籼型杂交中稻盐两优2208分子标记纯度鉴定技术规程的研究毕业论文

'籼型杂交中稻盐两优2208分子标记纯度鉴定技术规程的研究毕业论文目录摘要IAbstractIII第一章绪论11.1水稻育种概况11.2杂交水稻品种和纯度鉴定概况11.2.1杂交水稻纯度鉴定的研究进展11.3杂交水稻纯度鉴定的类型21.3.1常规鉴定法31.3.2DNA指纹图谱研究进展41.4分子标记在水稻纯度鉴定的应用前景91.4.1品种保护和新品种鉴定中的应用91.4.2品种真实性及纯度鉴定的应用91.4.3分子标记在作物纯度鉴定中的问题与应用前景101.5本研究目的10第二章材料与方法132.1供试材料132.1.1水稻材料132.1.2主要仪器和试剂132.1.3主要缓冲液及试剂的配制132.1.4SSR引物来源142.2方法142.2.1田间纯度调查142.2.2水稻总DNA提取15I 2.2.3SSR分子标记的PCR反应体系的优化152.2.4PCR扩增产物电泳检测162.2.5SSR引物的筛选172.2.6SSR指纹图谱谱带分析182.2.7统计分析方法182.2.8纯度计算方法182.2.9田间杂株类型的分析18第三章结果与分析193.1盐两优2208田间杂株鉴定193.2两种方法提取模板DNA及对应模板的PCR检测193.3SSR反应体系的优化213.4盐两优2208杂交种种子纯度检测223.4.1盐两优2208多态性引物的筛选223.4.2杂交水稻盐两优2208品种种子纯度的鉴定243.4.3杂株类型统计分析28第四章讨论304.1纯度鉴定PCR模板的提取及影响PCR阳性率因素304.2鉴定结果的差异性探讨304.3样本植株的大小和发芽率对纯度鉴定的影响314.4SSR标记鉴定的最小样品量31参考文献33附录37致谢39I 第一章绪论第一章绪论1.1水稻育种概况水稻属于禾本科植物，是世界上最重要的一种粮食作物，占世界粮食作物总产量的40％。中国作为最大的稻米生产、消费国，我国有60%以上人口的主食为稻米，2012年中国稻谷播种面积为3050万公顷，占粮食作物总播种面积的27％左右。占世界稻谷播种面积的19％，水稻总产量达l745亿t，约占世界粮食总产量的38％。在我国耕地面积逐年减少的情况下，水稻作物在我国粮食生产上发挥了巨大的作用，其中杂交水稻种子的纯度与农民的收入密切相关[1]。我国水稻史上发生过三次大的技术性革命：第一次是发生在20世纪50年代的“矮化育种”[2]；第二次是发生在2O世纪70年代的“杂种优势”[3]；第三次是“两系”选育。这三次技术革命使水稻在增产增收方面起了重要作用。我国是世界上第一个利用水稻“杂种优势”用于生产的国家，也是世界上最大杂交水稻生产国与消费国，杂交水稻面积约占水稻总面积的58%，杂交水稻种子每年使用量约2.5亿kg。但随着社会在不断进步，人口持续增长、耕地面积锐减、环境严重污染等恶劣环境，给水稻增产带来了空前的压力。种子质量关系到广大农民的切身利益[4]，甚至影响到了社会的安定和谐，因此在提高水稻种子的质量方面显得尤为重要。利用生物技术缩短水稻育种进程，提高水稻产量[5]是育种和生物科技工作者的共同使命。1.2杂交水稻品种和纯度鉴定概况1.2.1杂交水稻纯度鉴定的研究进展中国是世界上第一个成功的研究和广泛生产杂交水稻的的国家，从1964开始杂交水稻育种研究工作，于1973年实现了“三系”配套．1974年推出了“强优势组合”[6]，于1975年研制出了一整杂交套制种技术，在1976，杂交稻广泛投入生产(闵邵楷，1983)，杂交水稻生产面积为1333万m211 第一章绪论，占水稻总面积的60%（旦千秋，2000）。随着杂交水稻育种面积的不断增加，农民对杂交种需求量也在不断的增加，生产上遇到的难题就是种子纯度问题。种子纯度被作为评价杂交水稻种子质量的核心指标，也是被用作种子分级鉴定的主要标准，是企业作为购销种子的关键性依据，受到种子公司、农民、种子管理部门的密切关注。据规定的杂交水稻种子纯度以96％为最低限度，低于96%的则视为为不合格种子，禁止销售。种子纯度下降将会导致作物产量和质量随之明显降低，而纯度低的杂交水稻种子会给农民带来伤害。据统计，杂交稻种子的纯度下降1％，稻谷每亩会减产4—5kg[7]，而纯度下降10％，杂交稻便无法增产。因此，建立一套快速、可靠、经济[7]的纯度检测技术，是促进中国种子产业参与国际竞争和规范种子市场的迫切需要。目前鉴定杂交水稻种子的纯度通常所采用的方法是进行异地田间社区种植鉴定[8]，但由于异地田间种植鉴定周期长，且鉴定费用高，还要等到季度来临才会有鉴定结果，无法满足种子公司当季的生产和销售需要。此外，每个地方的气候环境的差异也影响水稻的长势[9]，进而影响田间鉴定的准确性。不同的鉴定季节，植物的生产性状的表现也有一定的差异，鉴定经验的差异性导致田间鉴定结果不准确，为了解决这一问题，不仅要完善相关的法律法规，还要建立一套快捷经济、可靠、不受环境影响的种子纯度鉴定技术。为了确保安全的杂交水稻种子能够在市面上畅销，在杂交水稻种子销售之前必须事先进行纯度鉴定，再者一个新品种的推广、知识产权保护都必须要有该品种的特异DNA“身份标签”[10]，这个意义上讲，建立品种纯度鉴定技术也是势在必行的。近年来，随着分子生物学和生物技术的发展，人们逐渐将种子纯度鉴定技术转移到分子标记上来，DNA指纹鉴定技术的出现，使得纯度鉴定由传统方向转向了分子水平,为品种真实性和纯度鉴定提供了可靠、方便、准确、快速的方法，以期克服异地鉴定费用高、鉴定周期长等缺点。用分子标记鉴定技术逐步替代田间社区种植鉴定，以提高杂交稻种子纯度鉴定的效率。1.3杂交水稻纯度鉴定的类型自1987年品种纯度鉴定创始以来,随着新的品种选育与推广,其相应的检测技术也在不断进步。20世纪50年代的纯度鉴定方法,以田间小区种植鉴定为主。国际种子检验协会在这一时期开始研究在品种种子纯度鉴定的可能性与参考价值,70至80年代先后出现了电泳法、生长箱法和快速法[11],直到90年代分子技术和计算机模拟形态分析系统应用于纯度鉴定，其中最主要的研究方法己被国际种子协会收录在《品种测定手则》[12]11 第一章绪论中。自1976年推广杂交稻以来,我国杂交稻种子纯度鉴定技术主要是采用两种手段:一是种子和幼苗形态鉴定技术的研究,二是蛋白质、核酸等的生化分子方面的鉴定技术的研究。在过去的30年中，对杂交水稻种子纯度鉴定不论在理论上，还是在技术方面有重大突破，对农业发展和生产上起了重要作用。随着分子生物技术的迅猛发展，品种鉴别和种子纯度鉴定方法开始转向分子水平DNA分子水平，品种纯度鉴定技术可分为以下四类：形态鉴定技术、理化鉴定技术、蛋白质鉴定技术、DNA分子标记鉴定技术[13]。仅对杂交水稻种子形态观察是很难区分的,而蛋白质鉴定的多态性不够丰富[14],还存在组织和器官发育特异性,使纯度鉴定的取材局限在很小的范围之内,一定程度上限制了其应用。田间纯度植鉴定因周期过长,植株性状表达易受环境影响,同样也无法完全满足种子部门的生产需要。而分子标记能从DNA水平反映生物个体间的差异,具有不受环境影响、数量丰富、检测快速、多态性高等优点而逐渐得到应用。1.3.1常规鉴定法常规鉴定法主要从外观形态颜色等角度判断，常规鉴定法[15]主要有：种子幼苗鉴定法、形态鉴定法、田间社区种植鉴定、化学鉴定法等。1.3.1.1种子形态鉴定法根据种子的大小、形状(长宽比)、饱满度、稃尖色、稃毛艮短、柱头外露遗迹等特征，通过放大、解剖观察，对比标品或者标准图片，辨别种子的真假。Agrawal(1990)首次提出了水稻种子形态鉴定，但实际生产过程中亲缘性相近的品种在形态上很难辨别，因不同经验的田间工作者鉴别会得到不同的结论，有时候同一品种也会因为生长情况的不同而产生形态上的差异，很难建立一个统一的规范化标准[16]，只能从表型上进行粗略判定，准确度因人而异，一般只用于差异性明显的品种鉴定。1.3.1.2化学鉴别法根据不同品种皮壳的化学成分的差异性，对不同化学试剂产生不同的相应的颜色反应来区分。毕辛华等用苯酚染色法对粳稻亚种、籼稻染色鉴定效果更加显著；(颜启传，黄亚军，1996)用碘化钾染色可鉴别籼稻和粳稻及糯稻。采用化学鉴别法快速、简便，但也有其局限性，要求带检测的种子必须具有特异性反应[17]，其应用范围受到极大的限制，只适用于个别作物和品种，尤其不适于的亲缘性较近的杂交品种。1.3.1.3.幼苗鉴定法将水稻种子于光照培养箱中进行培养，待幼苗生长到可以进行评价鉴别的发育阶段后，对部分幼苗鉴定或让植株生长于特殊的环境，对呈现的不同抗性加以区分[18]。徐世衡等(1997)对汕优63杂交种子进行室内幼苗形态鉴定，依据其第一完全叶、发育进度、不完全叶等特征特性每株识别。