卵母细胞质量评定方法

'中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2008,28(7):116～121综述3卵母细胞质量评定方法33徐盛玉吴德王定越(四川农业大学动物营养研究所四川省动物营养与饲料工程重点实验室雅安625014)摘要在辅助生殖领域及繁殖科学中常涉及对卵母细胞质量的评定,据卵母细胞发育过程中的结构变化和生化变化,卵母细胞的质量评定主要涵盖对卵母细胞形态和成熟度的考察。从非侵袭性技术和侵袭性技术分析的角度论述了卵母细胞质量评定的方法,为合理评价卵母细胞质量提供了多种有效途径。关键词卵母细胞非侵袭性技术侵袭性技术质量评定中图分类号Q2在合子形成过程中,精子和卵细胞都提供了遗传育及成熟过程中超微结构的变化非常重要。物质。除此之外,卵细胞还为早期胚胎的发育提供了1.1卵母细胞质膜、透明带与卵周隙大量必需的营养物质。因而,作为卵细胞的发生基础,由单层扁平颗粒细胞包围的卵母细胞,质膜表面光卵母细胞质量的高低直接关系到合子发育甚至是新生滑并与颗粒细胞膜相贴,之间有桥粒连接。由立方颗粒个体一生的命运。大量的试验研究也表明,卵母细胞细胞包围时,卵质膜上开始出现短小的微绒毛。当颗粒质量的好坏将直接影响卵细胞的受精率、受精卵的卵细胞变成两层时,开始出现透明带,微绒毛伸人透明带裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和维持、胎儿的发内。卵泡腔出现时,透明带增厚,此时微绒毛多且长并垂育,甚至成年后的健康问题。因此,选择高质量卵母细直插入透明带内。直径为2mm的牛卵泡和0.5～1.0mm胞对于辅助生殖及体细胞克隆等技术来说至关重要,的山羊卵泡中的卵母细胞,透明带内的微绒毛开始缩短而如何来评价卵母细胞的质量则成了辅助生殖技术领变粗,并逐渐从透明带退出。卵母细胞成熟后,微绒毛则域及繁殖科学面临的一个关键问题之一。[1,2]全部倒伏在卵的表面。卵母细胞第一次成熟分裂后,卵母细胞质量的评定工作各国学者的方法标准不排出第一极体,卵细胞质收缩,卵黄膜和透明带之间出现一,不利于进一步研究。本文就卵母细胞的质量评定一个小的裂隙,称卵周隙或围卵腔。方法从非侵袭性技术和侵袭性技术分析的角度进行讨1.2细胞器的变化论,旨在为卵母细胞质量的高效评定工作提供参考。卵母细胞生长发育过程中细胞器的变化最为显著。总的变化规律为:大多数细胞器最初分布于近核1卵母细胞发育及成熟过程中结构的变化区,随着卵母细胞的生长发育,线粒体、高尔基体、粗面卵母细胞质量的评定主要是分析卵母细胞的形态内质网、皮质颗粒等细胞器不断丰富和增多,并逐渐向结构和其成熟度,评定的基础是卵母细胞在生长发育皮质区迁移,在细胞中央形成不含细胞器的“透明过程中的结构变化和生化变化,因此了解卵母细胞发区”[3,4];卵母细胞成熟后,除皮质颗粒外,其他的细胞器又向卵子中央迁移,最终高尔基体和内质网消失,线收稿日期:2008201230修回日期:2008204214[5～7]粒体则分散在胞质中。3教育部创新团队计划(IRT0555)、国家自然科学基金(30471257)资助项目1.3细胞核的变化33通讯作者,电子信箱:pig2pig@sina.com生发泡期(GV期)卵母细胞,在促性腺激素作用下 2008,28(7)徐盛玉等:卵母细胞质量评定的方法探讨117恢复减数分裂,光镜下可见细胞核膜破裂,核仁消失,核有关的mRNA和蛋白的储存相关。以上研究表明卵泡内物质与核质混合,此过程即为生发泡破裂(GVBD)。越大、成熟度越高,其中的卵母细胞质量越高。卵母细胞在成熟发育过程期间,其染色体(二倍2.2卵周隙、第一极体的形态建立的评价方法体)经历了中期I、后期I和末期I,排出第1极体后停卵母细胞成熟过程中经历两次减数分裂,排出极[8][2]滞于第二次减数分裂中期(MII)。研究牛和山羊体形成卵周隙。极体的排出表明卵母细胞发育经历了发现,从单层颗粒细胞包围的卵母细胞到早期有腔卵正常的程序;而卵周隙越大,表明细胞质收缩越厉害,[16,17]泡的卵母细胞,核仁由颗粒性染色质丝的不规则缠绕导致卵母细胞质量越差。Xia,Ebner等在研究中[2]而逐渐形成网状结构,其间有许多空泡。羊卵泡直将卵母细胞分级。I级:卵周隙正常,第一极体完整,形径为0.5～1.6mm时,核仁中出现很多电子致密度较低状规则圆或椭圆,表面光滑;II级:卵周隙正常,第一极的纤维中心,此时的核仁由颗粒性染色质丝、空泡及纤体完整,圆或椭圆,表面粗糙;III级:卵周隙正常,第一维中心组成,rRNA和hnRNA合成十分的活跃(rRNA极体破碎;IV级:卵周隙过大,第一极体巨大型;V级:的合成场所在纤维中心,核仁空泡则可能与核仁物质卵周隙过大,第一极体破碎。