猪主要养分生物学效价仿生评定方法的建立与应用-张宏福

'1猪主要养分生物学效价仿生评定方法的建立与应用中国农业科学院北京畜牧兽医研究所2013-1-19张宏福 2021/7/15http://www.klan.net.cn2一、项目背景及主要研究内容二、课题主要研究进展1.猪消化液的生物学特性研究2.猪模拟消化液的制备方法3.猪饲料消化率仿生法评定操作技术规程4.仿生法评定猪饲料养分消化动力学的研究5.仿生法评定猪饲料有效磷的研究三、下一步工作计划目录 2021/7/15http://www.klan.net.cn3一、项目背景及主要研究内容 饲料生物学效价仿生评定方法研究动物指标内容仪器定型：以现有3台为基础鸭有效能仿生试剂：试剂的制作方法、保存稳定性缓冲液：配制方法鸡氨基酸消化参数：时间、剂量操作规程：全套使用规程猪有效磷适用性：谷实、饼粕、动物蛋白、粮副可靠性：重演性、单位比对、动物试验结果比对 科技部创新方法专项于7.19日通过验收，取得“原创性成果” http://www.klan.net.cn71.猪肠道消化生理的研究通过在猪小肠部位安装瘘管采集猪小肠液，研究猪活体肠道动态食糜流量及其消化液在不同外因条件下的酶活变异规律。猪模拟小肠液的研制配制试剂盒仿生消化操作规程的建立仿生消化仪评定猪饲料养分生物学效价参数，建立操作规程猪饲料能量、氨基酸、磷仿生消化评定方法的研究利用仿生仪建立猪饲料能量、氨基酸和磷的消化评定方法，并和生物学法相对比，实现对猪饲料养分生物学效价的预测和评定。猪主要养分生物学效价仿生评定方法的应用本课题主要研究内容 2021/7/15http://www.klan.net.cn8二、主要研究进展 http://www.klan.net.cn9日粮蛋白来源蛋白水平测定指标目的1豆粕17%胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性；Na+、K+、Cl+、Ca2+、Mg2+浓度猪小肠消化环境信息的获得模拟小肠液的配制依据2豆粕14.5%3豆粕、棉粕、菜粕17%4豆粕、棉粕、菜粕14.5%（一）猪消化液的生物学特性研究1、日粮蛋白来源和水平对生长猪空肠液组成的影响 10日粮蛋白质来源和水平对空肠液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性无显著影响（p>0.05）；日粮蛋白来源和水平对空肠液主要消化酶活性的影响 日粮蛋白来源和水平对空肠液主要离子浓度的影响11日粮蛋白质来源和水平对空肠液中5种主要离子（Na+、K+、Cl+、Ca2+、Mg2+）的浓度无显著影响（p>0.05）； http://www.klan.net.cn122.日粮粗纤维水平对生长猪盲肠液组成的影响日粮粗纤维水平测定指标方法目的13.05%纤维素酶活性；Na+、K+、Cl+、Ca2+、Mg2+浓度；pH生长猪盲肠安装瘘管猪盲肠消化环境信息的获得大肠消化液的配制依据23.49%34.47% 13饲料纤维素酶活（U/mL）pH低纤维日粮0.079±0.0126.33±0.08b中纤维日粮0.084±0.0096.23±0.07b高纤维日粮0.066±0.0066.71±0.09a均值0.0766.42SEM0.0260.56方差来源,p值饲料0.24<0.01期0.430.43试猪<0.010.04日粮粗纤维含量和试验期对猪盲肠液中纤维素酶活和pH无显著的影响（p>0.05）日粮纤维水平对盲肠纤维素酶活性的影响 14日粮纤维水平对盲肠主要离子浓度的影响日粮纤维含量对猪盲肠液中钾、氯、钙、镁浓度有极显著影响（p<0.01）。各处理间钠离子浓度差异不显著；低、中纤维日粮组钾离子浓度显著高于高纤维日粮组；低纤维日粮组氯离子浓度显著低于高纤维日粮组；低纤维日粮组钙离子浓度显著高于中、高纤维日粮组；低纤维日粮组镁离子浓度显著低于中、高纤维日粮组（p<0.05）。 151.