bcl-2蛋白抑制剂z24结构改造物的设计、合成与筛选

'广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选姓名：唐满平申请学位级别：硕士专业：应用化学指导教师：王立升;郑志兵20060530 BcI-2蛋白抑制剂z24结构改造物的设计、合成与筛选摘要恶性肿瘤是威胁人类健康与生命的重大疾病之一，其发病率和死亡率逐年升高，而目前临床仍然缺乏非常有效的药物。近年来的研究发现肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致，调控细胞凋亡成为了当今抗肿瘤药物设计的一个全新靶点。细胞凋亡受体内外多因素调控，其中bc|-2基因(B淋巴细胞基因-2)及其相关蛋白是目前一致公认的细胞凋亡调节者。bcI-2基因在许多肿瘤细胞都高表达，其基因产物Bcl_2蛋白阻止细胞凋亡是肿瘤发生和耐药形成的重要原因之一。由于bc|-2基因只在肿瘤细胞中高效表达，且其生物学功能在正常细胞中不是绝对需要的．因此，拮抗BcI_2蛋白功能的抑制剂将可能没有或只有极小的毒副作用。z24是通过基于BcI-2蛋白结构的计算机虚拟药物筛选和结构优化得到的一个Bc卜2蛋白抑制剂，体内和体外活性测试结果表明，Z24对Bc卜2(B细胞淋巴瘤)和VEGF(tin管内皮生成因子)具有双重的抑制作用。它对多种肿瘤动物模型均具有显著的体内抑瘤活性，对血管内皮细胞有选择性抑制作用，并明显抑制鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管的生成。 Z24本研究通过分析Z24与BcI_2蛋白的相互作用特点j113BcI-2蛋白活性中心对配体的要求，对Z24进行了结构改造设计，并对部分结构改造物进行了合成，共合成目标物40个，其结构都经过1HNMR、MS等测试方法确证，部分化合物还通过元素分析测试。药理实验结果表明，目标化合物中TMP-9，TMP-20，TMP-22，TMP-23，TMP一29，TMP一31，TMP-37共7个化合物选择性较好且毒性较低，具有I；1：1j13性对照Z24相当或更好的选择性。其中TMP一9，TMP一22，TMP一31表现出相当好的选择性，有望成为新的BcI_2蛋白有机小分子抑制剂。关键词：抗肿瘤药物，BcI--2，Z24，细胞凋亡，结构改造，抑制剂II Design，SynthesisandScreeningoftheDerivativesoftheCompoundZ24astheinhibitorofBcl一2ProteinABSTRACTDespitetheprogressinbasicandclinicmedicalsciences，cancerisstillthesecondmostfrequentcauseofdeathintheworld．Traditionaltreatmentsofcanceroftenhavestrongsideeffects．Recently,thestudiedinoncologyrevealedthatapoptosisWasinvolvedintumorgenesisandmulti—drugresistanceincancertreatment．Thefindingsindicatethatblockingoftheapoptosis-inducingpathwaycouldbeanothermechanismformulti·drugresistance(MDR)．TheregulationofapoptosishasbeenbecomeanoveltargetforanticancerdrugdesignBcl一2protein，abcl一2geneproduct，isa25KDamembraneproteinthatpreventscellapoptosisisoverexpressedinmanyhumancancersBcl一2’Sover-expressionisassociatedwithtumordevelopmentorprogressionandresistancetochemo—andradiotherapy．Becausethebcl-2geneisonlyover-expressediIltumorcellsanditsfunctionisnotnecessaryinnormalcells，thebcl-2inhibitormayhavenoorlowertoxicsideeffectonnormalcells．Z24isaspecificandeffectiveinhibitoroftheBcl-2protein．Theresults，／nvitroandinvivo,showedthatZ24hadgoodeffectofIlI anticancerandinducingapoptosis．ItshowedthedoubleinhibitiontoBcl．2andVEGF．Z24Inthisstudy,aseriesofBcl-2inhibitorcompoundsweredesignedaccordingtothestructuralcharacteristicsoftheZ24andtherequiredoftheBcl-2protein’Sactivecentertoitsligand．40compoundsweresynthesized．Structuresofthesecompoundswereidentifiedby1HNMR,MSandelementaryanalysis．Accordingtotheobservedresults，7compoundsshowedgreaterpotentialactivitiesthanZ24inoverexpressiveBcl-2Helacelllines．Amongthesecompounds，compoundTMP．9，TMP·_22andTMP-·31showedattractiveselectivity,whichdeservedgreaterstudy．KEYWORDS：anti-tumordrug；apoptosis；Z24；Bcl一2；derivatives；inhibitorIV mI：毫升h：小时mol：摩尔符号说明rain：分钟℃：摄氏度g：克 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选1．1Bc卜2蛋白家族第一章前言B细胞淋巴瘤／白血病一2(Bcl一2)基因于1984年FhTsujimoto首先发现【”。1988年试验报告Bcl一2基因可使细胞存活时间延长。1990年进一步确i正Bcl一2基因具有抗细胞凋亡的功能后，Bcl一2基因作为重要的凋亡抑制基因，在多种肿瘤中得到研究。现已发现的Bcl一2家族的系列成员包括抑制细胞凋亡的Bcl一2、Bcl—xl、Bcl—W、A1、Mct一1、Bfl一1、Survivin。1等：促进细胞凋亡的Bcl—XS、Bax、Bad、Bak、Bim、Hrk、Puma等【3，4】。虽然该家族内各成员在不同组织中表达各不相同，但他们在结构上有共同之处：一是在碳端有一疏水跨膜结构域(TM)，决定蛋白的亚细胞(BHl一BH4)，其中阴l和BH2为他们所共有，参与Bcl一2家族成员的二聚化；BH3结构域是Bcl一2家族成员促凋亡活性不可缺少的；实验证实，缺乏BH4或含突变BH4的Bcl一2突变体均不能阻止细胞凋亡，因此认为BH4结构域是Bcl一2家族成员抗凋亡活性所必需的。Bcl一2基因定位于人染色体，18q21．3由230kb组成，含三个外显子，3’和5’端分别有5．3kb和1．4kb的非翻译片断。正常情况下，不表达或低表达旧。1．2肿瘤与BeI-2蛋白恶性肿瘤是人类三大死亡原因之一。据世界卫生组织调查，目前全世界每年有1000万人患恶性肿瘤，710万人死亡。据有关专家预测，到2020年，每年新发恶性肿瘤病人将达到2000万。我国卫生部去年对国内死亡率最高的前五位疾病进行排名，恶性肿瘤名列首位，恶性肿瘤致死人数占总疾病死亡人数的24．39％。全国每年新发恶性肿瘤患 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选者200万人，死于恶性肿瘤的人数达150万。基于以上所述的现实，各国政府，研究机构和制药公司长期以来一直对抗肿瘤药物开发予以高度重视和投以巨资，肿瘤治疗也得到不断发展。肿瘤化学治疗(以下简称化疗)是肿瘤治疗的三个基本手段之一，用于肿瘤治疗药物经过50多年的发展，已取得了巨大的成就，获得了一大批不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但遗憾的是它们都有不同程度的毒副作用，因而在临床上使许多病人不能坚持连续接受治疗；另外，化疗耐药和肿瘤转移是目前抗肿瘤药物研究的另一个重要问题，肿瘤抗药性和肿瘤转移性的产生，常常使肿瘤治疗达不到预期的效果。因此，如何解决抗肿瘤药物的毒副作用和耐药问题，以及如何阻止肿瘤转移成为当今抗肿瘤药物研究的焦点。近年来，分子肿瘤学和分子药理学的发展使肿瘤发生的本质得以逐步阐明：大规模快速筛选、组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程；抗肿瘤药物的研究与开发已进入一个崭新的时代。目前或在相当一段时期内，传统细胞毒性药物仍将是肿瘤药物治疗的主体，细胞毒性药物的主要缺陷是对实体瘤疗效差，不良反应大，易产生耐药性。近年来的l临床医学研究结果证实，肿瘤发生是细胞增殖与凋亡失衡所致；肿瘤化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡途径受阻为肿瘤产生耐药的重要原因之一。因此，调控细胞凋亡成为当今抗肿瘤药物设计的一个新靶点。细胞凋亡受细胞内外多因素调控，其中Bcl-2基因(B淋巴细胞基因-2)及其相关蛋白是目前一致公认的细胞凋亡调节者，Bcl一2基因在许多肿瘤细胞都高表达，其基因产物Bcl一2蛋白阻止细胞凋亡是肿瘤发生和耐药形成的重要原因之一。由于Bcl一2基因只在肿瘤细胞中高效表达，且其生物功能在正常细胞中不是绝对需要的，因此，拮抗Bcl一2蛋白功能的抑制剂将可能对正常细胞没有或只有极小的毒副作用。1．3Bc卜2蛋白的肿瘤调节机制Bcl一2蛋白由224个氨基酸组成，包括4个保守的功能区BHl、BH2、BH3和BH4[2]。它通过与Bax等促细胞凋亡蛋白进行蛋白相互作用来发挥控制细胞凋亡的功能【3】。生物学实验已经证实，凋亡拮抗蛋白(如Bcl一2)和凋亡激活蛋白(如Bax)形成异二聚体或同二聚体调节两者之间的平衡。Bcl一2和Bax蛋白间的这种 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选平衡是细胞接受死亡信号后是否进行凋亡的一个检查点(Checkpoint)(见图1—1)【4】。当Bcl一2与Bax之间的杂二聚被打破时，Bcl一2的保护功能也就消失，这表明Bcl一2必须与Bax结合才能产生作用。在Bcl一2的BHl和BH2上进行定点致突变结果表明，这两个区域对Bcl-2与Bax结合是重要的。BHl上的单个氨基酸glyl45被alanin或者glutamic取代和BH2上的grpl88被alanin或者glutamic取代和BH2上的grpl88被alamine取代后将完全破坏Bcl一2与Bax结合而使其失去凋亡抑制作用【5】。当Bcl-2超量表达时，它与Bax杂二聚，死亡得到抑制13】。因此，Bcl一2与Bax的比例决定了Bcl一2／Bax杂二聚与Bax／Bax同二聚的数量，同时决定细胞死亡的敏感性。图卜1Bcl一2蛋白家族相互作用模型图Figure1—1．ModelforBcl一2familyproteininteraction可以设想，通过调节这些成员之间的比率来改变死亡域值，在理论上应该影响癌症治疗的结果。例如，能够选择性地打开二聚体的小分子也许能加速肿瘤细胞的凋亡和增加化疗的敏感性。 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选，1．4BcI一2蛋白抑制剂Z24的发现郑志兵博士等应用基于Bcl一2蛋白结构的计算机虚拟药物筛选方法，对含有二十五万个小分子化合物的ACD数据库进行筛选(AvailableChemicalDirectory，MDL，InformationSystems，Inc．，SanLeandro，CA)，得到80个Bcl—2蛋白的潜在配体。对其中部分化合物进行合成，并在HeLa和SiHa两种肿瘤细胞株上进行了抑制试验，结果表明：化合物(LD)．能有效地抑制肿瘤细胞生长，而且还对高表达Bcl一2的肿瘤细胞表现出一定的抑制选择性。因此，将化合物(LD)确定为先导物。进一步的结构优化，发现了化合物Z24，其活性和选择性明显优于先导物LD。体内和体外活性测试结果表明，Z24对多种肿瘤动物模型均具有显著的体内抑瘤活性，对血管内皮细胞有选择性抑制作用，并明显抑制鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管的生成【”。HZ24图1-2．先导化合物和Z24的结构Figure1-2．StructureoftheLeadCompoundandZ241．5Z24对BcI-2(B细胞淋巴瘤)和VEGF(dn管内皮生成因子)的双重抑制作用、Bcl一2阻止细胞凋亡很好地阐明了其与肿瘤的发生、生长和耐药的关系。而Bcl一2阻止血管内皮细胞凋亡，Eel一2与其它新生血管形成刺激因子，如VEGF／VEGFR，在诱导和加速血管形成时的彼此关联作用，这些进一步阐明了其与新生血管形成的关系。特别是Bcl一2能够维持除了血管生成因子的血管细胞的存活，还能诱导产生更多的VEGF，使得许多血管抑制剂在Bcl—2大量表达的情况下，几乎失去了应有的作用。4 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选我们以前的研究发现，对Bcl-2蛋白有选择性抑制的小分子对VEGF刺激的血管内皮细胞生长也有明显的抑制作用，从VEGFR和Bcl一2蛋白活性中心结构对比来看，两者有相似之处，而且Z24与VEGFR和Bcl一2蛋白活性中心都能较好的对接，这说明我们设计的化合物具备双重抑制作用的可能，深入的作用机制研究还有待进行。显然能开发对VEGF和Bcl一2具有双重抑制作用的小分子将显得更有价值。1．6其它新BcI-2蛋白有机小分子抑制剂的研究进展近些年来，随着研究者们对Bcl．2蛋白抑制剂研究的重视出现了一大批新型的有机小分子抑制剂。这些分子量小于750道尔顿的小分子化合物通常比寡核苷酸或小肽具有更高的膜渗透性和可能更好的成本效率。1．6．1ABT一73711zl美国伊利诺州阿伯特实验室的菲西科(Stephenw．Fesik)和同事运用核磁共振、平行合成和分子结构设计的方法发现了抗凋亡蛋白Bcl一2、Bcl．