snt1164.1-2011 牛传染性鼻气管炎检疫技术规范

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１６４．１—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１６４．１—２００２，ＳＮ／Ｔ１１６４．２—２００３牛传染性鼻气管炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狉犺犻狀狅狋狉犪犮犺犲犻狋犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛传染性鼻气管炎检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１６４．１—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．２５字数３３千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８７定价２１．００元 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１６４．１—２００２《牛传染性鼻气管炎病毒分离操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１６４．２—２００３《牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１６４．１—２００２和ＳＮ／Ｔ１１６４．２—２００３相比，主要的技术性变化如下：———增加了从精液样品中分离病毒的方法；———删除了ＳＮ／Ｔ１１６４．１—２００２中７．２．４；———修改了病毒毒价测定方法；———增加了实时荧光ＰＣＲ方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：罗琼、田纯见、苏卫、陈茹、林志雄、鱼海琼、董志珍、霍蕾、唐泰山、张常印。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１６４．１—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１６４．２—２００３。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１牛传染性鼻气管炎检疫技术规范１范围本标准规定了牛传染性鼻气管炎的病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应和实时荧光ＰＣＲ检测技术规范。本标准适用于进出境牛的牛传染性鼻气管炎检疫和诊断。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１９４８９—２００８实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１１６４．３牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验操作规程ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１９１８牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程ＯＩＥ《ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ》（２００８年）第二部分关于牛传染性鼻气管炎的诊断技术规定。