颜启传(1984)通过研究发现植株于70℃11 第一章绪论处理15分钟左右，杂交稻种子受到的热伤害较小，杂交稻种子的抗热性要比不育系强[19]，通过这种方法区分。管晓春等(1998)通过控制培养条件，诱导协优T950、绮优221—3、特优172等多个杂交水稻幼苗的中胚轴伸长，发现经同样的处理，中胚轴的长度在不同品种间表现出差异性[20]。张皿兵等(1995)通过用1%盐酸处理的“汕优2号”、“汕优6号”，直到芽鞘和茎基部出现颜色上差异，以鉴别出不同的水稻品种。李稳香等(1995)采用幼苗鉴定法对明恢63、金23A等10个杂交种子进行鉴别，结果表明通过温度、光照处理，杂交种的茎基部里呈深红色，而保持系和不育系的茎基部则呈现微红色或无色，可鉴别出杂交种的纯度[21]，但不能将保持系和不育系两者区分开来。1.3.1.4田间社区种植鉴定田间小区种植鉴定被作为一种准确可靠的方法，被作为贸易赔偿依据。为了进行品种纯度鉴定，试验设计每个阶段与标准样品相比较，标准样品一般是育种家生产的种子。应保证充足的标准样品数量，以便持续数年使用，不用时应采用低温贮藏[22]，最好直接从育种家处更换。在进行田间社区种植鉴定时，应注意以下几点：一是选择气候环境条件适宜、肥力一致、土壤均匀的地块作为试验地，并有并保证有相关经验的田间管理者；二是田间植株应有合理的种植区间，种植株数要有科学统计依据；三是至少要设置2个实验地的重复，以避免失败；四是加强对田间病虫害防治的管理，科学施肥。社区种植鉴定是目前育种工作者在田间鉴定除杂使用的比较准确、可靠的一种鉴定方法。由于其不存在品种限制，只需掌握待鉴定品种的特性，就可以观察鉴定，这种方法实施起来简单容易掌握适用于大田。但是这种方法也存在下列不足：(1)受地域条件限制，要求有合适的光温条件。(2)费工、费力、耗时长，社区种植鉴定实施起来周期长，当年生产的杂交种纯度很难当年确定，给来年的种子调运带来了极大的不便。在当今自由市场竞争日趋激烈的情况下，鉴定周期太长会丧失销售的最佳时期，造成种子企业种子积压造成巨大的经济损失。1.3.2DNA指纹图谱研究进展1.3.2.1RAPD指纹图谱RAPD(RandomlyAmplifiledPolymorphicDNA)是由Williams(1990)等人提出的一种新的分子标记方法，RAPD是以PCR扩增为基础，利用随机排列顺序的10核苷酸为引物，以基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增产物采用聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，以检测扩增产物多态性，扩增产物多态性则代表基因组对应DNA多态性[23-25]11 第一章绪论。RAPD的随机引物能与特定区域的碱基序列发生特异性的结合，这种特异性结合区域如满足扩增反应的模板条件，便可扩增出相应的DNA片段。当这些特定区域内的碱基序列发生片段缺失、插入就可能使些结合位点分布发生变化，扩增产物也会增加。陈洪等(1996)在国内首次报导了RAPD技术鉴定杂交稻汕优63的种子纯度，通过300个随机引物对父母本及其F1进行检测，发现引物P18能稳定的扩增出一条来自于父本明恢63的约800bp的特异性条带[26]，鉴定结果与田间种植的表型完全一致；钱前等(1998)利用RAPD指纹技术成功鉴别了真假II优63；杨剑波等(1996)采用30对随机引物，对汕优63及其亲本进行PCR扩增检测，结果发现有6对引物在杂交种F1和其双亲之间形成差异性明显的条带；杨蜀岚等利用RAPD法，利用250对引物对以培矮64s为母本的两系杂交稻及相关亲本等12份供试材料进行分析，其中引物OPN220能将以培矮64s为母本的杂交种与其他它品种区分开来，也可以将母本培矮64s与杂交种F1区别开。Wang等(1994)对北方三个家族杂交稻不育系、保持系和恢复系及其杂交种F1进行了RAPD指纹鉴定，研究表明RAPD作为一种技术手段可以用作杂交水稻种质与纯度鉴定[27]。此外，利用RAPD技术在水稻(Mackill，1995；Schnell，1995；李文杉等，1995)、玉米(Welshetal，1991)、棉花(Mullanietal，1995)等作物进行了纯度鉴定，取得了很好地实验效果。RAPD指纹技术有着众多的优点及其对基因组独特的配对检测形式，使这一技术在种质鉴定方面得到极大的推广，但是也有其相应不足之处[27]：(1)无法提供完全的信息反映品种的特性；(2)RAPD技术在种质与纯度鉴定的实验操作方面，可重复性不强，对实验条件要求比较苛刻，从而严重影响了试验统计结果的可靠性(张恒庆，1999)；(3)RAPD指纹技术为显性遗传性状，亲本之一与杂交种F1有可能会出现完全一致的扩增带型，仅用一对随机引物还不一定能鉴别某一位点到底是亲本还是杂交种子，因此筛选出能反映出两位点以上的位点差异性的引物是能鉴定种子真假关键；(4)提取水稻基因组DNA的方法还值得探索[28]。1.3.2.2RFLP指纹图谱RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）即限制性内切酶片段长度多态性，以Southern杂交为基础。Bostein和white首先提出了利用RFLP技术构建遗传图谱，RFLP是根据不同的限制内切酶位点发生碱基突变[29]11 第一章绪论，产生的酶切片断发生变化，采用特定的杂交探针检测这一变化，检测出不同等位位点的差异性，因为对特定的限制性内切酶产生的DNA片断是特异的，故而它可作为该品种的特有指纹标记，从而可以用作鉴别真假种子。根据不同品种之间能找到很多RFLP标记(Haymer，1994)，该技术可作为品种纯度鉴定最可靠的方法。直至80年代才将RFLP技术运用于植物方向，Wang等(1992)采用150对引物对70个水稻品种进行了RFLP相关性分析，又采用25对引物分析21个稻属种的93个品种，利用RFLP技术进行品种纯度鉴定。Smith(1991)采用38个探针成功的区分了78个玉米杂交种，总共获得了288个RFLP标记，与此同时采用RFLP技术还可以鉴别出玉米杂交种[30]。Matsurra(1994)等利用RFLP技术对黄瓜亲本NB、GF及其杂交种进行了分析，成功鉴别出了杂交种中混杂的亲本。此外，在向日葵(Gentzbitteetal，1994)、水稻(Sasaki，1995)、小麦(Liu，1992)、大豆(Keimetal，1994)、大麦(Peterson，1989)等作物上也有相关的报道。与其他传统的遗传标记相比，RFLP标记技术有如下几方面优点：(1)在非等位座位之间不存在相互干扰的现象[31]；(2)RFLP标记技术在等位座位上是以共显性的形式表现的，在杂交组合时不受杂交方式的干扰；(3)RFLP标记不受环境条件的干扰；(4)标记源于基因组DNA的变异，在数量要求上没有上限．因此RFLP检测技术被认为是目前进行品种真实性与纯度鉴定的最可靠的方法。但RFLP法所需模板DNA用量大，还要进行限制性内切酶酶切，操作起来比较繁琐，实验周期长，技术要求高，往往还需要大剂量的同位素，由于它是一种专利技术、受专利的保护[32]，因此在实践应用过程中受到了一定限制。1.3.2.3AFLP指纹图谱AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）:扩增片段长度多态性，由荷兰科学家zabeau等发明的检测DNA多态性来构建指纹图谱的一种技术。这种方法综合了RFLP和RAPD两种技术，基本原理是：将基因组DNA用两种或者两种以上限制性内切酶酶切[32]，将所产生的酶切片段用人工接头连接起来，通过特异性连结起来的片段作为PCR扩增的模板，PCR扩增的引物为AFLP引物。该引物由三部分组成：①限制性内切酶的识别序列；②与人工接头互补的核心序列；③处于引物3’端的选择性碱基。只有能与选择性碱基配对的限制性片段才可进行特异性扩增，根据变化核苷酸的数目不同，便可以此判定产物片段的数目[33]，从而选择性扩增目的片段。不同品种之间会产生不同的酶切片段，从而产生了扩增产物的多态性。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，就得到了品种特异性的AFLP指纹图谱[34]，被用作品种分析和纯度鉴定。Blair（1998）利用AFLP技术分析了54分水稻品种的遗传多样性，鉴定结果跟同工酶鉴定法一致[35]11 第一章绪论。