snt2855-2011 恶性卡他热检疫技术规范

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５５—２０１１恶性卡他热检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犿犪犾犻犵狀犪狀狋犮犪狋犪狉狉犺犪犾犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用国际动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版）中２．４．１５章“恶性卡他热”部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙敏、梁成珠、孔繁德、郑小龙、高宏伟、邓明俊、林超、刘彩霞。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１恶性卡他热检疫技术规范１范围本标准规定了恶性卡他热的临床诊断、病毒分离鉴定、间接荧光抗体试验、免疫过氧化物酶试验、病毒中和试验、竞争抑制酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应等检疫方法的技术要求。本标准适用于进出口牛、鹿、猪等多种动物恶性卡他热的检疫和诊断。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法。３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＭＣＦ（ｍａｌｉｇｎａｎｔｃａｔａｒｒｈａｌｆｅｖｅｒ）：恶性卡他热。ＡＩＨＶ１（ａｌｃｅｌａｐｈｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１）：狷羚疱疹病毒１型ＯｖＨＶ２（ｏｖｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ２）：绵羊疱疹病毒２型ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）：磷酸盐缓冲液ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变效应ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ）：免疫球蛋白ＧＴＣＩＤ５０（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）：半数组织培养感染量ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链反应ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核糖核苷三磷酸ｄＡＴＰ（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧腺苷三磷酸ｄＣＴＰ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧胞苷三磷酸ｄＧＴＰ（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧鸟苷三磷酸ｄＴＴＰ（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧胸苷三磷酸ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）：碱基对ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）：异硫氰酸荧光素ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）：二甲基亚砜ＴＢＥ：Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）、硼酸、ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸）缓冲液Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数４临床诊断４．１临床表现从最急性到慢性型病例，恶性卡他热（ＭＣＦ）的临床症状相差甚远。最急性病例，既无临床症状，也１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１无精神沉郁，只在死前１２ｈ～２４ｈ可能出现腹泻和下痢。一般情况下，ＭＣＦ病例症状是伴随着高热逐步出现的，起初眼鼻流液，继之转变为黏脓性分泌物，病畜可能食欲下降，产奶量降低。特征性症状包括：———病畜双眼角膜从外周开始逐渐浑浊；有些病例可在会阴、乳房和乳头部，出现皮肤损害（主要表现为溃疡和渗出），并可形成硬痂（与上皮坏死有关）。口腔充血、流涎，并逐步发展为舌、硬腭和齿龈溃疡，颊乳头糜烂是其典型症状；———浅表淋巴结肿大，四肢关节肿大；———出现感觉过敏、运动失调、眼球震颤等神经症状，在无其他症状时可能出现头颈部僵硬。其他资料参见附录Ａ。４．２病理学变化４．２．