３缩略语ＩＢＲ（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｏｖｉｎｅＲｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）：牛传染性鼻气管炎ＴＣＩＤ５０：半数组织细胞感染量ＢＫ：原代胎牛肾细胞ＭＤＢＫ：牛肾传代细胞系ＢＴ：原代胎牛睾丸细胞ＣＰＥ：致细胞病变作用ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链反应ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）：碱基对ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸钠犜犪狇（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ：实时荧光ＰＣＲＣｔ值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数ＵＤＧ（ｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）：尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１４检疫方法４．１病毒分离和鉴定４．１．１材料准备４．１．１．１器材４．１．１．１．１无菌６孔、２４孔、９６孔平底组织培养板。４．１．１．１．２无菌棉拭子。４．１．１．１．３１０ｍＬ无菌试管和１．５ｍＬ无菌离心管。４．１．１．１．４细胞培养瓶。４．１．１．１．５单道、８道微量可调移液器（２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ）。４．１．１．１．６灭菌常规玻璃器材。４．１．１．１．７二氧化碳培养箱。４．１．１．１．８电热恒温水浴箱。４．１．１．１．９生物安全柜。４．１．１．１．１０倒置显微镜。４．１．１．１．１１２００μＬ、１０００μＬ灭菌吸嘴。４．１．１．１．１２冰箱（－２０℃保存血清，－７０℃保存种毒）。４．１．１．２试剂４．１．１．２．１标准阳性，阴性血清由指定单位提供，按说明书使用。４．１．１．２．２细胞使用ＭＤＢＫ传代细胞或三代以内未感染ＩＢＲ病毒的原代胎牛肾细胞（ＢＫ）、睾丸细胞（ＢＴ）。４．１．１．２．３溶液配制本标准所用溶液配制参见附录Ａ。４．１．１．３样品采集４．１．１．３．１呼吸道样品用无菌棉拭子伸入鼻道采取分泌物，放入含大剂量１０００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１０００μｇ／ｍＬ的链霉素的０．５ｍＬ细胞维持液的试管中。也可用棉拭子采集眼分泌物放入细胞维持液。４．１．１．３．２外生殖器样品取棉拭子用力刮取外阴道炎或龟头炎病变粘膜表面，并收集粘液，放入含１０００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１０００μｇ／ｍＬ的链霉素的０．５ｍＬ细胞维持液中。４．１．１．３．３脑组织样品在剖检时无菌采集脑组织。２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１４．１．１．３．４流产组织样品刚死亡的胎儿无菌采集胎儿的肝、肺、脾、肾等各种组织样品和胎盘子叶，放入含１０００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１０００μｇ／ｍＬ的链霉素的细胞维持液中。４．１．１．３．５精液采集新鲜精液或冷冻精液至少０．５ｍＬ，置液氮保存备用。４．１．１．３．６血清样品无菌采血分离血清。４．１．１．４样品的运输采集的样品应立即放入４℃冰箱保存，冷藏运输尽快送到实验室。４．１．１．５样品处理４．１．１．５．１棉拭子样品棉拭子样品收到棉拭子样品后，拭子在细胞维持液中充分搅动以便将病毒洗脱出来并置室温３０ｍｉｎ。拧干拭子，将样品以２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，将上清液作为组织培养的接种材料。４．１．１．５．２组织样品组织样品先用细胞生长液制成２０％（质量浓度）的匀浆悬浮液后再经２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，将上清液作为组织培养的接种材料。４．１．１．５．３精液样品用作病毒分离的精液需经特殊处理，因精液中含有对细胞或对病毒繁殖有抑制作用的酶和其他因子（见４．１．２．２）。４．１．１．５．４抗菌素的添加上述样品制备后可加入两性霉素Ｂ（终浓度为２μｇ／ｍＬ）或经０．２２μｍ微孔滤器过滤。４．１．１．６细胞制备使用ＭＤＢＫ传代细胞或三代以内未感染ＩＢＲ病毒的原代胎牛肾细胞（ＢＫ）、睾丸细胞（ＢＴ），细胞浓度约为３×１０５／ｍＬ，按常规方法培养，长成良好单层备用。