体外仿生消化模拟消化液配制参数胃期小肠期大肠期消化酶种类活性胃蛋白酶737.5U/mL淀粉酶221.43U/ml脂肪酶3.34U/ml胰蛋白酶8.68U/ml糜蛋白酶69.10U/ml纤维素酶0.076U/mL缓冲液离子种类和浓度Na＋80.6mmol/LK＋6.0mmol/LK+14.95mmol/LCL-116.69mmol/LPBS0.2MK+11.08mmol/LCL-25.12mmol/LPBS0.2MpH2.06.446.42（二）猪模拟消化液的制备方法 16生理指标模拟消化液内源肠液提纯酶商品酶肠液消化酶提纯方法：直接冻干法饱和硫酸铵法2.模拟消化液试剂盒的标准化研究试剂盒批量生产 http://www.klan.net.cn17方法重复胰蛋白酶糜蛋白酶脂肪酶淀粉酶总蛋白饱和硫酸铵法ammoniumsulfatemethod157.59±1.7065.32±3.7098.14±4.0974.84±12.5759.39±1.77266.97±6.4061.39±1.8786.55±17.7176.16±5.2599.38±5.43直接冻干法Directlyfreeze-driedmethod195.75±1.8793.97±5.1785.15±4.7493.30±1.4590.03±1.902101.02±4.8598.96±9.8585.77±1.4194.03±6.4778.43±2.05方法间P值，Pvalueofdifferentmethods<.0001<.00010.16950.00040.0102硫酸铵法与直接冻干法提取的消化酶活性回收率比较直接冻干法（冻干+透析）提取生长猪空肠液消化酶，回收率高、简便、快速、重复性好。 http://www.klan.net.cn18操作规程胃期小肠期大肠期胃蛋白酶浓度消化时间消化时间纤维素酶浓度消化时间（三）猪饲料能量、蛋白质氨基酸仿生法评定操作规程的建立 1.猪饲料养分仿生评定（胃期+小肠期）最佳消化时间的研究http://www.klan.net.cn19胃期消化时间对玉米、豆粕干物质消化率的影响胃蛋白酶浓度对饲料的仿生干物质消化率没有显著影响。胃期消化时间对饲料的仿生干物质消化率有极显著影响，可以认为玉米胃期消化4小时时达到稳定，豆粕胃期消化6小时时达到稳定。 http://www.klan.net.cn20胃期消化时间对玉米、豆粕能量消化率的影响胃蛋白酶浓度对饲料的仿生能量消化率没有显著影响。胃期消化时间对饲料的仿生能量消化率有极显著影响，变化趋势与仿生干物质消化率一致。可见玉米胃期消化4小时时达到稳定，豆粕胃期消化6小时时达到稳定。 http://www.klan.net.cn21小肠期消化时间对玉米和豆粕消化率的影响玉米的仿生干物质、仿生能量消化率在16小时达到稳定，豆粕仿生干物质、仿生能量消化率在10小时时达到稳定。综合考虑，小肠期的仿生消化时间定为16小时。 http://www.klan.net.cn22仿生消化前段（胃期+小肠期）消化时间的确定胃期消化4小时+小肠期消化16小时与胃期消化6小时+小肠期消化16小时相比，玉米和豆粕的干物质消化率没有显著差异，能量消化率差值0.81%，低于机器测量误差（1.5%）。因此将胃期和小肠期的时间定为4小时+16小时是合适的。 23添加纤维素酶饲料还原糖产率和体外能量消化率显著增加（P<0.05）；但添加1（11U）、3（33U）与5（55U）倍猪盲肠液纤维素酶生理浓度对饲料还原糖产率和体外能量消化率无显著差异（P>0.05）。确定纤维素酶的添加量为11U。2.猪饲料养分体外评定大肠阶段消化酶浓度和消化时间的确定不同浓度纤维素酶对饲料消化率的影响 24随着大肠期消化时间增加，还原糖生成量逐渐上升（P<0.05），6h均达到最高值，随着反应时间继续增加，底物和酶达到饱和，产物（如葡萄糖等还原糖）不再增加。