XL和Bel．W的小子分抑制剂ABT-737(化学结构见图1．6．1)。ABT-737和相关化合物在多种肿瘤细胞系中对化疗和放疗表现出了协同作用，在单独使用时对表达的癌性淋巴和小细胞肺癌的细胞系有强效抵抗作用。它比以前描述过的任何抑制剂强度大三个数量级，可能会具有疗效。1．6．2YCl37123lPedroJ．R．等运用基于分子结构的计算机筛选目标化合物发现了YCl37(化学结构见图1-6-2)，它是一种新颖的优秀的Bel-2的小分子抑制剂。YCl37不仅能选择性的杀死过表达的肿瘤细胞而且对其它各种基本细胞不受影响。它是第一个对体外癌细胞Bcl．2抑制剂选择性难以控制提出异议的例子。1．6．3HAl4—1【16】Huang的研究组‘1刀以Bcl．xl与Bak的BH3区域结合复合物的高分辨三维结 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选构为模板构建了Bcl．2蛋白的三维结构，以它为靶点筛选具有约19万个化合物结构的MDL／ACD．3D数据库，得到选择性最佳的HAl4．1(化学结构见图1-6-3)。HAl4．1是一种可渗透入细胞的非肽类小分子化合物，可与Bcl一2的表面凹槽结构结合竞争性取代Bak．BH3而诱导细胞凋亡【18】。体外研究证实，11A14—1可造成Bcl．2高表达的急性白血病细胞及淋巴瘤细胞凋亡。1．6．4生物碱cholerythrineChart课题组【19】通过高通量筛选方法对含有107423个天然萃取物的库进行了筛选，最后得到一个亲和力较好的生物碱ehelerythrine(化学结构见图1-6-4)。实验显示，chelerythrine可以促进线粒体释放细胞色素C，且其诱导高表达Bel—XI的人成神经细胞瘤SHSY5Y细胞(对许多放疗耐受)及高表达Bcl一2的鼠IL．3依赖的早幼粒细胞系FDC．P1发生凋亡的浓度范围较低，IC50为1．5Itmol／L．BIAcore实验室【20】在一万个化合物中通过看其在Bax和Bcl．xL的相互抑制能力，仅仅得到一个能诱导超过50％的抑制剂—CompolllldA5。在Bel—xL转染MCF7细胞的实验中发现，CompoundA5的亲合力是毫微摩尔级，而HAl4—1是微摩尔级的。而且，CompoundA5也能抑制Bax的同型二聚体，这是细胞凋亡级式中一个很重要的一步。、Hamilton研究组【211曾成功地利用三联苯骨架来模拟Q螺旋，其交错的构象可以很好地模拟Q螺旋的表面。他们根据Bcl—xL与Bak的BH3区域结合复合物的高分辨三维结构设计的Compound4具有很高的亲合力。对接及NMR研究证实它的确结合于Bel．xL的疏水凹槽中。但其类药性及水溶性都不太好，可能是细胞活性不佳。6 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂7．24结构改造物的设计、合成与筛选图1-6-3．HAl4—1Figure1-6-3．HAl4·1o—、cH3Br图1—6—5．CompoundA5Figure1-6-5．CompoundA5L。一t7＼O图1—6—2．YCl37Figurel_6-2．YCl37／O图1—6—4．ChelerythrinoFigureI-6-4．Chelerythrine∞犷oo图1-6—6．Compound4OH举喽 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选1．7临床应用抗肿瘤药物的现状肿瘤药物治疗的历史己久，但真正的肿瘤化学治疗起始于二十世纪40年代第一个抗肿瘤药一氮芥用于肿瘤治疗以后。经过50多年的发展，抗肿瘤药物的研究已取得了巨大的成就，获得了一大批不同作用机制的临床抗肿瘤药物(见表l—1)。从表中抗肿瘤药物的治疗结果来看，虽然这些药物都具有明确的作用机制和治疗效果，但是，它们都有不同程度的毒副作用。表1-1几大类抗肿瘤药的代表药物、作用机制和毒副作用Table1-lseveralkindofanti．tumorsmedicinesandtheirsfunctionmachine-madeandpoisonoussideeffect药物类型常用抗肿瘤药作用机制毒副作用烷化剂抗代谢药环磷酰胺、异环磷酰与核酸或蛋白质胺、其它氮芥类发生烷化反应氟尿嘧啶j优福定、阿糖胞苷、Enocitabine、甲氨喋呤、巯嘌呤抑制或拮抗DNA合成物质的代谢骨髓抑制，恶心呕吐，脱发，肝肾功能损害等。骨髓抑制，粘膜损害，上消化道症状，肝肾损害等。抗肿瘤抗生素阿霉素类、阿克拉霉抑制DNA和域脱发，骨髓抑制，口腔炎素、米托葸醌、丝裂RNA的合成或心脏毒性。霉素C、博来姆素、复制新抑癌菌素等植物碱类白金错构体类激素类其他长春新碱、长春碱、长春花碱酰胺、足叶乙甙顺铂、碳铂、Nedaplatin三苯氧胺、LH．RH拮抗剂门冬酰胺酶、丙卡巴肼切断DNA双链轻微骨髓抑制作用，神经末梢损害，肺部损害与DNA结合而抑制癌细胞的分裂增殖与激素受体结合拮抗激素的正常生理作用肾脏毒性，恶心呕吐，骨髓抑制表现类似激素水平过低而引起的症状分解肿瘤细胞生长骨髓抑制所需的必需氨基酸或阻碍DNA或RNA的合成8 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选第二章目标化合物的设计本研究以Z24为先导化合物，采用基于量子化学，计算机图形学，分子力学和结构生物学发展起来的计算机辅助药物设计(computer—aideddrugdesign，CADD)技术，并结合分子对接方法，设计新的基于Bcl-2受体3D结构的抗肿瘤活性抑制剂。2．1DOCK(分子对接)在分子设计中的应用分子对接(moleculardocking)是研究小分子配体与受体生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力的一种重要的理论模拟方法。分子对接可有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征匹配互补的小分子化合物，广泛应用于数据库搜寻及虚拟组合库的设计和筛选研究中【22-23】。由美国加州大学Kuntz等人开发的DOCK程序是目前应用最广泛的一个分子自动对接及数据库搜寻算法，最新版本为DOCK4．0(http：／／wWw．cmpharm．ucsf．edu／kuntz)[2A-271。本文将分子对接应用到分子改造中，通过有机小分子与受体的对接，观察有机小分子与受体相互作用密切的位点，计算有机小分子与受体之间的相互作用力等，依此作为先导分子结构改造的依据。利用MSI公司的Affinity(它是一套用于自动对接(docking)配体(客体)到受体(主体)的程序。对给定的由配体分子和受体分子组成的体系，Affinity能自动地依据配体／受体复合物能量变化，并遵循能量降低原理，查找最佳的配体和受体结合结构)模块软件，将Z24等分子对接到Bcl一2受体的活性位点。在进行分子对接时，Affinity将分子分为两部分，即非结合区域(非活性区域)和结合区域。对接时非结合区域保持刚性，而结合部位原子和配体原子可移动。对于给定的Bcl一2受体一小分子配体复合物体系，Affinity首先对初始结构进行优化，优化得到的构象和能量分别被存为构象和能量的最初标准。接着用平移，旋转和扭曲变化的随意组合来移动配体分子，对移动获得的新构象，如果受体与配体之间靠的太近，相互作用能太大，则继续在空间移动配体分子，直到它处于一个满9 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选足相互作用能判据的位置。然后对新构象进行优化，并将优化结果与最初标准进行比较，通过结构相似性判据和能量判据来决定该构象是否作为一个可能合理的复合物结构。对前后获得的复合物构象进行比较，如果均方根偏差大于0．05rim，同时两者能量差处于可接受的范围内时，新的构象将被接受，储存起来，否则将被淘汰。如果新构象的能量比最初的构象能量低，则将新的构象能作为新的能量标准。继续对配体分子移动和优化，并将优化后的构象与前面所储存的构象进行比较，同时用新的构象能与最低能量进行比较来决定该构象是否被接受。如此反复一直到获得预定数目构象为止。在分子对接的过程中，考虑了溶剂化效应，介电常数取基于距离的模式，与网格计算有关的其它参数取为缺省值。收集的构象个数为10个，选择构象的能量判据值为30Kcal，配体分子每次允许移动最大距离为0．-3nm，最大角度为180．00度，对Z24分子中需要自由旋转的化学键均允许自由旋转。优化时极小化1000步。在此基础上综合考虑复合物能量与结构因素确定Z24与Bcl-2的结合模式。以下是分子对接的结果。图2-1为Bcl一2蛋白活性中心负像Figure2-1．Forthenegative∞proteinactivatedcenter图2．2为化合物Z24与Bcl．2蛋白活性中心的对接结果的情况Figure2-2．ForcompoundsZ24Bcl-2Bcl一2proteinactivatedcenterwiththeresultsofdocking从上图我们可以知道Z247与Bcl一2蛋白活性中心在静电势和形状上有较好的互补。10 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选2．2Z24的结构改造设计虽然Z24具有良好的活性和选择性，但它的稳定性不是很理想，我们推测可能与酰胺氮原子的曼尼希部分容易脱去有关，故本研究设计如下结构的化合物，希望通过延长一个碳原子来增加分子的稳定性。根据Z24先导化合物的结构特点，并参考Bcl一2蛋白活性中心对配体的结构要求，即：1】化合物空间结构对活性的影响；2)取代基电性的变化对化合物活性的影响；3)氢键对化合物活性的影响；4)分子柔性对化合物活性的影响；5)分子理化性质的变化，如稳定性，水溶性等，设计了以下结构改造物，见通式．Z24R1=H；Cl；FR2=之≯c之之y呲C>-吼《：卜眦R3=r◇叽g毗《矿c—q“2户Br，”吼vo．时。一p，，l!I＼ 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选第三章目标化合物的合成3．1阳性药Z24的合成路线H图3—1Z24的合成路线Figure3—1TherouteofsynthesisZ24熔点仪(温度未经校正)RY-I熔点仪干燥箱DZF．6050型真空干燥箱低温反应槽DSL．1400低温反应槽天平√～I也130电子天平核磁仪日本电子JNM．ECA-400超导NMR仪质谱仪MicromassZabSpee高分辨磁质谱仪实验部分12O 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选3．2阳性药Z24的制备3．2．1吲哚酮踪(2)的合成NH2NH2H12该反应为Wollff-kishner反应，反应产率较高。根据原料溶解性选用无水甲醇为反应溶剂，反应温度为甲醇回流。由于反应产率较高，且化合物(2)为中间体，故未对反应条件作进一步优化。实验操作步骤：将吲哚醌2．59(0．017m01)和无水甲醇20n[1l(O．5m01)、85％水合肼3．09(O．043m01)按顺序置于50ml圆底烧瓶中，缓慢升温至反应液回流，反应1小时。点薄层板(展开剂：乙酸乙酯：石油醚=l：1)监控反应无原料即停止反应，迅速将其置于冰浴中冷却0．5小时，抽滤，用甲醇洗涤，得土黄色粉末。于60℃干燥箱真空干燥，次日称重2．559，收率93％，mp：215．218"C(219"C)[6]。TLC(展开剂：乙酸乙酯：石油醚=1：1)检测为单一斑点。3．2．2吲哚酮(3)的合成OH23吲哚腙(2)在强碱条件下反应，放出氮气，得吲哚酮(3)。本实验使用强碱，条件较苛刻，所以操作中要求严格无水。实验操作步骤： 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选在250ml的圆底烧瓶中，将2．Og金属钠溶于100ml的乙醇中，加热回流30分钟后蒸馏，得绝对乙醇(金属钠99．5％)。将去除氧化表皮的金属钠2．Og切丝后投入到50ml的绝对乙醇中，至全溶，制得乙醇钠。在60—70"C、搅拌下分次投入吲哚腙5．09(0．034m01)，同时通入大量氮气，以保证隔绝空气，加完后持续反应45min，点板监控反应(乙酸乙酯：石油醚=1：1)，待原来基本反应完毕后停止反应。迅速将反应液倾入52．0g冰中，出现大量灰色固体。用10％HCl调至pHl(至突变色)，固体全部溶解，加入NaCl使溶液饱和，用240ml(80mlX3)无水乙醚萃取。加入25．Og无水硫酸钠干燥过夜，抽滤，蒸干乙醚，以50ml水溶解固体，置于4"C冰箱中过夜结晶，得褐色针状结晶2．899(收率70％)，mp：125-127℃。3．2．33-吡咯次甲基一2一吲哚酮“)的合成O谢^H34此反应为酮的a—H与羰基的脱水缩合反应，哌啶作为催化剂。由于醛容易被氧化，所以该反应需在氮气的保护下隔绝空气反应，以减少副反应的发生。实验操作步骤：将2一吲哚酮1．49(0．01lm01)、2-吡咯甲醛1．69(0．017m01)、无水甲醇14ml、哌啶0．45ml(0．005m01)依次加入到25ml圆底烧瓶中，同时氮气保护，防止醛被氧化。在室温下搅拌，逐渐有橙黄色固体出现。反应24小时后，点板(乙酸乙酯：石油醚=1：5)，原料点消失，停止反应。抽滤，用甲醇洗涤，得黄色固体，真空干燥(干燥剂：无水CaCl。)过夜，得2．129产品，收率96．4％．mpl23—126℃[文献125—127"C]【9】。 广西大学硕士学位论文BcI．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选3．2．4卜哌啶亚甲基-3-n比咯次甲基一2一吲哚酮(5)的合成H+H+㈣竺礤+㈣一【|，l【山Lo45实验操作步骤：将多聚甲醛o．229(O．012m01)、哌啶0．6039(0．008m01)、无水乙醇15ml置于25ml圆底烧瓶中，避光，通氮气保护，加热回流1．5小时，使多聚甲醛解聚并生成曼尼希中间体。加入3一吡咯次甲基一2一吲哚酮1．09(0．005m01)，回流2．5小时，点薄层板(乙酸乙酯：石油醚=1：5)，原料点消失，停止反应。于搅拌下缓慢冷至室温，得细小淡黄色针状结晶，抽滤，以乙醇和水分别洗涤固体，以除去原料和哌啶。真空干燥，得1．349产物，收率92％，mp131～13212。3．2．5724盐酸盐的制备由于曼尼希碱在溶液中不很稳定，易异构和分解，成盐时需快速进行。另外，为防止成盐时酸的残留而使盐更易吸潮，酸碱的摩尔比应尽量保持1：1。基于此种想法，成盐时需先用HPLC检测Z24碱的纯度。制备通法如下：将150ml无水乙醚置于500ml圆底烧瓶中，冰浴冷却约5℃以下，加入曼尼希碱，搅拌使绝大部分碱溶解，迅速滤去不溶物。