所以,第一极体形态和卵[9]的运输和贮存有关);随后,空泡消失,核仁发生致密周隙大小与卵母细胞的受精率和胚胎质量相关密切。化。核仁的致密化伴随着rRNA合成的急剧下降,使核以上的研究结果表明,I级卵母细胞体外受精率、优质[10,11]仁由RNA的合成场所转变为RNA的贮存场所。胚胎率、种植率和临床妊娠率都显著或极显著高于其[18]核仁致密化的时间随动物不同而异,如小鼠在卵泡腔他各级形态的卵母细胞。说明根据卵周隙、第一极形成之前发生核仁致密化,猪则发生在早期有腔卵泡。体形态可有效地评价卵母细胞的质量。在卵母细胞的发育过程中,核孔越来越明显,密度增2.3纺锤体形态观测法[8]加,且核周隙越来越难以分辨。纺锤体是由极间微管、染色体牵丝及区间牵丝排列组成的中部宽阔、两极缩小的形如纺锤的结构。细2非侵袭性技术对卵母细胞质量的评定胞分裂过程中,纺锤体对卵母细胞染色体的平衡、运非侵袭性技术也即无损分析技术,通过观察卵母动、分配和极体的排出有非常重要的作用。纺锤体异细胞的形态和其他不损害卵母细胞生物活性的方法进常,会导致异常的减数分裂,所产生的不正常卵母细胞行判断,由于不会影响卵母细胞的进一步发育,因而很受精后可能产生异常胚胎。[19]适合应用于辅助生殖等生物技术领域。朱亮等应用LC2PolScope纺锤体成像系统(美国2.1卵巢重量和卵泡大小评价法SRI公司生产)观察人的成熟卵母细胞(即有敌意极体卵巢和卵泡对卵母细胞的发育起着营养调控和支存在的卵母细胞)纺锤体存在的情况,结果显示观测中撑作用,研究表明卵巢的大小与重量直接影响卵母细有纺锤体的卵母细胞的正常受精率和良好胚胎形成率胞的质量和数量,重量在2.000～4.000g的猪卵巢中均明显高于无纺锤体的卵母细胞。这提示,成熟卵母[12]能获得更多的A级卵母细胞。通过卵巢重量预测细胞纺锤体的存在可以反映其质量的高低。有相当一[20]卵母细胞质量这种简单快捷的方法,可提高卵母细胞部分无纺锤体的卵母细胞本身存在染色体异常。的采集效率。LC2PolScope纺锤体成像系统是一种能够对活体细胞纺发育后期的卵母细胞浸润在卵泡液中,不同阶段卵锤体进行无毒、无害的观测的技术。此系统较以往研泡中卵泡液的成熟程度不同,对卵母细胞成熟的影响存究卵母细胞纺锤体的技术而言突破了非侵袭性的观测在差异。将卵母细胞与来源于不同阶段卵泡的卵泡液共这一难题。同培养,结果显示,较大卵泡卵泡液培养的卵母细胞成熟2.4渗透压处理法[13][14]比例显著高于小卵泡卵泡液。Marchal等研究猪卵质量不同的卵母细胞的渗透调节机能存在差[21]泡大小对其卵母细胞减数分裂和体外受精后进一步发育异,因而可据此判断卵母细胞的质量。3%蔗糖操能力的影响,体外培养结果表明来自大卵泡(>5mm)和作液(3%sucrosecontainingoperationmedium,3中型卵泡(3～5mm)卵母细胞的成熟度、受精率及囊胚率SCOM)处理小鼠MII期卵母细胞,渗透压恢复后细胞[15]均显著高于小卵泡(<3mm)。Krisher等认为卵泡的形态也恢复的卵母细胞与未处理的卵母细胞进行IVF大小影响卵母细胞的质量可能与影响卵母细胞发育能力(体外授精)比较,结果显示二者受精率和卵裂率差异 118中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.72008[22][21,23]不显著。Wang等在核移植的去核操作中采用和客观性,仍不失为一种有效的评定手段。3SCOM处理小鼠卵母细胞,后经IVF和ET,已得到产3.1ATP含量测定法仔。说明使用3SCOM处理后的卵母细胞的进一步发ATP(三磷酸腺苷)由线粒体产生,除为机体提供育不受影响。能量外,其功能还包括维持细胞活力,细胞内环境的稳[24][28]周佳勃等利用0.3mol/L的蔗糖溶液处理排出态以及调控细胞存活等。因而,ATP的含量在一定第一极体的成熟卵母细胞,发现体外成熟的山羊卵母[29]程度上能有效反映整个细胞的活力。Catherine等在[21]细胞在高渗液中呈现不同形态,按Wang等的分类评价由绒毛膜促性腺激素重复刺激后的小鼠的卵母细法分类并进行卵胞浆内单精子注射(ICSI)时,III类卵胞质量时,通过测定不同时期的ATP含量来评价卵母的注射后存活率、受精率和桑椹/囊胚率均高于I、II类细胞质量。Tiziana等[30]深入论述了ATP与猪卵母细卵。这说明体外成熟的卵母细胞即使排出了第一极胞活力的关系也即卵母细胞质量间的关系,并通过测体,质量仍有很大差异。定ATP的含量反映卵母细胞发育的成熟度。