pharsight，美国），计算药代动力学参数药物半衰期（t1/2），曲线下面积（AUC0－t），血药达峰浓度（Cmax），血药浓度达峰时间（Tmax），和平均滞留时间（MRT）。5.3结果与讨论5.3.1化合物-3不同口服制剂的的动力学的考察裸鼠经口服配方1（化合物-3，10mg/kg）灌胃后，血浆中吉西他滨的Cmax仅为32.6ng/ml（具体数据没有显示），浓度较低，所以淘汰该口服配方。如图5-1所示的是裸鼠给予口服灌胃化合物-3：（A）口服配方2和（B）口服配方3后的时间-浓度曲线。从图中可以看出，化合物-3在体内能够代谢生成母药吉西他滨。且在两种方案下，吉西他滨的浓度始终高于化合物-3。表5-1所示的是WinNolin软件计算的动力学参数（以平均血药浓度计算）。化37 第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究（A）（B）图5-1裸鼠经（A）口服配方2和（B）口服配方3灌胃给药后血浆中化合物-3和吉西他滨的浓度Fig.5-1.Plasmaconcentrationofcompound-3andgemcitabineformationinnudemiceafteroraladministration:(A)Formulation2,(B)Formulation338 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察表5-1裸鼠经不同口服配方灌胃给药后的化合物-3和吉西他滨的主要动力学参数Table.5-1.Pharmcokineticparametersofcompound-3andgemcitabineformationinnudemiceafteroraladministrationFormulation2Formulation3Compound-3GemcitabineCompound-3GemcitabineCmax(ng/ml)56.7390152681Tmax(h)10.510.167AUC(h*ng/ml)148.4581.7314.4886.3t1/2(h)2.71.321.3MRT(h)2.61.51.91.2合物-3的血药浓度都于达峰，口服配方-3所得到的吉西他滨和化合物-3的血药达峰浓度（Cmax）分别为681ng/ml和152ng/ml，而裸鼠经配方2口服灌胃后吉西他滨和化合物-3的Cmax分别为390ng/ml和56.7ng/ml，曲线下面积（AUC0－t）也获得相同的结论，口服配方3的化合物-3及代谢活性产物吉西他滨的血浆曝露量均高于其他两个配方，所以体内药效实验选择1%CMC-Na含0.5%Tween80混悬液的方案。5.3.2吉西他滨和化合物-3的口服生物利用度图5-2所示的为雄性裸鼠口服灌胃和静脉给予吉西他滨后的血浆浓度-时间曲线。尾静脉给予20mg/kg后，吉西他滨在小鼠体内迅速的分布，代谢，由图可观测到血浆中的药物浓度随着时间迅速降低，30min浓度仅为10min的10%左右，2h血药浓度仅为27.1ng/ml，口服吉西他滨组的达峰时间为0.5小时，Cmax为896.0ng/ml，8小时在血浆中几乎已经检测不出吉西他滨（浓度低于1ng/ml）。表5-2所示的是WinNolin软件计算的动力学参数（以平均血药浓度计算）。由表[30]可知，吉西他滨的半衰期均小于1小时，与文献的报道一致，吉西他滨在裸鼠体内被快速的清除，肝中和血液中大量存在的胞苷脱氨酶能够代谢吉西他滨，与实验结果相符合，所以吉西他滨的口服生物利用度仅为24.8%。39 第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究100000PO10000IV1000100Conc.(ng/ml)1010246810Time(h)图5-2裸鼠经口服和静脉给予吉西他滨后血浆中的浓度-时间曲线Fig.5-2.Plasmaconcentrationofgemcitabineinnudemiceafteroralandintravenousadministration表5-2裸鼠口服和静脉给予吉西他滨后的主要动力学参数Table.5-2.PharmcokineticparametersofgemcitabineinnudemiceafteroralandintravenousadministrationParametersIntravenousgroupOralgroupCmax(ng/ml)11070±2047.1896±367.1Tmax(h)0.5AUC(h*ng/ml)3565.1884.7t1/2(h)0.80.6MRT(h)0.30.7Bioavailability24.8如图5-3所示的是裸鼠经口服（A）和静脉（B）给予化合物-3后的血浆浓度-时间曲线。在各时间点下均能测得化合物-3和其代谢生成的吉西他滨，口服后化合物-3和吉西他滨分别于1小时和30分钟到达Cmax，尾静脉给予化合物-3后，代谢生成的吉西他滨于1小时到达Cmax，为332ng/ml。