GBT 26612-2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程

'ICS6502030B43a目中华人民共和国国家标准GB／T26612—2011纯血马DNA亲子鉴定技术规程ProceduresofThoroughbredparentageverificationwithDNAtestingtechniques2011—06-16发布2011—11—01实施宰瞀粥紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19 刖菁本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业大学马研究中心、中国马业协会。本标准主要起草人：赵春江、吴常信、韩国才、张浩、吴克亮、杜丹、韩文朋GB／T26612—20 范围纯血马DNA亲子鉴定技术规程本标准规定了纯血马DNA亲子鉴定所用的方法、过程、结果的记录和解读等本标准适用于纯血马的亲子鉴定。2规范性引用文件GB／T26612—20下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其撮新版本适用于本标准。GA／T383法庭科学DNA实验室检验规范SN／T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SN／T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31纯血马Thoroughbred符合国际纯血马登记委员会(InternationalStudBookCommittee，ISBC)规定、在ISBC批准的成员国登记委员会登记了的马匹。32镦卫星DNA亲子鉴定方法IOarentagelestJngwithDNAtechnique以微卫星DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法。4原理根据微卫星DNA的侧翼序列设计引物，对微卫星DNA位点进行扩增，其中包括国际动物遗传协会(InternationalSocietyofAnimalGenetics，ISAG)和ISBC要求的九个微卫星位点。通过凝胶电泳判定个体的基因型。根据盂德尔遗传规律，比对亲代个体和子代个体各微卫星DNA位点的基因型是否相符，从而达到亲子鉴定的目的。5试剂与器材51试剂511乙醇(ethan01)，分析纯。5．1．2异丙醇(isopropan01)，分析纯。5．1．3氢氧化铺(NaOH)，分析纯。5．14乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，分析纯5．15氯化钠(NaCI)，分析纯。5．1．6十二烷基硫酸钠(SDS)，分析纯。5．1．7乙酸钾(CH。COOK)，分析纯。5．1．8氧化锂(LiCl)，分析纯。 GB／T26612—205．1．9氯化钾(KCl)，分析纯。5．110氧化镁(MgCI。)，分析纯。51．1130％(质量分数)丙烯酰胺溶液：将29％丙烯酰胺和1％N，N’一亚甲双丙烯酰胺溶于去离子水，充分搅拌溶解井过滤去杂质，避光保存。5．112过硫酸铵，分析纯。5．113硼酸(boricacid)，分析纯。5．114乙酸，分析纯。5．1．15甘油，分析纯。5116四硼酸钠，分析纯。5．117硝酸银(AgNOa)，分析纯。51．18甲醛，分析纯。5．1．19溴化乙锭，分析纯。51．20TaqDNA聚合酶。51．21溴酚蓝，分析纯。51．22盐酸(HCI)，分析纯。51．23三(羟基甲基)氨基甲烷(TrisBase)，分析纯。51．24Tris—HCI：由TrisBase和HCI组成的缓冲溶液。5125三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTPs)：等量的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧棱苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧棱苷酸(dCTP)的混合物。5{26毛囊裂解液：200mmol／LNaOH。5127中和液：200mmol／LHCI，100mmol／LTri}HCI，pH85。5128缓冲液：a)血液裂解缓冲液(BufferA)：100mmol／LTrisHCI(pH75)，100mmol／LED强，100mmol／LNaCI，0．5％(质量分数)SDS；b)蛋白沉淀缓冲液(BufferB)：200mL5mol／LCHsCOOK，500mL6mol／LLiCI混匀后使用；c)DNA溶解缓冲液(TE)：10mmol／LTri}HCI，1mmol／LEDTA．pH=80jd)电泳解缓冲液5×TBE：446mmol／LTrisBase，445mmoI／LBoricAcid，10mmol／LEDTA(pH8．O)；e)电泳解缓冲液50×TAE：2mol／LTris碱，lmol／L冰乙酸，0．1mol／LEDTA(pH8一o)；I)上样缓冲液；30mmol／LEDTA，36％(体积分数)丙三醇，0．05蟛(质量／体积分数)溴酚蓝，pH=70；g)10×PCR缓冲液：100mmoI／LTris—HCI(pH8o)，0．5mol／LKCI，15mmol／LMgCI2。5129琼脂糖(分析纯)。5130N，N，N’，N‘四甲基乙二胺(TEMED)。5131琼酯糖胶：琼脂糖加入电泳解缓冲液，加热熔解冷却后制成的胶状物，可用于DNA电泳。5．2器材52．1全自动DNA分析仪。52．2离心机，离心力i00009。5．2．3紫外可见分光光度计。52．4移液器，量程0．