该研究发3SCOM对卵母细胞具有高渗作用,采用3SCOM现从猪卵巢中收集的卵母细胞未经成熟培养时ATP含对卵母细胞进行预处理,不仅在形态上,而且在功能上量为1.21±0.1pmol/卵母细胞,而成熟培养后每个卵能区分具有不同渗透调节机能的卵母细胞。运用渗透母细胞的ATP含量可达3.60±0.51pmol,差异达极显压处理法在辅助生殖过程中不仅能有效的评价卵母细著水平。说明通过监测ATP含量的变化可有效反应该胞的质量,而且可以直接淘汰质量差的卵母细胞。阶段的卵母细胞质量。2.5体外受精(IVF)、体外胚胎培养评定法3.2GSH含量评价方法卵母细胞质量的好坏直接影响卵母细胞的受精谷胱甘肽(GSH)在卵母细胞中的主要功能是参与率、卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和维持、胎儿抗氧化作用和抵抗活性氧(reactiveoxygenspecies,的发育,因此这些指标是考察卵母细胞质量的可靠依[31]ROS)的毒害,维持减数分裂纺锤体的形态,并且在[25]据。Grazul2Bilska等,通过体外受精并培养8d后观胞核和线粒体周围GSH浓度较高,可保护DNA免受氧察绵羊胚胎的发育情况,考察不同母体营养水平对卵自由基的损害,从而起到保护卵母细胞的作用。[26]母细胞的质量影响。Adamiak等在研究小母牛不同卵母细胞胞质的成熟度可以通过细胞内GSH含体况与不同饲喂水平和饲粮不同组成对卵母细胞质量[32]量来判断。研究显示体内成熟的猪卵母细胞中的影响时,通过考察体外受精、胚胎培养等方法评价卵[33][27]GSH浓度为36.26pmol/oocyte,远高于体外成熟卵母细胞的质量。Wu等为了比较生长2成熟系统和传母细胞的GSH浓度。这种差异可能的原因是体内、统的成熟体系在支持小卵泡卵母细胞的胞质发育上的外环境氧气含量差异大,雌性生殖道中氧气浓度仅相能力差异,观测了孤雌发育和体外授精胚胎在附植前当于体外成熟液中的1/3,体外成熟过程中,卵母细胞的发育情况,评估了电激活和授精24h和72h的2细胞动员内部GSH来抵抗氧化作用的伤害,导致GSH的期和8细胞期的卵裂率,培养7d测定囊胚率。从而比浓度急剧降低,并显著低于体内成熟卵母细胞的GSH较生长2成熟系统和传统的成熟体系在体外培养卵母细浓度。牛卵母细胞IVM过程中低氧压可以降低卵母胞质量的差异。细胞内H2O2的浓度,这有助于降低ROS而提高卵母细可见,尽管IVF、体外胚胎培养评定要耗费更多时[34]间和人力、物力去检验卵母细胞质量,相对快速评定有胞发育的能力。在成熟液中添加1.00mmol/L的一定的滞后性,但上述评定方法体现了卵母细胞进一GSH,对于提高性未成熟山羊卵母细胞成熟率非常有[35]步发育的能力,是卵母细胞质量高低最直观的反应,是效。这些研究表明,低氧或添加GSH有利于卵母细评价卵母细胞质量最直接的方法。胞的发育成熟,GSH可以抵抗ROS的毒害作用而保护卵母细胞。因而细胞内GSH的浓度反映细胞质成熟的3侵袭性技术对卵母细胞质量的评定程度,可以作为卵母细胞细胞质成熟程度的一个特征[36,37]不同发育阶段卵母细胞内的生化变化是建立侵袭性的指标。性评定技术的基础。尽管侵袭性评定技术对卵母细胞3.3CyclinB蛋白检测法造成不可逆损伤,但由于测定指标的可量化性、准确性CyclinB又称周期素B是减数分裂成熟过程中最 2008,28(7)徐盛玉等:卵母细胞质量评定的方法探讨119重要的蛋白之一,它的合成和降解对于卵母细胞减数分裂的连续性是必须的。CyclinB蛋白的含量是成熟促[38,39]进因子(MPF)活化的一个首要限制性因子。MPF是调节细胞周期进程重要的蛋白激酶,MPF启动细胞[40]由G2期进入M期,在卵母细胞减数分裂过程中起中心调控作用。[41][42][27]Sun等、Jesse等和Wu等的研究分别考察图1猪卵母细胞结构线粒体(红),微管(绿),了不同处理卵母细胞cyclinB的表达量,通过Western驱动蛋白(紫红),脱氧核糖核酸(蓝)荧光染色blot和光密度分析,表明CyclinB的表达量可以作为考Fig1Pigoocytesstainedformitochondria(red),察卵母细胞胞质成熟的有效指标。microtubules(green),kinesines(magenta),3.4线粒体和细胞质的区室化观测法anddeoxyribonucleicacid(blue)线粒体在细胞代谢中起主导作用,其形态、数量及LeftOocyteswithlowdevelopmentalcompetencedisplayaveryweak分布的变化与细胞的代谢水平、增殖及分化密切相关。