表5-2所示的是WinNolin软件计算的给予化合物-3后生成的吉西他滨的动力学参数（以平均血药浓度计算）。化合物-3口服组生成的吉西他滨的AUC0－t是350.0h*ng/ml，尾静脉给予化合物-3所生成吉西他滨的AUC0－t为744.2h*ng/ml，生成吉西他滨的相对生物利用度为47.0%(相对生物利用度=AUCpoproducedgemcitabine/AUCiv40 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察producedgemcitabine×100%)，较吉西他滨的生物利用度高。且吉西他滨在体内的平均滞留时间（MRT）均大于1小时，较直接给予吉西他滨的MRT有所延长。（A）PO500Compound-3400Gemcitabineformation300200Conc.(ng/ml)100002468Time(h)（B）IV100000Compound-310000Gemcitabineformation1000100Conc.(ng/ml)1010246810Time(h)图5-3裸鼠经口服（A）和静脉（B）给予化合物-3后血浆中化合物-3和吉西他滨的浓度-时间曲线Fig.5-3.Plasmaconcentrationofcompound-3andgemcitabineformationinnudemiceafter(A)oraland(B)intravenousadministration41 第五章化合物-3的裸鼠体内动力学的考察基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究表5-3裸鼠口服和静脉给予化合物-3后生成的吉西他滨的主要动力学参数Table.5-3.Pharmcokineticparametersofproducedgemcitabineafteroralandintravenousadministrationofcompound-3ProducedgemcitabineParametersIntravenousgroupOralgroupCmax(ng/ml)235±82332±90.5Tmax(h)1.00.5AUC(h*ng/ml)744.2350.0t1/2(h)1.70.8MRT(h)2.31.1Relativebioavaibility47.042 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第六章化合物-3的体内药效实验第六章化合物-3的体内药效实验6.1实验目的建立非小细胞型肺癌的肿瘤模型，考察化合物-3通过口服给药，在体内的抑制肿瘤生长的作用，且以腹腔注射吉西他滨作为阳性对照。6.2实验方法6.2.1动物及动物饲养裸鼠（Balb/cathymicnu+/nu+），雌性，5~6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物饲养于苏州大学SPF实验楼，经过12小时明暗交替的环境饲养。进食辐照灭菌的饲料和酸化水。6.2.2非小细胞型肺癌H460肿瘤模型的建立建立非小细胞型肺癌H460皮下肿瘤模型，30只雌性裸鼠，5~6周龄，每只裸鼠6接种5×10癌细胞，实验当天收集细胞（细胞最好在对数生长期，培养瓶内细胞生长密度约80%左右），经无菌的PBS清洗2遍，用4%Trypanblue（4%台盼蓝）进行细胞活力计数，测定的细胞活力需在90%以上，经无菌PBS清洗两次后，离心后弃上清液，癌细胞悬浮于不含胎牛血清的RPMI-1640培养液中，调整细胞密度至57×10cells/mL。细胞置于冰上，于1小时内完成接种，肿瘤细胞接种于裸鼠右侧前肢的位置，皮下注射100μL。小鼠接种后需每天观察，直至肿瘤模型成功建立。6.2.3化合物-3和吉西他滨对非小细胞型肺癌肿瘤的抑制作用3当小鼠的肿瘤体积达到100~200mm，将肿瘤小鼠随机分配为4组，组间的肿瘤体积差异不超过10%。分别为口服空白辅料对照组（1%CMC-Na含0.5%Tween80）：[38]每天一次给5天停2天；吉西他滨腹腔注射组：80mg/kg，每周2次，共给药4次；化合物-3口服组：10mg/kg，10ml/kg，每天一次，给5天停2天，共给药10次；化合物-3口服组：40mg/kg，每周2次，共给药4次，实验周期为2周。每周至少2次2测量小鼠的体重及肿瘤的大小的变化，肿瘤大小使用公式V=（a×b）/2计算，a是43 第六章化合物-3的体内药效实验基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究肿瘤测量的长径，b是短径。实验结束后，每只小鼠实施安乐死，收集肿瘤样本并称重。肿瘤抑制生长率=（空白辅料组-实验组的瘤重）/与空白辅料组的瘤重×100%。6.3结果与讨论6.3.1化合物-3和吉西他滨对非小细胞型肺癌肿瘤的抑制作用在此之前的预实验中，每天给予40mg/kg的化合物-3，小鼠都于第4天死亡，这可能与前药在肿瘤细胞内的半衰期有关，如第4章节中的实验结果，在H460细胞中，24h细胞内的剩余量约20%，若每天给药，化合物-3会在体内蓄积，从而产生毒性。