Dedryver等通过研究14份水稻材料来对比AFLP和RAPD这两种方法的差异性，结果显示RAPD法运用21对引物得到了43个标记共103条扩增片段，而运用AFLP法的利用18对引物获得了147个标记。John等(1998)对55个小麦品种进行了AFLP分析，研究结果表明AFLP技术非常适合鉴别小麦品种的真实性，AFLP在产物的多态性方面远比RAPD、RFLP等技术要高，一度被认为是纯度鉴定技术中多态性最高的一种技术[36]，适用于普通的分子标记鉴定的范围(张修军，1999)。AFLP纯度鉴定分析时需要的模板量较少，不收外界环境条件的限制，多态性高，仅需用少量引物便可获得大量多态性片段，实验操作的重复性好，灵敏高效，呈共显性[37]，能区分杂合和纯合体。但由于此技术酶切过程中对DNA和内切酶质量都有严格的限制，还要使用同位素标记，成本高，且AFLP已获专利申请[38]，虽然可以于非赢利性的科学实验，商业化生产受到了一定限制，所以很难再实际生产上普及[39]。近来的硝酸银染色代替同位素标记已取得了很好的效果，降低成分的同时，更加缩短了试验时间，也增加了AFLP技术的实用性(张峰，1999)。1.3.3.4SSR标记SSR(SimpleSequenceRepeat)即为简单序列重复,又称微卫星DNA(MicrosatelliteDNA),是指存在于基因组中由1-6个核苷酸组成的串联重复序列，广泛分布于基因组的不同位置,长度约200bp[40]。SSR序列分布在基因组的编码区与非编码区，其中植物基因组中重复序列占整个基因组序列的50％以上。目前SSR分子标记技术广泛地应用在水稻遗传作图、种质资源保存与利用、杂种优势预测、品种及种质的区别与鉴定、遗传多样性分析等领域[41]。每个微卫星DNA两端的序列通常是同一物种或亲缘性相近的品种中相对保守的单拷贝序列,通过这段保守的单拷贝序列设计一段与其互补的引物,对微卫星序列进行PCR扩增,将SSR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,通过凝胶成像结果来判断品种的差异性。SSR分子标记由于具有多态性高、数量丰富、实验结果稳定可靠、遗传上呈共显性等优点[42],被当作一种理想的分子标记应用于水稻育种。Temnykh（2001）通过筛选Tsp509酶切所得到的小片段基因组文库，获得了188个SSR标记。Yang（2001）等研究发现SSR等位位点的数目与重复单元的重复次数呈正相关,不同品种之间有着不同的SSR重复次数，由此产生了等位位点的多态性，通过特异的SSR引物对基因组DNA进行扩增，以检测不同品种间的多态性，根据这些不同引物产生的多态性片段就构成某一品种特有的指纹图谱[43]。李云海（2002）等运用SSR检测杂交稻亲本的遗传差异性，筛选出了5对SSR引物来鉴别水稻雄性不育系和恢复系。肖小余（2003）等从208对SSR引物中筛选出123对多态性的引物，以此来构建四川省主要杂交水稻亲本DNA指纹图谱[44]。苏顺宗等(2003)利用SSR分子标记对目前普遍种植的12个杂交品种进行纯度鉴定，平均每个品种从88对引物中筛选出4-6对[45]11 第一章绪论在其双亲之间表现出多态性较好引物对F1进行扩增，结果表明SSR分子标记与田间社区种植鉴定的结果没有表现出统计学上的差异。SSR分子标记鉴定的多态性比RFLP标记要高，其可重复性和可信度要比RAPD高[46]，也因此成为了遗传标记研究中的热门。Gregan(1994)采用SSR技术研究96份大豆资源发现了29个SSR变异位点，而用而RFLP技术却只能发现2-3个变异等位位点[47]，由此可见SSR标记的多态性要高于RFLP标记。Plasechk等(1996)采用23对SSR引物对40份欧洲小麦品种进行检测，结果共发现了多达142个多态性位点，平均每对SSR引物可检测到6.2个位点。Bryan等(1997)分析了200余个SSR克隆，设计了其中的153对引物，从中筛选了49对SSR引物对10个小麦品种进行了检测，平均每对引物可检测到3.5个等位变异[48]，但RFLP检测出的多态性频率仅占SSR检测的20％左右。Akagi等(1997)采用20对SSR引物对59个日本粳稻品种进行了遗传多样性分析，结果表明用17对SSR引物就能鉴别出59个品种，通过其中的5个微卫星位点就可区分出大部分的品种。微卫星DNA作为目前极受欢迎的一种指纹图谱技术，它包含了RFLP所有的遗传学优点，还避免了使用放射性同位素的缺点，简便快速、呈共显性、稳定性好[49]，在品种鉴定应用中展现出了巨大潜力。几种常见的分子标记优缺点，如表1.1。表1.1:几种分子标记的比较标记类型SSRAFLPRAPDRFLP引物来源特异性引物有核心，选择性碱基组合的特定引物10bp左右的随机引物特定DNA探针分析技术PCR电泳技术PCR电泳技术PCR电泳技术分子杂交电泳技术费用低高低中等多态性水平高高比较高中等操作难易程度易难易难可检测座位数1—520—1001—101—4遗传性状共显性都有显性共显性模板质量要求低高低高实验周期长短短较长短长使用同位素否都有否都有水稻SSR标记鉴定已经是一个成熟的体系，无需另外设计引物。就水稻而言，SSR标记目前是流行的一种DNA指纹图谱方法，已在各类研究中得到广泛应用。11 第一章绪论1.4分子标记在水稻纯度鉴定的应用前景1.4.1品种保护和新品种鉴定中的应用作物新品种保护是农业生产领域的一种产权保护制度[50]，是国家审批机关依据相关的法律、法规，授予新品种选育所属者该品种专属所有权。在审定新品种之前，需要确定该品种的遗传特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)、稳定性(Stability)即称为“DUS”[51]。随着生物技术不断进步，一些新的品种之间共用亲本，导致亲缘性差异越来越小，直接使用传统鉴定方法已经不能满足要求。分子标记技术满足“DUS”测试的3个基本条件，实验的重复性好、结果稳定可靠，被作为新品种鉴定的重要技术。DNA分子标记鉴定技术是根据品种DNA的组成，利用分子标记对基因组进行PCR扩增，凝胶成像对比扩增产物的差异性[52]。李莉等(2000)用40对SSR引物对协优63和协优64及亲本进行了鉴定，结果显示出13对引物扩增了31条带，显示出了稳定的多态性[53]，且杂种表现为双亲的互补型。詹庆才(2002)对目前的6个杂交组合及其亲本之间的多态性进行了研究，结果显示在178对SSR引物中，有52对引物能在至少一个组合中显示稳定性的多态性，且杂种表现为双亲互补带型。运用DNA指纹鉴定技术，建立作物的标准参照图谱，以保护我国名、特、优种质[54]，同时保护育成品种的知识产权与育种者的权益意义重大。1.4.2品种真实性及纯度鉴定的应用SSR分子标记鉴定品种的纯度已得到广泛的推广，SSR标记由于多态性高，可以准确分辨出大量的多态性位点，适宜用作品种纯度鉴定。SSR分子标记鉴定品种纯度，就是利用SSR标记比较品种间基因组DNA，通过电泳对比品种间的PCR扩增产物的差异性，可以达到“验伪”的目的。鉴定一个品种，对其所有种子的SSR指纹图谱鉴定，可以达到“验杂”的目的。李稳香（2002）等对10个杂交水稻组合的子一代种子采用SSR分析，通过人为掺杂对比田间种植鉴定进行验证，研究表明，筛选出的62对引物便能将1-10个杂稻组合及其亲本区分开[55]11 第一章绪论，人为掺杂的田间鉴定跟SSR分子鉴定结果是一致的。Mccouch（2002）等通过SSR分子检测区分开了59个亲缘性相近的粳稻品种。Olufowote（2003）等利用6对SSR引物鉴定了71个水稻品种。程保山（2004）等采用12对SSR引物并建立指纹图谱成功的区分了35个常规稻品种。彭锁堂（2004）等对9个杂交稻及其亲本进行了SSR分析，结果表明2l对引物便扩增出了62条多态性条带，能区分所有恢复系和大部分不育系，且杂交稻均呈现双亲的互补带型，利用引物RMl7检测汕优63和两优培九的种子纯度，检测的纯度分别为96.O％和98.O％，与田间小区种植鉴定结果96.2％和97.7％基本一致。李晶熠（2006）等筛选到一个SSR标记，这种标记能检测出由不育系冈46A引起的常规混杂的常规稻种。采用SSR指纹图谱技术，建立一套水稻标准图谱数据库[56]，对于种子纯度鉴定的准确性具有重大意义。1.4.3分子标记在作物纯度鉴定中的问题与应用前景建立简便、快捷、经济的水稻种子纯度鉴定技术体系，是规范水稻种子市场和促进我国水稻种子产业进行国际竞争的重要保证[57]。田间小区种植鉴定是在幼苗生长至成熟期，根据植株形态和生育期的差异性进行鉴定，是品种纯度鉴定最为可靠的方法。