４．１．２试验程序４．１．２．１样品取经过处理的上述样品２００μＬ接种到已形成良好单层的ＭＤＢＫ传代细胞或三代以内未感染ＩＢＲ病毒的原代胎牛肾细胞（ＢＫ）、睾丸细胞（ＢＴ）的２４孔细胞培养板上，每份样品接种４孔，置３７℃５％二氧化碳吸附１ｈ，弃去液体，然后加入（不含ＩＢＲ抗体的犊牛血清的）细胞维持液，每孔２００μＬ。置３７℃５％二氧化碳培养箱培养，逐日观察细胞病变５ｄ；若５ｄ仍不出现ＣＰＥ，则收获培养物经反复冻融后继代于新制备的细胞上，盲传三代继续培养观察。出现病变者收获培养物，保存于－７０℃以下待鉴定。同时设立正常细胞对照４孔，每孔２００μＬ细胞维持液。３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１４．１．２．２精液样品用２ｍＬ（加有１０００ＩＵ／ｍＬ的青霉素和１０００μｇ／ｍＬ的链霉素的无ＩＢＲ抗体的）灭活犊牛原血清稀释２００μＬ新鲜精液。充分搅匀置室温３０ｍｉｎ。取此１ｍＬ混合液接种到已形成良好单层的ＭＤＢＫ传代细胞或三代以内未感染ＩＢＲ病毒的原代胎牛肾细胞（ＢＫ）、睾丸细胞（ＢＴ）的２４孔细胞培养板上，置３７℃５％二氧化碳吸附１ｈ，弃去液体，用２ｍＬ细胞维持液冲洗细胞两次弃去液体，每孔再加维持液２ｍＬ。余下步骤同４．１．２．１。４．１．３结果判定４．１．３．１总则本病毒致细胞病变特点是细胞变圆、聚合、呈葡萄状、拉网、最后脱落。收获出现上述病变的细胞培养物，经反复冻融两次后，以２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液再做下列试验。若盲传三代培养观察，仍不出现ＣＰＥ，判定为阴性。４．１．３．２分离物作病毒中和试验用ＩＢＲ标准阳性血清（效价１∶３２以上）和阴性血清分别与该分离物做中和试验（固定血清，稀释病毒，参见附录Ｂ）按Ｋｒｂｅｒ方法计算ＴＣＩＤ５０／５０μＬ。４．１．３．３犜犆犐犇５０的测定按Ｋｒｂｅｒ方法测定计算分离物ＴＣＩＤ５０／５０μＬ终点。４．１．３．４综合评价如果分离物能引起典型的ＩＢＲ细胞病变，并经病毒中和试验（固定血清，稀释病毒），其阴性血清组和阳性血清组的ＴＣＩＤ５０／５０μＬ的对数之差≥２．５，则判定该分离物为ＩＢＲ病毒。为缩短病毒分离程序，可将两种样品加入单层细胞中：一种是与标准阳性血清预孵育的样品；另一种是与阴性血清对照预先作用过的样品，如果ＣＰＥ被标准阳性血清所抑制，则分离物可认为是ＩＢＲ病毒。４．２微量血清中和试验４．２．１材料准备４．２．１．１器材４．２．１．１．１无菌２４孔、９６孔平底组织培养板。４．２．１．１．２细胞培养瓶。４．２．１．１．３单道、８道微量可调移液器（２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ）。４．２．１．１．４灭菌常规玻璃器材。４．２．１．１．５二氧化碳培养箱。４．２．１．１．６电热恒温水浴箱。４．２．１．１．７生物安全柜。４．２．１．１．８倒置显微镜。４．２．１．１．９２００μＬ、１０００μＬ灭菌吸嘴。４．２．１．１．１０１０ｍＬ无菌试管和１．５ｍＬ无菌离心管。４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１４．２．１．１．１１冰箱（－２０℃保存血清，－７０℃保存种毒）。４．２．１．２试剂４．２．１．２．１水本标准所用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规定。４．２．１．２．２溶液配制本标准所用溶液配制参见附录Ａ。４．２．１．２．３病毒株ＩＢＲ标准毒株（ＢａｉｔｈａＮｕ／６７冻干毒或其他标准毒株）、标准阳性、阴性血清，由指定单位提供，按说明书使用。４．２．１．２．４细胞使用ＭＤＢＫ传代细胞或三代以内未感染ＩＢＲ病毒的原代胎牛肾细胞（ＢＫ）、睾丸细胞（ＢＴ）。４．２．１．２．５待检血清无菌采血并分离出血清，待检血清不少于１ｍＬ，置－２０℃保存。４．２．２预备试验４．２．２．１细胞制备使用ＭＤＢＫ传代细胞或三代以内未感染ＩＢＲ病毒的原代胎牛肾细胞（ＢＫ）、睾丸细胞（ＢＴ），细胞浓度约为３×１０５／ｍＬ，按常规方法培养，长成良好单层备用。４．２．２．