snt1447-2011 猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１４４７—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４，ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪狅犳狊狑犻狀犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１４４７—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１．５字数４１千字２０１１年１２月第一版２０１１年１２月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６１１定价２４．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４《猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验》、ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５《猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４和ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５相比，主要技术变化如下：———增加了细菌分离鉴定；———补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王巧全、李树清、张强、李健、胡永强、刘俊平、熊炜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１４４７．１—２００４；———ＳＮ／Ｔ１４４７．２—２００５。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范１范围本标准规定了猪传染性胸膜肺炎的细菌分离鉴定、聚合酶链式反应、补体结合试验、阻断酶联免疫吸附试验等实验室检测的操作程序及技术要求。本标准适用于猪传染性胸膜肺炎的检疫、诊断、流行病学调查和免疫监测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样。３疾病简介参见附录Ａ。４现场检疫及采样４．１现场检疫逐头进行临床检查，根据动物病情、临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。４．２采样４．２．１病料的采集标准按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定采样。４．２．２活体病料采集用棉拭子采鼻腔分泌物，放入无菌试管中送实验室进行检验。４．２．３组织样品的采集无菌采集具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、扁桃体。４．２．４血样的采集制备无菌操作采集动物血，每头不少于１０ｍＬ。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。５实验室诊断５．１总则对该病可以进行细菌分离鉴定、分子生物学或血清学检查等。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１其中细菌分离、聚合酶链式反应主要检病原，补体结合试验、酶联免疫吸附试验主要检抗体。５．２细菌分离鉴定５．２．１试剂营养琼脂、血琼脂、巧克力琼脂、类胸膜肺炎微生物（ＰＰＬＯ）琼脂。５．２．２病原分离将样品按常规分离要求直接接种到血琼脂表面，再用鸡表皮葡萄球菌作交叉划线于３７℃含５％二氧化碳（ＣＯ２）下培养。继代培养用巧克力琼脂和ＰＰＬＯ琼脂进行培养。５．２．３病原鉴定培养形态及染色特性：于血琼脂平板培养２４ｈ～４８ｈ，胸膜肺炎放线杆菌（ＡＰＰ）为露珠样的小菌落，直径１ｍｍ～２ｍｍ。多数菌株产生β溶血带，靠近鸡表皮葡萄球菌菌苔的菌落较大，随着与葡萄球菌生长线的距离增加而变小或不生长，即所谓“卫星现象”。