１解剖病理学变化包括：———胃肠道可能有出血和糜烂，急性病例可出现肠道内容物带血；———淋巴结肿大，但程度不一。淋巴结切开时，常见发白、硬化，有些可见颌下淋巴结和咽后淋巴结出血甚至坏死；———呼吸道可见卡他性炎症积液，糜烂和白喉膜生成；———泌尿道膀胱上皮层淤血性出血，肾皮质出现白色小坏死灶，直径约１ｍｍ～５ｍｍ，有时可被一出血带包围。４．２．２组织病理学变化：确诊ＭＣＦ的基础。淋巴器官上皮变性，血管炎症、增生乃至坏死，非淋巴器官间质广泛分布淋巴细胞是其特征性变化，如：———所有上皮表面出现溃疡和糜烂，常伴发上皮和上皮内淋巴细胞浸润；———常见大脑血管炎，血管外膜和膜介质出现淋巴细胞浸润，并常见类纤维变性。血管腔内可见淋巴细胞贴壁，重病例可见内皮损伤和内皮下膜淋巴细胞集聚，有时可见血管堵塞；———淋巴结增生以副皮质淋巴样干细胞膨胀为特征，常伴发滤泡退行性病变，淋巴组织炎性水肿常涉及周围组织；———非淋巴组织特别是肾皮质和肝门静脉周围区的间质淋巴细胞集聚明显，脑内可能有非化脓性脑膜炎、脑脊髓炎，伴随淋巴细胞周围的套状白细胞聚集及脑脊髓液中细胞成分增多；———角膜淋巴细胞浸润，从周边逐步向中心发展，随病程延长，发展为水肿和坏死。也可能出现脉管炎、眼前房积脓和虹膜睫状体炎。５实验室诊断５．１狷羚疱疹病毒１型（犃犐犎犞１型）５．１．１病毒分离５．１．１．１设备和材料生物安全柜、立式冷冻离心机、倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅、蔡氏滤器和微孔滤膜（０．２２μｍ）、细胞瓶、细胞培养板、１５ｍＬ离心管、组织研磨器、微量可调加样器及配套吸头（２０μＬ和２００μＬ）、移液管。细胞：反刍动物源的大多数原代或低代细胞都可用于ＡＩＨＶ１的病毒分离，常用牛甲状腺细胞。５．１．１．２试剂ＤＭＥＭ培养基或其他培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素及其他常规试剂，配制方法见附录Ｂ。试２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．１．１．３操作方法５．１．１．３．１样品采集和送检无菌采集动物抗凝全血（使用ＥＤＴＡ作抗凝剂）。对病死动物，立即采集淋巴结、肾上腺、脾、肺等组织，置于冰盒中冷藏保存，尽快送实验室进行处理。５．１．１．３．２样品处理５．１．１．３．２．１抗凝全血的处理取抗凝血加入２倍～３倍体积红细胞裂解液，混匀静置４ｍｉｎ～５ｍｉｎ，待红细胞完全破碎，１５００犵离心５ｍｉｎ。弃上清液去除红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤）。加入ＰＢＳ缓冲液，制成白细胞悬液，－２０℃保存备用。５．１．１．３．２．２动物组织的处理取病料组织５ｇ，剪碎后置于无菌平皿内，加入１０ｍＬ无血清培养液（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ），用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。３００犵离心１０ｍｉｎ，收取上清液－２０℃保存备用。５．１．１．３．３病毒分离将上述细胞悬液的浓度调整至５×１０６个／ｍＬ，接种于制备好的单层细胞培养物上，置５％二氧化碳培养箱，３７℃吸附６０ｍｉｎ。补充适量细胞维持液继续培养，３６ｈ～４８ｈ后换液一次，以后每２ｄ～３ｄ换液一次。培养过程中每日观察细胞病变（ＣＰＥ）情况，连续观察２１ｄ。特征变化是：单细胞层内出现多核灶，并逐渐收缩形成带有胞质突的聚集体，聚集体最终脱离。如果不出现ＣＰＥ，应盲传二次，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养。盲传两代，无ＣＰＥ，则判为阴性。以不接种样品的细胞培养物作为阴性对照。５．１．１．３．４分离物鉴定使用特异性血清或单克隆抗体，采用免疫荧光或免疫细胞化学技术对分离物进行鉴定。５．１．２间接荧光抗体实验（犐犉犃）５．１．２．１设备和材料荧光显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、超低温冰箱、立式冷冻离心机、台式离心机、微量可调加样器及配套吸头（２０μＬ和２００μＬ）、多孔载玻片、盖玻片、１．５ｍＬ和１５ｍＬ离心管。细胞：牛鼻甲细胞。５．１．２．２试剂ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清、ＰＢＳ、胰蛋白酶、ＥＤＴＡ、伊文思兰、兔抗牛荧光抗体、甘油，配制方法见附录Ｂ。５．１．２．３操作方法５．１．２．３．１抗原片的制备５．１．２．３．１．１用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞生长液在细胞瓶中培养牛鼻甲细胞。３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１５．１．２．３．１．２待细胞长成单层后，弃去瓶中的细胞培养液，加入２％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞维持液，接种ＡＩＨＶ１病毒（ＷＣ１１株），放入３７℃二氧化碳培养箱培养２ｄ～４ｄ。