大肠阶段体外消化时间对饲料消化率的影响 http://www.klan.net.cn25指标参数操作样品粒度60目手工上样量能量饲料与日粮2g，其他1g，精度0.1mg手工猪胃液20ml模拟胃液，技术参数见规程程控猪小肠液2ml模拟小肠液，技术参数见规程程控猪大肠液2ml模拟大肠液，技术参数见规程程控温度39℃程控胃4h程控空肠16h程控大肠3.5h程控震荡频率180rmp程控缓冲液流速120mL/min程控清洗液体积1500mL/次程控清洗次数6程控猪饲料仿生消化过程参数规范(33hr) 26经过胃期消化，豆粕消化率最高，为27%；玉米的消化发生在小肠期，约67%，其他饲料为20%；模拟大肠消化，不同饲料消化不同，麦麸为10%,豆粕和菜籽饼为5%，玉米和米糠为3%。So：空白组，不加消化酶；ST：胃期消化；SI：小肠期消化；LI：大肠期消化1.能量消化率（四）仿生法评定猪饲料养分消化动力学研究仿生消化不同阶段（胃、小肠、大肠期）对饲料消化率的贡献 http://www.klan.net.cn27随着模拟消化进行，能量体外消化率逐渐积累；经过全消化道的模拟消化，玉米达到84%,豆粕、菜籽饼和米糠超过70%,麦麸为56%。So：空白组，不加消化酶；ST：胃期消化；SI：胃期和小肠期消化；LI：全消化道消化仿生消化法饲料能量消化率动态变化 28从每个模拟消化阶段看：麦麸的CP体外溶解度最高（14.57%）；胃期消化，豆粕的CP消化较高（38.57%）；小肠期消化对各饲料CP消化率都有很大的贡献；大肠酶对CP作用微弱。2.蛋白质消化率So：空白组，不加消化酶；ST：胃期消化；SI：小肠期消化；LI：大肠消化仿生消化不同消化阶段对饲料蛋白质消化率的贡献 仿生饲料的蛋白质消化率动态变化29从各阶段对饲料蛋白质消化率的累积贡献来看，小肠期对饲料蛋白质总消化率的贡献最大，其次是胃期，各饲料原料的蛋白质消化率均在小肠期消化完成后达到最大值，大肠期对饲料蛋白质消化的贡献几乎为零。 （五）仿生法评定猪饲料有效磷的研究透析袋孔径大小透析液体积透析液流速样品粉碎粒度非酶促反应条件酶促反应条件胃期消化时间小肠期消化时间小肠消化酶仿生法评定猪饲料有效磷规程 1.仿生消化系统非酶促反应条件对饲料磷消化率的影响在本试验条件下，随着透析袋截留分子量减小，三种饲料原料干物质和总磷消化率均逐渐降低（P<0.05）。截留分子量3500接近报道的体内测定结果。透析袋截留分子量玉米豆粕麦麸MWCO/Da干物质消化率%磷消化率%干物质消化率%磷消化率%干物质消化率%磷消化率%1400072.56±0.20a87.55±0.24a55.24±0.37a75.48±0.75a40.53±0.29a92.48±0.09a700069.52±0.29b78.43±0.78b55.11±0.27a73.92±0.59b38.45±0.27b87.98±0.32b350053.69±0.60c55.46±0.68c45.64±0.75b55.53±0.81c29.94±0.23c75.66±0.66c不同分子量Viscase透析袋对饲料磷消化率的影响 http://www.klan.net.cn透析液体积对饲料磷消化率的影响缓冲溶液体积对玉米、麦麸磷消化率影响不显著，对豆粕磷消化率虽存在显著性影响（P<0.05），但最大仅相差1.29%。 http://www.klan.net.cn透析液流速对饲料磷消化率的影响随着缓冲液流速增加，玉米、豆粕、麦麸磷的消化率均无显著变化（P>0.05）。但缓冲溶液流速越快产生的压力越强，容易造成透析液渗漏现象。 http://www.klan.net.cn样品粉碎粒度对饲料磷消化率的影响粉碎过40目和60目筛的玉米、豆粕、麦麸磷体外消化率无显著差异（P>0.05）。 消化时间Digestivetime/h玉米Corn豆粕Soybeanmeal麦麸Wheatbran0.533.49±0.33a21.95±0.21a76.77±0.75d0.7533.32±0.02a22.19±0.20a78.42±0.15c133.04±0.29a22.02±0.12a79.12±0.04b1.2529.00±0.34b20.87±0.10b81.30±0.18a1.528.03±0.33c21.06±0.12b81.09±0.25a胃期消化时间对饲料磷体外消化率的影响%胃期消化时间定为1h2.