1PL～1000pL。5．2．5PCR仪，96孔热循环。5．2．6水平电泳槽，长度31cm。" GB／T26612—20527垂直电泳槽，长度24cm。528凝胶成像系统。52．9漩涡振荡仪。52．10剪刀，6DNA亲子鉴定规程6．1DNA的提取采取血液或带有毛囊的马毛发，从中提取DNA。具体方法参见附录A。DNA样品操作注意事项见SN／T1119。62亲子鉴定所用DNA微卫星位点亲子鉴定所用DNA微卫星位点应包括ISAG和ISBC要求的如下九个微卫星位点：AHT4，AHT5，ASB2，HMS3，HMS6，HMS7，HTG4，HTGl0，VHL20。在所扩增的位点中还可包括HTG6，HTG7，HMS2等三个微卫星位点或其他若干个已被证实在纯血马群体中多态性丰富的微卫星位点，以进一步提高亲子鉴定的准确性。引物序列参见附录B。63DNA微卫星位点的扩增可用荧光物质标记用于扩增上述12个位点的引物，采用PCR方法扩增这些微卫星位点。PCR条件参见附录C。PCR操作中防止污染等注意事项见GA／T383。64基因型的检测使用根据荧光信号探测PCR产物大小的全自动DNA分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染(参见附录D)等可检测两个碱基长度差异的方法检测上述12个位点的基因型。在分析中设置对照样本。上述操作技术要求见SN／T1193。65基因型的表示方法基因型用国际通用的字母表示。在所检测的微卫星位点中，等位基因数为奇数的，片段长度居中的基因型记为“M”；如等位基因数为偶数，居中的两个基因型中片段较小的定义为“M”。其他等位基因对照“M”按升序排列。微卫星位点基因型的记录参见附录E。66亲子关系的判断根据两亲本及子代个体的基因型判断其是否存在亲子关系。基因型的读取和亲子关系的判断由两人分别独立完戚，其结果互相印证。6．7否定个案的重复检测对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，重新采取DNA样品进行鉴定，两次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系。7亲子鉴定结果的记录7．1亲、子代基因型相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型相符的个案，记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型，并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测，不能排除子代个体与两亲本存在亲子关系”，并由亲子鉴定负责人签字。7．2亲、子代基因型不相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型，并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测，可排除子代个体与两亲本存在亲子关系”，并由亲子鉴定负责人签字。 GB／T26612—20附录A(瓷料性附录)从血液或毛囊中提取DNAA1马血液样品DNA的提取A．1．1从马颈静脉采取血样5mL，用移液器量取i00皿10％(质量分数)EDTA抗凝。A．1．2取50pL血液样品放入1．5mL离心管中。A．1．3加入400“LBufferA，充分混合至凝块消失。A．1465℃温浴2h～4h。A．15加入800“LBufferB，颠倒混合，然后冰浴10rain(或放人一20℃冰箱内5nun～10rain)。A．16用离心机在室温下以12000r／rain离心15rain。A．17吸取ImL上清液于另一新的1．5rnL离心管中。注意不要吸刊下层沉淀物或表层漂浮物，必要时可重复离心去除沉淀物。A．I8加人600pL异丙醇(isopropan01)，颠倒混合几次。A．1．9室温12000r／rain离心15rain。AI10弃上清液，然后用70吖(体积分数)乙醇(ethan01)清洗两次，室温干燥，加入150pLTE室温溶解30rain。A1．11在水平电泳槽内用l_0％(质量分数)琼脂糖胶电泳检测DNA的质量；采用紫外可见分光光度计，以260／280吸光度检测DNA浓度。A112—20℃保存。A2马毛囊样DNA的提取A．2．1采取马的鬃毛，应该带有毛囊，10支以上。A．2．2取02mL离心管，标记样品号。A．2．3取6根～10根带有毛囊的毛样，在根部用剪刀剪切约05cm(避免粘在剪刀上)，放人离心管中。A24加入80吐毛囊裂解液(此浓度为黑毛样品的用量，栗毛加g／s浓度的毛囊裂解液)于毛囊处，漩涡振荡仪上迅速漩涡混合3rain。A25在PCR仪上用如下程序进行一个热循环：75℃lrain，80℃2rain，90℃1rain，97℃10rain。A26从热循环仪上取下样品，加入80pL中和液(此浓度为黑毛样品的用量，栗毛加2／3浓度的中和液)，漩涡混合3rain。A27—20℃保存。 附录B(资料性附录)用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物如表B．1所示。