在培养带毒细胞的同时，培养部分正常细胞。５．１．２．３．１．３每天观察细胞病变，待细胞病变即将出现又未出现时，弃去培养基，用ＰＢＳ洗１次。５．１．２．３．１．４在细胞瓶中加入５ｍＬ胰蛋白酶ＥＤＴＡ细胞消化液消化细胞，待细胞完全变圆，倒掉消化液。５．１．２．３．１．５用ＰＢＳ将脱落的细胞用移液管移到１５ｍＬ离心管中，８００犵离心５ｍｉｎ，弃上清液。加入ＰＢＳ洗涤细胞１次后，用ＰＢＳ将细胞重悬。５．１．２．３．１．６用ＰＢＳ调整细胞浓度，调至细胞悬液滴加至多孔载玻片上为单层，不重叠为最佳。５．１．２．３．１．７用２００μＬ加样器滴加病变细胞于多孔载玻片上，同时设置正常细胞对照孔，风干。丙酮固定１０ｍｉｎ，干燥，－７０℃保存备用。５．１．２．３．２抗体检测５．１．２．３．２．１用１０％牛血清（ＰＢＳ稀释）封闭抗原片，即用１０％牛血清滴加所有细胞孔，包括正常细胞孔和感染细胞孔，滴加好的玻片马上放入湿盒内（盒内垫有湿纱布），３７℃孵育３０ｍｉｎ。５．１．２．３．２．２取出玻片，用ＰＢＳ洗３次，每次浸泡２ｍｉｎ。５．１．２．３．２．３将玻片晾干，滴加１∶２０稀释的待检血清，每个样本滴加２个孔，即１孔正常细胞，１孔感染细胞，同时设阳性血清对照和阴性血清对照，滴加时应避免相互交叉串孔，置３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。５．１．２．３．２．４取出玻片，用ＰＢＳ洗３次，每次浸泡５ｍｉｎ，其间轻轻振摇数次。５．１．２．３．２．５取出玻片晾干，滴加稀释好的兔抗牛ＦＩＴＣ荧光结合物，置于３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。５．１．２．３．２．６取出玻片，用ＰＢＳ漂洗３次，每次浸泡５ｍｉｎ，其间轻轻振摇数次。４伊文思兰复染３０ｓ，ＰＢＳ洗涤２ｍｉｎ。玻片用蒸馏水漂洗２次，再用ＰＢＳ／甘油５．１．２．３．２．７用１／１０（５０／５０）封片，在荧光显微镜下观察结果。５．１．２．３．２．８结果判定：正常细胞孔细胞无荧光反应，滴加阳性血清的感染细胞孔细胞有荧光反应，滴加阴性血清的感染细胞孔细胞无荧光反应，即可判定结果。待检血清的感染细胞孔细胞无荧光反应判为阴性，感染细胞的细胞核、细胞浆有荧光反应者判为阳性。５．１．３免疫过氧化物酶试验（犐犘犜）５．１．３．１设备和材料光学显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、超低温冰箱、立式冷冻离心机、台式离心机、微量可调加样器及配套吸头（１ｍＬ和２００μＬ）、莱顿试管、４格玻片、１．５ｍＬ和１５ｍＬ离心管。细胞：牛鼻甲细胞。５．１．３．２试剂ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清、ＰＢＳ、胰蛋白酶、过氧化物酶标记的抗牛ＩｇＧ、甘油、吐温２０、ＡＥＣ底物（３氨基９乙基咔唑），配制方法见附录Ｂ。５．１．３．３操作方法５．１．３．３．１抗原片的制备５．１．３．３．１．１在内置盖玻片的莱顿试管或４格玻片上，用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞生长液培养牛鼻甲细胞。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１３５．１．３．３．１．２待细胞长成单层后，弃去细胞培养液，将病毒稀释成１０ＴＣＩＤ５０（病毒滴定同５．１．４．３．１．２），接种至莱顿试管，每管１．６ｍＬ，或接种至４格玻片内，每格１ｍＬ。同时设置正常细胞对照。５．１．３．３．１．３观察细胞病变，当ＣＰＥ出现时，丙酮固定１０ｍｉｎ，干燥，－７０℃保存备用。５．１．３．３．２抗体检测５．１．３．３．２．１用ＩＰＴ稀释液将待检血清１∶２０稀释，在固定好的病毒感染盖片或玻片格上滴加稀释血清１５０μＬ～２００μＬ，滴加好的玻片置３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。同时设置阴性血清和阳性血清对照。５．１．３．３．２．２取出玻片，用ＰＢＳ洗３次，每次浸泡５ｍｉｎ，其间轻轻振摇数次。５．１．３．３．２．３取出玻片晾干，在盖玻片或玻片格上滴加１５０μＬ～２００μＬ过氧化物酶标记的抗牛ＩｇＧ（用ＩＰＴ稀释液１∶５０００稀释），置３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。５．１．３．３．２．４取出玻片，用ＰＢＳ漂洗３次，每次浸泡５ｍｉｎ，其间轻轻振摇数次。５．１．３．３．２．５用蒸馏水稀释ＡＥＣ底物（蒸馏水５ｍＬ，缓冲液２滴，双氧水２滴，ＡＥＣ３滴），并在盖玻片或玻片格上滴加１５０μＬ～２００μＬ，置３７℃湿盒内孵育８ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。５．１．３．３．２．６取出玻片，用蒸馏水漂洗，晾干，光学显微镜下观察结果。５．１．３．３．２．７结果判定：正常细胞无颜色反应，滴加阳性血清的感染细胞其细胞核内有微棕红色，滴加阴性血清的感染细胞无颜色反应，即可判定结果。待检血清的感染细胞孔无颜色反应判为阴性，感染细胞核内有颜色反应者判为阳性。５．１．４病毒中和试验（犞犖）５．１．４．