仿生消化系统酶促反应条件对饲料磷消化率的影响 小肠期消化时间对饲料磷体外消化率的影响%消化时间/h玉米豆粕麦麸128.44±0.69d17.05±0.11d52.18±0.11e231.84±0.86c19.15±0.12c69.19±0.05d334.30±0.30a20.97±0.11b75.05±0.21c434.22±0.30a22.01±0.10a79.13±0.11b534.29±0.33a21.98±0.00a83.60±0.07a683.65±0.07a小肠消化时间定为5h 小肠消化酶对饲料磷体外消化率的影响%试验材料处理组PP+TP+T+CP+T+C+AP+T+C+A+L玉米15.07±0.33d15.82±0.01c14.74±0.07d16.77±0.33b29.40±0.31a豆粕12.02±0.20e15.11±0.15d16.74±0.21c18.33±0.12b20.96±0.16a麦麸75.32±0.06e77.93±0.15d78.39±0.63c79.22±0.17b81.66±0.15a注：P-胃蛋白酶，T-胰蛋白酶，C-糜蛋白酶，A-淀粉酶，L-脂肪酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等猪小肠液中主要消化酶均对植物性饲料磷体外消化率有显著（P<0.05）影响。 条件胃期小肠期pH26.44温度39℃39℃酶种类胃蛋白酶胰蛋白酶糜蛋白酶淀粉酶脂肪酶消化时间粒度缓冲液体积缓冲液流速1h60目1000ml425ml/min5h60目1000ml425ml/min仿生法评定猪饲料有效磷基本规程 申请专利“猪饲料有效磷仿生评定法”（201210352892.2）L.Chen,L.X.Gao,F.Zhao,Y.X.Zhong,G.Y.Hu,andH.F.Zhang.Effectsofdietaryfiberlevelonthecellulaseactivityandelectrolytecompositioninthececalfluidofpigs,andinfluenceofassayconditionsoninvitrohindgutdigestibilityusingSimulativeDigestionSystem.Journalofanimalscience.L.X.Gao,L.Chen,andH.F.Zhang.Effectsofdietaryfiberlevelonthedigestiveenzymeactivitiesandelectrolytecompositioninthesmallintestinalfluidofpigs.Livestockscience.L.Chen,H.F.Zhang,L.X.Gao,andF.Zhao.AnovelinvitromethodtoestimatekineticsofdigestibilityinfeedsusingSimulativeDigestionSystem.Asian-AustralasianJournalofAnimalSciences.陈亮,张宏福,高理想,赵峰.玉米、豆粕和麦麸的干物质消化率仿生评定影响因素的研究.动物营养学报.已投稿文章（4篇） 培养研究生（6名）姓名学位论文题目1陈亮博士在读体外模拟猪大肠消化法测定猪饲料能量消化率的研究2高理想博士在读生长猪大肠仿生消化法的研究3李东卫硕士毕业仿生法评定生长猪常用植物性饲料有效磷酶促反应条件研究4庄晓峰硕士毕业仿生法评定猪植物性饲料磷消化率方法的参数研究5胡光源硕士毕业生长猪小肠仿生消化试剂设计依据的研究6钟永兴博士毕业猪饲料消化能值测定的仿生消化法研究 http://www.klan.net.cn41猪活体动态肠道食糜流量的变化生长猪大肠对能量消化的贡献猪盲肠NSP酶和微生物的影响猪饲料氨基酸消化率仿生评定方法的建立三、课题下一步研究计划 2021/7/15http://www.klan.net.cn42谢谢！'