将饱和HCl一乙醚逐滴加于碱中溶液中，析出黄色固体，滤出固体，用无水乙醚洗涤数次，真空干燥，即得盐，在隔绝空气和避光下保存。 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选3．3目标化合物的合成3．3．1目标化合物合成+”_一OH．HCI+。I《?“鬯业竺+N一．+U——二二二=二=二二二兰二一Hc17、oHconc．HCI1NH2concH2SO』R12Ⅸ棒q一。3．3．2关键中间体合成讨论吲哚酮氮烷基化产物是本研究的一个关键中间体。文献曾报道2一吲哚酮在NaH催化下，于DMF溶剂中，与卤代烃发生烷基化的反应。从实验重复情况来看，反应所需要的时间较长，反应条件较为苛刻(需要无水操作)，尤其产率不高。后来采用相转移催化方法(K2C03，TBAB，KI，丙酮)来合成吲哚酮氮烷基化产物，产率有所提高，但反应时间较长。曾经有过文献报道KF—Alz03试剂催化烷基化反应条件比较温和产率也较高。经实验后，发现KF—A1203试剂不仅价格低廉，制备简单，可以长期保存和回收重复使用，最重要的是在它的催化下，可以使许多原来需要苛刻条件(如强碱，高温等)的反应能在温和条件下进行，不仅安全可靠，还提高了产率。因此，本研究采用KF—A1203作催化剂来烷基化反应来制备吲哚酮氮烷基化产物。反应溶剂与温度的选择也是很重要的，初步实验结果表明使用未经过无水处理的乙腈，反应产率较低；反应温度偏高(>90℃)，虽然缩短了反应时间，但是16刚杰Y呲刚太Y勉半町未q 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选副反应较多，产率太低。因此，反应温度控制在80～85℃之间。反应的进程采用TLC方法来监控，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=l：2。选择2，4，6，8，10小时等几个反应点检测，当反应产物和原料点变化不大时，反应产物量不变时确定为反应的终点，约为4小时。根据以上对温度、反应溶剂、催化剂，反应时间等条件的研究，最终选用如下实验方法来合成中间体吲哚酮氮烷基化产物，见下反应式。⑨孓。～xH3．3．3主要中间体的制备KF／A1203无水乙睛．回流4hRO3．3．3．15-氟一2一吲哚酮的制备a．N一(2’一肟基)一乙酰基一4一氟一苯胺(I)的制备45．009(0．272m01)水合三氯乙醛，650．09十水硫酸钠置于2000ml三口瓶中，加入600ml水，搅拌使固体溶解成均相。27．809(0．248m01)对氟苯胺。55．009(0．79m01)盐酸羟胺溶于400ml水和22．5ml浓盐酸中。稍冷后，将此溶液倒入反应瓶中．加热回流2-3min。抽滤，用4X50ml水洗涤，自然凉干，得灰白色针状固体46．069。取粗品10．009，用水重结晶，得白色针状结晶(I)，mp159-161℃[文献值160℃]，产率83．7％。b．5-氟一吲哚醌(II)的制备将123．0ml浓硫酸置于500ml三口瓶中，加热至60。C，在此温度下，将29．609(0．161m01)1分批加入反应瓶中，维持温度在60—70"(2，加完后，升温至80"(2左右反应20min。冷却，将反应液倒入碎冰中，待冰块溶解后，抽滤，用5×25ml水洗涤，抽干，得红色固体，23．179，mp226-228"C[文献值227"C]．产率87．2％。C．5-氟一2一吲哚酮(III)的制备将28．059(0．17m01)II，悬浮于200ml无水甲醇中，加入30．Og水合肼(65％)，微回流1h，回流结束后，将此溶液冰浴冷却0．5h，析出黄色结晶，过滤，用水洗涤，置于空气中晾干后，于真空干燥至恒重，得29．39中间体5一氟吲哚腙．在绝干燥条件下，将2．09金属钠溶于50ml绝对无乙醇中。称取5．239上述 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选制得的中间体，在氮气保护下，将其每隔10分钟分批加入到醇钠溶液中，不断搅拌，控制反应温度在60一70V。待反应物加完后，继续加热回流至产生的氮气放完(约0．5h)，将液体迅速倒入冰中，搅拌使固体物质溶解后，用10％盐酸调至pH=1，用2×25ml乙醚萃取，无水氯化钙干燥，过滤，浓缩，得到灰白色粗品。将粗品用50ml水(加少量活性碳)进行重结晶。得纯品(Ⅲ)2．689，收率65．2％，mpl23—126℃[文献125-127℃]⋯。3．3．3．25一氯一2-V哼l哚酮(Ⅳ)的制备合成方法同5一氟一2-V哼l哚酮的制备。3．3．3．3催化剂KF-A1203的制备将37克氟化钾在100毫升水中完全溶解后，加入63克的中性氧化铝，室温下搅拌10分钟。再将溶液中的水蒸干，80摄氏度真空干燥18小时，密封保存备用。3．3．3．41-[2’_(1’一哌啶)]乙基一2一吲哚酮(V)的制备在100ml三颈瓶中加入1．27克吲哚酮，1．08克卜(2一氯乙基)一哌啶，7．5克KF—A1203和50毫升无水乙腈，氮气保护下温和回流四小时，冷却后，抽滤出固体。将滤液蒸干，加入2N的盐酸调节pH=l，用乙酸乙酯萃取三次。水相加入碳酸钠，调节pH=9，用3X25ml乙酸乙酯萃取。合并有机相，用3X10ml饱和的氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，蒸除溶剂，得深红色油状物1．69克。柱层析分离纯化得1．34克红色油状物，收率75．1％。3．3．3．5卜(3’一二甲氨基)丙基一2一吲哚酮(Ⅵ)的制备按照(V)的制备方法合成。乙酸乙酯：石油醚=1：2为洗脱剂进行柱层析纯化，得红色的油状物，产率77．7％。3．3．3．65一氯一1一[2’一(1’一哌啶)]乙基一2一吲哚酮(V11)的制备按照(V)的制备方法合成，乙酸乙酯：石油醚=2：3为洗脱剂进行柱层析纯化，得土色的油状物，产率61．8％。3．3．3．75一氯一卜[2’一(1’吗啉)]乙基一2一吲哚酮(Ⅷ)的制备按照(V)的制备方法合成，乙酸乙酯：石油醚=2：1为洗脱剂进行柱层析纯化，得白色的油状物，静置一天后变成白色固体，产率88．8％。3．3．3．85一氯一1一(3’一二甲氨基)丙基一2一吲哚酮(Ⅸ)的制备按照(V)的制备方法合成，乙酸乙酯：石油醚=1：1为洗脱剂进行柱层析纯化，得粉红色的油状物，静置过夜后变成粉红色固体，产率67．1％。3．3．3．95一氟-1一[2’一(1’一哌啶)]乙基一2一吲哚酮(X)的制备 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按照(V)的制备方法合成，乙酸乙酯：石油醚=3：1为洗脱剂进行柱层析纯化，得粉红色的油状物，静置过夜后变成粉红色固体，产率75．8％。3．3．3．105一氟一卜[2’-(1’吗啉)]乙基一2一哼I哚酮(Ⅺ)的制备按照(V)的制备方法合成，乙酸乙酯：石油醚=1：1为洗脱剂进行柱层析纯化，得粉红色的油状物，静置过夜后变成粉红色固体，产率72．5％。3．3．3．115-氟一卜(3’一二甲氨基)丙基一2一吲哚酮(Ⅻ)的制备按照(V)的制备方法合成，乙酸乙酯：石油醚=3：1为洗脱剂进行柱层析纯化，得粉红色的油状物，静置过夜后变成粉红色固体，产率75．2％。3．3．4目标化合物的合成(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2一吲哚酮(T卿一39)的制备将0．679(2．74ret001)卜(2’_哌啶)乙基一2一吲哚酮，0．359(2．82ret001)对氟苯甲醛和2滴哌啶置于三颈瓶中，加入3ml甲醇，在氮气保护下于室温搅拌24小时。将反应液加入1．5克粗硅胶拌样，蒸干，以石油醚：乙酸乙酯(5：1)为柱层析洗脱液进行分离纯化，收集组分，得0．869黄色固体，产率89．6％。将游离碱用无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加入顺丁烯二酸的丙酮溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤，得马来酸盐。mpl79-180。C。MS[M+]+=351．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)68．35—8．32(m，2H，J=14．3Hz)，7．52—7．48(t，2H，j_-14．6Hz)，7．29—7．25(d，2H，J=16．5ttz)，7．13—7．09(t，2H，J=17．4Hz)，7．06—7．02(t，1H，J=16．Ottz)，6．92(s，1H)，3．94(s，2H)，2．6l(S，2H)，2．52(S，4H)，1．60(S，4H)，1．44(S，2H)。其马来酸盐元素分析(C22H23FN20．C4H404)：理论值(％)：C，66．94；H，5．83：N，6．00．实测值(％)：c，66．89：H，5．98：N，6．02(z)一1-[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(2’一甲氧苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP-38)的制备按照3一(4’一氟苯甲烯基)一1一(2’一(1’一哌啶)乙基)-2一吲哚酮的制备方法合成。将滤液蒸干，石油醚：乙酸乙酯(1：1)柱层析，得0．828克黄色固体。产率83．4％。19 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选用无水乙醚将游离碱完全溶解，向其中慢慢滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤，得盐酸盐。Mp238—240"C。(盐酸盐)：MS[M+]+=362．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．77(S，1H)，7．9(S，1H)，7．58—7．56(d，1H，J：7．5Hz)，7．48—7．42(m，28，J=24．9Hz)，7．34—7．30(t，1H，J=15．4Hz)，7．05—6．98(m，2H，J=29．4Hz)，6．93—6．88(t，1H，J=17．4Hz)，4．51—4．48(m，211，J=15．0Hz)，3．91—3．88(d，3H，J=13．5Hz)，3．59—3．57(d，2H，J=8．6Hz)，3．20一3．18(m，2H，J=8．0Hz)，2．78—2．75(m，2H，J=l1．811z)，2．32—2．29(d，2H，J=27．2Hz)，1．96一1．88(d，3H，J=29．911z)，1．61(S，311)．(z)一3一(4’一氟苯甲烯基)一卜(3’一二甲胺丙基)-2-N哚酮(TMP一40)的制备按照3一(4’一氟苯甲烯基)一1一(2’一(1’一哌啶)乙基)-2-Pffl哚酮的制各方法合成。将滤液蒸干，石油醚：乙酸乙酯(1：1)柱层析，得1．429黄色固体，产率73．5％。用无水乙醚将游离碱完全溶解，向其中慢慢滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤，得盐酸盐。mpl82．卜183．2"C。(盐酸盐)：MS[M+]+=325．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．70(S，1H)，7．77(S，1H)，7．66—7．61(m，21t，J=23．3Hz)，7．61(S，lH)，7．32(S，11t)7．20一7．13(t，2H，J=25．2Hz)，6．95-6．91(t，2H，J=14．8Hz)，3．95(S，2H)，3．13(S，2H)，2．81(S，611)，2．39(S，2H)，1．69(S，211)(z)一卜[2’(1’一哌啶)]乙基一3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)一2-吲哚酮(1_巾一1)的制备将1．09(4．10ret001)卜(2’-哌啶)乙基一2一吲哚酮，0．7389(4．22ret001)5一甲氧基一3一吲哚甲醛置于三颈瓶中，加入2滴哌啶和5ml无水甲醇，在氮气保护下于室温搅拌24小时。过滤，用无水甲醇3X3ml洗涤，烘干得纯品1．479黄色固体，产率89．2％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp238．0-241．4℃。MS[M+]+=402．3m／e，1HNMR(400Hz，DMSO-d6)6ii．95(s，4H)，9．44(s，IH)，8．19(s，lH)，7．99—7．97(d，1H，J=7．6Hz)，7．75—7．74(d，1H，J=2．2Hz)，7．42—7．39(d，1H，J=13．4Hz)，7．23—7．19(m，1H，J=15．1Hz)，7．06—7．02(m，2H，J=7．6Hz)，6．88—6．85(in，1H，J=lO．9Hz)，3．92—3．88(m，5H，J=13．2Hz)，2．51—2．50(t，6H，J=3．6Hz)，1．49一1．46(m，6H，J=lO．7Hz)(z)一卜[2’(1’一哌啶)]乙基一3一(2’一呋喃甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一2)的制备按(z)-1-[2’一(1’一哌啶)]乙基-3-(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=5：1，得0．909草绿色固体，产率68．2％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有草绿色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp235．8-237．0℃。(盐酸盐)：MS[M+]+=323．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．76(s，1H)，8．47—8．45(d，IH，J=7．5Hz)，7．80—7．79(d，IH，j=1．7Hz)，7．48—7．46(d，1H，J=7．9Hz)，7．43(s。1H)，7．40一7．36(t，1H，J=14．1Hz)，7．13—7．09(t，1H，J=15．2Hz)，6．95—6．94(d，1H，3=4．7Hz)，6．64-6．63(m，IH，J=3．6Hz)，4．51—4．47(t，2H，J=14．6Hz)，3．60—3．57(d，2H，J=10．9Hz)，3．22(s，2H)，2．80—2．72(m，2H，J-31．4Hz)，2．34-2．24(m，2H，J=39．7Hz)，1．94—1．87(t，3H，J=31．4Hz)，1．71(s，1H)，1．48—1．42(m，1H，J=25．