该方法简单明了、经济节约，但鉴定周期长，易受环境条件制约，且存在以下不足：1)因表型易受环境影响明显，不同栽培条件、气候环境都会影响表型结果，从而导致判定结果的可信度不高。如水稻的幼苗叶鞘进行可见光处理才能显色；需要密植处理才能有效鉴定植株的抗倒性；抽穗期则容易光周期长短的影响；光温敏核不育系会产生因持续低温而自交结实。杂交稻的小区种植鉴定鉴定一般会出现以下两种情况：一是长江中下游地区杂交稻表现出植株偏大、穗期偏长、结实率偏低的“大青棵”杂株，相反在海南地区却表现出植株矮小抽穗期短的特征，鉴于这些情况给田间除杂带来了极大的困难；光温敏核不育系在遇不育的临界温度以下时，会转育而自交结实，会导致很难区分母本中的杂株。2)形态标记的数量受到了一定的限制，多态性基础比较差，而现今很多杂交稻都存在共用亲本的现象，在形态特征上不易区别。随着时间推移新品种数日积月累，形态性状已不能满足当代生产的需要。因此，研究出一种省时可靠的品种鉴定技术迫在眉睫。随着分子标记技术的进步，为杂交水稻种质鉴定提供了新的航向。此技术能提供更丰富的多态性，并且可一次性检测出更多的品种迅速、可靠。如果能很好的利用分子指纹图谱技术建立杂交稻品种的指纹图谱和指纹数据库，将能很大程度上解决杂交稻的纯度鉴定，也将是往后杂交水稻纯度鉴定的主要方向。目前杂交水稻品种纯度鉴定技术要以SSR分子标记为主，近年来SSR分子标记在水稻科研方面的得到了极大的推广，许多育种单位都选用这一方法进行纯度鉴定，SSR操作简单，检测结果可信度高、引物来源广泛、成本低、周期短、模板DNA的提取方便，在实际的育种制种过程中一般与大田鉴定，将种植鉴定和分子标记鉴定结合起来，充分发挥两种鉴定方法的综合技术优势。11 第一章绪论1.5本研究目的盐两优2208是2013年通过国审的籼型两系杂交中稻，本实验选取盐两优2208作为实验材料旨在针对该品种建立一套SSR分子标记技术操作规程，为种子企业提供生产质量控制依据。本实验针对盐两优2208筛选出几对在其双亲间表现出多态性好且稳定的SSR引物，并结合田间小区种植鉴定，对比实验室SSR分子标记鉴定技术，分析导致SSR标记鉴定与田间鉴定的不致性的原因，对田间杂株取样对应做SSR标记分析杂株类型，对比电泳条带与田间纯度调查杂株电泳条带，实验室内浸种催芽，随机抽样，每株幼苗为一个样本，DNA样本量从100、200、300、400、500逐渐递增分析最少需要多少样本量才可以满足田间1000株群体调查纯度额要求。在纯度鉴定基础上进一步验证产生PCR阴性的原因，从DNA模板质量，PCR反应体系及扩增体系的技术方法等因素中优化出简单、高效、快速、准确的纯度鉴定方法，保证经济省时的同时还保证鉴定结果的可靠性。11 第二章材料与方法第二章材料与方法2.1供试材料2.1.1水稻材料本实验材料为杂交稻盐两优2208、不育系盐220s、恢复系盐恢888均由中垦锦绣华农提供。2.1.2主要仪器和试剂冷冻离心机Centrifuge5424R、常温离心机Centrifuge5424、微量移液枪：德国Eppendoorf凝胶成像系统、梯度PCR仪T100:美国伯乐电子天平BS224S:北京市赛多利斯仪器系统有限公司恒温水浴锅DFD-700：北京长安科学仪器厂手提式高压灭菌锅YX280B:上海三申医疗器械有限公司数显光照培养箱250D、磁力搅拌器79-1：江苏省金坛市科兴仪器厂电泳仪DYY-8C型、电泳槽DYCP-31DN、电泳槽DYCP-31D：北京六一仪器厂冰箱BCD-233：海尔公司超纯水系统AFX1-1001-P：艾科浦国际有限公司DNAMarker、TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、dNTPs购自大连宝生物工程有限公司。甲叉双丙烯酰胺，CTAB，EDTA，丙烯酰胺，过硫酸铵，去离子甲酰胺，以及EB，购自Ameresco公司。EDTA、Tris：武汉亚法公司进口分装SDS、溴酚蓝：Sigma公司无水乙醇，异丙醇，异戊醇，冰乙酸，氯仿，考马斯亮蓝，氢氧化钠，甲醛，硼酸，琼脂糖，盐酸等常用生化试剂均采用国产分析纯。2.1.3主要缓冲液及试剂的配制1)DNA快抽溶液Ⅰ：称取1gNaOH固体粉末，补ddH2O至80ml，搅拌溶解，在定容至100ml，配制成1%的NaOH溶液。2)DNA快抽溶液Ⅱ：取10ml12M的浓盐酸溶于470ml水中（即或0.25mol/L的HCl，0.25mol/LHCl与0.5mol/LTris按1:2比例混合（PH8.0）)。3)TE缓冲液（PH8.0）：10mMTris-HCl，1mMEDTA（pH8.0），常温（量取1M17 第二章材料与方法Tris-HCl10mL、0.5MEDTA2mL混匀后定容1L）（pH8.0），定容50mL。1)0.5mol/LEDTA：称取186.1gEDTANa2.2H2O,加入800ml水中，与磁力搅拌器上搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0，加水溶解定容至1L，灭菌(108℃—115℃20min)。2)1mol/LTris-HCl溶液：称121.1gTris，加入到800ml水中，磁力搅拌器上搅拌溶解，用浓HCl调PH至8.0,定容至1L,灭菌(108℃-115℃20min)。3)70%乙醇：量取无水乙醇70ml,加ddH2O搅拌,定容至100mL。4)氯仿/乙醇（24:1）：量取异戊醇20ml、氯仿480ml混匀。5)10%过硫酸铵（APS）：称取10gAPS粉末加入到80mlddH2O中充分溶解，定容至100ml，4℃避光保存。6)30%丙烯酰胺溶液配方：称取290g丙烯酰胺，10g甲叉丙烯酰胺，加ddH2O溶解并定容至1L。7)50×TAE：57.1mL冰乙酸，242gTris，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），定容值1L,室温存放。8)1×TAE:量取20ml50×TAE，加ddH2O定容至1L。9)SDS提取buffer：50mM/LTris-HCl，pH8.0；2.5mM/LEDTA，pH8.0；300mM/LNaCl；1%SDS，115℃灭菌后使用。10)CTAB提取buffer：100mM/LTris-HCl，pH8.0；20mM/LEDTA，PH8.0；1.4M/LNaCl；2%CTAB，灭菌后使用。2.1.4SSR引物来源本实验采用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433-2007水稻品种鉴定DNA指纹方法，推荐使用的48对基本核心标记的SSR引物，引物序列合成于金斯瑞生物科技，标记具体信息见附表1。2.2方法2.2.1田间纯度调查田间混杂不育株识别方法：在孝感夏季条件下，盐两优2208种植田间稻穗包颈、穗颈节低于于剑叶叶枕的是混有母本盐220s杂株；母本盐220s柱头比盐两优2208发达，母本柱头的外露率高达80%，而盐两优2208的柱头外露率约20%；盐两优2208比盐220s对“920”更敏感，抽穗期施用一两次“920”17 第二章材料与方法后．田间的盐两优2208要高出盐220s一大截；从叶片看,盐220s植株的叶片较盐两优2208稍窄且反卷程度高,而盐两优2208在倒3叶以后无反卷现象；盐两优2208开花当天花药饱满肥大且呈黄色，第二天逐渐变为浅褐色，而盐220s花药则瘦瘪为白色；盐两优2208一般穗形紧凑，直至灌浆后穗型才变松散，但盐220s始穗期1-2天后穗型就开始变的松散。通过以上几点便可分在抽穗期鉴别出盐两优2208杂交种中混杂的不育系盐220s。田间混杂异品种和变异株识别方法：一般为常规稻种子和其他异株，常规稻植株较矮小,茎基部一般为白色,分孽力弱比盐两优2208弱,穗头短,不包颈,抽穗期与盐两优2208不一致，而其他异品种杂交稻生育期与盐两优2208不一致。2.2.2水稻总DNA提取将亲本盐恢888、盐220s和杂交种盐两优2208的种子于实验室光照培养箱37℃浸种催芽，亲本各保证30株，盐两优2208保证700株，幼苗于室内培养至5cm，随机从待检的盐两优2208幼苗植株上剪取约4幼嫩叶片，单株分装，分别采用“热碱快抽法”和“SDS”分单株提取基因组DNA。参照McCouch的方法，采用“SDS”法提取总DNA，具体步骤如下：①取水稻新鲜叶片0.5g，剪细剪碎后置于1.5mLEP管中。②加入800uL65℃预热的SDS提取buffer(50mM/LTris-HCl，PH=8.0；2.5mM/LEDTA，PH=8.0；300mM/LNaCl；l％SDS)，快速摇匀后放置于65℃恒温水浴锅中，持续温浴50min，期间每隔3分钟摇动一次，保证抽提液与水稻植株细胞混合充分。