开设“改善单链抗体亲合力的分子结构改造”特色实验课的体会.pdf

'第32卷第4期实验室研究与探索V01．32NO．42013年4月RESEARCHANDEXPLORATIONINLABORATORYAnr．2013开设“改善单链抗体亲合力的分子结构改造"特色实验课的体会朱建国，林源，李本强(上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室，上海200240)摘要：为本科生，开设了“改善单链抗体亲合力的分子结构改造”特色实验课，内容包括改善单链抗体亲和力的置换碱基确定及PCR引物设计实验，点突变单链抗体基因扩增及其重组表达质粒构建实验，点突变单链抗体表达及亲和力测定分析实验。通过实验，使学生掌握了抗体分子结构与其亲合力的关系的基本原理以及通过结构改造改善抗体分子功能的基本技术。对增强学生对生物技术的好奇心和兴趣，启发学生科研创新意识，培养学生的科研能力起到了积极的作用。关键词：生物技术；特色实验课；科研能力；创新意识中图分类号：S858．31文献标志码：A文章编号：1006—7167(2013)04—0155—02ReflectionsontheExperimentalCourseof“ImprovedAffinityofSingle-chainAntibodyUsingMolecularModification’’ZHUJian—guo，LINYuan，LIBen—qiang(ShanghaiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，SchoolofAgricultureandBiology，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200240，China)Abstract：Theexperimentalcourseof“Improvedafinityofsingle—chainantibodybyusingmolecularmodification’’wasgiven，whosecontentincludestheimprovementofaffinityofsingle—chainantibodybybasereplacement，thedesignoftheexperimentalprimersforPCR，theamplificationofthepointmutationsingle—chainantibodygene，theconstructionoftherecombinantplasmid，theexperimentofpointmutationsingleantibodyexpressionandafinitymeasurementanalysis．Thegoalsofthiscoursearetoenablethestudentstograsptheantibodybasictheoryofmolecularstructureandafinity，aswellasthebasictechnologyofimproveafinityofsingle-chainantibodybyusingmolecularmodification．Theanalysisshowsthatithasplayedanactiveroleinenhancingstudentscuriosityandinterestinbiotechnology，inspiringthestudents’innovationconsciousnessanddevelopingtheirinnovation，etc．Keywords：Biotechnology；specialexperiment；researchcapacity；innovation向第三代基因重组抗体阶段。其中的单链抗体O引言(Single．chainvariablefragment，scFv)由于具有分子量抗体(Antibody)是疾病治疗诊断中最有力的工具小、易于基因操作改造、在特定医学应用中拥有多种有之一，也是迄今为止检测和治疗分子中发展最快的一利性质、便于经济有效的生产等特点，显示出比传统类功能性分子。基因工程技术已经将抗体研制技术推单克隆抗体(mAb)更大的优势，是第三代抗体的重要代表，其相关的理论和技术也应该是生命科学学科领域学生重点掌握的知识。收稿日期：2012—05—18“动物生物技术综合实验II”是一门涵盖以现代基金项目：2010年上海交通大学特色实验课项目资助(2010)作者简介：朱建国(1962一)，男，宁夏灵武人，博士，教授，博士生免疫学、分子生物学等学科原理和技术为基础的动物导师，研究方向预防兽医学。疫病综合防治技术实验课程。该课程中的一些实验内Te1．：021_34206367；E-mail：zhu—jg@sjtu．edu．en容在教学过程中被证明设置不科学或与其他课程内容 156实验室研究与探索第32卷重复，需要设置更为科学合理的实验内容对其进行更用渗透休克法提取细胞周质中的表达的单链抗体，用新。ELISA实验检测表达的单链抗体与抗原的结合强度，本课题组多年来一直从事单链抗体技术研究，成以分析比较氨基酸置换前后单链抗体的亲和力。功构建了单链抗体库，并筛选得到了多个针对传染性3取得的教学效果支气管炎病毒(IBV)以及新城疫病毒(NDV)等的单链抗体。随着研究的深入，我们也发现了单链抗体构(1)形成一种科研教学动态运行模式。本项目选建技术中的一些新问题，譬如抗体分子亲和力不高、稳题来自本课题组多年来一直从事单链抗体技术研究的定性较差等。这些是书本上找不到现成解决方法的共实际项目。