耐受性试验可得40mg/kg一周2次，小鼠可以完全耐受，所以选择40mg/kg每周2次的给药方案。小鼠接种H460细胞后3~4天，肿瘤细胞逐渐形成肿瘤小块并迅速增长，第5天3小鼠的肿瘤体积达到100~200mm，肿瘤形状规律，大小均一，与文献报道的成瘤时[39]间相近，非小细胞型H460皮下瘤模型成功建立。去除肿瘤生长差异大的小鼠后，将肿瘤小鼠随机分为4组，按上述的方案分组给药。在肿瘤小鼠中，化合物-3和母药吉西他滨在体内抑制肿瘤生长的作用，如图6-1（A）所示的是给药期间各组的肿瘤生长曲线，给药后第三天，各实验组与空白组的肿瘤大小就存在明显的差异。空白组的肿瘤体积随着时间迅速的增长，口服化合物-3和腹腔注射吉西他滨盐酸盐都能明显减缓肿瘤的生长。在测量肿瘤体积的同时，观察小鼠的状态和体重，体重减少是全身毒性的表征之一。连续5天口服给予10mg/kg化合物-3后，小鼠状态不如其他给药组，体重明显降低，与空白辅料组的最大体重差接近20%，该组停止给药，其他各组正常给药。从肿瘤的体积变化可知，经过2周的治疗后，腹腔注射吉西他滨，口服化合物-3都能显著抑制肿瘤的生长。图6-1（C）所示的是实验过程中，各组小鼠体重的变化。如上文所述，10mg/kg连续给药5天后，小鼠体重明显的降低，每周2次口服化合物-3（40mg/kg）组及腹腔注射吉西他滨盐酸盐（80mg/kg）组小鼠耐受性较好，体重降低并不明显。口服化合物-3（40mg/kg）组与腹腔注射吉西他滨组的小鼠体重相比，没有明显的差异（p>0.05）。实验周期为2周，实验结束后，对肿瘤小鼠实施安乐死（颈椎脱臼），剥离肿瘤，如图6-1（B）所示各组的肿瘤。各组肿瘤称量后总结于表6-2，腹腔注射吉西他滨，44 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第六章化合物-3的体内药效实验口服化合物-3都能显著抑制肿瘤的生长，与空白辅料组相比，腹腔注射吉西他滨（80mg/kg）的肿瘤生长抑制率是61.1%，口服组化合物-3（40mg/kg）组的抑制率是65.1%，口服10mg/kg组的抑制率是71.4%，实验组肿瘤大小与空白组的大小有显著性差异（p<0.01）。（A）Control,Q1D*10,oral1500)10mg/kgcompound-3Q1D*5,oral340mg/kgcompound-3Q3D*4,oral100080mg/kggemcitabineQ3D*4,i.p500TumorVolume(mm0051015Daysafterstartingdrugtreatment（B）（C）24Group-1Group-220Group-316Group-41284Micebodyweight(g)0051015Dayspost-implantationGroup-1:Vehicle,Group-2:Compound-3(10mg/kg)45 第六章化合物-3的体内药效实验基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究Group-3:Compound-3(40mg/kg),Group-4:GemcitabineHCl(80mg/kg)图6-1（A）化合物-3和吉西他滨在非小细胞肺癌H460模型中的肿瘤生长曲线（B）实施安乐死后，各组肿瘤的大小及称重（C）给药后肿瘤小鼠的体重曲线Fig.6-1.(A)Antitumorefficacyofcompound-3andgemcitabineHClinNSCLCH460modelsand(B)Aftersacrifice,thetumorswereweighed(C)Micebodyweightaftertreatment体内药效实验结果表明化合物-3有口服抗癌活性，能够显著抑制非小细胞型肺癌H460皮下瘤的生长，每周两次口服（40mg/kg）小鼠可以完全耐受，安全且有效。化合物-3可以作为口服制剂进一步的开发。46 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第六章化合物-3的体内药效实验表6-2化合物-3和吉西他滨在非小细胞肺癌H460模型中抑制肿瘤生长的结果Table6-2Theinhibitioneffectsofcompound-3andgemcitabineonthegrowthofhumanNSCLCH460xenograftsinmiceBodyweirht(g)TumorDosingDoseTumorweightCelllineCompoundFrequency(initial/ultimategrowthpvalueRoute(mg/kg)(mean±SD,g)day)inhibition(%)ControlOral0Q1D×10doses17.1±0.9/19.3±1.50.933±0.39Gemcitabinei.p.80Q3D×4doses17.2±1.1/16.7±1.70.363±0.2461.10%0.002**H460Compound-3Oral10Q1D×10doses17.0±0.8/16.7±2.40.267±0.1671.40%0.001**Oral40Q3D×4doses17.2±1.3/16.7±1.40.325±0.1765.20%0.002**Bodyweightwasmeasuredbeforeandafterdrugadministration**p<0.01vsvehiclecontrol47 