GBT 23476-2009 松材线虫病检疫技术规程

'囝亘中华人民共和国国家标准GB／T23476--2009松材线虫病检疫技术规程Technicalregulationonquarantineforthepinewiltdisease2009-04-01发布2009—09—01实施丰瞀鳃紫瓣警矬瞥翼发布中国国家标准化管理委员会仪1” 刖昌GB／T23476--2009本标准的附录F为规范性附录，附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录G为资料性附录。本标准由国家林业局提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：国家林业局森林病虫害防治总站、江苏省森防站。本标准主要起草人：熊惠龙、李海燕、徐克勤、赵宇翔。 松材线虫病检疫技术规程1范围本标准规定了松材线虫病的检疫技术规程。本标准适用于松材线虫寄主植物及其加工制品等检疫工作。2规范性引用文件GB／T23476--2009下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T23478--2009松材线虫普查监测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1松材线虫病pinewiltdiseasecausedbypinewoodnematode由松材线虫寄生在松树体内引起松树迅速死亡的一种毁灭性林木病害。又称松树萎蔫病、松材线虫萎蔫病、松树枯萎病。3．2松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(SteineretBuhrer)Nickle一种无脊椎动物，属于线虫门(Nematoda)，侧尾腺纲(Secernentea)，滑刃目(Aphelenchida)，滑刃总科(Aphelenchoidoidea)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。3．3检疫quarantine为了保护一个国家或一个地区人民的身体健康和农林牧业的生产安全，根据国家和地方政府颁布的检疫法规，由法定的专门机构，对那些主要通过人为活动而远距离传播的流行性疫病所采取的检疫检验和严格的检疫处理措施。3．4疫木thediseasedwood感染松材线虫病的寄主植物及其制品。主要为松属(Pinus)植物及其制品，包括松木包装材料、电缆盘等。3．5检疫检验quarantineinspection对检疫法规所规定应施检疫的森林植物及其产品，通过一定的技术手段检查、检验是否带有害生物。3．6媒介昆虫intermediaryinsect将松材线虫由罹病树中携带而出，通过补充营养或产卵时造成的创口又将其传染到其他寄主松树上的昆虫，是松材线虫病发生不可缺少的条件，是松材线虫病侵染循环的组成部分之一。松材线虫病媒】 GB／T23476--2009介昆虫必须具备以下三个条件：一是生活史与松材线虫的生活史相吻合；二是具有一定的种群密度}三是能够携带一定数量的松材线虫。3．7松木及制品pinewoodandwoodenware松属原木、锯材和用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、木条箱、木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木、衬木等。经人工合成或经加热、加压等深度加工的包装木质材料，如胶合板、纤维板等除外。3．8松墨天牛MonochamusalternatusHope属节肢动物门(Arthropoda)，昆虫纲(Hexapoda)，鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，墨天牛属(Monochamus)，是松材线虫病的主要媒介昆虫。又名松褐天牛、松天牛。3．9木材蓝变woodblue-stain由于蓝变菌(或称青变菌)的存在而导致木材变为蓝灰色。它是松材线虫病木取样的一个辅助而非必要依据。3．10分散型3龄幼虫(LⅢ)dispersalthird—stagelarvae夏末初秋，松材线虫病枯死木中出现与增殖期3龄幼虫不同的另一类型3龄幼虫，从形态上表现出内含物显著增加，它可以抵抗不良环境条件如冬季寒冷和木材失水，被称为分散型3龄幼虫。3．