本课题组经过多年的PRP与本科生科技性问题，需要在实验中引导学生探索研究新的解决创新和毕业设计的教学实践，在特色实验教学方面形方法。为此，我们申报上海交通大学特色实验项目成了一定的工作积累。在多年的教学和科研相结合的“改善单链抗体亲合力的分子结构改造”，目的是在本实践中，我们团队注重探索由任课老师、博士研究生、科生所能承受的技术层面内，研究制定切实可行的实硕士研究生和本科生组成的结构合理的科研教学动态验内容和方案，替代现有的设置不科学的实验课内容，运行模式。通过本项目顺利实施，说明我们探索的由以期通过实验，使学生掌握抗体分子结构与其亲合力科研团对承担本科教学实验的运行模式是成功的。的关系的基本原理以及通过结构改造改善抗体分子功(2)改善了现有实验课程的内容。本课题组开设能的基本技术。这将对增强学生对生物技术的好本科生“动物生物技术实验2”课程，教学效果良好。奇心和兴趣，启发学生科研创新意识，培养学生的科研但随着课程运行，我们发现一些实验内容已经不能适能力发挥重要的作用。应学科发展的需要，需要用新的实验内容替代现有的设置不科学的实验课内容，本课题组正是基于在该课1实验目的程教学实践过程中对课程建设内容的理解和把握，将通过实验，让学生掌握抗体分子结构与其亲合力本实验项目分为9个学时合理地镶嵌在“动物生物技的关系的基本原理，掌握氨基酸置换对抗体片段亲和术实验2”课程中，使得该课程教学效果大为改善。力影响的基本原理以及PCR点突变、基因碱基置换的(3)全面提高了学生的科学素养及科研能力。实基本技术方法，从而对通过结构改造改善抗体分子验方案设计能充分考虑本科生所能承受的技术能力，功能的基本原理和技术有一个全面系统的认识。这将且有利于激发学生创新意识和能力。通过这一完整、对增强学生对生物技术的好奇心和兴趣，启发学生科具体科研项目的科研过程的参与，使学生从科研项目研创新意识，培养学生的科研能力发挥重要的作用。立项可行性论证、实验方案设计、实验操作、结果分析讨论等环节有一个全面系统的体验和锻炼⋯，全面提2实验内容高了学生的科学素养及科研能力。整个实验项目由3个实验组成，每个实验安排34结语学时，共需9学时。(1)实验一改善单链抗体亲和力的置换碱基确(1)验证性实验改为探索性试验，有利于激发学定及PCR引物设计实验。分析本实验室构建的单链生的科研兴趣和创新意识。在充分考虑学生所能承受抗体ZL．10的基因序列，确定为提高抗体亲和力需要的专业理论和技术能力的前提下，从课题组实际科研置换的氨基酸，按照点突变PCR的原理设计两对引项目中需要探索的项目中凝练出一个小型科研项目，物，用于对重链CDR3301-303碱基和307-310碱基拟解决的问题都是书本上找不到现成解决方法的共性进行突变。问题，需要在实践中引导学生探索研究新的解决方法。(2)实验二点突变单链抗体基因扩增及其重组表实践证明，当学生知道他们要做的实验是探索一种未达质粒构建实验。利用引物设计在突变的scFv基因两知的东西时，非常兴奋。让学生实际体验创新乐趣，更端加入酶切位点(NcoI和NotI)，通过PCR扩增法对能激发学生的好奇心和探索精神，对于启发学生科研scFv基因实施点突变并最终获得点突变的scFv基因，创新意识，培养学生的科研能力具有重要的作用。分别用限制性内切酶NcoI和NotI对scFv基因和载体(2)正式实验和预备实验相结合，力求完整系统。质粒进行双酶切，使其产生相同粘性末端，利用大肠杆本实验是一个系统的小型科研项目，实验内容完整系菌T4连接酶，将酶切后的scFv基因和载体连接。统，但由于本科生教学计划的实际需要，本项目只能安(3)实验三点突变单链抗体表达及亲和力测定排9学时，而且分割成三次实验，每个实验间隔一周，分析实验。对含有scFv的重组表达质粒的阳性克隆跨度大，内容不连贯，难以衔接，不利于学生对整个实进行培养，再加入诱导剂诱导蛋白表达。收集菌体，利(下转第196页) l96实验室研究与探索第32卷123456难与问题都是想象中的，谈不上克服与解决。只有勇[7]孙兴民，刘文贵．对设计性实验的认识与实践[J]．实验室科学，2007(5)：97—99．敢地迈出第一步，创建一个科技制作实验室，才能面对[8]白广梅，王小逸．促进创新实验项目不断产生的思考[J]．实验室真实的问题，真实的困难，然后，通过努力，不断地思研究与探索，2010，29(8)：119．121．考、学习和实践去克服困难、解决问题，开创师范院校[9][美]戴维．H．乔纳森．学习环境的理论基础[M]．郑太年，任友科技教育人才培养的一片新天地。群译．上海：华东师范大学出版社，2002．[10]项国雄．和谐社会建构中的中国教育技术[M]．北京：电子工业参考文献(References)：出版社，2005：564．[11]张善青，倪雁冰，牛兴华，等．实验用数控机床的科学配置[J]．实吴金林．独立学院人才培养目标定位研究[J]．教育与职业，2005验科学与技术，2006(4)：95-97．(2)：26—28．[12]阮俊，金海萍，李五一，等．提高实验室安全与环保工作参与积史宁中，张楚庭．高等师范教育面向21世纪教学内容和课程体极性的探讨[J]．实验室研究与探索，2011，30(1)：172．174．系改革成果丛书(综合改革研究分卷)[M]．北京：北京师范大学[13]张旭，马文权，刘晶晶．实验技术队伍建设面临的问题及解决出版社，2001：134．途径[J]．实验室研究与探索，2006，25(3)：397—399．刘向阳，郑海务．专业实验室建设与改革实践[J]．实验室研究与[14]邢立新．加强实训教学培养学生动手能力[J]．职业教育研究，探索，2010，29(2)：145-148．2010(2)：122．123．夏兆省．初中科学创设情境教学的探讨[J]．教学、教研，2006[15]宋晓峰．论高校实验室软环境建设[J]．