２病毒增殖将冻干ＩＢＲ标准毒株用培养液作１０倍稀释，取长成良好单层的细胞，倒掉细胞生长液，用培养液洗一次后，按原细胞生长液的十分之一的量接毒，将细胞瓶迅速翻转使病毒液充分浸没细胞单层，置３７℃５％二氧化碳吸附１ｈ，然后加入细胞维持液。置３７℃５％二氧化碳培养箱培养，逐日观察。当８０％～９０％细胞出现典型ＩＢＲ病变时，收毒并反复冻融两次，以２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测定病毒滴度（ＴＣＩＤ５０／５０μＬ）并分装小瓶，每瓶１ｍＬ，做好标记和收毒日期，置－７０℃或液氮保存备用。４．２．２．３病毒毒价测定制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用培养液将其作１０倍递增稀释，从１０－１－８。然后在～１０９６孔平底组织培养板上先每孔加入５０μＬ培养液，再加入等量的各稀释度的病毒悬液，每个稀释度作８孔，设正常细胞对照４孔（每孔含培养液１００μＬ），最后将生长良好的细胞经细胞消化液消化后，用细胞维持液将细胞配成悬液，按１００μＬ／孔（细胞含量约３×１０５个细胞／ｍＬ）加入各孔内。置３７℃５％二氧化碳培养箱培养３ｄ～７ｄ，记录各病毒稀释度的细胞病变孔数。用Ｋｒｂｅｒ方法计算ＴＣＩＤ５０／５０μＬ（参见附录Ｃ）。４．２．２．４血清处理待检血清、标准阳性和阴性血清置５６℃水浴箱内灭活３０ｍｉｎ。５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１４．２．３正式试验４．２．３．１被检血清稀释在９６孔板上将每份被检血清按两倍系列从原血清开始，用培养液作倍比稀释，每个稀释度为两孔，每孔５０μＬ，每份血清多加１个原血清孔作为血清毒性对照孔。４．２．３．２工作病毒液的加入根据已知病毒液效价，将病毒液稀释成每５０μＬ含１００ＴＣＩＤ５０的工作病毒液。按每孔５０μＬ加入各孔内，血清对照孔内不加工作病毒液，加５０μＬ培养液，振荡均匀。置３７℃５％二氧化碳培养箱中和１ｈ。４．２．３．３细胞的加入用细胞消化液将生长良好的细胞消化后，加入细胞维持液，制成细胞悬液（细胞含量约为３×１０５个细胞／ｍＬ）。按每孔１００μＬ加入中和完毕的各检测孔内，置３７℃５％二氧化碳培养箱中培养３ｄ～７ｄ逐日观察结果。４．２．３．４对照４．２．３．４．１正常细胞对照对照孔与检测孔的操作同时进行。正常细胞对照设４孔，每孔含培养液１００μＬ，细胞悬液１００μＬ。４．２．３．４．２阴性血清对照设两孔，每孔加阴性血清５０μＬ，加工作病毒液及细胞悬液的方法与被检血清相同。４．２．３．４．３阳性血清对照先将阳性血清作１∶２、１∶４稀释至１∶１２８，每个稀释度作两个孔，每孔５０μＬ，加工作病毒液及细胞悬液的方法与被检血消相同。４．２．３．４．４病毒回归对照以工作病毒液开始即１００ＴＣＩＤ５０并将其稀释成１０ＴＣＩＤ５０、１ＴＣＩＤ５０、０．１ＴＣＩＤ５０三个稀释度，取工作病毒液及每个稀释度接种４孔，每孔５０μＬ，每孔再各加５０μＬ培养液和１００μＬ细胞悬液。４．２．４结果判定４．２．４．１细胞对照细胞生长，形态正常。４．２．４．２阴性血清对照出现完全细胞病变，判读为ＣＰＥ（＋）。４．２．４．３阳性血清对照不出现ＣＰＥ，判读为ＣＰＥ（－），表明病毒被阳性血清抗体中和。其效价与原滴度不能低于±１个滴６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１度（２倍稀释）。４．２．４．４病毒回归对照在出现下列情况时，方能判定，否则无效。１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ均出现细胞病变；１０ＴＣＩＤ５０／５０μＬ均出现细胞病变；１ＴＣＩＤ５０／５０μＬ半数细胞出现病变；０．１ＴＣＩＤ５０／５０μＬ细胞未出现病变。４．２．４．５判定标准首先判定血清对照，查明是否有血清毒性或污染，如所有对照成立，工作病毒液用量１００ＴＣＩＤ５０应在５０ＴＣＩＤ５０～２００ＴＣＩＤ５０范围内，方可判定。被检血清的效价为能抑制５０％或５０％以上的细胞孔出现病变的血清最高稀释度；未经稀释的被检血清能抑制５０％或５０％以上的细胞孔出现病变者判为阳性。４．３酶联免疫吸附试验见ＳＮ／Ｔ１１６４．３。４．４聚合酶链反应（犘犆犚）见ＳＮ／Ｔ１９１８。４．５实时荧光犘犆犚方法４．５．１材料准备４．５．１．１器材４．５．１．１．