取出离心管直至冷却至室温。③4℃，10000r／min离心10min，转移上清至2mL的EP管中，加等体积（400mL）的平衡酚和氯仿：异戊醇(24:1)混匀。④4℃，10000r／min离心15min，将上清夜转移至另一个2.0mL的EP管中，加入两倍体积（800mL）的冰冻无水乙醇混匀，于-20℃冰箱冷冻30min以上。⑤4℃，8000r／min离心10min倒掉上清液。用800ul70％乙醇洗涤，8000r／min离心5min后倒掉上清，42℃风干10min。与于50μlTE溶解，-20℃储存。运用酸碱快速提取法根据詹庆才介绍的方法略作改进：酸碱快抽法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：取1cm左右的水稻幼苗，加40μlDNA快抽溶液Ⅰ，100℃煮沸30s，然后加60μl缓冲液Ⅱ，100℃煮沸2min，待冷却至室温后用作PCR模板。17 第二章材料与方法2.2.3SSR分子标记的PCR反应体系的优化正交设计的PCR反应体系优化：反应体系的优化实验材料为盐两优2208，扩增带型单一的RM17为引物，对反应体系中各个底物进行正交设计试验，试验针对DNA模板添加量、引物添加量、Buffer添加量、Taq酶添加量、dNTPs添加量分写设计4个添加量梯度，共16个处理如表2-2，最后用ddH2O补至25μl。扩增产物检测采用浓度为3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后3min，凝胶成像拍照。表2-2正交设计的16组PCR反应体系的各反应底物添加量体系编号模板（μl）dNTP（μl）引物（μl）Taq酶（μl）Buffer（μl）10.50.60.30.1120.50.80.50.21.530.510.70.3240.51.20.90.42.5510.60.30.11610.80.50.21.57110.70.32811.20.90.42.591.50.60.30.11101.50.80.50.21.5111.510.70.32121.51.20.90.42.51320.60.30.111420.80.50.21.515210.70.321621.20.90.42.5PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后一个循环72℃，延伸8min，4℃保存。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯胺酰胺凝胶电泳检测，用EB染色成像拍照并分析实验结果。2.2.4PCR扩增产物电泳检测2.2.4.1琼脂糖凝胶电泳1%的琼脂糖凝胶电泳:称取0.3g琼脂糖倒入在100ml三角瓶中，量取30ml1×TAE，用锡箔纸封住瓶口，微波炉加热1min煮沸，待琼脂糖全部融化。3%的琼脂糖凝胶电泳:称取0.6g琼脂糖倒入100ml三角瓶中，量取30ml1×17 第二章材料与方法TAE，用锡箔纸封住瓶口，微波炉加热2min煮沸，待琼脂糖全部溶化，冷却至65左右。预先将制胶板和胶槽洗干净并晾干，将制胶板扣入胶槽，并插上梳子，将事先制好的煮好的琼脂糖凝胶缓缓倒入制胶板，待凝胶均匀布满整个制胶板，室温凝固后，拔出梳子，将制胶板放入水平电泳槽，倒入1×TAE直到电泳缓冲液没过凝胶为止。点样：将扩增好的PCR产物与6×LoadingBuffer以6:1的比例混匀，上样4μl；电泳：恒压100V，根据指示剂的位置，取出凝胶，EB染色3min，水槽冲洗，点样孔也要冲洗干净，凝胶成像拍照观察。2.2.4.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对田间鉴定的杂株进行取样，对应取样做SSR标记分析，杂株类型分析采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺电泳具体过程如下：12%的非变胶的配制：在烧杯中依次加入30%丙烯酰胺21.6ml、10×TBE缓冲液5.4、ddH2O36.6ml、60μl的加速剂TEMED和10%的（催化剂）过硫酸铵800μl并混匀；用移液枪开始向槽内灌胶，当胶液面升到玻璃板上沿时分，用夹子紧紧夹住胶，使丙烯酰胺至少聚合30min；电泳:等待凝胶完全聚合以后，取下夹子，向电泳槽内加入0.5×TBE缓冲液充分浸泡玻璃板，在缓慢取出梳子，清理干净点样孔中的气泡，用200V电压预电泳8min。上样：SSR引物扩增出的PCR产物与DNAloddoingbuffer按照3:1的比例混合，用10μL的微量移液器点样4μl。恒电压U=200V电泳,电泳时间以凝胶板上的蓝色指示泳动至至胶版约四分之三处时停止电泳；凝胶染色：电泳结束后，倒干净缓冲液，拧开垂直电泳槽，螺母，卸下电泳槽上的玻璃板。轻轻的移开两块玻璃板，使之分开，缓慢的将聚丙烯酰胺凝胶从玻璃板上剥离下来（切记不可让胶破裂），用蒸馏水冲洗1min，将凝胶放入EB中染色，染色时间3min，染色完毕后用自来水漂洗干净，在凝胶成像系统上观察和拍照2.2.5SSR引物的筛选本实验通过利用48的SSR引物（附表1）在双亲之间表现出的多态性，来筛选出在双亲前表现出多态性良好的引物，要求所筛选的引物尽可能满足以下条件：SSR引物在双亲间的PCR产物电泳谱带带型单一、同一对引物在盐两优2208、盐恢888、盐220s三者相互之间都具有明显的多态性。通过引物筛选我们可以找到供试品种的多态性引物，利用特征引物对种实验室浸种催芽随机取样的供试品种进行SSR标记的纯度鉴定。对田间杂株取样进行SSR带型分析。共显性引物筛选：用48对SSR引物分别对盐两优2208的亲本进行扩增，筛选出双亲之间具有共显性、多态性的SSR引物。17 第二章材料与方法2.2.6SSR指纹图谱谱带分析对于任意一对SSR引物得到的指纹谱带，利用成像仪上的软件计算分子量，计算引物在所有样品中的复等位位点数目，根据其分子量大小对所有复等位位点从小到大依次进行阿拉伯数字编号。指纹图谱上的条带和软件计算出的等位位点分子量大小相同的则用相同阿拉伯数字编号表示，同时参照聚丙烯酰胺电泳胶上的重复样品，不同凝胶之间具有参照性，条带赋值更精确。按此方法，获得所有指纹图谱条带在聚丙烯酰胺凝胶上的多态性位置编号。成像仪软件计算的条带值是根据Marker条带值估计出来的，可作为实验的参考值。2.2.7统计分析方法SSR标记纯度鉴定是，目前通常是取样100或者200株提取DNA，从统计学的角度，为了保证实验数据的准确科学性以及SSR纯度鉴定的效率，分析不同样本量时的纯度。为比较田间种植鉴定和SSR分子鉴定在统计学上是否存在差异，分别记录5对多态性的引物在检测样本数为100、200、300、400、500各个整百点时的纯度，将5对引物之间的相同样本数时的纯度求平均值，对比调查孝感和海南田间1000株群体的纯度，SSR分子标记纯度鉴定所需的最少样本量，便可以满足田间1000株取样调查纯度的要求。2.2.8纯度计算方法通过田间表型鉴定与SSR标记鉴定出各试验材料的纯度，其计算公式如下：%鉴定总株数-杂株数鉴定总株数纯度=2.2.9田间杂株类型的分析为了检测田间杂株中可能混有的异品种、变异品种，通过田间观察盐两优2208具体的表型，区分出不同的杂株类型，将田间鉴定出的杂株叶片分单株取样分装带回实验室，对各个杂株进行SSR分析，对比双亲条带，如果通过琼脂糖凝胶电泳无法区分出变异株和异品种，则进一步采用分辨率更高的非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳。17 第三章结果与分析第三章结果与分析3.1盐两优2208田间杂株鉴定为了消除环境对水稻植株田间鉴定表现型的影响，降低试验误差,更准确地比较SSR分子鉴定与田间鉴定方法的差异,判断用SSR鉴定代替田间鉴定的可行性与可靠性,并在海南和孝感2个环境中进行。田间鉴定样本为每重复1000株，盐两优2208在海南和孝感两地的田间检测纯度如3-1。表3-1孝感和海南田间纯度鉴定结果试验地纯度海南98.4%孝感97%田间纯度鉴定的盐两优2208的总株数为1000，孝感检测出的杂株数量为30株，纯度为97%，海南检测出的杂株数量为26株，纯度为98.4%，具体结果如表3-2。从田间鉴定的结果可以看出，盐两优2208在制种过程中操作严格，没有父本混杂，且植株生长过程中母本自交结实的比重为6‰，证明了该品种的纯度很高。