2Hz)(z)一卜[2’(1’一哌啶)]乙基一3一(2’一(3一溴一苯甲烯基))一2一吲哚酮(1忡一3)的制备2l 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按(Z)一1-[2’一(1’一哌啶)]乙基-3-(4’一氟苯甲烯基)-2一吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：氨水=4：1：1d，得0．309黄色固体，产率35．6％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp180．8-181．8℃。MS[M+]+=411．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．76(S，1H)，7．73(S，lH)，7．56—7．55(d，1H，J=1．1Hz)，7．54—7．53(d，lH，J=1．7Hz)，7．51(S，1H)，7．35—7．31(t，1H，J=15．7Hz)，7．28—7．24(JI】，lH，J=16．5Hz)，6．92-6。90(d，1H，J=7．5Hz)，6．88—6．86(m，lH，J=8．7Hz)，3．94—3．90(m，2H，J=14．8Hz)，2．62—2．61(m，2H，J=7．5Hz)，2．51(S，4H)，1．61—1．58(m，4H，J=11．2Hz)，1．46—1．44(m，2H，J=5．4Hz)(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一5一氯-3-(2’一(2一甲氧基一苯甲烯基))一2-吲哚酮(T肝一4)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基-3-(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：氨水=4：l：2滴，得0．759黄色固体，产率75．6％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp197．5-199．1℃。MS[M+]+-397．2m／e，1HN胍(400Hz，CDCI3-d6)68．01—7．99(d，1H，J=8．0Hz)，7．64—7．62(d，1H，J=8．0Hz)，7．52—7．49(m，1H，J=13．0Hz)，7．44—7．43(m，1H，J=9．0Hz)，7．20—7．18(in，1H，J=11．0Hz)，7．07—7．03(t，1H，J=14．0Hz)，7．00一6．98(t，1H，J=9．0HZ)，6．83—6．80(t，1H，J=16．0Hz)，3．91—3．87(in，5H，J=17．0nz)，2．59—2．50(m，6H，J=34．0Hz)，1．61—1．58(in，4H，j=11．0Hz)，1．54—1．44(m，2H，J=42Hz) 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基-5-氯一3一(2’一噻吩甲烯基)一2-吲哚酮(TMP-5)的制各按(Z)一1-[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=5：l，得0．759黄色固体，产率72．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp223．2-224．8℃。MS[M+]+：373．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．83-7．82(d，1H，2=3．6Hz)，7．71(S，1H)，7．68—7．67(d，1H，J=5．0Hz)，7．49—7．48(d，1H，J=2．0Hz)，7．24(S，lH)，7．22(S，lH)，7．19—7．17(m，1H，J=9．0Hz)，6．90(S，1H)，4．00(S，2H)，2．60(S，2H)，2．53(S，4H)，1．57(S，4H)，1．46(S，2H)(z)一1-[2’一(1’(1御一6)的制备按(Z)一卜[2’的制备方法合成。体，产率70．3％。一哌啶)]乙基-5-氯一3一(2’一(4-氟一苯甲烯基))一2一吲哚酮一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)-2-哼1哚酮(TMP-39)柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=5：1，得0．489黄色固将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp168．4-171．0℃。MS[~I+]+=385．3m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)88．37—8．34(m，2H，J=14．5Hz)，7．48—7．47(d，1H，J=5．4Hz)，7．46(S，1H)，7．25—7．24(d，1H，J=2．0Hz)，7．23—7．22(d，1H，J=2．0Hz)，7．15—7．11(m，2H，2=17．3Hz)，6．84—6．82(d，1H，J=8．1Hz)，3．92—3．89(m，2H，3-=14．5Hz)，2．58—2．56(m，2H，3-=7．2Hz)，2．50(S，4H)，1．60一1．57(m，4H，3-=10．6Hz)，1．43(S，2H)．(z)一1-[2’一(1’一哌啶)乙基卜5一氯一3一(2’一(2-吡啶)甲烯基)-2一吲哚酮(T肝一7)的制备 广西大学硕士学位论文BcI．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、台成与筛选按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应24h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体0．259，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=3：1进行柱层析，得O．49黄色固体，总产率75．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp121．5-124．5℃。MS[M+]+=368．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)69．18—9．17(d，1H，J=2．3Hz)，8．90—8．89(d，lH，J=3．7Hz)，7．8卜7．78(m，1H，2=9．5Hz)，7．74(S，1H)，7．62—7．60(d，1H，J=7．8Hz)，7．34—7．32(m，lH，J=7．6Hz)，7．29—7．27(m，1H，J=lO．7Hz)，6．84-6．82(d，1H，J=8．1Hz)，3．93—3．90(m，2H，J=14．3Hz)，2．59—2．57(m，2H，J=7．OHz)，2．50(S，4H)，1．59—1．57(m，4H，J=lO．1Hz)，1．44一1．43(m，2H，J=5．Oftz)(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基-5-氯-3-(2’一(2-g[t咯)甲烯基)一2-吲哚酮℃1御一8)的制备按(Z)一1-[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体0．219，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇=4：0．1进行柱层析，得0．49黄色固体，总产率72．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp263．5-264．5℃。MS[M+]+=356．3m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)613．43(S，1H)，7．45—7．44(d，1H，J=2．OHz)，7．39(S，1H)，7．18—7．17(d，1H，J=2．OHz)，7．16—7．15(d，1H，J=2．0Hz)，6．87—6．85(in，1H，J=8．4Hz)，6．80—6．78(m，1H，J=7．OHz)，6．40—6．39(m，1H，J=3．6Hz)，3．99-3．95(m，2It，j=14．8Hz)，2．62—2．60(in，2H，J27．6ttz)，2．5l(S，4H)，1．60—1．57(m，4H，J=10．9Hz) 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选元素分析(C20H22C1N30)：理论值(％)：C，67．50：H，6．23：N，11．81．实测值(％)：c，67．50：H，6．22：N，1I．62(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一5一氯一3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)-2-哼1哚酮(TMP-9)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMPI)的制备方法合成。过滤，用无水甲醇3mlX3洗涤，烘干得纯品0．319黄色固体，产率80．2％。。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp260．3-261．8℃。MS[M+]+=436．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．05(s，IH)，9．48(s，IH)，8．29(s，lH)，8．13—8．12(d，IH，J=2．OHz)，7．83—7．82(d，1}t，J=2．3Hz)，7．42—7．40(d，1H，J-8．7Hz)，7．23—7．20(m，lH，J=lO．4Hz)，7．05—7．03(d，1H，J=8．2Hz)，6．88—6．85(m，1H，J=11．2Hz)，3．92—3．91(m，2H，J=6．7Hz)，3．89(s，3H)，2．50—2．48(m，4H，J=7．5Hz)，2．42(s，2H)，1．46一1．44(m，4H，J=lO．iHz)，1．36一1．35(d，2H，J=5．iHz)(z)一卜[2’一(1’一哌啶)】乙基一5一氯一3一(2’一(2-呋喃)甲烯基)-2-m／[哚酮(T肝一10)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)-2-眄I哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得草绿色固体0．69，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=l：i进行柱层析，得0．29草绿色固体，总产率82．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有草绿色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp230．卜232．5℃。MS[M+]+=357．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)68．45—8．44(d，IH，j=2．OHz)，7．83—7．82(d，1H，J=1．7Hz)，7．48(s，1H)，7．27—7．25(m，3H，J=8．1Hz)，6．95-6．94 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选(d，111，J=3．6Hz)，6．87(s，lH)，6．65—6．64(m，1H，J"--1．7Hz)，3．93(s。2H)2．60(s，2H)，2．50(s，4H)，1．59(s，4t1)，1．44(s，2H)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氯-3-(2’一(2-噻吩)甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一11)的制备按(Z)一1_[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)-2一吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体0．79，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=l：l进行柱层析，得0．259黄色固体，总产率92．5％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp251．2-252．9℃。MS[M+]+=374．9m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．82-7．81(d，lH，J=3．4Hz)，7．72(s，1H)，7．69—7．67(d，1H，J=5．0Hz)，7．50一7．49(d，1H，J=1．9Hz)，7．24—7．21(m，1H，J=lO．1Hz)，7．19—7．17(m，1H，J=8．7Hz)，6．83—6．81(d。1H，J=7．3Hz)，3．94(s，2H)j3．69(s，4H)，2．64(s，2H)，2．56(s，4H)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基-5-氯一3一(4’一氟一苯甲烯基)一2一吲哚酮(TMP一12)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)-2-吗1哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体O．39，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得0．259黄色固体，总产率61．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp228．8-230．9"C。MS[M+]+=387．Om／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)68．37-8．33(m，2H，J=14．2Hz)，7．50—7．49(d，1H，J=1．