11持久型4龄幼虫(LⅣ)dauerlarvae由分散型3龄幼虫蜕变而来，除虫体角质膜较厚外，它没有口针，食道退化，头圆丘形，尾端明显指状，体表覆盖保护性的胶粘物。易于附着在媒介昆虫的体上，以利于媒介昆虫的携带和传播。3．12批batch应检验对象的抽样单位。“批”是指同一地点、同一日期、同一品名和同一运输工具运载的应检验物品。3．13抽样sampling为确定应检验对象是否感染松材线虫，根据检疫技术规程要求而抽取一定数量样本的过程。4应施检疫的植物及其产品来自国内外疫情发生区的松属、雪松属、冷杉属、云杉属和落叶松属等植物的苗木、接穗、插条、盆景等生长繁殖材料；来自国内外疫情发生区的上述植物的木材、枝桠、根桩、木片以及它们的制品；来自非发生区违规调运或不具备合法手续的松木及制品等；带有松材线虫及其传播媒介昆虫活体的货物、包装材料、铺垫材料及运输工具。自然界感染松材线虫病的寄主植物和通过人工接种感染此病的植物名录见附录A。5现场检疫5．1产地检疫5．1．1直观检验产地检疫的直观检验主要通过现场踏查的方法进行。用目测方法查找有无死树或针叶褪色和黄化、枯萎变成红褐色并整齐地挂在松枝上，树脂分泌减少直至停止，近期死亡等典型症状的松树，选择抽2 GB／T23476--2009样对象。5．1．2抽样5．1．2．1抽样的对象按照GB／T23478--2009中4．5．1．3执行(参见附录B)。5．1．2．2抽样时考虑的因素按照GB／T234782009中4．5．1．4执行(参见附录B)。5．1．2．3抽样的数量按照GB／T23478--2009中4．6．1执行(参见附录B)。5．2调运检疫5．2．1现场直观检验5．2．1．1直接观察和借助锯、斧等工具检查应施检疫的松木或其加工制品等是否干枯；重量是否明显减轻；木质部是否有蓝变；松脂味是否消失；有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。5．2．1．2检查松树及其枝条是否有天牛危害、补充营养取食痕迹。5．2．2抽样5．2．2．1抽样比例按照GB／T23478--2009中4．8．1执行(参见附录B)。5．2．2．2抽样方法按照GB／T23478--2009中4．8．2执行(参见附录B)。5．3复检按照5．2调运检疫执行。6取样方法按照GB／T234782009中4．7执行(参见附录B)。7松材线虫的室内鉴定7．1松材线虫的分离一般采取贝尔曼漏斗法、浅盘分离法、改进型线虫分离器分离(参见附录C)。7．2松材线虫的镜检7．2．1当在解剖镜下观察培养皿中的线虫分离液，发现线虫时，挑出(挑取时可选用500pL移液枪挑取)做成临时水玻片(参见附录D)；或用尖头吸管吸取沉淀管底部分离液1～3滴，滴于载玻片上，在解剖镜下观察，发现有线虫时制成临时水玻片。7．2．2将临时水玻片置于显微镜下观察、测量。7．3松材线虫的培养当只分离到幼虫或雌、雄成虫数量极少时，可以采用疫木保温保湿或真菌单异括体培养方法快速培养松材线虫(参见附录D)。不具备松材线虫真菌培养基质制作的检疫单位可以委托有无菌培养条件的单位制作。真菌培养基质4℃冰箱冷藏备用。7．4松材线虫的形态学鉴定7．4．1形态鉴定根据松材线虫成虫的形态特征为鉴定依据对松材线虫进行鉴定。松材线虫成虫形态特征参见附录E。松材线虫的繁殖型幼虫、分散型幼虫和持久型幼虫作为鉴定的辅助特征。7．4．2检验记录有关检验情况和鉴定结果填人《松材线虫病检验记录表》(见附录F)。3 GB／T23476--20097．5松材线虫的分子生物学鉴定分子生物学鉴定不受松材线虫龄期的影响，无须培养即可对松材线虫幼虫进行鉴定。PCR技术作为形态学鉴定的辅助手段，对于鉴定那些形态特征不够典型的松材线虫或拟松材线虫以及幼虫有很大的帮助。具体方法参见附录G。8检疫结果——被检样品中未发现松材线虫的，作为签发“植物检疫证书”的依据。——被检样品中发现松材线虫的，作为签发“检疫处理通知单”的依据。 A．1自然发病的寄主植物附录A(资料性附录)松材线虫的寄主范围GB／T23476--2009奄美岛松PinusamamianaKcidzumi、华山松P．armandiiFranch、台湾果松P．armandiivar．mastersiana(Hayata)Hayata、美国短针松P．banksianaLamb．、白皮松P．bungeanaZucc．exEndl．、加勒比松P．caribaeaMorelet、瑞士五针松P．cerebraLinn、沙松P．clausaAarg．、小干松P．