表3-2孝感田间杂株类型及数量父本母本变异株或异品种006623233.2两种方法提取模板DNA及对应模板的PCR检测对比“热碱快抽法”和“SDS法”这两种基因组DNA抽提法的效果（如图3-1a）,分别将两种方法提取的模板用SSR分子检测，各自的检测结果如图（3-1b、3-1c、3-1d），比较发现，“SDS法”提取的模板DNA质量明显要优于“热碱快抽法”提取的模板DNA质量，通过进一步的SSR检测发现，当加入相同体积（0.5μl）的模板时，“SDS法”的PCR扩增产物量要高于“热碱快抽法”的产物量，当加大热碱快抽法的模板添加量时，其PCR扩增产物量有明显的增加，实验证明了通过增加（热碱快抽法）的模板添加量时，可以用热碱快抽法取代“SDS法”用于本实验的模板DNA的提取。31 第三章结果与分析图3-1a两种方法提取的总DNA注：M：-EcoT14ⅠdigestDNAmarker，1-12：SDS法提取的总DNA，13-24：热碱快抽法提取的总DNA图3-1b引物RM583（热碱快抽法提取的模板0.5μl）的扩增条带注：M为5000bpDNAMarker，1-22是以盐恢888为模板的扩增条带，图3-1c引物RM583（SDS法提取的模板0.5μl）的扩增条带注：M：5000bpDNAMarker，1-22是以盐恢888为模板的扩增条带31 第三章结果与分析图3-1d用引物RM583（热碱快抽法提取的模板添加量为1.5μl）的扩增条带注：M为：5000bpDNAMarker，1-22是以盐恢888为模板的扩增条带从图3-1b可以看出，当模板添加量为0.5μl时，泳道16、22、24的PCR产物量明显偏低甚至认为PCR阴性，说明如果模板的加入量不足会导致PCR扩增的稳定性差，产生一定几率的PCR阴性，而热碱快抽法的模板浓度纯度不高，各管快抽的模板DNA的浓度不一，为了尽可能的减少实验过程中产生PCR阴性，适当加大模板添加量（1.5μl）如图（3-1d）每个泳道都能扩增出明亮的条带，便能很好的解决一定几率的PCR阴性问题，尽可能的保证每个样本都能产生不影响实验结果且明显可见的扩增。3.3SSR反应体系的优化通过正交设计的16组PCR反应体系如图图3-2a序号1-12表示正交设计的12组PCR反应体系，图3-2b序号12—16表示正交设计的4组PCR反应体系注：每个体系设置一个重复，M为5000bp31 第三章结果与分析Marker，正交设计的16组PCR反映体系均采用父本DNA（热碱快抽法提取的）作为模板从图3-1可以看出，正交设计的16组PCR体系均可扩增出条带，说明本实验设计的各个实验因子的浓度梯度没有偏离正常范围，在PCR产物量有渐变的差别，正交设计的16组PCR体系，以四个体系为一个实验组（1、2、3、4为组一，5、6、7、8为组二……），实验组4的量要少于实验组3的产物量，实验组3与实验组2的产物量无明显差异，实验组2的产物量要比实验组1的多；在实验组1的4个体系中，在模板添加量相同的情况下，梯度增加dNTP、引物浓度、Taq酶、buffer的添加量，发现扩增产物逐渐增多，说明适量的增加其他反应因子的浓度可以增加产物的生成；对比实验组2、3、4可以看出在增加模板浓度的情况下，产物的生成量也在渐渐增加，但是当模板添加量达到1.5μl时，产物的生成量便不在增加，只需用微量的模板DNA便可完成实验操作；从实验组9可以看出PCR所有体系都相同的添加量的两个泳道，产物量也不同；对比实验组1和实验组2的8个反应体系发现，适量增加dNTP、引物、Buffer的浓度，有利于扩增出更多的PCR产物；对比实验组2和实验组3的8个反应体系发现，随着适量增加各反应成分浓度，产物生成量变不在有明显变化。故而从经济角度考虑，根据以上各反应成分的浓度梯度优化实验和参考其他学者的研究成果，确定了反应体系10为最适宜的反应体系，本实验最终的SSR扩增体系（25μl）：10xPCRBuffer2.5μl，2.5μM/μl的dNTP0.8μl，5U/μLTaq酶0.2μl，SSR上、下游引物(10-5μmol/μl)各0.5μl，模板DNA1.5μl（热碱快抽法提取的）。PCR反应程序为：PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后一个循环72℃，延伸8min，4℃保存。3.4盐两优2208杂交种种子纯度检测3.4.1盐两优2208多态性引物的筛选本实验采用48对SSR引物对杂交中稻盐两优2208及其亲本材料进行多态性分析，筛选出选出扩增带型稳定，多态性丰富，实验操作的可重复性高的5对SSR引物。对PCR带型进行软件分析，（如图）扩征产物大小介于100-200bp之间。31 第三章结果与分析对比每对引物在双亲之间的多态性，经过多次比较，最终确定多态性、稳定性好的5对引物用作鉴定盐两优2208种子纯度。采用3％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，筛选出5对在盐两优2208的双亲间表现出多态性的引物分别是：RM586、RM336、RM224、RM17、RM561。这5对引物具有以下特点：自交结实的不育系具有与母本相同的带型；这些引物在杂交种与其双亲之间扩增出差异性谱带；试验操作的可重复性高，多次重复实验皆可得到稳定的扩增条带。通过筛选图片可以看出：48对引物全部都可以扩增出1—3条带，仅5对引物通过琼脂糖凝胶电泳在双亲之间表现出多态性，其余的43对引物在对比双亲之间的条带没有表现出多态性，或者多态性不明显，而这些在双亲间多态性不明显的引物，在用作纯度鉴定时很容易对实验结果产生因人而异的观察统计误差，会导致纯度结果的可信度降低；一部分引物虽然在双亲之中都可以扩增出2条带（如RM471、RM209、RM481等），但是对比双亲的条带同样没有多态性（父本和母本的两条带都处于相同大小的位置），而如RM258虽然在双亲都可以扩增出3条带，但是对比双亲之间3条带同样处于相处的位置，无法体现双亲间的差异性，如果出现对某个亲本扩增出超过一条带以上的情况，并且在双亲间体现出了差异性，有可能造成分不清F1和亲本之一类型，如RM209这对引物，在父本和母本之间各自都有两条带，其中一条属于共有带，而第二条带则表现出了差异性，而带型多了以后会比较复杂，带型的的扩增受PCR实验误差的影响，产生一定比例的PCR阴性，因此在选用杂交种不育系与恢复系之间的多态性SSR引物时，尽可能的选用扩增条带简单的引物。图3-3a从右往左依次为1-12号引物在盐两优2208双亲之间的扩增多态性注：M为5000bpMarker，每对引物都以父本和母本为模板分别进行扩增31 第三章结果与分析图3-3b为13—24号引物在盐两优2208双亲之间的扩增多态性注：M为5000bpMarker，每对引物都以父本和母本为模板分别进行扩增。图3-3c为25—36号引物在盐两优2208双亲之间的扩增多态性注：M为5000bpMarker，每对引物都以父本和母本为模板分别进行扩增图3-3d为37—48号引物在盐两优2208双亲之间的扩增多态性注：M为5000bpMarker，图中每对引物都以父本和母本为模板分别进行扩增3.4.2杂交水稻盐两优2208品种种子纯度的鉴定对盐两优2208的SSR纯度鉴定与田间鉴定结果进行了初步统计(表3.2)。本实验进行的SSR鉴定样本量由100、200、300、400、500逐渐递增，各个整百点时的SSR纯度（如表），而孝感田间小区种植鉴定样本量为1000株，鉴定的纯度为97％，实验室随机抽样进行SSR鉴定的平均纯度为98.2％-98.6%，结果表明两种鉴定方法相差不大。当采用的样本数量为200时，SSR纯度鉴定结果便可满足田间鉴定1000株群体纯度的调查。31 第三章结果与分析表3-2田间鉴定与SSR标记差异性比较引物编号SSR鉴定引物纯度总株数100200300400500RM58398%98.5%98.67%98.5%98.4%RM33699%98.5%98.67%98.25%98%RM22499%99%98.33%98.25%98.2%RM1798%98.5%98.33%98%98.2%RM56199%99%98.67%98.75%98.2%平均值98.6%98.7%98.53%98.35%98.2%与海南田间纯度之差0.1%0.2%0.03%0.15%0.3%与孝感田间纯度之差1.5%1.6%1.43%1.25%1.1%图是引物RM583、RM336、RM224、RM14、RM561对盐两优2208样本数分别为100、200、300、400、500粒种子各个整百点的SSR分子标记纯度鉴定结果，孝感和海南田间纯度鉴定的“盐两优2208”的纯度是97％和98.4%。