１设备和材料生物安全柜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、液氮贮存罐、微量可调加样器及配套吸头（１ｍＬ和２００μＬ）、９６孔细胞培养板、移液管。细胞：牛肾细胞或牛甲状腺原代或次代细胞、低代睾丸细胞。５．１．４．２试剂ＤＭＥＭ培养基或其他培养基、胎牛血清、ＰＢＳ、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、ＥＤＴＡ及其他常规试剂，配制方法见附录Ｂ。５．１．４．３操作方法５．１．４．３．１中和病毒滴度（犜犆犐犇５０）测定５．１．４．３．１．１中和病毒制备将保存于液氮中的ＡＩＨＶ１种毒（ＷＣ１１株）取出，置于４℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液适当稀释后，取１ｍＬ接种于长成单层的牛肾、牛甲状腺原代或次代细胞或低代睾丸细胞细胞瓶中，３７℃吸附１ｈ。用维持液洗涤１次后，再加入维持液，置于３７℃二氧化碳培养箱中培养，当５０％～７５％细胞出现ＣＰＥ时，收获病毒培养液，分装成１ｍＬ，－７０℃保存备用。５．１．４．３．１．２病毒滴度测定牛肾细胞经常规传代培养，接种９６孔细胞培养板，实验前将培养板中旧的培养液吸出。取一管分装好的待滴定ＡＩＨＶ１病毒液用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ生长液作１０－１、１０－２……１０－８系列稀释，每一稀释度的病毒接种８孔，每孔２５μＬ。设置正常细胞对照４孔～８孔，以ＤＭＥＭ生长液代替病毒液。每孔５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１补加培养液１５０μＬ～２００μＬ后，将９６孔板置３７℃５％二氧化碳培养箱培养。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现ＣＰＥ，记录试验数据。根据ｓｐｅａｒｍａｎｋａｒｂｅｒ法计算ＴＣＩＤ５０，确定２５μＬ病毒液达到１００ＴＣＩＤ５０时所需的稀释度。５．１．４．３．２病毒中和试验５．１．４．３．２．１待检血清经５６℃水浴灭活３０ｍｉｎ，用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ生长液做１∶２～１∶１６配比稀释后，加入９６孔细胞培养板内，每个稀释度４孔，每孔２５μＬ。同时设置阳性及阴性血清对照孔。５．１．４．３．２．２每孔分别加入２５μＬ１００ＴＣＩＤ５０的ＡＩＨＶ１病毒液，３７℃孵育１ｈ。－１、１０－２、１０－３、１０－４稀释，每孔２５μＬ，每个稀释度４孔。５．１．４．３．２．３将剩余病毒作１０５个／ｍＬ，每孔加５０μＬ。５．１．４．３．２．４将牛肾细胞悬液调整至３×１０５．１．４．３．２．５９６孔细胞培养板置３７℃５％二氧化碳培养箱培养７ｄ～１０ｄ，显微镜下观察ＣＰＥ。５．１．４．３．２．６根据ｓｐｅａｒｍａｎｋａｒｂｅｒ法计算中和５０％病毒的血清稀释度作为待检血清的效价。阴性血清在１∶２稀释倍数下应没有中和作用。５．１．５竞争抑制酶联免疫吸附试验（犆犐犈犔犐犛犃）５．１．５．１设备和材料酶标板、洗板机、４℃冰箱、单孔道和多孔道微量可调加样器及配套吸头（１０μＬ、２００μＬ和１ｍＬ）。５．１．５．２试剂包被抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体（ＭＡｂ１５Ａ），均由指定单位提供。包被液、封闭液、洗液、抗体稀释液、底物溶液、终止液等，配制方法见附录Ｂ。５．１．５．３操作方法５．１．５．３．１用包被缓冲液将半纯化的ＭＣＦ病毒抗原（ＡＩＨＶ１ＷＣ１１株或Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ株）作适当稀释，包被酶标板，每孔加入５０μＬ（含０．２μｇ病毒抗原），４℃孵育１８ｈ～２０ｈ。５．１．５．３．２倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干，加入洗液（ＰＢＳＴ）３００μＬ洗板３次，并充分除去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）。５．１．５．３．３加入封闭液，每孔１００μＬ，室温（２１℃～２５℃）静置２ｈ。倒掉孔内液体，晾干后，４℃保存备用。５．１．５．３．４待检样本（血清或血浆）用ＰＢＳＴ洗液１∶５稀释后，加入酶标板，每孔５０μＬ，每个样本加２孔，封板后室温孵育１ｈ。同时设置４个阴性对照孔，２个阳性对照孔和１个空白对照孔，阴性和阳性血清同法稀释，空白对照以ＰＢＳＴ洗液代替。５．１．５．３．５倒掉孔内液体，洗板后，在各孔中加入５０μＬ工作浓度的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体（ＭＡｂ１５Ａ）溶液，封板后室温孵育１ｈ。５．１．５．３．６倒掉孔内液体，洗板后，在各孔中加入１００μＬ，ＴＭＢ底物溶液，室温孵育１ｈ。５．１．５．３．７在各孔中加入１００μＬ终止液终止反应。５．１．５．３．８使用酶标仪，于４５０ｎｍ波长下测定ＯＤ值，记录试验数据。５．１．５．３．