表B1用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物GB／T26612—20位点名称序列(5’37)正向：AACCGCCTGAGCAAGGAAGT反向：GCTCCCAGAGAGTTTACCCT正向：AcGGAcAcAT0ccTGocTGc反向：ATcTAGcAGGcTAAGGAGGCTCAGC正向：CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG反向：GATCATATGCCCTTATCTCTTTGCGC正向：CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTG反向：ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT正向{CCAACTCTTTGTCACATAACAAGA反向CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT正向GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG反向CTCCATcTTGTGAAGTGTAACTCA正向：CAGG从ACTCATGTTGATAcCATC反向：TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT正向：CTATcTcAGTcTTGATTGcAGGAC反向：CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC正向：ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG反向：CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG正向：ccTGcTTGGAGGcTGTGATAAGAT反向GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCT正向CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA反向：TTTTTATTcTGATCTGTCACATTT正向：cAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG反向：AACTCAGGGAGAATcTTCCTCAG GB／T26612—20跗录c(资料性附录)扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的PCR条件C1PCR条件扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的PCR条件如表C1所示表C．1用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小位点名称标记颜色片殷大小／bp退火湿度／℃Mg。。浓度／mmol／L蓝色黄色绿色黄色蓝色黄色HTG6绿色黄色蓝色C．2PCR反应体系PCR反应体系如下：50pL反应体系：10×PCR缓冲液5旺，dNTPs(5mmol／L)l／xL，引物(50t”mol／L)各2btL，ToqDNA聚合酶(5U／I-L)0．5btL、模板DNAl0pL(50ng～500ng)、ddHzO31．5／aL，扩增每个位点所需的最佳镁离子浓度参见表C1。反应条件：PCR反应条件随仪器不同略有改变。94℃预变性lmin～3rain。94℃变性30s，退火30s(扩增每个位点所需的最佳退火温度参见表C．1)，72℃延伸45s，30个循环。72℃延伸30rain。4℃保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知可成功扩增的马DNA样品作阳性对照；用等体积的重蒸馏水代替模板DNA作空白对照。c3PCR扩增产物的电泳检测PCR扩增产物电泳检测：取2．5g琼脂糖，放入100mL电泳缓冲液(将电泳缓冲液50XTAE用去离子水稀释50倍)加热充分熔解后制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过凝胶。将4止PCR扩增产物和适量上样缓冲液混合后上样。9V／cm恒压电泳，溴酚蓝迁移至凝胶中部停止。将胶放人溴化乙锭溶液(浓度为o5btg／mL)中染色15vain，采用凝胶戒像系统观察电泳结果并记录。 附录D(资料性附录)采用银染进行做卫星DNA基因型的分析方法GB／T26612～20D．112％(质量分数)聚丙烯胺凝肢(25mL体积，01cm胶条)制作及电泳D．1．1清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，晾干后上垫条，用夹子夹好。D12在100mL烧杯内加入30％(质量分数)聚丙烯酰胺10mL，25mL50％(体积分数)的甘油，电泳解缓冲液5×TBE5mL，10“(质量分数)过硫酸铵0．175mL，TEMED8pL，加入蒸馏水7325mL，混合均匀后迅速灌胶。上述为一块胶的量，多块胶时按比例加倍。D13当灌胶至玻璃板上沿0．1cm时停止，插入梳子，室温放置至其聚合。D．1．4凝胶聚合好后，向垂直电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。D．1．5预电泳10rain，然后上样、电泳。D．2硝酸银染色方法D2．1用去离子水冲洗胶。D2．2用25％(体积分数)的乙醇浸泡胶2nun～3rain。D．23去离子水冲洗2遍。D．24用0．1蹦(质量分数)AgNO。染色棱染色30mm～40rain。D．25去离子水冲洗2遍。D．26用显色液(取15gNaOH，加去离子水至500mL溶解，加0076g四硼酸钠和800乩甲醛)显色10min～20rain。D27用去离子水冲洗多余的显色液。D．2．8显色后的胶用保鲜膜封好，观察和照相。 GB／T26612—20附录E(资料性附录)纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记如表El所示。表E．1纯血马亲于鉴定微卫星DNA基因型登记表位点名称子代基因型母马基因型公马基固型子代基因型母马基因型公马基因型'