图3-4a引物RM583对盐两优2208部分样本纯度的鉴定结果注：M：5000bpDNAMarker，f为参照的父本，m为参照的母本，1-22为待鉴定的盐两优2208，31 第三章结果与分析图3-4b引物RM336对盐两优2208部分样本纯度的鉴定结果注：M：5000bpDNAMarker，f为参照的父本，m为参照的母本，1-22为待鉴定的盐两优2208，白色箭头：检测出的混杂的母本不育系杂株图3-4c引物RM224对盐两优2208部分单株纯度鉴定的结果注：M：5000bpDNAMarker，f为参照的父本，m为参照的母本，1-22为待鉴定的盐两优2208，白色箭头：检测出的混杂的母本不育系杂株31 第三章结果与分析图3-4d引物RM224对盐两优2208部分单株纯度鉴定的结果注：M：5000bpDNAMarker，f为参照的父本，m为参照的母本，1-22为待鉴定的盐两优2208，白色箭头：检测出的混杂的母本不育系杂株图片3-4e引物RM17对盐两优2208部分单株的纯度鉴定结果注：M：5000bpDNAMarker，f为参照的父本，m为参照的母本，1-22为待鉴定的盐两优2208，图3-4f引物RM561对盐两优2208部分单株的纯度鉴定结果注：M：5000bpDNAMarker，f为参照的父本，m为参照的母本，1-22为待鉴定的盐两优2208，白色箭头：检测出的混杂的母本不育系杂株31 第三章结果与分析3.4.3杂株类型统计分析孝感田间的杂株类型具体统计结果如表3-3表3-3孝感田间杂株类型及数量引物父本杂株母本杂株变异株或者异品种RM337RM1700662323引物RM17、RM336对田间取样的杂株进行SSR分子鉴定如图（3-5a）图3-5a引物RM17对孝感田间鉴定的30株杂株SSR带型分析（琼脂糖凝胶电泳）注:M为5000bp的Marker，m:母本，泳道f:父本，1-30为杂株条带图3-5b引物RM17对孝感田间鉴定的杂株SSR带型分析（聚丙烯酰胺凝胶电泳）注:M为5000bp的Marker，泳道19：母本，泳道20:父本，其余泳道为样本条带31 第三章结果与分析图3-5c引物RM337对田间杂株分析（12%聚丙烯酰胺凝胶电泳）注:M为5000bp的Marker，泳道1:父本，泳道2:母本，3-30为样本条带从图3-5a可以看出，田间鉴定的杂株取样进行SSR带型分析，发现仅有6株不育系为杂株，其余的都是共有父本和母本的条带，跟盐两优2208的带型相同，但是与田间鉴定出的杂株类型有差别，无法明显区分异品种和变异株，所以进一步采用12%的非变性的聚丙烯胺酰胺凝胶电泳进行分析，如图3-5b泳道21-26为混杂的母本杂株，其余的为异品种或者变异株，如图3-6c泳道15、24、25、27、28、29为与不育系带型一致的杂株，确定为不育系混杂，没有发现有父本种子混杂，其余的杂株为异品种和变异株。采用两种引物RM17和RM337检测田间杂株，关于混杂父本、母本、异品种或变异株检测结果吻合。31 第四章讨论第四章讨论4.1纯度鉴定PCR模板的提取及影响PCR阳性率因素本实验采用热碱法快速抽提DNA作为PCR模版时，常常遇到一定比例PCR阴性，在PCR其他条件相同的情况下，产物量取决于模板的浓度与质量，当用“SDS法”和“热碱快抽法”两种方法提取的模板DNA添加量相同时，由于SDS法提取的模板浓度要高于热碱快抽法，所以实际的PCR扩增过程中，扩增的产物量也会相应的增加。通过增加模板（热碱快抽法提取的）添加量而增加了PCR底物的反应几率，从而很好的弥补了热碱快抽法提取DNA质量不高的不足，在实际大批量的纯度检测应用中，采用热碱快抽法获取模板DNA就可以满足本实验的纯度鉴定需求，完全可以用省时省力的“热碱快抽法”取代费时、操作繁琐的“SDS法”。本文希望得到一种适用于水稻纯度鉴定的快速高效的检测方法，为了适应农作物实际生产的需要，在保证结果可靠的基础上，节省检测时间。选取不同浓度或者不同抽提方法提取的基因组DNA作为PCR模版进行实验，因为快抽法的模板质量毕竟及不上“SDS法”提取的模板，如果出现极个别热碱快抽法的模板质量偏低，则会导致PCR检测的产物量偏低，EB染色后条带依然偏淡，会使观察效果因人而异，由于杂交稻会扩增出两条带，而其中一条带因为实验EB染色，电泳等因素导致其中一条带显色不明显，会误以为是杂株条带或是没有扩增，通过优化PCR反应体系包括退火温度、延伸时间、变性时间。本实验在使用快抽法提取模板DNA时应使反应液充分与样本接触以保证提取效率，经改善各实验环节后（PCR反应成分添加量、电泳条件、染色条件等）不仅减少了杂带的产生，还保证了PCR产物的扩增量。4.2鉴定结果的差异性探讨鉴定杂株类型时，如果只用一对SSR引物，则不易区分出其他类型的杂株（异品种杂交稻），但是通过田间观察却可以发现这些杂株，故而SSR纯度高于田间的纯度也是很正常的。田间鉴定也主要以表型判断为根据，而表型是环境和基因型相互作用的结果，人为判断有一定的难度，不同的鉴定者会因经验、观察习惯的不同而造成鉴定结果难做到一致，因此田间鉴定存在误差是不可避免的。31 第四章讨论用筛选出的5对SSR引物分别进行纯度鉴定时鉴定结果不完全一致，对田间杂株取样进行SSR分析，发现部分杂株扩增的条带与母本一致（琼脂糖凝胶电泳），其余的杂株共有父本和母本的条带，与真实的盐两优2208所扩增条带没有表现出差异性，但这些共有双亲条带的杂株在田间却可以鉴别出来，仅通过琼脂糖凝胶电泳却无法直接分辨，究其原因是可能有以下几点：一是混杂了其他亲缘性相近的杂交品种，这些异品种在某些SSR位点上扩增出与盐两优2208相同或相近大小的片段，或者是异品种与盐两优2208在某些SSR位点上本身就没有差异性，需要进行多位点检测才可以进一步区分，而相同或相近片段无法在琼脂糖凝胶上体现出多态性；二是检测出了跟不育系相同带型的杂株，初步认定为混杂的不育系，但是也有可能是检测的为点数太少，混杂了其他不育系异品种，而异品种在某些SSR位点上表现出与不育系相同的带型，需要检测多个位点才能区分，这无疑增加了纯度鉴定的难度与成本；三是在采用的亲本种子在其亲本选育过程中自身产生了变异，导致某些子代在进行SSR检测时所扩增的条带与亲本条带对比会出现细微的差别；四是。为了具体分析以上细微的差别，本实验进一步采用分辨率更高的12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来代替琼脂糖凝胶电泳对田间杂株的PCR条带进行分析，结果不仅验证了田间杂株鉴定结果的可靠性，还区分了杂株类型，本实验采用两种引物对田间杂株进行SSR鉴定后，采用聚丙烯胺酰胺凝胶电泳分析时均未发现有父本混杂，说明了盐两优2208制种收割父本时严格按照了程序执行，没有将恢复系漏割与制种田不育系混杂。4.3样本植株的大小和发芽率对纯度鉴定的影响室内SSR鉴定与田间鉴定所选用的时期不一致，实验室所采用SSR鉴定采用5cm幼叶提取DNA进行分析,而田间鉴定则主要集中在成苗期或者抽穗期阶段进行。从模板DNA提取过程来看,两种方法有可能受发芽率的干扰而影响实验者的抽样。就杂交水稻而言，杂株的数量只占极少数，以混杂不育系为主，相对于杂交水稻而言其亲本种子的发芽势弱，且发芽率较低，这些混杂的亲本种子最终能否正常发芽并被播种或者是否被正常抽样将直接影响纯度鉴定结果。同样的室内SSR鉴定时，混杂的亲本或者其他的杂种也会因为发芽势不一致的而造成样本单株的改变，导致实验者在抽样时因为选择习惯上的（习惯抽取幼苗长势好）而漏掉矮小的幼苗，而矮小的幼苗有极有可能是混杂的亲本，造成实验结果的不准确。因此,在保证发芽率的情况下确定最佳样本数量，使田间小区种植鉴定与SSR鉴定结果尽可能一致,为生产上用SSR鉴定替代田间种植鉴定降低成本、提高效率，更好地适应种子供求贸易节奏的需求,服务于我国的农业生产。4.4SSR标记鉴定的最小样品量31 第四章讨论本实验结合田间社区种植鉴定和SSR标记鉴定发现盐两优2208的纯度都在97%以上，由于纯度鉴定的取样具有随机性，那么很有可能会出现选择样本数量过少，导致无法检测出杂株，而鉴定样本数太多时无疑会增加鉴定的工作量和成本。本实验采用5种多态性引物针对不同的样品数量进行检测，最终确定了样本数量为200的纯度鉴定。对比SSR分子检测结果跟孝感、海南两处田间调查结果发现这两种鉴定方法的结果没有明显的差异性，证明了采用SSR分子标记技术鉴定纯度的可靠性与可行性。SSR标记是一种基于分子操作水平上的鉴定,对于熟练的实验操作者而言鉴定结果准确、可靠。