取典型菌落作革兰氏染色，应为革兰氏阴性小球杆菌，两极着色继代培养中呈明显多形态，幼龄培养物中偶有成丝状。５．２．４判定被分离菌具有以下特点即可初步判定为猪胸膜肺炎放线杆菌：———染色镜检为革兰氏阴性杆菌或多形态；———在血琼脂培养基上生长具有溶血现象；———生长培养需要ｖ因子，即具有“卫星现象”；———被检菌生化特性：尿素酶试验为阳性，能分解Ｄ木糖、甘露醇，不分解棉子糖、阿拉伯胶糖。５．３猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应５．３．１设备和材料５．３．１．１仪器设备５．３．１．１．１ＰＣＲ扩增仪。５．３．１．１．２电泳仪。５．３．１．１．３凝胶成像系统。５．３．１．２试剂５．３．１．２．１三蒸水０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ。５．３．１．２．２吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ。５．３．１．２．３琼脂糖。５．３．１．２．４溴化乙锭。５．３．１．２．５犜犪狇酶。５．３．１．２．６２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。５．３．１．２．７２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ。５．３．１．２．８分子量指示物：１００ｂｐ～２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１５．３．１．２．９ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ乙酸电泳缓冲液（ＴＡＥ）、琼脂糖凝胶、６×加样缓冲液（见Ｂ．６）、１０×ＰＣＲ缓冲液（见Ｂ．７）。５．３．１．３引物引物见表１。表１引物引物浓度产物大小引物核苷酸序列μｍｏｌ／ＬｂｐａＳ７５’ｃｔｔｔａｇｇｇａｇｇｇｇｔａｇａａｔｔ３’５ｂＳ１０５’ｇａｔｔａｃｔａｇｃｇａｔｔｃｃｇａｃｔｔ３’５６９２ａＰ１５’ｃｇｔａａｃｔｃｇｇｔｇａｔｔｇａｔｇｃ３’５ｂＰ４５’ｃｇｔｔｔｇｃｔｃａｔｔｃｇａｔａａａｃｇ３’５３６３ａＰ６５’ｇｔｇｃｇｇｇｔａａｔｇａｔａｃｇｇｔｔ３’５ｂＰ８５’ｃｇｇｃｔａａａｃｃａａａｇｔｔｃｇｇａｔ３’５２２３ａ上游引物ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ。ｂ下游引物ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ。５．３．２操作步骤５．３．２．１样品被检菌株、扁桃体、肺等组织样品及鼻拭子。５．３．２．２样品处理菌株：挑取可疑菌落于ｐＨ７．２０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ中，制成约１０８菌悬液（液体稍浑浊），再用ＰＢＳ进行１０倍、１００倍稀释。原液、１０倍和１００倍稀释液均作为复合ＰＣＲ扩增的模板。组织样品及鼻拭子：取组织０．５ｇ～１ｇ剪碎，加入１ｍＬＰＢＳ缓冲液，匀浆。鼻拭子在１ｍＬＰＢＳ缓冲液中反复挤压。分别将挤下的液体和组织匀浆液１００犵离心５ｍｉｎ，弃沉淀。上清液１００００犵离心５ｍｉｎ，弃上清液。沉淀加入５０μＬＰＢＳ和１μＬ灭菌吐温２０，－２０℃冷冻１５ｍｉｎ，取出立即置１００℃水浴中煮沸５ｍｉｎ，重复冻融、煮沸两次。１００００犵离心５ｍｉｎ，留上清液，取部分上清液进行１０倍、１００倍稀释。原液、１０倍和１００倍稀释液均作为套式ＰＣＲ扩增的模板。ＡＰＰ阳性和阴性组织进行同样的处理。５．３．２．３复合犘犆犚５．３．２．３．１对照设立阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标准菌株ＤＮＡ。阴性对照用林氏放线杆菌（犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊犾犻犵狀犻犲狉犲狊犻犻）菌株ＤＮＡ。空白对照用等体积的水代替模板。ＡＰＰ菌株的培养（方法见Ｃ．２）。ＤＮＡ的提取（方法见Ｄ．２）。３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１５．