第七章总结与展望基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第七章总结与展望7.1总结本课题设计了一系列基于吉西他滨结构改造的前药，在糖环的5’-OH连接了不同的磷酸酯的长链，体外部分细胞毒性实验结果显示5个吉西他滨的前药都能够明显抑制多种癌细胞的生长，其中非小细胞型肺癌细胞（H460，A549），胰腺癌细胞（Panc-1），前列腺癌细胞（DU145，PC-3），和结直肠癌细胞（HCT-116）对前药都非常敏感。化合物-3较其他前药能够更有效的抑制多种癌细胞的生长，因此，选择化合物-3做进一步考察。化合物-3对上述6个癌细胞中的IC50值均小于1μM，化合物-3在HCT-116和Panc-1中的IC50值与吉西他滨相近，在PC-3，DU145细胞中化合物-3较吉西他滨IC50值低，能够更有效的抑制肿瘤细胞的生长。在模拟的吉西他滨耐药株中，吉西他滨的IC50值升高了44.5倍，而化合物-3升高1.3倍，化合物-3可应用于对吉西他滨耐药的肿瘤。化合物-3可经碱性磷酸酯酶代谢生成活性代谢产物吉西他滨，在肝脏中的代谢很少。化合物-3可以通过被动扩散和主动转运进入细胞，同等条件下，前药进入敏感细胞株的浓度高于不敏感株的浓度，细胞内的前药浓度与各癌细胞生长的抑制率有明显2的相关性（R=0.89）。1%CMC-Na含0.5%Tween80的混悬剂为筛选出最佳的口服制剂，该配方进一步应用于体内药效的实验。选择非小细胞型肺癌H460作为异种移植的肿瘤模型。体内药效的实验结果：与空白辅料组相比，每周两次口服化合物-3（40mg/kg）能够明显抑制肿瘤的生长，较高剂量腹腔注射吉西他滨（80mg/kg）抑制肿瘤生长的效果更好。基于体外和体内的实验结果，化合物-3能够作为口服制剂进一步开发应用于治疗非小细胞型肺癌，通过口服给药可以为患者带来便捷，提高患者的顺应性。7.2展望本课题考察了吉西他滨前药的体内外抗癌活性，体外稳定性，药代动力学特性，并初步的研究了化合物-3进入癌细胞的机制，及化合物-3的口服抗肿瘤活性。将继续48 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究第七章总结与展望考察以下几个方面：（1）体外转运机制的研究，介导化合物-3的摄取转运体的鉴定（2）构建耐吉西他滨细胞株，建立耐药肿瘤模型，考察化合物-3对耐药肿瘤的活性（2）化合物-3进一步成药性（安全性、制剂等）考察本课题应用前药策略，基于吉西他滨的结构合成了系列前药，该前药具有口服抗肿瘤活性，较高剂量腹腔注射吉西他滨疗效更好，可进一步考察该前药的成药性。49 参考文献基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究参考文献1.Rautio,J.,etal.,Prodrugs:designandclinicalapplications.NatRevDrugDiscov,2008.7(3):p.255-70.2.Zawilska,J.B.,J.Wojcieszak,andA.B.Olejniczak,Prodrugs:achallengeforthedrugdevelopment.PharmacolRep,2013.65(1):p.1-14.3.Stella,V.J.,Prodrugs:Somethoughtsandcurrentissues.JPharmSci,2010.99(12):p.4755-65.4.Simplicio,A.L.,J.M.Clancy,andJ.F.Gilmer,Beta-aminoketonesasprodrugswithpH-controlledactivation.IntJPharm,2007.336(2):p.208-14.5.Majumdar,S.andK.B.Sloan,Synthesis,hydrolysesanddermaldeliveryofN-alkyl-N-alkyloxycarbonylaminomethyl(NANAOCAM)derivativesofphenol,imideandthiolcontainingdrugs.BioorgMedChemLett,2006.16(13):p.3590-4.6.Liederer,B.M.andR.T.Borchardt,Enzymesinvolvedinthebioconversionofester-basedprodrugs.JPharmSci,2006.95(6):p.1177-95.7.Ecobichon,D.J.,Cytoplasmiccarboxylesterasesofhumananddomesticanimalliver:aggregation,dissociation,andmolecularweightestimation.CanJBiochem,1972.50(1):p.9-15.8.Beaumont,K.,etal.,Designofesterprodrugstoenhanceoralabsorptionofpoorlypermeablecompounds:challengestothediscoveryscientist.CurrDrugMetab,2003.4(6):p.461-85.9.McComb,R.B.andG.N.Bowers,Jr.,AlkalinephosphataseandtheInternationalClinicalEnzymeScale.AmJClinPathol,1985.84(1):p.67-73.10.Heimbach,T.,etal.,Enzyme-mediatedprecipitationofparentdrugsfromtheirphosphateprodrugs.IntJPharm,2003.261(1-2):p.81-92.11.Potter,P.M.andR.M.Wadkins,Carboxylesterases--detoxifyingenzymesandtargetsfordrugtherapy.CurrMedChem,2006.13(9):p.1045-54.12.Sanghani,S.P.,etal.,Hydrolysisofirinotecananditsoxidativemetabolites,7-ethyl-10-[4-N-(5-aminopentanoicacid)-1-piperidino]carbonyloxycamptothecinand7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-amino]-carbonyloxycamptothecin,byhumancarboxylesterasesCES1A1,CES2,andanewlyexpressedcarboxylesteraseisoenzyme,50 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基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究参考文献38.Pratt,S.E.,etal.,HumanCarboxylesterase-2HydrolyzestheProdrugofGemcitabine(LY2334737)andConfersProdrugSensitivitytoCancerCells.ClinicalCancerResearch,2013.19(5):p.1159-1168.39.Zhao,C.R.,etal.,SynthesisandBiologicalEvaluationofOralProdrugsBasedontheStructureofGemcitabine.ChemicalBiology&DrugDesign,2012.80(3):p.479-488.53 缩略语说明基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究缩略语说明缩写英文全称中文名称抗体定向酶前体药物ADEPTAntibody-directedenzymeprodrugtherapy疗法ALPAlkalinePhosphatase碱性磷酸酯酶AUCAreaundertheconcentration-timecurve曲线下面积CDACytidinedeaminase胞苷脱氨酶CNTConcentrativenuclesidetranspoter集中核苷转运蛋白dCKDeoxycytidinekinase脱氧胞苷激酶dFdCDPGemcitabinediphosphate吉西他滨二磷酸盐dFdCMPGemcitabinemonophosphate吉西他滨单磷酸盐dFdCTPGemcitabinetriphosphate吉西他滨三磷酸盐DMHAN,N-dimethylhexylamineN,N-二甲基己胺ENTEquilibrativenuclesidetranspoter平衡型核苷转运蛋白ESIElectrosprayionization电喷雾离子化基因定向酶前体药物GDEPTGene-directedenzymeprodrugtherapy疗法HPLCHighperformanceliquidchromatography高效液相色谱IC50Halfmaximalinhibitoryconcentration半数抑制浓度Liquidchromatography-tandemmassLC-MS/MS液相色谱-串联质谱spectrometryMRTMeanresidencetime平均驻留时间3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-MTT噻唑蓝H-tetrazoliumbromidem/zMass-to-chargeratio质荷比NSCLCNonsmallcelllungcancer非小细胞型肺癌t1/2Halflife半衰期54 