９结果判定按式（１）进行：犗犇ｓａｍｐｌｅ犘犐＝１－×１００％…………………………（１）犗犇ｎｅｇｔｉｖｅ式中：犘犐———抑制百分比，％；６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１犗犇ｓａｍｐｌｅ———待检样本犗犇值的均值；犗犇ｎｅｇｔｉｖｅ———阴性对照犗犇值的均值。当阴性对照犗犇值的均值为０．４～２．１，阳性对照犘犐≥２５％时，试验成立，否则试验不成立。当样本犘犐≥２５％时，判为阳性；当样本犘犐＜２５％时，判为阴性。５．２绵羊疱疹病毒２型（犗狏犎犞２型）５．２．１聚合酶链式反应（犘犆犚）５．２．１．１设备和材料生物安全柜、电热恒温水浴箱、台式高速离心机、冰箱、普通ＰＣＲ仪、荧光ＰＣＲ仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、１．５ｍＬ离心管等。５．２．１．２试剂ＤＮＡ提取试剂盒、７０％乙醇、异丙醇、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、琼脂糖、溴化乙锭、ＤＮＡ相对分子质量标志物、ＰＣＲ扩增预混试剂、各种分子生物学常用化学试剂（分析纯）。５．２．１．３操作方法５．２．１．３．１样品的采集和送检按照５．１．１．３．１的方法采集和送检样品。５．２．１．３．２样品的处理５．２．１．３．２．１抗凝全血的处理取ＥＤＴＡ抗凝全血３００μＬ，加入１ｍＬ红细胞溶解液，室温孵育１０ｍｉｎ，１３０００犵高速离心２０ｓ，弃上清液。再加入０．５ｍＬ红细胞溶解液，重复上述步骤。加入５００μＬＰＢＳ，混匀洗涤细胞，１３０００犵再次离心２０ｓ，沉淀细胞。弃上清液，加５０μＬＰＢＳ重悬细胞。５．２．１．３．２．２动物组织的处理取病料组织５ｇ，剪碎后置于研钵内，加入适量液氮进行研磨，称取研磨好的病料组织１０ｍｇ～２０ｍｇ，转入新的１．５ｍＬ离心管备用。１）５．２．１．３．３犇犖犃提取５．２．１．３．３．１在上述细胞悬液中加入６００μＬ核裂解液，吹打混匀细胞，直到无可见细胞颗粒。对于组织样本，加入６００μＬ核裂解液后，６５℃水浴１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。５．２．１．３．３．２加３μＬＲＮａｓｅ到核裂解液中，反复颠倒５次，置３７℃水浴２０ｍｉｎ，取出，冷却至室温。５．２．１．３．３．３加２００μＬ蛋白沉淀剂，高速涡旋２０ｓ，冰浴５ｍｉｎ。５．２．１．３．３．４１３０００犵离心４ｍｉｎ，可见一白色蛋白沉淀。小心将含有ＤＮＡ的上清液移至另一个干净的１．５ｍＬ离心管中，管中预先加入６００μＬ室温异丙醇。５．２．１．３．３．５缓慢轻柔反复颠倒离心管直到出现可见线形ＤＮＡ。室温１３０００犵离心１ｍｉｎ，小心弃去上清液。１）本标准所用ＤＮＡ提取试剂盒由Ｐｒｏｍｅｇａ公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。试剂盒组成参见附录Ｃ。７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１５．２．１．３．３．６加入６００μＬ室温７０％乙醇，轻轻颠倒离心管数次以洗涤ＤＮＡ，室温１３０００犵离心１ｍｉｎ，小心弃去上清液。５．２．１．３．３．７将离心管倒置在干净吸水性强的滤纸上空气干燥约１５ｍｉｎ。５．２．１．３．３．８加入５０μＬＤＮＡ溶解液，放置４℃过夜或６５℃１ｈ，使ＤＮＡ充分水合。５．２．１．３．３．９将ＤＮＡ溶液放置４℃保存，如需长期保存需－２０℃冷冻保存。５．２．１．３．４套式犘犆犚５．２．１．３．４．１引物片段大小ＰＣＲ反应引物序列ｂｐ５５６：５’ＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣ３’第一轮反应４２３７７５：５’ＡＡＧＡＴＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＡＡＡ３’５５６：５’ＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣ３’第二轮反应２３７５５５：５’ＴＴＣＴＧＧＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＣ３’５．２．１．３．４．２犘犆犚反应体系扩增反应总体积为５０μＬ：包括２μｇＤＮＡ、１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、２ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁、０．０１％（体积分数）明胶、１０％ＤＭＳＯ、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、１μｍｏｌ／Ｌ引物、２Ｕ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。取第一轮ＰＣＲ反应的扩增产物２μＬ，作为第二轮反应的ＤＮＡ模板。５．２．１．３．４．３犘犆犚反应参数９４℃３ｍｉｎ，１个循环；９４℃２０ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，２５个循环；７２℃５ｍｉｎ，１个循环。两轮ＰＣＲ反应的反应参数相同。５．２．１．