stainingthatisconfinedtothecorticalarea.Theunevendistributionwill卵母细胞成熟时线粒体由皮质转向胞质中央区扩散,probablycauseincorrectcompartmentalisationoftheooplasm.Right:[4]有利于卵母细胞成熟过程中能量的利用。因而线粒oocyteswithhighdevelopmentalcompetenceshowauniformdistributionof体的形态、数量及分布可以作为评定卵母细胞胞质成cytoplasmicorganelleswithahomogeneouslocalisationofthemitochondria熟度的依据。throughouttheooplasm(originalmagnification400×)细胞质的区室化作用同样被认为是协调胞核和胞质卵母细胞发育能力的一种标志。成熟培养0～6h时,[43]成熟的重要因素。线粒体的活性和在胞质中的分布FSHrmRNA达最高峰,接着下降。在成熟培养6～24h可作为胞质区室化的标记,是卵母细胞成熟变化特征的的过程中LHrmRNA的相对量没有改变。但在质量较[44]众多标志之一。多数物种包括小白鼠、苍鼠、牛和猪差的COCs中,FSHrmRNAs和LHrmRNAs的水平均降线粒体的分布形式和代谢活力在卵母细胞成熟过程中均[47]低。提示监测FSHrmRNAs和LHrmRNAs的含量在不断变化。胞质中由微管网络介导的线粒体迁移运动cdc2可以对卵母细胞质量进行评估。P34蛋白对MPF激过程对于卵母细胞体外成熟条件下获得完整的发育能力cdc2活有重要作用。G2/M转变期P34蛋白被激活,使是必需的。图1是在激光共聚焦显微镜下观察到的猪卵cdc2P34的14Thr和15Tyr位点发生去磷酸化,MPF被母细胞线粒体经荧光染色后的图像,可见胞质中由微管cdc2激活,促进G2/M转变。P34基因的表达直接影响[45]网络介导的线粒体迁移运动。cdc2P34蛋白的含量进而影响卵母细胞G2/M的转可见,通过卵母细胞的荧光染色并和共聚焦显微[40]cdc2变。因而,P34mRNA的差量表达可以表征该阶镜结合观察线粒体、微管、驱动蛋白(kinesines)的分布[48]段的卵母细胞质量。Claude等研究发现在牛的卵母可反映卵母细胞胞质区室化的程度并能以此评定卵母cdc2细胞中P34mRNA的相对表达量在成熟卵母细胞中细胞的质量。显著的高于未成熟的卵母细胞。3.5基因表达差异法可见卵母细胞中特定阶段特定物质FSHr及LHr哺乳动物早期胚胎的发育完全依赖卵子发生时期合cdc2和P34等的mRNA表达量的差异可以表征卵母细胞成的母源核糖核酸(mRNA)和蛋白的驱动。母源信息发在该阶段的质量。挥作用的时间长短因动物种类而存在差异。哺乳动物母源/胚胎信息转换(MET)发生可以早到2细胞期的后期,4小结如小白鼠,晚一些的如猪在4细胞期,人在4到8细胞非侵袭性方法以不损伤细胞为目的,因而不会对细[46]期,兔在8细胞期。由此我们可以推断,未受精之前胞的进一步发育造成不利影响,非常适用于辅助生殖技的卵母细胞储存的mRNA含量将直接影响胚胎基因组术。侵袭性技术建立在细胞的生化变化基础上,主要以具有完全的转录活性之前的早期胚胎的发育。测定细胞内有关物质的变化为手段,用于测定后的细胞研究发现体外成熟过程中牛卵丘2卵母细胞复合体不再具有进一步发育的能力,但测定结果具有可量化性、(COCs)的FSHr的表达发生变化,推测它可能是显示 120中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.72008准确性和客观性,适用的范围更加的广泛。[17]EbnerT,YamanC,MoserM,eta1.Prognosticvalueoffirstpolarbodymorphologyonfertilizationrateandembryoqualityin参考文献intracytoplasmicsperminjection.HumReprod,2000.15(2):427～430[1]SunQY,QinPC.Studyonultrastructureofbovineoocyte[18]ZouSH,WuRY,LiFL,etal.TheimpactofMIIoocytedevelopment.JournalofShandongAgriculturalUniversity,morphologyontheoutcomeofintracytoplasmicsperminjection.1989,4:9～16JournalofReproductiveMedicine.2004,13(5):266～269[2]TanJH,SunQY,YangZM,etal.Ultrastructuralstudieson[19]ZhuL,ChenSL,XingFQ.Therelationshipbetweenspindlesthegoatoogenesis.ActaAnatomicaSinica,1992,23:106～andhumanoocytesquality.ChineseJournalofObstetricsand110Gynecology.2005,40(4):275～276[3]FairT,HulshofSC,HyttelJP,etal.Ultrastructureinbovine[20]WangWH,MengL,HackettRJ,etal.Developmentalprimordialtoearlytertiaryfollicles.AnatEmbryol,1997,195:abilityofhumanoocyteswithorwithoutbirefringentspindles327～365imagedbyPolscopebeforeinsemination.HumReprod.2001,[4]AsseyRJ.HyttelP,GreveT,etal.Oocytemorphologyin16:1464～1468dominantandsubordinatefollicles.MolReprodDev,1994,37:[21]WangMK,LiuJL,LiGP,etal.Sucrosepretreatmentfor335～344enucleation:anefficientandnon2damagemethodforremoving[5]GreewaldGS.IsolationandpreliminarycharacterizationofpigthespindleofthemouseMIIoocyte.Mol.Reprod,2001,58:primordialfollicles.JReprodFert,1989,87:561～571432～436[6]GronDG.Finestructureofthesheepoocyteduringantral[22]WangMK,LianL,ZhuZY,etal.Progressontheestimationfollicledevelopment.ReprodFert,1980,59:125～132ofthequalityofoocytes,zygotesandearlyembryos.Journalof[7]LiYL,QinPC.UltrastructuralstudiesontheoocyteReproductiveMedicine,2002,6,11(3):171～175developmentofswineovaries.ActaVeterinariaetZootechnica[23]WangMK,ChenDY,LiuJL,eta1.InvitrofertilizationofSinica,1985,16:73～82mouseoocytestransferofmetaphaseIIchromosomesresultsin[8]SunQY,QinPC.Changesinthenucleusofthedevelopinglivebirths.Zygote,2001,9(1):14～19bovineoocyte.JNortheastagriculturecollege,1990,21:234[24]ZhouJB,WuYG,HanD,etal.Effectsofspermandoocyte～248qualitycontrolonintracytoplasmicsperminjection(ICSI)in[9]CrozetN,MotlikJ,SzollosiD.Nucleolarfinestructureandgoats.ActaBiologiaeExperimentalisSinica,2004,37(5):RNAsynthesisinporcineoocytesduringtheearlystagesof367～374antralfollicles.Biolcell,1981,41:35～42[25]Grazul2BilskaAT,BorowczykEA,EvoniukWJ,etal.