基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究攻读学位期间发表的论文及专利攻读学位期间发表的论文及专利攻读学位期间发表发表的论文[1]HeG,QiH,WangM,YangJ,WenF,WangW,QiaoC,ZhangH.LC-MS/MSmethodforthesimultaneousquantitationofthreeactivecomponentsderivedfromanovelprodrugagainstschistosomeinfection.JPharmBiomedAnal.2013Sep;83:186-93.[2]WangM,LuJ,LiJ,QiH,WangY,ZhangH.SteviolglucuronidationanditspotentialinteractionwithUDP-glucuronosyltransferase2B7substrates.FoodChemToxicol.2014Feb;64:135-43.[3]WangY,WangM,QiH,PanP,HouT,LiJ,HeG,ZhangH.Pathway-dependentinhibitionofpaclitaxelhydroxylationbykinaseinhibitorsandassessmentofdrug-druginteractionpotentials.DrugMetabDispos.2014Apr;42(4):782-95.[4]ZhuJ,WangM,YuY,QiH,HanK,TangJ,ZhangZ,ZengY,CaoB,QiaoC,ZhangH,HouT,MaoX.AnovelPI3KinhibitorPIK-C98displayspotentpreclinicalactivityagainstmultiplemyeloma.Oncotarget.2015Jan1;6(1):185-95.[5]QiH,LuJ,XuY,LiJ,WangM,WangY,ZhangH.Invitroandinvivoanti-proliferationacticityofphosphateestergemcitabineprodrugs.(Inpreparation)攻读学位期间的专利吉西他滨磷酸酯前体药物的制备及其应用(撰写中)国内会议摘要QiH,LuJ,LiJ,XuY,WangY,ZhangH(2015)InhibitionofH460TumorstGrowthbyaGemcitabineProdrug.The1SunriseSymposiumfordrugmetabolism,pharmacokinetics,andDynamic,SSDMPD2015(AbstractandPoster).Nanjing,China.QiH,LiJ,WangM,LuJ,ZhangH(2014)Invitroandinvivoanti-proliferationthacticityofgemcitabineprodrugs.The5AsiaPacificRegionalISSXMeeting,APISSX2014(AbstractandPoster).Tianjin,China.55 致谢基于吉西他滨结构改造的前体药物其体内外抗癌活性的研究致谢三年的时间过得比想象中的快了许多，在论文完成之际，首先我衷心感谢敬爱的导师—张洪建教授。回首刚来到实验室时，老师教导我们严谨细致地做科研，开心的体验研究生生活，老师对科研认真和执着的态度一直影响着我。本课题从选题立项，实验设计，论文的撰写与修改，都凝聚着老师的智慧和心血。老师创造了良好的实验环境，以高度的责任和渊博的知识在学术思想和科研方法上给予诸多指导，教导我遇到问题要学会冷静的分析思考。在生活中，作为整个课题组的大家长，他还给予我很多鼓励和关怀，更是以切身的经历教导我如何成为“Afullgrownman”，那就是对待任何人都要真诚，也正是他的这种态度和人格魅力，赢得了我们所有人的尊敬，这两个字我已铭记在心，老师的教导，使我受益终身。感谢课题组汪维鹏副教授，您对科学严谨的态度，对学生的关怀让我敬佩，感谢贵春山副教授在实验过程提供的宝贵意见，感谢阮建清老师，教导我思考远比埋头苦干有效率的多，感谢您们在实验过程和生活上提供的宝贵意见，我会永远铭记在心。感谢李佳俊同学在实验部分的提供的帮助，你的激励和关怀让我倍感温暖！感谢王美玉师姐在学习和生活中的帮助，你的热情和笑容时常感染着我，感谢王业东同学，你的严谨的态度是我学习的榜样，感谢可爱的师弟师妹徐云婷、卢葭、袁媛、李远以及课题组的所有成员给予我家人的温暖。感谢我的家人和朋友对我学业和生活上的支持和鼓励，你们的爱让我的生命中充满了快乐！感谢所有关心和帮助过我的人，向你们表示最诚挚的谢意！56 '