科学之友，2010(10)：(36)：4244．116．117．冯煤生．日本青少年科学教育装备的启示与思考[J]．中国教育[16]刘龙，宋书中，陈岩，等．以“挑战杯”为契机开展大学生科技术装备，2006(4)：67．70．技活动的实践[J]．理工高教研究，2005，24(3)：43-44．黄俊生，衷明华，林曼斌．师范特色化学实验教学示范中心的建设与发展[J]．实验室研究与探索，2010，29(8)：230．232．(上接第156页)验过程的整体把握。所以我们探索出一个正式实验与antibodyfragments[J]．ReviewsinMedicalMicrobiology，2012，23(2)：9-13．预备实验相结合的运行模式，特别抓预备实验环[5]ErikK，MichaelR，CharlesBS．eta1．Physico．chemical节。即每次正式实验开始前，每个小组至少有一个determinantsofsolubleintrabodyexpressioninmammaliancell学生提前到实验室准备实验，而正式实验结束后，至少cytoplasm[J]．ProteinEngineering，Design&Selection，2010，23有一个学生负责观察结果，确保学生前后连贯地熟悉(6)：489-498．整个实验过程，由两个博士生全程担任助教。这种由[6]NakamuraN，ShuyamaA，HojyoS．Establishmentofachickenmonoclonalantibodypanelagainstmammalianprionprotein[J]．J任课老师师、博士研究生、硕士研究生和本科生组成的VetMedSci，2004，66(7)：807—814．结构合理的科研教学团队动态运行模式，对于这类实[7]WilliamJJF，IainS，JoannaPR，etalGenerationofhigh—afinity验运行特别有效。chickensingle-chainFvantibodyfragmentsformeasurementofthe(3)注重考核环节，确保教学质量。除了各个环pseudonitzschiapungenstoxindomoic[J]．AcidappliedAndEnvironmentalMicrobiology，2006：3343-3349．节认真把关外，特别注重通过实验报告考察学生的掌握能力¨，老师每次都要认真点评上一次的实验报[8]BoonCH，TongC．Makingcell—permeableantibodies(Transbody)throughfusionofproteintransductiondomains(PTD)withsingle告，让学生针对实验中出现的问题及时进行讨论，谈实chainvariablefragment(scFv)antibodies：Potentialadvantagesover验体会，能清醒地认识本科生的实验能力。在方案设antibodiesexpressedwithintheintraeellularenvironment『J]计方面能充分考虑学生所能承受的技术能力，既能保IntrabodyMedicalHypotheses，2005，64：1105—1108．证实验按照预期结果完成，又善于激发学生创新意识[9]AdrianAM，KathrinT，AlcideB．Antigen．independentselectionofintraeellularstableantibodyframeworks[J]．Methods，2004，34：和能力，取得了较好的成绩。215-224．参考文献(References)：[10]白素萍．加强实验室人员队伍建设提高实验教学水平[J]文理导航(实践平台)，2012(10)：63．[1]DavidWC，Yijiac，JohnPC，eta1．Potentinhibitionofhuntingtin[11]匡翠萍，刘曙光，钟桂辉，等．实验教学改革与学生创新能力培养aggregationandcytotoxicitybyadisulfidebond—freesingle。domain[J]．实验室研究与探索，2012，31(9)：86-88．intracellularantibody[J]．PNAS，2004，101(21)：17616—17621．[12]隋春红，王程，韩丽琴，等．与科研课题结合的化学实验教学模[2]LinY，ZhuJG．ImprovedAfinityofachickensingle—chain式在教学型高校的实践和体会，中国校外教育，2012，25：41．antibodytoavianinfectiousbronchitisvirusbysite—directed[13]陈友媛，许国辉，杨世迎，等．多种实验方式联合实验教学模式的mutagenesisofcomplementarity-determiningregionH3[J]．A~iean构建[J]．实验室研究与探索，2012，31(9)：131—134．JournalofBiotechnology，2011．10(79)：18294-18302．[14]马传峰．实验教学改革的探索与思考【j]实验室研究与探索，[3]林源，王建华，朱建国．鸡传染性支气管炎病毒单链抗体的筛2012，31(9)：89-91．选及其互补决定区序列分析[J]．西北农林科技大学学报，2010，[15]李铁，李明弟，姜爱民，等．创新实验开放教学体系的改革[J]．39(2)：47-53．实验室研究与探索，2012，31(9)：142-152．[4]zhuJG．LinY，LiBQ．Productionandpropertiesofsingledomain'