３．４．４琼脂糖凝胶电泳将适量５×ＴＢＥ稀释成１×ＴＢＥ溶液，配制溴化乙锭含量为０．５μｇ／ｍＬ的１．８％琼脂糖凝胶。取１０μＬＰＣＲ产物，与２μＬ上样缓冲液混匀后，点样进行电泳。同时使用ＤＮＡ相对分子质量标志物点样，以判断ＰＣＲ产物片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在３Ｖ／ｃｍ～５Ｖ／ｃｍ长度，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳检测结果用凝胶分析成像系统记录。５．２．１．３．４．５结果判定用已知感染ＯｖＨＶ２病毒的病畜组织ＤＮＡ作阳性对照，正常动物组织ＤＮＡ作阴性对照，等体积的水代替模板ＤＮＡ作空白对照。对样品进行ＰＣＲ检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，而样品未出现预期大小的扩增条带，则可判定样品ＯｖＨＶ２病毒阴性。如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现预期大小的扩增条带，对ＰＣＲ产物进行测序分析比对，ＰＣＲ产物核酸序列与ＯｖＨＶ２病毒ＤＮＡ序列相一致，则可判定样品ＯｖＨＶ２病毒阳性。ＰＣＲ目的片段ＤＮＡ序列参见附录Ｄ。８标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１５．２．１．３．５荧光犘犆犚５．２．１．３．５．１引物、探针序列上游引物：５’ＴＧＧＴＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＡＣＣＧＴ３’下游引物：５’ＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＴＧＣＡＧ３’探针：５’ＦＡＭＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＭＲＡ３’５．２．１．３．５．２犘犆犚反应体系扩增反应总体积为２５μＬ：包括１２．５μＬ犜犪狇ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ２），２４０ｎｍｏｌ／Ｌ上游引物，６００ｎｍｏｌ／Ｌ下游引物，８０ｎｍｏｌ／Ｌ探针，５０μｇＤＮＡ。５．２．１．３．５．３犘犆犚反应参数５０℃２ｍｉｎ，１个循环；９５℃１０ｍｉｎ，１个循环；９５℃１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ，４０个循环。５．２．１．３．５．４结果判定阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。检测样品的Ｃｔ值≥４０时，则判定ＯｖＨＶ２病毒阴性。检测样品的Ｃｔ值≤３５时，则判定ＯｖＨＶ２病毒阳性。检测样品的３５＜Ｃｔ值＜４０时，应重新进行测试，如果重新测试的Ｃｔ值≥４０时，则判定ＯｖＨＶ２病毒阴性；如果重新测试的Ｃｔ值＜４０，则判定ＯｖＨＶ２病毒阳性。５．２．２血清学检测ＯｖＨＶ２抗体只有通过用ＡＩＨＶ１做抗原才能检测到。按照５．１．２和５．１．３的方法，进行ＩＦＡ、ＩＰＴ试验，可检测ＯｖＨＶ２抗体。由于牛疱疹病毒４型（ＢＨＶ４）与ＡＩＨＶ１有交叉反应，因此试验的阴性对照，应同时设置ＢＨＶ４感染的单层细胞。只有在ＡＩＨＶ１感染细胞视野出现特征性病变（细胞核内有抗原分布，有少量或无细胞质着染），而ＢＨＶ４感染细胞不出现时，才能将血清判为阳性。按照５．１．５的方法，进行ＣＩＥＬＩＳＡ试验，也可检测ＯｖＨＶ２抗体。但由于个别绵羊抗体对ＡＩＨＶ１的交叉反应位点识别能力不同，以至于不能检测部分血清中的抗体，对ＣＩＥＬＩＳＡ阴性结果的解释应该谨慎。２）本标准所用ＰＣＲ扩增预混试剂（ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ）由ＡＢＩ公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。试剂盒组成参见附录Ｃ。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１附录犃（资料性附录）恶性卡他热概述恶性卡他热（ｍａｌｉｇｎａｎｔｃａｔａｒｒｈａｌｆｅｖｅｒ，ＭＣＦ）是多种偶蹄动物的一种急性、全身性、常致死性疾病。本病最常感染牛亚科和鹿科动物，猪、山羊、狷羚、非洲紫褐羚、曲角羚、大辫羊、兔等对恶性卡他热也有易感性的报道。ＭＣＦ主要由两种γ疱疹病毒引起：狷羚疱疹病毒１型（ａｌｃｅｌａｐｈｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１，ＡＩＨＶ１）和绵羊疱疹病毒２型（ｏｖｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ２，ＯｖＨＶ２）。前者的自然宿主为非洲大羚，常呈不明显感染，是非洲区域的牛和世界范围内野生动物保护区中多种反刍动物ＭＣＦ的病原；后者作为亚临床感染在绵羊中流行，是世界绝大多数地区ＭＣＦ的病原。在这两型疾病中，临床病畜并不是病毒的传染源，其自然宿主非洲大羚和绵羊向外排毒。本病临床症状变化很大，从死前只有少数症状的急性型到以高热、双侧角膜浑浊、眼鼻卡他性分泌物增多、鼻口部坏死、口腔上皮溃疡为典型特征的慢性病例，不尽一致。