３．２．３．２犘犆犚反应体系总体积３０μＬ，１０×ＰＣＲ反应缓冲液３μＬ；氯化镁３μＬ；ｄＮＴＰ３μＬ；引物Ｓ７和Ｓ１０各０．５μＬ；Ｐ１和Ｐ４各０．７５μＬ；１μＬ模板，阳性和阴性对照１０ｎｇ～２０ｎｇＤＮＡ；１单位犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，并加入１％灭菌吐温２０，补充水至３０μＬ。５．３．２．３．３循环参数ＰＣＲ反应为９６℃６ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３５个循环；７２℃５ｍｉｎ。５．３．２．３．４电泳取产物１０μＬ与２μＬ６×加样缓冲液混合，加样于含ＥＢ的１．５％琼脂糖凝胶中。在１×ＴＡＥ缓冲液中，３Ｖ／ｃｍ～４Ｖ／ｃｍ电泳约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。阳性、阴性、空白对照和ＤＮＡ相对分子质量指示物同样电泳。５．３．２．４套式犘犆犚５．３．２．４．１对照设立阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标准菌株ＤＮＡ，或已知ＡＰＰ阳性组织制备的模板。阴性对照用林氏放线杆菌菌株ＤＮＡ，或已知ＡＰＰ阴性组织制备的模板。空白对照用等体积的水代替模板。５．３．２．４．２反应体系总体积３０μＬ，１０×ＰＣＲ反应缓冲液３μＬ；氯化镁３μＬ；ｄＮＴＰ３μＬ；每轮相应引物各０．５μＬ；１μＬ模板，阳性和阴性ＤＮＡ对照１０ｐｇ～２０ｐｇＤＮＡ；第一轮用１单位犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，并加入１％灭菌吐温２０。第二轮用０．５单位犜犪狇ＤＮＡ聚合酶；补充水至３０μＬ。５．３．２．４．３循环参数第一轮ＰＣＲ使用引物Ｐ１／Ｐ４，９６℃６ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，２５个循环；７２℃５ｍｉｎ。取第一轮ＰＣＲ反应产物１μＬ，用引物Ｐ６／Ｐ８进行第二轮ＰＣＲ扩增，９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３５个循环；７２℃３ｍｉｎ。５．３．２．４．４电泳按５．３．２．３．４操作。５．３．３结果判定５．３．３．１复合犘犆犚阳性对照会出现６９２ｂｐ和３６３ｂｐ的ＤＮＡ片段。阴性对照会出现６９２ｂｐ的ＤＮＡ片段，但不出现３６３ｂｐ的ＤＮＡ片段。空白对照在６９２ｂｐ和３６３ｂｐ均没有核酸带。对照成立才能进行判定。菌株原液、１０倍和１００倍稀释菌悬液经复合ＰＣＲ扩增后：在６９２ｂｐ和３６３ｂｐＤＮＡ位置上都有核４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１酸带，判为阳性菌株。阳性菌株ＰＣＲ产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊。无核酸带或带的大小不在３６３ｂｐＤＮＡ位置上判为阴性菌株。５．３．３．２套式犘犆犚阳性对照会出现２２３ｂｐ特异的ＤＮＡ片段。阴性和空白对照均没有该核酸带。对照成立才能进行判定。待测样品原液、１０倍和１００倍稀释液经套式ＰＣＲ扩增后：在２２３ｂｐＤＮＡ位置上有核酸带，判为阳性样品。阳性样品ＰＣＲ产物应通过核酸序列测定，并与标准参考序列比对，进行确诊。无核酸带或带的大小不在２２３ｂｐＤＮＡ位置上，判为阴性样品。５．４补体结合试验５．４．１材料准备５．４．１．１巴比妥缓冲液（犞犅犇）配制方法见附录Ｅ。５．４．１．２标准抗原和血清标准抗原、标准阳性血清、标准阴性血清需添加到补体中的标准犊牛血清。５．４．１．３溶血素效价滴定先将溶血素用ＶＢＤ作１∶１００稀释（取０．２ｍＬ含等量甘油的溶血素，加９．８ｍＬＶＢＤ），按表２制备６管不同稀释倍数溶血素。表２稀释溶血素单位为毫升试管号１２３４５６稀释倍数１０００×２０００×２５００×３０００×４０００×８０００×ＶＢＤ９．０１．０１．５２．０３．０７．０１∶１００溶血素１．０１∶１０００溶血素１．０１．０１．０１．０１．０取６支试管，分别标上６个溶血素浓度，每管各加１．０ｍＬ标准红细胞悬液（见附录Ｆ），再加上不同稀释倍数的溶血素１．