１ＰＣＲ实验应在符合ＳＮ／Ｔ１１９３的实验室进行。４．５．１．１．２荧光ＰＣＲ检测仪、计算机。４．５．１．１．３高速冷冻离心机。４．５．１．１．４生物安全柜。４．５．１．１．５恒温水浴箱。４．５．１．１．６２℃～４℃冰箱和－２０℃低温冰箱。４．５．１．１．７纯水或超纯水器。４．５．１．１．８旋涡混合器。４．５．１．１．９微量可调移液器及吸嘴。４．５．１．１．１０组织研磨器或手持式均质器。４．５．１．１．１１１．５ｍＬ、１０ｍＬ无菌离心管。４．５．１．２试剂４．５．１．２．１１犿狅犾／犔犇犔犇犻狋犺犻狅狋犺狉犲犻狋狅犾（二硫苏糖醇）商品用试剂。４．５．１．２．２犜犪狇犕犪狀犘犆犚通用混合液试剂盒参见附录Ａ。４．５．１．２．３犘犅犛（狆犎７．２）溶液参见附录Ａ。７ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１４．５．１．２．４犆犺犲犾犲狓１００树脂参见附录Ａ。４．５．１．２．５红细胞裂解液参见附录Ａ。４．５．２样品处理和病毒犇犖犃的提取４．５．２．１样品前处理４．５．２．１．１临床样品处理在样品处理区进行。用无菌棉拭子伸入鼻道采取分泌物、取棉拭子用力刮取外阴道炎或龟头炎病变粘膜表面，并收集粘液等，剖检取病变组织。拭子样品放入含有０．５ｍＬＰＢＳ的无菌离心管中，涡旋混合后，２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液备用；组织样品取３．０ｇ置于组织匀浆器中加入５．０ｍＬＰＢＳ匀浆，然后将组织悬液以２５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液备用。４．５．２．１．２血凝块及全血处理取出装有血凝块的采血管，将无菌手持式均质器置于血凝块中均质，直至无团快状物存在。全血（抗凝血）不需均质处理，全血及血凝块均质液加入６倍～１０倍体积的红细胞裂解液，充分混匀，置于冰上１５ｍｉｎ，１６００ｒ／ｍｉｎ～２０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，弃上清夜，如沉淀仍有血凝块，可用红细胞裂解液反复裂解直至无血凝块存在，细胞沉淀用ＰＢＳ洗涤２次后，加入１倍体积的ＰＢＳ悬浮细胞备用。４．５．２．１．３细胞培养物处理取接种样品后出现ＣＰＥ或可疑的细胞培养物冻融三次，取细胞悬液５００μＬ，经２０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，弃上清液，取沉淀备用。４．５．２．２病毒犇犖犃的提取注：样品中病毒ＤＮＡ的提取也可选用其他合适的ＤＮＡ抽提方法或商品化试剂盒提取病毒ＤＮＡ。４．５．２．２．１前处理后样品病毒犇犖犃的提取取无菌微量离心管若干支，分别按不同样品加入上述处理好的样品和５％Ｃｈｅｌｅｘ１００溶液：临床样品上清液５０μＬ，５％Ｃｈｅｌｅｘ１００溶液１５０μＬ；血凝块及全血样品制备的细胞悬液１００μＬ，５％Ｃｈｅｌｅｘ１００溶液１００μＬ；细胞培养物离心后的沉淀可直接加入５％Ｃｈｅｌｅｘ１００溶液２００μＬ，涡旋混匀，５６℃～６０℃孵育２０ｍｉｎ，涡旋混合１０ｓ，９８℃水浴８ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，涡旋混合１０ｓ，置冰上冷却３ｍｉｎ，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，取上清液６μＬ用于荧光ＰＣＲ反应。剩余部分置于４℃短期或－２０℃长期保存备用。４．５．２．２．２精液中病毒犇犖犃提取４．５．２．２．２．１精液收集每批次的冻精管中随机取三支，将精液混匀收集于无菌微量离心管中备用。４．５．２．２．２．２提取步骤在１．５ｍＬ无菌微量离心管中分别加入以下各成分并吹打混匀：１０％Ｃｈｅｌｅｘ１００溶液１００μＬ、蛋白８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１酶Ｋ（１０ｍｇ／ｍＬ）１１．５μＬ、１ｍｏｌ／ＬＤＬＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ７．５μＬ、灭菌双蒸水９０μＬ、精液样品１０μＬ。然后，将１．