[10]MotlikJ.MeiotlicinvitroofpigoocyteisolatedfromearlyantralEffectsofovernutritionandundernutritiononinvitrofertilizationfollicles.JReprodFertil,1984,72:323～328(IVF)andearlyembryonicdevelopmentinsheephettinger[11]CrozetN,KankaJ,MotlikJ,etal.Nucleolarfinestructurersearchextensioncenter,47thannyalsheepandbeefday,NorthandRNAsynthesisinbovineoocytefromantralfollicles.DakotaStateUniversity,2006:56～66GameteRes,1986,14:65～73[26]AdamiakSJ,MackieK,WattRG,etal.Impactofnutrition[12]HuangBD,HuJH,LiQW,etal.Theresearchontheonoocytequality:cumulativeeffectsofbodycompositionandrelationbetweenweightofovaryandquantityoftheporcinedietleadingtohyperinsulinemiaincattle.Biologyofoocytes.JournalofNorthwestSci2TechUnivofAgrandForReproduction,2005,73:97～105(NatSci,Ed),2005,33(8):12～15[27]WuD,QueenieCK,Cheung,etal.Agrowth2maturation[13]Georgios,Vatzias,DanielRH.Effectsofporcinefollicularsystemthatenhancesthemeioticanddevelopmentalcompetencefluidandoviductconditionedmediaonmaturationandofporcineoocytesisolatedfromsmallfollicles.Biologyoffertilizationofporcineoocytesinvitro.BiologyofReproduction,Reproduction,2006,75:547～5541999,60:42～48[28]StJohnJC.ThetransmissionofmitochondrialDNAfollowing[14]MarchalR,VigneronC,PerreauC,etal.Effectoffollicularassistedreproductivetechniques.Theriogenology,2002,57sizeonmeioticanddevelopmentalcompetenceofporcine(1):109～123oocytes.Theriogenology,2002,57:1523～1532[29]CatherineMH,Combelles,DavidFA.Assessmentofoocyte[15]KrisherRL.Theeffectofoocytequalityondevelopment.JqualityfollowingrepeatedgonadotropinstimulationintheAnimSci,2004,82(ESuppl):14～23mouse.BlologyofReproduction,2003,68:812～821[16]XiaP.Intracytoplasmicsperminjection:correlationof[30]TizianaAL,BreviniR,Vassena,etal.Roleofadenosineoocytegradebasedonpolarbody,perivitellinespaceandtriphosphate,activemitochondria,andmicrotubulesinthecytoplasmicinclusionswithfertilizationrateandembryoacquisitionofdevelopmentalcompetenceofparthenogeneticallyquality.HumReprod,1997,12(8):1750～1755activatedpigoocytes.BiolReprod,2005,72:1218～1223 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