但SSR分子标记的本质是PCR扩增，因此在实际操作过程中：采集样品、提取DNA、对应编号、数据记录、图片观察统计等都需要做到认真仔细，以保证纯度鉴定结果的可靠性。PCR扩增结果存在的一定比例的阴性也是值得注意，因为本实验采用热碱快抽法的模板DNA，那么会存在极个别样本在抽提过程中提取液与样本没有充分接触或者受热不均匀、不充分使模板最低限度浓度无法得到保证，从而导致PCR扩增没有目的产物生成或者产物生成量很少无法用直接目测观察到，所以在用“热碱快抽法”获取模板的过程中应保证样品尽可能的剪碎、样本沉积在EP管最底部，再者高效的Taq酶和适宜的退火温度是使扩增产物具有特异性的重要保证，这样的SSR鉴定结果才是可信的。所以在选用SSR引物时，最宜选用扩增条带尽可能的简单（父本和母本最好各一条带）、便于观察统计、扩增条件不敏感、样品PCR扩增的实验操作可重复性强的SSR引物。本研究利用SSR分子标记技术鉴定盐两优2208种子纯度,以期建立一套适合该品种纯度鉴定的技术规程,在操作流程中应注意以下几点:在对盐两优2208的取材（浸种催芽的幼苗）过程中，一定要遵循随意取材的原则，不可主观性的只取生长旺盛高大的幼苗；在浸种催芽过程中防止种子间相互挤压，种子间相互挤压会使部分谷粒的长势出现滞后的现象，应使种子均匀分散开来；在使用热碱快抽法提取模板时使样本充分剪碎，保证提取液与样本充分接触以提取更多的模板；使用琼脂糖凝胶电泳时，上样量不宜超过5μl，上样量过大会使部分PCR产物出现滞后现象，使带型变宽，干扰带型分析，上样量低于2μl时会使看不清条带；SSR纯度鉴定的样本数量以200为宜，200个样本的鉴定结果便可满足该品种的纯度鉴定。31 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附录附录NY/T1433-2007水稻品种鉴定DNA指纹48对SSR引物序列引物编号退火温度℃正向引物序列（5’→3’）反向引物序列（5’→3’）RM583155AGATCCATCCCTGTGGAGAGGCGAACTCGCGTTGTAATCRM71255CTAGAGGCGAAAACGAGATGGGGTGGGCGAGGTAATAATGRM85355CCAAAGATGAAACCTGGATTGGCACAAGGTGAGCAGTCCRM471455ACGCACAAGCAGATGATGAGGGGAGAAGACGAATGTTTGCRM274555CCTCGCTTATGAGAGCTTCGCTTCTCCATCACTCCCATGGRM190655CTTTGTCTATCTCAAGACACTTGCAGATGTTCTTCCTGATGRM336755CTTACAGAGAAACGGCATCGGCTGGTTTGTTTCAGGTTCGRM72855CCGGCGATAAAACAATGAGGCATCGGTCCTAACTAAGGGRM219955CGTCGGATGATGTAAAGCCTCATATCGGCATTCGCCTGRM3111055TGGTAGTATAGGTACTAAACATTCCTATACACATACAAACATACRM2091155ATATGAGTTGCTGTCGTGCGCAACTTGCATCCTCCCCTCCRM191255CAAAAACAGAGCAGATGACCTCAAGATGGACGCCAAGARM11951355ATGGACCACAAACGACCTTCCGACTCCCTTGTTCTTCTGGRM2081455TCTGCAAGCCTTGTCTGATGTAAGTCGATCATTGTGTGGACCRM2321555CCGGTATCCTTCGATATTGCCCGACTTTTCCTCCTGACGRM1191667CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTGCGCCGGATGTGTGGGACTAGCGRM2671755TGCAGACATAGAGAAGGAAGTGAGCAACAGCACAACTTGATGRM2531855TCCTTCAAGAGTGCAAAACCGCATTGTCATGTCGAAGCCRM3392055GTAATCGATGCTGTGGGAAGGAGTCATGTGATAGCCGATATGRM2782155GTAGTGAGCCTAACAATAATCTCAACTCAGCATCTCTGTCCRM2582255TGCTGTATGTAGCTCGCACCTGGCCTTTAAAGCTGTCGCRM2242355ATCGATCGATCTTCACGAGGTGCTATAAAAGGCATTCGGGRM172455TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTCGGTGATCCTTTCCCATTTCARM4932555TAGCTCCAACAGGATCGACCGTACGTAAACGCGGAAGGTGRM5612655GAGCTGTTTTGGACTACGGCGAGTAGCTTTCTCCCACCCCRM82772755AGCACAAGTAGGTGCATTTCATTTGCCTGTGATGTAATAGCRM5512855AGCCCAGACTAGCATGATTGGAAGGCGAGAAGGATCACAGRM5982955GAATCGCACACGTGATGAACATGCGACTGATCGGTACTCCRM1763067CGGCTCCCGCTACGACGTCTCCAGCGATGCGCTGGAAGAGGTGCRM4323155TTCTGTCTCACGCTGGATTGAGCTGCGTACGTGATGAATGRM3313255GAACCAGAGGACAAAAATGCCATCATACATTTGCAGCCAGOSR283355AGCAGCTATAGCTTAGCTGGACTGCACATGAGCAGAGACARM5903455CATCTCCGCTCTCCATGCGGAGTTGGGGTCTTGTTCG39 附录RM213555ACAGTATTCCGTAGGCACGGGCTCCATGAGGGTGGTAGAGRM33313650CCTCCTCCATGAGCTAATGCAGGAGGAGCGGATTTCTCTCRM4433755GATGGTTTTCATCGGCTACGAGTCCCAGAATGTCGTTTCGRM4903855ATCTGCACACTGCAAACACCAGCAAGCAGTGCTTTCAGAGRM4243955TTTGTGGCTCACCAGTTGAGTGGCGCATTCATGTCATCRM4234055AGCACCCATGCCTTATGTTGCCTTTTTCAGTAGCCCTCCCRM5714155GGAGGTGAAAGCGAATCATGCCTGCTGCTCTTTCATCAGCRM2314255CCAGATTATTTCCTGAGGTCCACTTGCATAGTTCTGCATTGRM5674355ATCAGGGAAATCCTGAAGGGGGAAGGAGCAATCACCACTGRM2894455TTCCATGGCACACAAGCCCTGTGCACGAACTTCCAAAGRM5424555TGAATCAAGCCCCTCACTACCTGCAACGAGTAAGGCAGAGRM3164655CTAGTTGGGCATACGATGGCACGCTTATATGTTACGTCAACRM3324755GCGAAGGCGAAGGTGAAGCATGAGTGATCTCACTCACCCRM71024855TAGGAGTGTTTAGAGTGCCATCGGTTTGCTTATACATCAG39 致谢致谢本研究是在导师居超明副教授的悉心指导下完成的，导师严谨的治学态度，丰富的科研知识以及民主的处事方式让我受益匪浅，并将终身受用。在这两年的学习中，居老师给予了我无微不至的指导和关怀，使我的专业素养得到明显提高；同时，导师宽厚谦和的为人，轻松平等的交流方式以及开阔的视野都潜移默化的影响着我。在此也要感谢蔡得田教授、汤行春副教授、杨之帆教授、陈建国教授等人为本研究提供相关的实验仪器；感谢徐国成老师、师兄汪德军、杨老师冒着酷暑指导完成田间鉴定；感谢师兄李华中、师姐王云之、师兄胡锐、师妹邓燕在实验过程中的无私帮助；感谢程丹师姐、韩宵帆师姐、刘潇楠师姐、邓小伟师兄、袁龙宇、陆婕、陈阅军、蔡华万等同学曾给予我无私的帮助。衷心感谢我的父母和家人对我的支持和理解，感谢多年来你们对我的无私奉献，让我在任何时候都能坚持下来，一直保持坚强乐观的生活态度。最后，感谢湖北大学生命科学学院的教育和培养，感谢所有的老师和同学们，感谢所有关心、支持和帮助我的人！衷心祝愿湖北大学越办越好！李自翔2014年5月39'