contortaLoud、赤松P．denslifloraSieb．etZucc．、千头赤松P．densifloravar．umberaclifora、短针松P．echinataMill．、湿地松P．elliottiiEngelm．、恩氏松P．engelmanniiCarr．、硬枝展松P．greggiiEngelm．、地中海松P．halepensisMill．、卡西亚松P．kesiyaRoyleexGordn、华南五针松P．五埘彻g抛ng鲫sisChunexTsiang、光叶松P．1eiophylleSchkecht&Cham、硫球松P．1uchuensisMayr、马尾松P．massoniarlaLamb．、米却肯松P．michoacanaMartinez、欧洲山松P．mugoTurra、粗糙松P．muricataD．Don、小干松变种P．murrayarla(Greville&JHBalfour)Critchfield、欧洲黑松P．nigraArnold、卵果松P．oocarpaSchiede、日本五针松P．parvifloraSieb．&Zucc．、长叶松P．palustrisMill．、展叶松P．patulaSchlecht．etCham．、海岸松P．pinas—terAit．、西黄松P．ponderosaDou91．etLaws．、拟北美乔松P．pseudostrobusLindl．、辐射松P．radiataD．Don、美加红松P．resinosaAit．、刚松P．rigidaMill．、野松P．rudisEndl．、北美乔松P．strobusLinn．、墨西哥白松P．strobusvar．chiapensisMartinez、欧洲赤松P．sylvestrisLinn．、火炬松P．taedaLinn．、黄山松P．taiwanensisHayata、黑松P．thunbergiiParl．、黄松P．thurlbergii×P．massorliana、北美二针松P．virginianaMill．、胶枞Abiesbalsamea(L．)Mill．、北非雪松CedrusatlanticaManetti、雪松C．deodara(Roxb．)Loud．、欧洲落叶松LarixdeciduaMill．、美洲落叶松L．1aricinaK．Koch、挪威云杉Piceaabies(L．)Karst．、加拿大云杉P．carla—densis(Mill)Britton，Sterns&Poggenb．、欧洲云杉P．excelsa(Lain．)Link、白云杉P．glauca(Moench)Voss．、黑云杉P．marianaB．S．P．、锐尖北美云杉P．pungensEngelm．、红云杉P．r“一bensSarg．、花旗松Pseudotsugamenziesii(Mirbel)Franco。A．2人工接种感病的植物海南五针松PinusfenzeliarlaHand．一Mzt、柔松P．flexilisJames、光松P．glabraWalt、乔松P．griffithiiMcClelland、约弗松P．je，，reyiA．Murr．、红松P．koraiensisSieb．etZucc．、华南五针松P．kwangtungensisChunetTsiang、糖松P．1ambertianaDou91．、山白松P．monticolaLamb．、台湾五针松P．morrisonicolaHayata、日本五须松P．pentaphyllaMayr．、刺针松P．pun—gensLamb．、晚松P．serotinaMichx．、类球松P．strobl：formisEngelm．、章子松P．sylvestrisvar．mongolicaLitvin．、油松P．tabulaeformisCarr．、云南松P．yunrlaerlsisFranch、平泽银枞Abiesamabilis(Dou91．)Forb．、日本冷杉A．fiwlnaSieb．etZucc．、巨冷杉A．grandisLindl．、日光冷杉A．homolepisSieb．etZucc．、库叶冷杉A．sachalinensisMast．、日本落叶松Larixkaempferi(Lamb．)Cart．、西方落叶松L．occidentalisNuttall、恩格曼氏云杉Piceaengelmannii(Parry)En—gellm．、北美云杉P．sitchensis(Bong．)Carr、西美山铁杉Tsugamertensiana(Bong．)