ＡＩＨＶ１病毒可通过临床感染动物外周血白细胞、淋巴结和脾脏细胞悬液以及非洲大羚的外周血白细胞或其他器官细胞悬液获得，ＯｖＨＶ２病毒目前还没有正式得到分离鉴定，可选择ＰＣＲ方法进行诊断。ＡＩＨＶ１病毒的自然宿主非洲大羚可持续产生抗体，多种免疫学方法均可检测；临床感染动物的抗体反应则十分有限，常无中和抗体产生，可采用免疫荧光法、免疫酶法、竞争抑制酶联免疫吸附试验检测。ＯｖＨＶ２抗体只能用ＡＩＨＶ１型抗原检测，可采用免疫荧光法、竞争抑制酶联免疫吸附试验等方法，超急性感染动物通常无抗体存在。本病发生于世界各地，一年四季均可发病，更多见于冬季和早春，多呈散发，有时呈地方流行性。多数地区发病率较低，但病死率可高达６０％～９０％，给养殖业带来严重损失。该病被列入ＯＩＥ疫病名录，我国将其列为二类动物疫病。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１附录犅（规范性附录）溶液配制犅．１磷酸盐缓冲液（０．０１犿狅犾／犔狆犎７．２犘犅犛）氯化钠８．５ｇ氯化钾０．２ｇ磷酸氢二钠２．９ｇ磷酸二氢钾０．２ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬ将上述成分充分溶解混匀，分装，经１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌，冷却后４℃保存备用。犅．２磷酸盐缓冲液（０．０５犿狅犾／犔狆犎７．２犘犅犛）氯化钠９ｇ磷酸氢二钠１５．４ｇ磷酸二氢钠１．４ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬ将上述成分充分溶解混匀，４℃保存备用。犅．３７０％乙醇无水乙醇７０ｍＬ蒸馏水３０ｍＬ充分混匀，置４℃保存，充分冷却后再使用。犅．４红细胞裂解液（犜狉犻狊犖犎４犆犾）氯化铵３．７３５ｇＴｒｉｓ１．３ｇ加蒸馏水至５００ｍＬ充分溶解混匀，０．２２μｍ滤膜过滤除菌，４℃保存备用。犅．５细胞生长液和细胞维持液ＤＭＥＭ培养基ＤＭＥＭ干粉１包碳酸氢钠２ｇＨｅｐｅｓ（４羟乙基哌嗪乙磺酸）３ｇ谷氨酰胺０．３ｇ１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１加三蒸水至１０００ｍＬ充分溶解混匀后，０．２２μｍ滤膜过滤除菌，分装成小瓶，４℃保存备用。细胞生长液：含１０％灭能的无菌胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基。细胞维持液：含２％灭能的无菌胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基。犅．６细胞消化液胰酶２．５ｇ乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）０．２ｇ加无钙镁ＰＢＳ至１０００ｍＬ充分溶解混匀，分装成小瓶，１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ后，置－２０℃保存备用，短期使用可４℃保存。犅．７犐犘犜稀释液氯化钠２１．０ｇ吐温２００．５ｍＬ加０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２ＰＢＳ至１０００ｍＬ宜使用前配制。犅．８包被液（０．０５犿狅犾／犔狆犎９．６碳酸钠／碳酸氢钠缓冲液）碳酸钠１．９４ｇ碳酸氢钠２．９３ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬ充分溶解混匀后置４℃保存备用，保存期不超过３０ｄ。犅．９洗液（０．０１％犘犅犛犜）吐温２００．１ｍＬ加０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２ＰＢＳ至１０００ｍＬ配制后置４℃保存备用，保存期不超过７ｄ。犅．１０封闭液蔗糖２ｇ甘氨酸０．７５ｇ牛血清白蛋白０．５ｇ氯化钠０．４４ｇ加０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２ＰＢＳ至１００ｍＬ宜使用前配制。１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１犅．１１底物溶液犅．１１．１底物缓冲液（狆犎５．０磷酸柠檬酸缓冲液）０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液（２８．４ｇ／Ｌ）２５．７ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸（１９．２ｇ／Ｌ）２４．３ｍＬ加蒸馏水至１００ｍＬ犅．１１．２底物溶液（四甲基联苯胺（犜犕犅）使用液）ＴＭＢ（１０ｍｇ／５ｍＬＤＭＳＯ）０．５ｍＬ底物缓冲液１０ｍＬ０．７５％Ｈ２Ｏ２３２μＬ犅．１２终止液（２犿狅犾／犔硫酸）蒸馏水１７７．８ｍＬ浓硫酸２２．２ｍＬ缓慢将浓硫酸加入水中，充分混匀，室温保存。犅．１３犜犅犈电泳缓冲液（５×浓缩液）Ｔｒｉｓ５４ｇ硼酸２７．５ｇＥＤＴＡ２．９２２ｇ去离子水１０００ｍＬ用５ｍｏｌ／Ｌ的盐酸调到ｐＨ８．０，使用时用去离子水稀释为１×ＴＢＥ电泳液。犅．