911z)，7．48(s，1H)，7．24—7．23(d，2H，j=1．7Hz)，7．16—7．12(t，2H，J=17．4Hz)，6．81(s，1H)，3．91(s，2H)，3．70(s，4H)，2．63(s，211)，2．56(s，4H) 广西大学硕士学位论文Bel．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选(z)一1-[2’一(1’一吗啉)]乙基-5-氯一3一(2’一吡啶甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一13)的制各按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2一吲哚酮(TMP-39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体0．599，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：l进行柱层析，得0．179黄色固体，总产率76．9％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp178．2-180．1℃。MS[M+]+=370．Om／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)69．21—9．20(d，1H，J=2．2Hz)，8．9卜8．90(d，1H，J=4．7Hz)，7．84—7．80(nl，1H，J=15Hz)，7．75(s，1H)，7．64—7．62(d，1H，J=8Hz)，7．36—7．34(m，1H，J=6．7Hz)，7．31-7：28(m，1H，J=lO．5Hz)，6．83—6．81(d，1H，J=7．8Hz)，3．94(s，2H)，3．70(s，4H)，2．66(s，2H)，2．57(s，4H)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基-5-氯-3-(2’一吡咯甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一14)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体，烘干得0．629，产率74．8％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp238．4-239．9℃。MS[M+]+=358．Om／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)613．41(s，1H)，7．47-7．46(d，1H，J=1．9Hz)，7．42(s，2H)，7．20—7．17(m，2H，j=13．5Hz)，6．85(s，lH)，6．82-6．81(m，lH，J=3．3Hz)，6．41—6．40(m，1H，J=5．8Hz)，3．99(s，2H)，3．71(s，4H)，2．66(s，2H)，2．57(s。4H)(Z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氯一3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)一2-吲哚 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选酮(T肝一15)的制备按3一(5’一甲氧基一3一哼I哚甲烯基)-1-(2’一哌啶乙基)一2一吲哚酮(TMPl)的制备方法合成。过滤，用无水甲醇3mlX3洗涤，烘干得纯品0．759黄色固体。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=l：1进行柱层析，得0．259黄色固体，总产率85．5％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp281．8-283．9℃。MS[M+]+=438．0m／e，1HN^lR(400Hz，CDCl3-d6)612．08—12．07(d，1H，J=2．5Hz)，9．49—9．48(d，州，J=3．1Hz)，8．31(S，1H)，8．15—8．14(d，1H，J=2．0Hz)，7．42—7．40(d，1H，J=8．6Hz)，7．24—7．21(m，lH，J=10．6nz)，7．08—7．06(d，1H，J=8．3Hz)，6．88—6．86(m，1H，J=11．1Hz)，3．94—3．92(m，2H，J=13．0Hz)，3．89(s，3H)，3．54-3．52(m，41t，J=8．311z)，2．51—2．50(m，6N，J=3．6Hz)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氯一3一(2’一呋喃甲烯基)一2-吲哚酮(T聍一16)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得草绿色固体0．589，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得0．159草绿色固体，总产率79．8％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有草绿色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp237．4-239．2℃。MS[M+]+=359．0m／e，1HNMIi(400nz，CDCl3-d6)68．46—8．45(d，lH，J=1．8Hz)，7．83(S，1H)，7．49(S，1n)，7．27—7．25(m，2N，J=8．1Hz)，6．96—6．95(d，1N，J=3．3Hz)，6．82-6．80(d，lH，J=8．4Nz)，6．65-6．64(m，lH，J=3．3nz)，3．93—3．90(Ill，2H，j=13．2Hz)，3．69(S，4H)，2．64—2．61(t，2N，J=13．2Hz)，2．54(S，4H) 广西大学硕士学位论文BcI．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选(Z)一1一(3’一二甲胺丙基)一5-氯-3-(2’一(2一甲氧基一苯甲烯基))-2-N哚酮(T肝一17)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制各方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1，得1．669黄色固体，产率88．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp177．6-178．8℃。MS[M+]+=371．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．72(S，1H)，8．03—8．01(d，1H，J=8．21{z)，7．65—7．63(d，2H，J=7．6Hz)，7．52-7．49(d，2H，J=2．6Hz)，7．47—7．46(m，1H，J=6．3Hz)，7．09—7．05(t，1H，J：14．9Hz)，7．02—7．00(d，2H，J=8．1Hz)，6．90—6．88(m，1H，J=7．9Hz)，3．94—3．93(m，2H，J=3．9Hz)，3．89(S，3H)，3．12(S2H)，2．80(s，6H)，2．37(s，2H)，1．61(s，2H)(z)一卜(3’一二甲胺丙基)一5-氯一3一(2’一噻吩甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一18)的制各按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基-3-(4’一氟苯甲烯基)-2-哼1哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：l，得0．59黄色固体，产率45．5％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp178．4-180．1℃。MS[M+]+=347．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．83—7．82(d，1H，J=3．6Hz)，7．71(S，1H)，7．68—7．65(d，1H，J=10．7Hz)，7．49—7．48(d，1H，J=1．9Hz)，7．24—7．23(d，1H，J=2．0Hz)，7．18—7．16(Ill，1H，J=8．7Hz)，6．88—6．86(d，1H，J=8．1Hz)，3．86—3．84(m，2H，J=7．1Hz)，2．45—2．42(m，2H，J=14．3Hz)，2．30(S，6H)，1．95—1．91(m，2H，J=14．3Hz) 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选(z)一1一(3’一二甲胺丙基)一5-氯-3-(2’一毗啶甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一19)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2一吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=l：1，得0．69黄色固体，产率55．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp122．卜123．8℃。MS[M+]+=342．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)69．17—9．16(d，1H，J=2Hz)，8．89—8．88(d，1H，J=4Hz)，7．80一7．79(m，1H，J=8Hz)，7．73(S，1H)，7．6卜7．59(d，1H，J=8Hz)，7．31—7．28(m，1H，J=13Hz)，7．28—7．25(m，1H，J=10Hz)，6．85—6．83(d，1H，J=8Hz)，3．84—3．80(t，2H，J=14Hz)，2．36—2．32(t，2H，J=14Hz)，2．22—2．2l(m，614，J=314z)，1．88—1．85(t，2H，J=14ttz)(z)一卜(3’一二甲胺丙基)-5-氯-3-(2’一吡咯甲烯基)一2-吲哚酮(T咿一20)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=l：4，得0．549黄色固体，产率51．7％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp145．2-147．1℃。MS[M+]+=330．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)613．45(s，1H)，7．44—7．43(d，1H，J=2．0Hz)，7．38(S，lH)，7．17—7．16(d，1H，J=2．0Hz)，7．15—7．14(d，1H，J=2．0Hz)，6．88—6．86(d，1H，J=8．4Hz)，6．79—6．78(m，1H，J=6．7Hz)，6．40—6．38(m，1H，j=6．2Hz)，3．89—3．86(m，2H，J=14．0Hz)，2．34—2．30(m，2H，J=14．0Hz)，2．22(S，6H)，1．89—1．85(m，2H，J=14．3Hz)(Z)一卜(3’一二甲胺丙基)-5-氯-3-(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)一2-吲哚酮 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选(T咿一21)的制备按3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)一1一(2’一哌啶乙基)一2-吲哚酮(TMPl)的制备方法合成。过滤，用无水甲醇3mlx3洗涤，烘干得纯品0．99黄色固体。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得0．19黄色固体，总产率77．O％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp239．6-240．2℃。MS[M+]+=410．1m／e，1ltNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．07(S，1H)，9．49(S，1H)，8．31(S，1H)，8．14—8．13(d，1H，J-2．Ollz)，7．82—7．81(d，1H，J=2．OHz)，7．42-7．40(d，2H，J=9．OHz)，7．24—7．23(m，1H，J=2．OHz)，7．08—7．06(d，1H；J=8．OHz)，6．89—6．86(m，1H，J=l1Hz)，3．89—3．81(m，5H，J=33Hz)，2．26—2．23(m，2H，J=14．014z)，2．13(S，6H)，1．77—1．75(m，214，J=7．Otfz)(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一5一氟-3-(2’一(2一甲氧基一苯甲烯基))一2-吲哚酮(T肝一22)的制各按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP-39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1，得0．659黄色固体，产率82．2％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp175．3-176．6℃。MS[M+]+=381．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)68．01(S，1H)，7．64—7．62(d，1H，J=7．6Hz)，7．45—7．42(m，lH，J-14．814z)，6．99—6．97(d，州，J=8．4Hz)，6．94—6．91(m，1H，j=l1．5Hz)，6．83—6．79(m，1H，J=12．8Hz)，3．93—3．89(m，2H，J=15．1Hz)，3．87(S，3H)，2．59—2．51(m，6H，J=31．7Hz)，1．61—1．