Carr．、黄杉Pseudotsugadouglasii。5 GB／T23476--2009附录B(资料性附录)引用《松材线虫普查监测技术规程》的条款B．1松林抽样的对象(见GB／T23478--2009，4．5．1．3)抽样对象为能够排除非疫病死亡因素(如人畜破坏、森林火灾、其他病虫害)，并表现出松材线虫病典型外部症状的可疑松树。B．2松林抽样应考虑的因素(见GB／T23478--2009，4．5．1．4)B．2．1松材线虫病发病高峰期一般在9～10月，从表现出针叶变黄、树脂分泌减少甚至停止至死亡约1个月至1个半月。B．2．2在松林中一般是优势木先发病。B．2．3由于松材线虫具有潜伏侵染以及不同松树的抗性差异等原因，一些松树仅部分枝条表现感病外部症状。这种症状在混交林中表现尤其明显。B．2．4抽取样品要及时并重点抽取尚未完全枯死或刚枯死的优势木(针叶呈黄绿或黄褐色，尚未完全枯萎，树皮尚未脱落，材质尚未腐朽)。B．2．5死树的针叶在小枝上下垂倒挂，当年不脱落。B．3松林抽样数量(见GB／T23478--2009，4．6．1)以林业小班为单位，表现典型症状的松树在10株以下全部取样；10株以上先抽取10株，再选取其余数量的1％～5％。B．4调运检疫的抽样比例(见GB／T23478--2009，4．8．1)B．4．1木材(含原木、锯材)及其制品按货物总量的1％～20％抽样，样本数低于10个全检。B．4．2松树、枝条、伐桩按货物的1％～5％抽样，样本数低于50个全检。B．5调运检疫的抽样方法(见GB／T23478--2009，4．8．2)B．5．1木材(含原木、锯材)及其制品、枝条、伐桩，采取表层或分层方式设点抽样检查。B．5．2抽取密度明显减轻和(或)有蓝变特征或有天牛危害症状的树木、枝条、木材(含原木、锯材)及其制品。B．6取样方法(见GB／T23478--2009，4．7)B．6．1松林取样B．6．1．1一般情况下在树干下部(胸高处)、上部(主干与主侧枝交界处)、中部(上、下部之间)3个部位取样。如仅部分枝条表现症状的，要在树干上部和死亡的枝条上取样。如外部表现症状明显的可在胸高处取样。在春季松褐天牛化蛹期，可在蛹室周围取样。B．6．1．2取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100g～200g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部至髓心钻取100g～200g木屑；或在取样部位分别截取2cm厚的圆盘。B．6．1．3所取的样品要及时贴上标签(记录样品号、采集地点、树种、树龄、取样时间和取样人等)。B．6．2松木及制品取样B．6．2．1选择截面无松脂痕迹、密度明显减轻和(或)木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室的6 GB／T23476--2009松木及制品进行取样。B．6．2．2原木取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100g～200g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部至髓心钻取100g～200g木屑；或在取样部位分别截取2cm厚的圆盘。B．6．2．3锯材和松木制品取样时直接砍取i00g～200g木片；或用手摇钻从木质部取i00g～200g木屑。B．6．2．4所取的样品要及时贴上标签(记录样品号、采集地点、材种、制品类型、取样时间和取样人等)。 附录c(资料性附录)松材线虫的分离C1贝尔曼漏斗法分离线虫在直径10cm～15cm的漏斗末端接一段长约10cm的乳腔管后置于漏斗架上，井在乳胶管上装一止水夹，然后在漏斗上铺大小适当的两层纱布；分离术屑时，两层纱布之问放i张纸巾。将带回宴验室的样术去皮后劈成长约3—4cm，直径2⋯3mm的细条，约取i0g(或木屑)置于漏斗中的纱布上，将纱布四角向中间盖上分离材料，然后向漏斗内注人清水至裎擞，并挤捏。注人清水后要注意使水克满漏斗和下面的乳腔管，乳胶管内不得有气泡。见图ei。2——线m滤‰3——∞☆，4——《±。图c2贝尔曼浅盘法分离线虫装置圈 GB／T23476--2009C．3改进型线虫分离器法改进型线虫分离器分离线虫，兼顾漏斗法和浅盘法各自的优点。分离器由一只网筛、乳胶管、止水夹和一次压模成型的主体构成(图c．3)。在筛网上放两层纱布，再将木屑或劈好的小木条放在上面。