５ｍＬ无菌微量离心管置于５６℃孵育３０ｍｉｎ后，高速涡旋振荡１０ｓ；再置沸水中煮沸８ｍｉｎ后，高速涡旋振荡１０ｓ；以１５０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，取上清液６μＬ用于荧光ＰＣＲ反应。剩余部分置于新管中，４℃短期或－２０℃长期保存备用。４．５．３引物和探针４．５．３．１正向引物ｇＢＦ：５’ＴＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＴ３’（在ＧｅｎＢａｎｋ中全基因序列ＡＪ００４８０１，位于第５７４９９５７５１９个碱基）４．５．３．２反向引物ｇＢＲ：５’ＧＴＡＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣ３’（在ＧｅｎＢａｎｋ中全基因序列ＡＪ００４８０１，位于第５７５９５５７５７５个碱基）４．５．３．３探针犜犪狇ＭａｎＰｒｏｂｅ：５’ＦＡＭＡＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＴＡＭＲＡ３’（在ＧｅｎＢａｎｋ中全基因序列ＡＪ００４８０１，位于第５７５２５５７５４５个碱基）４．５．４对照设置检测过程中分别设阳性、阴性对照组。用含ＢＨＶ１病毒的细胞培养悬液和正常ＭＤＢＫ细胞培养物按４．５．２．２提取ＤＮＡ分别做阳性、阴性对照，空白对照除以灭菌双蒸水代替模板外，测定步骤相同。４．５．５扩增试剂准备与配制在反应混合物配制区进行。反应液配制在冰盒上进行。从试剂盒中取出荧光ＰＣＲ反应液，在室温下融化后，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ。采用２５μＬ反应体系。每一管反应需荧光定量ＰＣＲ混合液１２．５μＬ，［ＲＯＸ校正染液０．５（可选）］，正向引物ｇＢＦ（４．５／Ｌ）、反向引物ｇＢＲ（４．５／Ｌ）和探针μＬμｍｏｌμｍｏｌ（３／Ｌ）各１，无ＤＮＡ酶的灭菌双蒸水４．５，根据待检样品数计算各试剂的总使用量，加入一μｍｏｌμＬμＬ适当体积离心管中，充分混匀，然后分装到各ＰＣＲ反应管中，每管２０μＬ。４．５．６加样在样品处理区进行。在各设定的ＰＣＲ管中分别加入４．５．２．２中制备的ＤＮＡ溶液各５μＬ，盖紧管盖后，５００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ。４．５．７实时荧光犘犆犚反应将４．５．６中加样后的ＰＣＲ反应管放入实时荧光ＰＣＲ检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置：———第一阶段，预变性５０℃２ｍｉｎ；———第二阶段，９５℃２ｍｉｎ；———第三阶段，９５℃１５ｓ，６０℃４５ｓ，４５个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。４．５．８结果判定４．５．８．１结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。４．５．８．２质控标准阴性对照和空白对照无Ｃｔ值并且无扩增曲线；阳性对照的Ｃｔ值应≤４５，并出现典型的扩增曲线；９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１如阴性对照、空白对照和阳性对照条件不满足以上条件，此次实验视为无效。４．５．８．３结果描述及判定４．５．８．３．１阴性无Ｃｔ值并且无扩增曲线表明样品中无ＢｏＨＶ１病毒。４．５．８．３．２阳性Ｃｔ值≤４５，并出现典型的扩增曲线，表示样本中存在ＢｏＨＶ１病毒。４．５．８．３．３综合评价采用ＰＣＲ方法或实时荧光ＰＣＲ方法检出阳性时，表示ＢｏＨＶ１病毒核酸阳性，初步判定为疑似牛传染性鼻气管炎，还需同时进行病毒分离鉴定并结合流行病学和临床症状（参见附录Ｄ），才能最终判定发生了牛传染性鼻气管炎。从某一动物体内分离到ＢｏＨＶ１病毒并不等于该病毒引起疾病爆发。它可能是在应激条件下被激活的潜伏病毒。只有检查众多动物并且血清学检查抗体阳转或者是ＢｏＨＶ１抗体滴度上升４倍或更高，实验室诊断才可信。收集鼻拭子的牛应间隔２周～３周采血２次，双份血清样品应该用同一个血清学试验进行检测。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１附录犃（资料性附录）溶液和试剂配制犃．