58(m，6H，J=11．214z)31 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z,24结构改造物的设计、合成与筛选(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一5一氟-3-(4’一氟一苯甲烯基)一2一吲哚酮(T肝一23)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1，得0．759黄色固体，产率84．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp181．2-183．1℃。MS[M+]+=369．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．82(s，1H)，7．63—7．59(m，2H，J=13．7Hz)，7．31—7．26(d，2H，J=17．4Hz)，7．20一7．16(m，IH，J=17．4Hz)，7．00—7．69(m，iH，J=18．9Hz)，6．86—6．83(m，IH，J=12．6Hz)，3．93—3．89(m，2H，J=14．6llz)，2．59—2．51(m，6H，J=33．3Hz)，1．61—1．58(m，6H，J=10．9Ilz)(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一5一氟-3-(2’一吡啶甲烯基)一2-吲哚酮(T咿一24)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：I，得0．79黄色固体，产率80．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp213．9-214．8℃。MS[M+]+=352．im／e，1IINMR(40011z，CDCl3-d6)68．98-8．96(m，州，J=10．iHz)，8．89—8．88(d，IH，J=4．5Hz)，7．82·7．78(m，IH，J=15．41-1z)，7．74(s，1H)，7．62—7．60(d，1H，J=7．9Hz)，7．35·7．33(m，IH，J=7．5Hz)，7．03·7．00(m，1H，J=II．51-1z)，6．83-6．80(m，IH，J=12．9Hz)，3．94—3．90(m，2H，J=14．9Hz)，2．60·2．50(m，6H，J=39．0Hz)，1．60—1．44(m，6H，J264．8Hz)(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一5一氟-3-(2’一呋喃甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一25)的制各 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1，得0．89黄色固体，产率85．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp246．8-249．2℃。Ms[M+]+=352．1m／e，1}ⅡⅧ脓(400Hz，CDCl3-d6)68．24—8．22(m，lH，J=9．8Hz)，7．81—7．80(d，1H，J-1．7Hz)，7．49(s，1H)，7．00—6．97(ffi，1H，J=11．2Hz)。6．95—6．94(m，1H，J=3．4Hz)，6．93(s，1H)，6．64-6．63(m，1H，J=3．3Hz)，3．94—3．90(m，2H，J=14．5Hz)，2．59—2．50(m，6H，3-：34．5Hz)，1．59—1．44(m，6H，J：60．8Hz)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基一5-氟-3一(2’一(2一甲氧基一苯甲烯基))一2一吲哚酮(T肝一26)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基-3-(4’一氟苯甲烯基)一2一吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。柱层析，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：l，得0．549黄色固体，产率78．2％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。Ⅲp165．4-167．1℃。MS[M+]+=383．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)68．03(s，1H)，7．65—7．63(d，lH，J=7．3Hz)，7．47—7．43(m，1H，J=8．4Hz)，7．29—7．27(d，1H，J=9．2Hz)，7．06—7．03(t，lH，3-=14．8Hz)，7．00一6．98(d，1H，J=8．4Hz)，6．97—6．92(m，lH，3-：20．4Hz)，6．79(s，1H)，3．91—3．88(m，2H，J-14．9Hz)，3．88(s，3H)，3．71(s，4H)，2．64(s，2H)，2．57(s，4H)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基-5-氟-3-(2’一噻吩甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一27)的制备 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基-3-(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体0．549，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得O．39黄色固体，总产率76．5％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp238．4-240．1℃。MS[^l+]+=359．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．83—7．82(d，1H，J=3．3Hz)，7．7卜7．68(t，2H，J=11．8Hz)，7．25—7．19(d，1H，J=5．9Hz)，7．19-7．17(t，1H，J=4．7Hz)，7．00一6．95(m，2H，J=20．2Hz)，3．96—3．71(m，6H，J=99．4Hz)(Z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基-5-氟-3-(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一28)的制各按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP-39)的制备方法合成。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=2：1进行柱层析，得0．659黄色固体，总产率73．5％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp251．4-253．2℃。MS[M+J+=371．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)68．38—8．34(d，1H，J=14．3Hz)，7．46(s，1H)，7．25—7．23(m，2H，J=8．4Hz)，7．16—7．11(m，2H，J=21．5Hz)，4H)，(Z)一1-[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氟一3一(2’一吡啶甲烯基)-2-哼1哚酮(TMP-29)的制备按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2一吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=3：2进行柱层析，得0．739黄色固体，总产率78．3％。 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mpl84．2-186．4℃。MS[M+]+=354．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)89．02—8．98(m，1H，3=12．6Hz)，8．90—8．89(d，1H，J=3．9Hz)，7．84—7．80(m，1H，J=15．4Hz)，7．75(S，1H)，7．64—7．62(d，lH，J=7．8Hz)，7．37—7．33(m，1H，3"=12．6Hz)，7．04—7．01(m，1H，j=11．2Hz)，6．79(S，1H)，3．93(S，2H)，3．70(s，4H)，2．64(S，2H)，2．56(S，4H)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氟一3一(2’一毗咯甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一30)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP-39)的制备方法合成。反应12h后有大量黄色沉淀生成，过滤得黄色固体0．59，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得0．359黄色固体，总产率81．4％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp226．1-228．8℃。临[M+]+=342．2m／e，1删R(400Hz，CDCl3-d6)513．47(s，1H)，7．39(s，lH)，7．22—7．19(m，2H，J=10．6Hz)，6．94—6．89(m，1H，3"=20．1Hz)，6．84—6．80(m，2H，．1=12．6Hz)，6．42—6．40(m，1H，J=5．9Hz)，3．98(S，2H)，3．71(S，4H)，2．66-2．57(d，6H，J_36．1Hz)(Z)一1-[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氟一3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)-2-哼1哚酮(T肝一31)的制备按3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)一卜(2’一哌啶乙基)一2一吲哚酮(TMPl)的制备方法合成。过滤，用无水甲醇3ml×3洗涤，烘干得纯品0．659黄色固体。 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：3进行柱层析，得0．359黄色固体，总产率82．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp235．5-236．6℃。MS[M+]+=422．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．06—12．05(d，1H，J=2．5HE)，9．48-9．47(d，1H，J=2．8Hz)，8．26(S，1H)，7．97-7．94(m，lH，J=11．2Hz)，7．44—7．40(m，1H，J=15．1Hz)，7．04—7．03(m，2H，J=4．7Hz)，6．88—6．85(m，1H，J=11．2Hz)，3．95—3．90(m，4H，J=18．0Hz)，3．54(S，3H)，2．50一2．49(m，8H，J-3．6Hz)(z)一卜[2’一(1’一吗啉)]乙基一5一氟一3一(2’一呋喃甲烯基)一2一吲哚酮(TMP一32)的制备按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2一吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。反应12h后有大量草绿色沉淀生成，过滤得草绿色固体0．549，母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得0．369草绿色固体，总产率80．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有草绿色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp245．0-247．0℃。MS[M+]+=343．0m／e，1HNMR(400Hz，CDC]3-d6)68．26—8．23(m，1H，J=12．1Hz)，7．81(S，in)，7．49(S，in)，7．00一6．98(m，1H，J=17．411z)，6．95—6．94(d，11t，J=3．4Hz)，6．80(S，1H)，6．65—6．64(m，1H，J=3．4Hz)，3．92(S，2H)，3．69(S，4H)，2．63—2．55(d，6H，J=32．2Bz)(z)一1一(3’一二甲胺丙基)-5-氟-3-(2’一噻吩甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一33)的制备 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按(Z)一1一[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇=4：0．2进行柱层析，得1．29黄色固体，总产率98．6％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mpl66．2-167．5℃。MS[M+]+=331．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)67．81—7．80(d，1H，J=3．4Hz)，7．69—7．64(m，1H，J=10．6Hz)，7．18—7．16(m，lH，J=8．6Hz)，6．98—6．93(m，1H，J=28．2Hz)，6．87—6．83(m，lH，J=16．5Hz)，3．84—3．83(m，2H，J=7．0Hz)，2．47—2．43(m，2H，J=14．6Hz)，2．30(S，6H)，1．