从网筛外缘加水至样品水平的位置。在20℃～30℃下放置12h后，打开止水夹，用离心管接取约5mL分离液；静止自然沉淀30rain或1500r／rain离心2min，吸去离心管内上清液，获得浓度较高的线虫悬浮液供镜检。1——样品；2——线虫滤纸3——筛盘；4——基座；5——橡胶管；6——止水夹。图c．3改进型漏斗分离松材线虫装置示意图 GB／T23476--2009D．1疫木保温保湿培养附录D(资料性附录)松材线虫的快速培养和临时玻片的制作将样品锯成小段，置于烧杯中加少量清水，木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在30℃条件下保温保湿培养3d，倒取杯中水液，可获得较多雌雄成虫；或将样品木段适当浸湿，放于塑料袋里，扎紧袋1：3，置于30℃培养箱中3d取出重新分离，可获得较多雌雄成虫。或从干净的松木板材锯出一些木屑，装进盘尼西林瓶里，然后将幼虫移至木屑里，放在培养箱30℃培养3d～5d，将木屑中的线虫分离出来。D．2单异活体培养制备马铃薯一葡萄糖一琼脂(PDA)培养基平板。用盘多毛孢(Pestalotiaspp．)或廉刀孢(Fusariumspp．)或灰葡萄孢(Botrytiscinerea)培养线虫。无菌条件下将多毛孢或镰刀孢或灰葡萄孢接种在PDA平板上。多毛孢或镰刀孢28℃恒温培养4d～5d，待培养完成后可长期置4℃冰箱冷藏备用；而灰葡萄孢25℃恒温培养4d～5d，茵丝长满平板备用。发现可疑幼虫时，取适量菌丝块放小培养皿中，恢复至室温接种线虫。多毛孢或镰刀孢在30℃恒温条件下保湿培养线虫；接种20条幼虫，48h即可分离鉴定；线虫量少时可相应延长培养时间。而灰葡萄孢在25℃恒温培养线虫，培养时间要加长1d～3d。D．3临时水玻片的制作D．3．1在洁净的载玻片中央滴一水滴，水滴的量以加盖玻片后恰好充满盖玻片下的空间为好。D．3．2用细针挑取或用毛细滴管吸取线虫，置于载玻片的水滴中，并使之沉底。D．3．3将有线虫的载玻片在酒精灯的火焰上往返通过5s～6s，杀死线虫。D．3．4用细针摆好水滴中的死线虫，然后用镊子夹盖玻片从一侧轻轻盖下。D．4半永久玻片的制作将分离所得的线虫液，转移至离心管中，2000r／rain离心3rain。吸去上部清水并保留底部3mL～4mL线虫液，置于53℃热水中15rain杀死线虫，待冷却后，加入等体积的TAF液固定48h以上。再用上述方法再离心，用5pL微量移液器吸取离心管底部线虫液，滴加进装有2mL棉蓝一乳酚油的钟面皿中，置恒温烘箱中45℃脱水24h。在载玻片上加上封片蜡圈，用挑针加一小滴甘油于蜡圈中心位置。解剖镜下挑取脱水后的目标线虫于甘油中，使其沉底并位于甘油滴中心位置。在封片蜡圈上放置盖玻片后，转移至控温电热平板上，保持75℃使蜡完全融化，取下并自然冷却后用透明指甲油加封一次。在显微镜下鉴定并确认为松材线虫后贴上标签，注明松材线虫的虫龄、数量、寄主、寄主产地、截获口岸及鉴定人。 附录E(瓷料性附录)松材缝虫的形态特征E1成虫特征雌雄成虫均呈蠕虫形，虫体细长，约1mm。头部居区高，缢缩明显，日针细长，基部略微增厚。中食道球卵圆形，占体宽的213以上，食道腺细长叶状，覆盖于肠背面。排泄孔的开口大致与食道和肠交接处平行，半月体在排泄孔后约2／3体宽处。雌虫尾部亚圆锥形，末端钝圆，少数有微小的尾尖赛。卵巢前伸，卵呈单行排列t阴门开口于虫体的中后郡73％处，上覆以宽的阴门盖。雄虫交合刺大，弓状，喙突显著，远端膨大如盘状。雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲．尾端为小的卵形交合伞所包裹。橙材线虫成虫形态特征圈见图E1。l——％m．2——雄m，3——雄虫月部I4——《女月∞Ⅸ面n(尾端i空音牵)I5——盘舍刺腹Ⅲ观，6——雌m前部{7——$^目『1，8～10——《虫月部；11——橙#线虫月部w种形状(A——赦，j、月尖*．B——月*目)。围E1松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(SteineretBuhnr)Nickle GU／T23476--2009E2幼虫特征分散型3龄幼虫(L口)体内内古物增加导致体色较深。尾部呈半圆形，与其他龄期幼虫相比更宽、钝。2龄至4龄幼虫在形态上以体长和生殖腺长度进行区别。E3松材线虫与近缘种拟松材线虫形态特征的主要区别拟松材线虫B．