１细胞培养用试剂的制备犃．１．１培养液的制备Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培养基或１９９培养基按说明书配制，加入青霉素１００ＩＵ／ｍＬ和链霉素１００μｇ／ｍＬ。犃．１．２细胞生长液的制备培养液加１０％无ＩＢＲ抗体的灭活犊牛血清。犃．１．３细胞消化液的制备胰酶—ＥＤＴＡ溶液氯化钠８．０ｇ氯化钾０．４０ｇ无水葡萄糖１．０ｇ碳酸氢钠０．５８ｇＥＤＴＡ０．２０ｇ胰酶０．５０ｇ１％酚红２．０ｍＬ双蒸水加至１０００ｍＬ以上各成分依次溶于５００ｍＬ双蒸水中，待充分溶解后，加双蒸水至１０００ｍＬ。过滤除菌，分装后置－２０℃保存备用。犃．１．４１％酚红溶液酚红１．０ｇ１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠２．５ｍＬ双蒸水加至１００ｍＬ酚红在乳钵内加少量１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠研磨，使其充分溶解，加水定容至１００ｍＬ，用滤纸过滤，４℃保存备用。犃．１．５细胞维持液的制备培养液加２％～５％无ＩＢＲ抗体的灭活犊牛血清。犃．２实时荧光犘犲犚试剂的制备犃．２．１犜犪狇犕犪狀犘犆犚通用混合液试剂盒采用抗体介导热启动技术的实时荧光定量犜犪狇ＭａｎＰＣＲ核心试剂盒，组合了缓冲液、ｄＮＴＰｓ、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、ＵＤＧ是２×浓度即用型试剂，只需加入模板、引物、犜犪狇Ｍａｎ探针、无ＤＮＡ酶的灭菌双蒸水便可进行实时荧光ＰＣＲ反应。操作方法按说明书使用。１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１犃．２．２犘犅犛溶液狆犎７．２氯化钠（ＮａＣｌ）８．５ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２．８５ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２７ｇ双蒸水定容至１０００ｍＬ调ｐＨ至７．２，高压灭菌后，置于４℃冰箱备用。犃．２．３红细胞裂解液０．１５ｍｏｌ／ＬＮＨ４Ｃｌ０．０１ｍｏｌ／ＬＫＨＣＯ３０．００１ｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ，操作方法按说明书使用。犃．２．４５％犆犺犲犾犲狓１００溶液Ｃｈｅｌｅｘ１００５ｇ双蒸水定容至１００ｍＬ移取时，边搅拌边用１０００μＬ移取，必要时，可将灭菌吸嘴尖部用灭菌剪剪掉，以移取时可吸取胶珠且不流出为宜，操作方法按说明书使用。１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１附录犅（资料性附录）固定血清稀释病毒方法将出现细胞病变的分离培养物冻融两次后，以２５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液于９６孔细胞培养板上用不含犊牛血清的培养液稀释１０－１－６，按每个稀释度４孔、５０／孔，与等量的特异性抗～１０μＬＩＢＲＶ阳性血清（１∶４稀释）混合，置３７℃含５％二氧化碳培养箱吸附２ｈ后，将ＭＤＢＫ细胞按１００μＬ／孔加入各孔中，置３７℃含５％二氧化碳培养箱培养７２ｈ，终判。同时设阴性血清对照，取已稀释成－１－４的分离培养物溶液按每个稀释度２孔、５０μＬ／孔，与等量的无ＩＢＲＶ的标准阴性血清混合，１０～１０其余步骤同特异性抗ＩＢＲＶ阳性血清处理方法。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１附录犆（资料性附录）犐犅犚病毒犜犆犐犇５０／５０μ犔测定计算方法Ｋｒｂｅｒ方法计算ＴＣＩＤ５０／５０μＬ。计算见式（Ｃ．１）∑犜５０＝狋＋Δ狋…………………………（Ｃ．１）式中：———在接种孔数内１００％病变的最高病毒稀释度；狋一个稀释度的感染孔数之和被接种孔数除后所得之商再减去１／２Δ狋———接种孔数与高于狋（５０％）。例：如使用９６孔组织培养板测定病毒滴度，每孔加入稀释病毒５０ｕＬ。