94—1．91(m，2H，J=14．3Hz)(z)一1一(3’一二甲胺丙基)一5-氟一3一(2’一吡啶甲烯基)一2一吲哚酮(TMP"34)的制备按(Z)一1_[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)-2-Ⅱ芎[哚酮(TMP一39)的制备方法合成。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得1．09黄色固体，总产率95．3％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mpl76．4-178．3℃。MS[M+]+=326．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)69．00一8．97(Ill，1H，J=12．9Hz)，8．90—8．89(d，1H，J=3．7Hz)，7．83—7．80(m，2H，J-13．7Hz)，7．63-7．61(d，1H，J=7．9Hz)，7．36—7．35(m，1H，J=8．4Hz)，7．04—7．01(m，1H，J=11．2Hz)，6．85—6．83(m，1H，J=8．7Hz)，3．86—3．83(t，2H，J=14．0Hz)，2．49-2．46(t。2H，J=14．7Hz)，2．32(S，6H)，1．98—1．92(m，2H，J=21．5Hz)(z)一1一(3’一二甲胺丙基)一5-氟一3一(2’-nit咯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一35)的制备 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按(Z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得1．09黄色固体，总产率97．5％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp210．4-212．2℃。MS[M+]+=314．1m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)613．49(S，1H)，7．35(S，1H)，7．17-7．14(m，2H，J=10．9Hz)，6．92—6．89(m，1H，J=11．0Hz)，6．87—6．83(m，1H，J=18．0Hz)，6．79—6．78(t，州，J=3．4Hz)，6．39—6．38(m，1H，J=5．9Hz)，3．88—3．85(t，2H，J=14．0Hz)，2．4卜2．37(t，2H，J=7．3Hz)，2．27(S，6H)，1．94-1．87(t。2H，J=28．6Hz)(z)一1一(3’一二甲胺丙基)一5-氟一3一(5’一甲氧基-3-哼1哚甲烯基)-2-NI哚酮(T肝一36)的制备按3一(5’一甲氧基一3一吲哚甲烯基)一卜(2’一哌啶乙基)一2-吲哚酮(TMP-1)的制备方法合成。过滤，用无水甲醇3mlX3洗涤，得纯品O．79黄色固体。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：2进行柱层析，得0．259黄色固体，总产率90．2％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有黄色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mp292．0-293．0℃。MS[M+]+=394．2m／e，1HNMR(400Hz，CDCl3-d6)612．06(S，lH)，9．49(S，1H)，8．27(S，1H)，7．98—7．96(d，1H，J=17．1Hz)，7．8-7．80(d，1H，J=2．2Hz)，7．44—7．40(d，1H，J=15．6HZ)，7．04—7．02(t，2H，J=6．7Hz)，6．89—6．86(m，1H，j=l1．2Hz)，3．89(S，3H)，3．84—3．79(m，2H，j=11．3Hz)，2．51—2．50(t，2H，J=3．7Hz)，2．13(s，6H)，1．77—1．75(nl，2H，J=6．9Hz)(z)一卜(3’一二甲胺丙基)一5-氟-3-(2’一呋喃甲烯基)一2-吲哚酮(T肝一37)的制备 广西大学硕士学位论文Bcl一2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选按(z)一卜[2’一(1’一哌啶)]乙基一3一(4’一氟苯甲烯基)一2-吲哚酮(TMP一39)的制备方法合成。母液拌入粗硅胶，蒸干，用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯=1：1进行柱层析，得1．09草绿色固体，总产率92．1％。将游离碱用大量无水乙醚完全溶解，置于冰中冷却，滴加饱和的盐酸乙醚溶液，有草绿色固体生成，抽滤，用无水乙醚洗涤3次，得盐酸盐。mpl99．0-199．9℃。MS[M+]+=315．Im／e，1ⅧwR(400Hz，CDCl3一d6)68．24—8．21(m，IH，J=12．IHz)，7．813—7．810(d，1H，J=1．4Hz)，7．48(s，IH)7．00—6．97(m，IH，J=11．211z)，6．94—6．93(d，lH，J=3．4Hz)，6．8-6．81(m，IH，J=12．9Hz)，6．64—6．63(m，IH，J=3．4Hz)，3．84—3．81(Ⅲ，2H，J=14．0Hz)，2．44—2．42(m，2H，J=7．3Hz)，2．30(s，6H)，1．92一1．89(m，2H，J=14．5Hz)3．3．5化合物结构一览表本论文共合成了40个新的结构改造物(结构见表3—1)和8个关键中间体，所有新目标化合物均采用1HNMR、MS等方法对其进行了结构确证，部分化合物还通过了元素分析。表3-1化合物结构一览表Table3-IStructuresofthecompounds化合物化合物结构编号洲秽TMP．3@TMP．1L、HT～Ⅱ’．20b。u产心毋。妒TMP-4oTM【P一5TⅣ口．6“oU 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选化合物化合物结构编号a、十一)。聊释TMP．9。E再o。、TⅣⅢ．7L^^。T～口．80“o0TMP．10。聊◇TMP．1l。既◇TMP．12。种’“oQTⅣ呼．13。取产TⅣ【P．14。聊柙TMP一15。卿Q“。。．，一◇。既◇乙A．Ao。up—＼-N7TM呼．16QTMP．17TMP．18、N7TⅣlP．19a种TⅣⅢ．20a聊押TMP．21“既q刃。、、／、^o—＼_H，TⅣIP一22’瓯产TMP．235孵‘TMP．246瓯po叼hoo’嘏TⅣm．256聊◇TⅣ呼一267蜊TMP．27ho，1TⅣ【P．285种TMP．295既pTMP．309聊柙LQho，1TMP．31‘蜉TⅣ口．32‘聊◇5聊◇TMP．33n，、L＼-N， 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选化合物化合物结构编号5既p’既柙TM口．36’哪0、TMP．34TⅣlP．35＼。!—＼_N，、N—TMP．379取pTⅣfP．38渖TM口-39Q：尹5—＼_N—b∞。℃叹TMP．40Q：尹’TⅣ【P-41TM口_42Ⅺ、oTMP．43TMP．44’弧T～IP．45。D巩‘D孔、oL、厂、L、o＼_尸“嘲5D巩TM畔_48oa。肿-46TⅣ口_47L’＼～。一＼r41 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选第四章药理实验及构效关系的初步探讨4．1实验方法复苏一株Bcl．2空载体Hela细胞及一株Bcl．2高表达的Hela细胞，在细胞对数生长期时，分别将两株细胞接种于96孔细胞培养板中，4000个／孔。37℃，5％C02培养箱中培养24小时。把化合物稀释成筛选剂量，分别加入两株细胞中，化合物作用时间为48小时。化合物作用时间结束后，用MTT染色法测定细胞存活率，计算出化合物对两株细胞的生长抑制率，并计算IC50。对Ic50进行比较，看化合物是否在两株细胞间有选择性抑制，由此来判断受试化合物的效果。4．2实验结果表4—1化合物T卿一1—1"MF-20和Z24分别对HeLa空载体和高表达的Bcl一2HeLa细胞的IC50值Table4-lThe1C50valueaboutcompoundsTMP一1～TMP-20andZ24separatelytospatialcarrierHeLacellandhighexpressionBcl-2HeLacel化学IC50lC50／itM化学／uM编号Hela空载体Bcl．2HelaHela空载体Bcl．2HelaZ2469．7154．9Z2469．7l54．9T～伊．1115．95218．28T^，咿．1l毒性低TⅣ衅．219．55182．05TⅣ咿．12>300TⅣ咿-312．6929．42TⅣ口-1326．9856．63TMP-437．引59．05TⅣ口-14毒性低>300TMp．512．8963．95TⅣⅢ-15毒性低TM旷-628．0829．7T～Ⅱ"．16毒性低>300T～伊．749．18133．45TM咿-1710—3016．47TⅣⅢ．89．83100．73TⅣ口．1817．397．47TMP-971．4240．6lT^，巾．1913．5716．7T^，伊．1024．4834．15TMP．2027．45lO．1 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂7．24结构改造物的设计、合成与筛选表4—2化合物TMP-21一TMP-40和Z24分别对HoLa空载体和高表迭的Bcl一2HeLa细胞的IC50值Table4-2TheICs0valueaboutcompoundsTMP-21～TMP-40andZ24separatelytospatialcarrierHeLacellandhighexpressionBcl-2HeLacell化学IC50／uM化学／uM编号Hela空载体Bcl．2HelaHela空载体Bcl．2HelaZ2469．7154．9Z2469．7l54．9T^，口．211．25O．89TⅣ口．3l>30016．47T^，Ⅲ．2244．3422．3T^，口-3259．7558．8lTⅣ衅．2320．1618．18T^，衅．3314．5812．02TⅣ口．2434．0841．05T^，咿-3420．034．15TMP_2540．4475．55TMP-3523．7523．67TM口．2626．0428．74TⅣ口．368．329．995TM口．27>300232．97T^，咿．3731．6424．81TM旷．2820．1331．33TⅣⅢ-3831．3l57．44TMP．2955．3439．5lTMP．3915．0113．89T^，田．30>300337．66T～口．40lO．3310．14根据以上数据，对目标化合物对空载体和Bcl-2高表达的HeLa细胞的IC50值分别取对数做如下的柱状图。可知目标化合物对空载体和Bcl．2高表达的HeLa细胞的作用活性。2．52一三=1．5昌葛≮lH0．50空载体一- 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选2．5芏2{1．5S1兰O．5OBcl一2高表达z24TIIP—lTMP-2TMP-3TMP一4TMP一5TMP一6TMP一7TMP8TMP一9TMP—10图4—2．化合物TMP-1～TMPl0和Z24对高表达的Bc卜2Hela细胞的作用活性Figure4-2．ThefunctionactivenesstoHighexpressBcl·2HelacellaboutthecompoundsTMP-I～TMPl0andZ24空载体j||j||j||j||||_■1___．_．_．_． 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选32．5气蚕2三兰1．5昌Uo1普0．5OBcl一2高表达-_．-．．__Il1．11．一 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选32．5一12盏；1．5=童1o兰0．50—0．532．5一三2兰21．52≮1—0．5OBcl一2高表达■●__1．_Z24TMP—TIdP—TMP—TMP—THP—TMP—TMP-TMP—TMP-TMP一图4—6．化合物TMP一21～TI¨"P30和Z24对高表达的Bcl-2Hela细胞的作用活性Figure4-6．ThefunctionactivenesstoHighexpressBcl一2HelacellaboutthecompoundsTMP-21-TMP30andZ24空载体_·■__I___●__■_．_．_．■__．_■_ 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选2o七1．5：=詈l0o譬0．50Bcl一2高表达Z24TMP—TMP—TMP—TMP—TMP-TMP—TMP-TMP—TMP—TMP一3l323334353637383940图4—8．化合物TMP一31～TMP40和Z24对高表达的Bcl一2Hela细胞的作用活性Figure4-8．ThefunctionactivenesstoHighexpressBcl-2HelacellaboutthecompoundsTM畔-3l~T^佃q0andZ24对目标化合物对空载体和Bel．2高表达的HeLa细胞的IC50比值取对数做如下的柱状图。可知目标化合物对空载体和Bel．2高表达的HeLa细胞的选择性。奄0．4自0．2g0逞一0．2g一0．4吕一0．6普一0．8一l选择性·■Ⅲt■¨z●。t■t5T孟6T■7T8TMP-9■■_ 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选0．5O．40．30．20．1O一0．1—0．2—0．3—0．4选择性■．z24肿-11册12矗3僻_14廿15肥161{景7僻-18属9脏■一■I+|jj—jjjjjjjjjojojjjjjjojjoj·』一jj‘_一?i?_i_7i7_i_一i_一．一．．_．．●．删⋯-⋯zTMP氆量t”：s晨eTMP哪41s僻一z。晨。_ 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选1．41．210．8O．6O．40．20一O．2—0．4选择性1．⋯_．．．．■．⋯．zzt珊一肿僻一■珊一悬僻一■肿一僻一3l3233。曩。353637Ill3940图4—12．化合物TMP-31一TMP一40和Z24对Bcl-2的选择性作用Figure4-12．TheselectivefimcdontoBcl一2aboutCompoundsTMP-3l～T～伊40andZ24小结：TMP-9，TMP一18，TMP一20，TMP一21，TMp-22。TMP一23．TMp-29，TMP一31．TMP一33．TMP-37．TMP-39，TMP一27共12个化合物具有选择性抑制作用，且TMP-9，TMP-20，TMP-22，TMP一23，TMP-29，TMP一31，TMP-37共7个化合物毒性较低，具有与阳性对照Z24活性相当或更高活性。TMP_18，TMP-19．TMP-21。TMP-33．TMP-36．TMP-39．TMP一40共7个化合物毒性较强。虽然TMP-18．TMP-21．TMP-33．TMP-39具有一定的选择性，但毒性较大。TMP一27也具有一定的选择性，但活性太低。49一“．Hu∞日H∞=。∞uH＼日一∞王。∞uHv∞．[ 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选4．3构效关系的初步探讨1．当R3是。““／，、<，c一／、o．cF、o时活性顺序依次减弱；2-当R3是cHpo时，化合物有一定的选择性；3t当R2和R3分别是之skc一|年口cH2＼／～‘时化合物具有较强毒性；4．当R2是“、《：》=：：丁cH2时化合物的活性和选择性也较高；5t当R2是。E叮c心时表现一定毒性6．苯环是5-F取代时活幛和诜择件都轻高：7．苯环是5-C1取代时，含c岭一N／的化合物活性都较高，但具有一定的毒性l8．苯环是5七I取代时，含cP／、q二、0的化合物毒性都较低；9．苯环是5cl取代时，含cH／、N<)结构的化合物活性适中；10．C-3位的双键取顺式构象为药效构象。50 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选第五章结论1．以z24为先导化合物，根据相关的经验规律和药物设计方法，对其进行结构上的改造，设计并合成-r40个新化合物和8个关键中间体。所有合成的化合物经质谱和核磁共振氢谱确证其结构，部分化合物还通过了元素分析。2．参考文献对Z24化合物进行了化学合成。3．目标化合物TMP—I～TMP一40的盐酸盐都具有较好的稳定性，符合药物稳定性的质量控制要求。4．药理实验结果表明，目标化合物中TMP-9，TMP一20，TMP一22，TMP一23，TMP一29，TMP一31，TMP一37共7个化合物选择性较好且毒性较低，具有比阳性对照Z24相当或更好的选择性。其qbTMP一9，TMP一22，TMP-31表现出相当好的选择性。 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选参考文献【1】李世宽．Bcl-2家族【J】．医学综述，2000，6(9)：387—388[2】韩康朝，邹继彬．Survivin和Bcl—2蛋白在乳腺癌中的表达及其临床意义[J]．海南医学。2005．16(4)：144—145【3】吴静，路红，薛群基．Bcl-2基因的研究进展【J】．世界华人消化杂志，2004，12(9)：2171．2173【4】刁世勇，王敏．Puma的研究进展【J】国外医学输血及血液学分册，2005，28(2)：118．121。【5]李文琦，廖静．Bcl-2基因与肺癌研究【J]．国外医学呼吸系统分册，2005，25(2)：94．97【6]Muchmoresw,SattlerM，LiangH，eta1．Nature，1996，381：335【7】LuHal—Yan，LinChen，LiSong，eta1．Antitumoractivityofanindolin一2一ketonecompoundZ24invivoanditsanti—angiogenesisactivity[J]．ChinJPharmacolToxieol，2003，l7(6)：401-407【8】OltvalZN，MillimanCL，KosmeyerSJ．Cell，1993，74：609【9】ZhaH，AimeSC，ReedJC．JBiolChem，1996，2717：440【10】BloemA，LockhorstH．PatholBiol(Paris)，1999，47：216【11】DavidSS，PreparationofOxindole[J]．JChemEdu，1993，70：332【12】TilmanOltersdorf,StevenW，AlexanderReta1．AninhibitorofBcl一2familyproteinsinducesregressionofsolidtumours[J]，Nature，2005，435(6)：677—681【13】PedroJoseReal，YeyuCan．Breastcancercellscanevadeapoptosis-mediatedselectivekillingbyanovelsmallmoleculeinhibitorofBcl一2[J】．CancerResearch，2004，“(11)：7947-7953[14】Li·liWang，Zhi-bingZheng．Antitumoractivitiesofanovelindolin-2-ketonecompound，Z24：morepotentinhibitiononbFGF—inducedangiogenesisandbcl-2over-expressingcancercells[J]．EuropeanJoumalofPharmacology,2004．502：l一10【15】吴曼，付明，郭顺星等．氧化吲哚类化合物z24的体内抑瘤活性及其血管生成抑制作用【J】．中国药理学与毒理学杂志，2003，17(6)：401-407 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广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、台成与筛选攻读硕士学位期间发表的学术论文1．王立升，朱红元，唐满平，于海侠等，4一氯二甲苯胺的单一对应体的合成，广西大学学报(自然科学版)200530(11：51．53．2．唐满平，郑志兵，王立升，李松，吲哚酮类衍生物及其用于制备抗肿瘤药物用途．(专利申请中) 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．1附录I：TMP-1～TMP-40的核磁谱(1H-NMR)图TMP．2iP‘I3i：．—上一一i山jjj⋯_^“§臻{琴穗，⋯⋯n-^⋯．¨tl‘【{’1I一嚣l纛滋⋯；嚣==一：f：r—————]：薯：。：?‘，t《：：=．，。：‘R：％⋯s，：⋯，*‘1、’oh⋯⋯4_⋯⋯I嚣：鬻k：嚣嚣-篇Z张?：0．．箕蠹器f：；f冀．蓄!．，～i《芝!i堞蕊；一‘⋯⋯10!黧爹一!its搿#一‰羹≈戮撩‘*黧一％-}嚣“：‰r⋯～甚嚣怒：{舻笺屯；謦。}嚣：P：：-：矗Ⅲ⋯馨箍!§r一蛰#Ⅳ嚣：：黼篇嚣鼍：二，：弹⋯“可 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂224结构改造物的设计、合成与筛选58 广西大学硕士学位论文Bel．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选们帅．5TⅣm．6 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．7；7"孙舭；㈡黝llCl黪羹魏嚣i瓣瓣?蘩爨_i掣iTMP．8C≯绀j。：f{d”●f】-¨m，n^，¨dm?||．6J_‘。；黪瓣l露r。薹嚣一端=j⋯：；锶≥鹦r⋯一：品：=一?P”：墨意妒粥蛳*m：b；{声；赫赫；⋯⋯强辕x；器“1：{i：嚣嚣蕊，：孽{篙一；曩誊算≯“m≥N吣怎／『取雾辇葭鋈*-，。¨张口l目#赫≤‰*￡¨露 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．9_±TⅣ【P．1gO＼．。f|i。黔／．．血圳lm●¨7q^d5uil瓣}麟轴，)8}6‘’；蠡器臻鬃鬻6l{A⋯妣～一蓊戮：：蚶=⋯”。?!t?4麓!惫?一jj褒巍铲。．{甜‘蕊⋯：}勰⋯⋯⋯·{§；j毡!F=，蛊l辇§：：辫鼢⋯}!!一}_⋯⋯”i蕊：!溉：i戮⋯’；；．i笼：“!澎：鬣‰囊麓=：∞端：：!：{一，嚣懑强i：=n：；!黼：～i苷j筠l黎拦；i辫‰··；#麓：!嚣”“!麓著蕊戮。。l，。，，oi呲．一，，；，，～；；；一 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．13”¨⋯磊：，。‘一”‘。5。”|瓣黧婺嚣l、Pm4附”^l●tI⋯．¨1TMP一14i：∞。。．：：：：％忙’。．⋯i巍；黜鲁!翟g。，⋯”}霸=ii羹≯H端⋯豢繁}；≥#：{强K‰豢妊i枣勰础严“囊§黔tji强}“””““嚣釜笠鬈!i·i豢；一i弘篙～￡蕊尊ji裂鼬·l惫：；》“臻鸶i强；戮。。==K吡 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TM[P．17TMP．18=i簧⋯?嚣，。篡i0。，i：鹊冀￥船。。。耋：：?：*?‘。：。馨嚣m饥““”蠡一鼍：．嚣一l}，“叫坝一川址一；一一慧泽蠹磐～瓣雾薰豪心 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文BcI一2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．21TMP一22． 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选68 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．25TMP．26’Fj一‘：。+【：；：：；：鼍‘rh卅啊一强昂：器“、：：?”””‘I“q：盐“”“-Hl：裟搿“””岫⋯器≯；鍪pwii妊强P’翼瓣鏊；蕊。。。≤童Ⅲj■。饕豢黎i灞争爨、l⋯，i：鍪鋈塑：．～————豁巍毪著器撇燃娶瓣鬻；；。《 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TⅣ【P．29．FTM口．30!‘-¨^一·⋯"，k●’{-It、一·，1q，’■⋯●●¨·’_，‘’01●●f』J，⋯●-■i臻：臻势躺““‘’rt⋯1-‘I‘r⋯．J⋯●●●々⋯●r■_，‘●”v‘"．1”{+，●●I“．，Jt⋯^’t■o“01‘，。""f●≈，●¨I”■1搿：譬：：：*“㈨，i；髫·t；：誉””⋯”。⋯‘’“’i‘～‘‘一～●●¨o“⋯’a⋯‘⋯‘L‘l●●I{#；t9t⋯⋯E⋯_|‘■‘n．1"f-¨‘”q⋯’，，，0●h"』，“}1⋯’’⋯t^Jt^●⋯^⋯‘’"T{‘I"I=}=：篓⋯●’‘●●t-⋯l^tc"‘lJ“’·．I-I■⋯tt●■¨I⋯It¨●’”nIt口“⋯-}二’“4¨●P●l；茹：，％⋯5聊◇i‘量曹“佃；；搿．。：：譬嚣=‰吾?箍．“L嚣窖：p“一飞嚣：一”’麓嚣。。LO，}：≈!：”_鬻嚣嚣眷：II：小n。。‘鼍‘9“3“”⋯jqI}“F⋯暌楚蠹7l。ll●●●，，●●二№●i，以。缎轴一¨≈_I}i，i．陵”j-jI．，k严，i二ih，p 广西大学硕士学位论文Bel-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．33+，搿鬻-’#：F爿州努；嚣鬈lI；TⅣ呼一34{：。：警i：；H％’譬二甍。。：：¨-。舞^§l§F』。●●燃ili。i＆一ni蕤；翠茹；莲麟i琵整葵L—!—}!=％一————⋯一．一——⋯一!：=船i≯，“：t：：：⋯⋯‘’：：o=”蚋：：．+”‘”“⋯j瓣=÷澎：鬻：：：～‘：·∞：：o””“““裟壤⋯；；黼⋯{嚣。。；雾““’：：：：‘”：：??iP豫一：。．．’=：。f．々I；；；0；。 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选74 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP一37TMP．38}，lf?冬巷—血蕴i!“fIillF}2l￡t}黼i=黧l瑟≥§熬L——』生也竺!=些墼旦⋯；t·．=掌晰n?j器产’i：：§k⋯：j踹％r、。⋯篙甾：P“：蒜搿-⋯¨””●⋯1El●·h鍪20t：警§勰i警mi辫‰∥～l镄鎏!￡瓣黼⋯“Ji；麓?!淤=掰‰麓銎：；誊茹；；*驴“i}招kt：：≮嚣⋯⋯，：怒?⋯“：h簌麓。，!誉酱Wm■-”i5h“!，‘I⋯，E：一⋯Wo-“№}k‘∞-⋯Ⅲ-^"，’‘’r⋯-of：口L¨I口”E⋯●●L-nwc"oielJl_‘t⋯⋯‘”“^l”-1m⋯⋯⋯，gj‘自l：●“：；羹r．1●J●●●I，Im卧§●●，L叫i!I．●●●，●L}●●f～I}}●i●』一；●0默●l 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、台成与筛选 —J耍查堂堡主兰垡堡苎!!!：!堡皇塑型型!翌苎塑整垄塑塑望生：盒堕兰堕垄TMP．1附录II：TMP一1～TMP-40的质谱(MS)图．。”嘎盛呵一◇◇弋邕：≥夕一．卜了，悄。，孓，，1，T．聊-2ni{《：。|一Ik一≤警l 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂／24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．5TMP．6№low盯*M】皇∞日柳¨目§州∥一baqP嗽∞≮·"警k，l哗。弹。毪，。，啤矿譬。，。。，∥。。矗。毪，一。，巴r。，且．。O 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．7菇i硪酮菇币两r⋯——～t警“’州’”譬≯”4“’!}“●tF●·TMP-8蕊聪鬻嚣瓣二忑⋯"oU40∞Sl■■_t№pkp掰 广西大学硕士学位论文Bcl-2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选8l 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选 广西大学硕士学位论文Bcl．2蛋白抑制剂Z24结构改造物的设计、合成与筛选TMP．13l_若TMP．14‘6Ⅷ_m¨1*’∞"c嚣躺{￡茹”∞∞∞4Ⅻ∞a㈣mm誓蔫悉鬻妻警《ⅢI1强{羁|蒜了■撕孕矿j％{l}薨w醚I穹-”≮．【．J．“m印b眶 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