m”cronatus(MamiyaetEnda)在形态学和生物学方面均与橙材线虫相似，但分布较橙材线虫广泛，在橙材线虫病的检验中常常可见，二者在形态上的主要区别在于：a)雌虫尾部，橙材线虫为亚圆锥形，末端钝圆，少数可见微小的尾尖突，不超过zp旷般为1蹦拟松材线虫为圆锥形，末端有明显的尾尖突，长度在351xm以上t一般为5pm。b)罐虫尾部，松材线虫交合刺远端有盘状突，交合伞为卵形；拟橙材线虫交舍剌远端无盘状突，交舍伞为近方形。拟橙材线虫形态特征图见图E2。4～5——n自≈部6——雄＆月部7——交舍伞I8——月尖囊．图E2拟松材线虫口～删nj(M日mi”dEnda)。《，M 附录F(规范性附录)松材线虫病检验记录表表F．1松材线虫病检验记录表GB／T23476--2009样品检验日期松脂味松褐天牛镜检有无松材批号样号干枯蓝变备注检验人来源(年、月、日)消失栖居痕迹线虫(+、一)13 GB／T23476--2009G．1线虫基因组DNA的提取附录G(资料性附录)松材线虫PCR检测G．1．1少量线虫(含单条线虫)DNA提取按照每条线虫，加入10pL预冷的线虫裂解液比例，将线虫与裂解液置于Eppenddorf管中。在PCR仪上，于70℃条件下保温处理35rain。在95℃条件下保温处理10rain。12000r／rain离心2min，上清液用于扩增。G．1．2大量线虫DNA提取取线虫群体200pL于Eppendorf管中，加入300pL线虫裂解液(200mmol／LTris—HCI、200mmol／LNaCl、100mmol／LEDTA、2％SDS、2％pmercaptoethanol、200／xg／mL蛋白酶K)，混匀；在65℃水浴中处理1h，每隔10min摇荡一次；用等体积(500pL)的酚、酚一三氯甲烷一异戊醇(25+24+1)、三氯甲烷一异戊醇(24+1)抽提，4℃条件下，12000r／rain离心20min，取上清液；在上清液中加入1／10体积的3mol／L的乙酸钠(pHi4．6)和两倍体积的无水乙醇(一20℃)，在一70℃条件下30rain；12000r／min离心20rain，沉淀用70％的乙醇(一20℃预冷)洗涤两次，沉淀气干1．5h，加入100pLTE重新悬浮沉淀；取10pL稀释250倍，用紫外分光光度计测定DNA的浓度([DsDNA]一50×(OD2s。一On。。)×稀释倍数(pg／mL))；用灭菌蒸馏水将各DNA提取液稀释到20ng／pL，作为PCR扩增的模板DNA，一20℃备用。G．2PCR扩增G．2．1PCR引物松材线虫特异引物组合B。G．2．2反应体系G．2．2．1普通Taq酶每反应的混合液总体积为20止，其中：a)2．0止10×PCR缓冲液：0．5mol／L的KCI；100mmol／LTris—HCl，pH一9．0；1％TritonX一100；b)2pL2．5mmol／L的dNTP；c)1．8pL25mmol／L的MgClz；d)0．2pL5U／／1LTaq酶；e)1．5ILLlommol的引物组合B；f)2．0pL20ng／mL的模板DNA；g)补充高压灭菌重蒸水至20pL。G．2．2．2快速扩增Taq酶每反应的混合液总体积为20pL，其中：a)2．0pLlo×快速TaqPCR缓冲液；b)2pL2．5mmol／L的dNTP；c)0．3pL快速扩增Taq酶；d)1．5／ILlommol／L的引物组合B；e)2．0pL的模板DNA；】4 f)补充高压灭菌重蒸亦至20pL。G23反应程序G．2．3．I普通Taq醢反应混合液在95℃预变性3min，进人循环95℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸505，共40个循环，最后72℃延伸7min。G232快速扩增Taq酶反应混合液在98℃预变性5st进人循环98℃变性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃延伸2rain。G3结果检测PCR扩增产物在15％的琼脂糖凝胶上电濠，电最缓冲澈为l×TAE或1×TBE，电压为5V／cm，电泳时间为30rain。置凝腔于302nm透射紫外灯上观察、拍照。结果参见图Gi、图G2．濂女M--标＆DNA；l～35——橙材线虫；36～43——M#材拽自{44～46——线虫束定种．圈GI松材线虫特异引轫组台B对大量线虫检剐图谱豫道M——标准DNA；47～49——橙材绕i，50～52——Ⅲ橙材缠^．图G2松材线虫特异引物组合B对少量线虫检测图谱'