１４溴化乙锭（犈犅）核酸染色液用蒸馏水配制成１０ｍｇ／ｍＬ的浓缩液。用时每１００ｍＬ琼脂糖溶液中加１０μＬ。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１附录犆（资料性附录）试剂盒组成犆．１犇犖犃提取试剂盒（犠犻狕犪狉犱犌犲狀狅犿犻犮犇犖犃犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犓犻狋）细胞裂解液１００ｍＬ核裂解液５０ｍＬ蛋白沉淀液２５ｍＬＤＮＡ水合液５０ｍＬＲＮＡ酶２５０μＬ犆．２犘犆犚扩增预混试剂（犜犪狇犕犪狀犝狀犻狏犲狉狊犪犾犕犪狊狋犲狉犕犻狓）包括：金牌犜犪狇酶，ＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ酶，带ｄＵＴＰ的ｄＮＴＰ，内参ＲＯＸ，优化的缓冲液。１４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２８５５—２０１１附录犇（资料性附录）犘犆犚扩增目的片段犇犖犃序列犇．１套式犘犆犚犇．１．１第一轮犘犆犚产物（４２３犫狆）ａｇｔｃｔｇｇｇｇｔａｔａｔｇａａｔｃｃａｇａｔｇｇｃｔｃｔｃｇｇｔｔａｇｇｇｔａｔｃｃｇａａａｇｃａｇｃｃｃｃａｇｔａｔｃａｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｔｇｃａｇａｇｇａａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃａｇｇｇｃａｃｇｔａｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃｔｔａｃａｇｔｇｃｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｃａｃａｇｔｔｔａｔｔｔｃａｇａｃａａａｃａｃｇｇｔａｇｃｃｔｇｃｔｃｃｔａｃｃａｃｇｇｔｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃｃｇａａｇｃｃｔｔｃｇｃｔｃｇｃｃａｃｔａｃｃｃｃａｇａａａｃｃｃｃｔｃａｇｇｃａａｃａｇｃａｇｃｇｔａｇｃｇｇｇｃｃｔｇｔｇｃｔｃｔａａｔｇａｃｇｇｇｃｇｇｃａｃｃｔａｇｃｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔｇａｃｃｃｔａｇｃｃｔｔｇｃｃｔｔｃｔｔｃｃｃｃｔｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｃａｃｃａｃｃｃｔｃｃｔｇａｇｔａｔａａａｃａａｃｔｔａａｇａｃｃｔｃｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｔｔａｔｃａｇａｔｇｃａｔａａｃｔｇｇｔｇｃｔｔａｔｃｔｔ犇．１．２第二轮犘犆犚产物（２３７犫狆）ａｇｔｃｔｇｇｇｇｔａｔａｔｇａａｔｃｃａｇａｔｇｇｃｔｃｔｃｇｇｔｔａｇｇｇｔａｔｃｃｇａａａｇｃａｇｃｃｃｃａｇｔａｔｃａｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｔｇｃａｇａｇｇａａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃａｇｇｇｃａｃｇｔａｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃｔｔａｃａｇｔｇｃｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｃａｃａｇｔｔｔａｔｔｔｃａｇａｃａａａｃａｃｇｇｔａｇｃｃｔｇｃｔｃｃｔａｃｃａｃｇｇｔｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃｃｇａａｇｃｃｔｔｃｇｃｔｃｇｃｃａｃｔａｃｃｃｃａｇａａ犇．２荧光犘犆犚产物（１３０犫狆）ａｔｃａｔｇｃｔｇａｃｃｃｃｔｔｇｃａｇａｇｇａａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃａｇｇｇｃａｃｇｔａｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃｔｔａｃａｇｔｇｃｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｃａｃａｇｔｔｔａｔｔｔｃａｇａｃａａａｃａｃｇｇｔａｇｃｃｔｇｃｔｃｔａｃｃａ 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２５５８２／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准恶性卡他热检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８５５—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．２５字数３１千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６２４定价２１．００元'