结果如下：稀释度：１０－１－２－３－４－５－６－７－８１０１０１０１０１０１０１０病变孔数：８／８８／８８／８８／８８／８８／８４／８０／８在这个例子中，１０－６是能使１００％的孔出现病变的病毒最高稀释度。狋＝６．０感染孔数（８）加上高于狋一个稀释度的感染孔数（４）之和被接种孔数（８）除后所得之又如：Δ狋是狋商，再减去１／２（４／８）即为５０％终点因子ＴＣＩＤ５０／５０μＬ。Δ狋＝（８＋４）／８－１／２＝１．０用下列求和公式表示５０％终点的最后计算结果：∑犜５０＝狋＋Δ狋＝６．０＋１．０＝７．０－７即病毒滴度为：ＴＣＩＤ５０＝１０－５稀释。１００ＴＣＩＤ５０／５０ｕＬ即为将病毒液作１∶１０１４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１附录犇（资料性附录）疾病简介犇．１牛传染性鼻气管炎牛传染性鼻气管炎是由牛疱疹病毒１型（ＢｏＨＶ１）感染牛引起的一种病毒性传染病，以上呼吸道炎症为特征。犇．２病原ＢｏＨＶ１属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属。病毒基因组是双股ＤＮＡ编码约７０个蛋白，其中３３个为结构蛋白，约１５个为非结构蛋白。病毒糖蛋白位于病毒衣壳的表面在致病力和免疫方面起重要作用。病毒粒子呈圆形，由１６２个壳粒组成正２０面体。直径１００ｎｍ～２００ｎｍ或更大些。是由芯髓并围着衣壳和囊膜三种微细结构组成。ＢｏＨＶ１可分为ＢｏＨＶ１．１型、ＢｏＨＶ１．２ａ型和ＢｏＨＶ１．２ｂ型和ＢｏＨＶ１．３型。ＢＨＶ１．２亚型的毒力比ＢｏＨＶ１．１亚型弱。病毒对乙醚、三氯甲烷、丙酮、酒精敏感。对胰蛋白酶不敏感。在ｐＨ４．５～５．０环境中不稳定，ｐＨ６．０～９．０稳定。在３７℃可存活２０ｍｉｎ，５６℃２ｍｉｎ可灭活。４℃可保存３０ｄ，－７０℃可存活数年，能在原代或次代牛肾、肺或睾丸细胞、以及由胎牛的肺、鼻甲或气管等组织制备的细胞株和已建立的传代细胞系如ＭＤＢＫ细胞等细胞培养物中生长。犇．３流行病学病毒在世界各地均有分布，基本上凡养牛地区就有此病毒，牛是本病的主要宿主，各种年龄及不同品种的牛均可感染，山羊、水牛、猪和鹿可以自然感染。这些动物的感染对流行病学的意义尚不十分清楚。病牛和带病毒的牛是主要传染源。本病可通过直接接触或间接接触而传染，还可通过接触病牛鼻镜、交配和人工受精而感染。本病毒对器官的亲和力易于改变，如适应于生殖器官的病毒在从阴道粘膜传于鼻粘膜上时，能较快地适应呼吸道器官。病牛有持久的潜伏感染和长期的间歇性排毒。康复牛虽然不呈现症状，但仍间歇性排毒。带毒牛因应激而排毒，在自然界形成感染循环链。肥育牛比放牧牛和奶牛的发病率高、病情较重、病死率也高。新生犊牛（小于２周岁）比成年牛病死率高。犇．４临床症状本病潜伏期４ｄ～６ｄ。在临床上表现为高热、呼吸困难、鼻炎、脓胞性外阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜炎、乳房炎、流产等它具有典型的泛嗜性，能侵袭多种器官和组织，引起多种多样的临床症状。该病死亡率较低，许多感染牛呈亚临床症状经过，常由于继发细菌感染导致更为严重的呼吸道疾病。犇．５发病机理和病理变化病毒经鼻腔进入动物体内并在上呼吸道和扁桃体的粘膜上繁殖，达到高滴度。随后扩散到结膜并通过神经轴突传到三叉神经节。偶尔可发生低病毒血症。生殖系统感染后，ＢｏＨＶ１在阴道或包皮粘 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１６４．１—２０１１１１０—２膜中繁殖并潜伏于荐神经节。病毒ＤＮＡ可在宿主神经节中维持终生。病毒的传播和繁殖可以诱导持续感染，也可间歇地排放到环境之中。１４本病的主要病理变化是鼻腔、喉头、气管或生殖道粘膜出现局灶性坏死。这些损伤是病毒繁殖和致６１细胞病变的直接后果。伴有强烈的炎症反应的病例，损伤可融合由大量白细胞浸润形成的化脓灶，当继１／发细菌感染时，则可能引起肺炎。流产胎儿体内，多种组织可出现极小的坏死病灶，特别是肝脏。犜犖犛犇．６检疫诊断根据临床症状，呼吸道粘膜、阴道粘膜和眼结膜等发生的炎症，并在粘膜上有白色脓胞和形成粘着的坏死损伤的典型病例，可以做出初步诊断，进一步确诊应依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、ＰＣＲ技术和实时荧光ＰＣＲ技术等。书号：１５５０６６·２２２５８７定价：２１．００元'