０ｍＬ到相应的试管中，３７℃水浴１５ｍｉｎ，即成致敏红细胞。用冷至４℃的ＶＢＤ液将补体作１∶４００稀释，放４℃冰箱于２ｈ内使用。取６支试管，分别标上各溶血素稀释度，每管加ＶＢＤ０．４ｍＬ，１∶４００补体０．４ｍＬ（根据补体效价高低，可用大于或小于１∶４００的稀释度），再在各管内加入不同稀释度溶血素致敏红细胞悬液０．２ｍＬ。混匀后置３７℃水浴１ｈ，取出后以１０００犵离心５ｍｉｎ，与标准溶血管（见附录Ｇ）比较，求得各管溶血度的百分率。以各管溶血度的百分率为纵坐标，稀释倍数为横坐标（以１∶１０００稀释度的适当长度为１，１∶２０００为１／２，１∶２５００为２／５，１∶３０００为１／３，１∶４０００为１／４，１∶８０００为１／８。）画图。合适的溶血素效价为平稳区的第二个稀释度。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１５．４．１．４补体效价滴定５．４．１．４．１取４支试管，按表３加入试剂，混匀，３７℃水浴３０ｍｉｎ，期间摇匀一次。表３补体效价滴定单位为毫升管号试剂１２３４ＶＢＤ０．６０．５５０．５０．４１∶４００稀释补体０．２０．２５０．３０．４致敏红细胞０．２０．２０．２０．２５．４．１．４．２取出后，１０００犵离心５ｍｉｎ，与标准溶血管（见附录Ｇ）比较，当一管与标准管不能确切相比时，取左右两标准管溶血度平均值。５．４．１．４．３补体单位５０％溶血补体量（Ｃ’Ｈ５０）的确定：先计算每管的溶血比率，溶血百分比／非溶血百分比［例如溶血百分比为３５％，则比率为３５／（１００－３５）＝０．５４］，以每管的溶血比率为横坐标，每管所用１∶４００稀释补体的毫升数为纵坐标，在双对数坐标纸上作图。将头二管二点连成一线，找出中间点，后二管二点同样处理，将二线的中间点作成一线，从此线与“１”的交叉处画一水平线，读出１∶４００稀释补体的Ｃ’Ｈ５０的毫升数。在试验中需用５个Ｃ’Ｈ５０。５个Ｃ’Ｈ５０补体的稀释倍数的计算：（４００×０．４）／（１∶４００稀释补体的Ｃ’Ｈ５０的毫升数×５）５．４．１．５致敏红细胞制备方法见附录Ｆ。５．４．１．６标准溶血管制备方法见附录Ｇ。５．４．２操作方法５．４．２．１待检血清以及标准阳性血清、阴性血清均用ＶＢＤ作１∶１０稀释，于６０℃水浴锅中灭活３０ｍｉｎ。５．４．２．２加０．０２５ｍＬ已１∶１０稀释好的血清到微量板的相应孔，加双孔，其中一孔为检测抗补体。５．４．２．３设置血清抗补体，阴性血清、阳性血清对照，ＶＢＤ、抗原和红细胞对照。５．４．２．４加０．０２５ｍＬ最适合工作抗原到稀释血清孔和抗原对照孔，血清抗补体孔、ＶＢＤ对照孔、红细胞对照孔分别加ＶＢＤ０．０２５ｍＬ、０．０５ｍＬ和０．１ｍＬ。５．４．２．５加０．０５ｍＬ含５Ｃ’Ｈ５０的补体，将微量板振荡混匀１ｍｉｎ后，加盖，置４℃冰箱冷感作１５ｈ～１８ｈ。５．４．２．６每孔加０．０２５ｍＬ致敏红细胞，振荡１ｍｉｎ，使致敏红细胞悬浮，置３７℃孵育３０ｍｉｎ。５．４．２．７以１０００犵离心５ｍｉｎ后，与标准比色，判定。５．４．３判定５．４．３．１对照组应符合正确溶血百分比（见表４），试验方成立，否则应重做。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１表４补体结合试验正式试验操作表单位为微升补体对照被检血清阳性血清对照阴性血清对照红细抗原ＶＢＤ成分胞对２．５１．２５２．５１．２５照１∶１０１∶１０１∶１０１∶１０１∶１０１∶１０５Ｃ’Ｈ５０５Ｃ’Ｈ５０Ｃ’Ｈ５０Ｃ’Ｈ５０Ｃ’Ｈ５０Ｃ’Ｈ５０血清２５２５２５２５２５２５抗原２５２５２５２５２５２５ＶＢＤ２５２５２５２５２５２５２５２５２５１５Ｃ’Ｈ５０５０５０５０５０５０５０５０５０５０５０５０５０板振荡混匀１ｍｉｎ后，加盖，置４℃冰箱冷感作１５ｈ～１８ｈ致敏红细胞２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５３７℃孵育３０ｍｉｎ，以１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后，与标准比色判定对照正确９０～８５～９０～１０～１００１０００～３０１００１０００～５０１０００溶血（％）１００１００１００５０５．４．３．２判定标准如下：———被检血清１∶１０稀释≤３０％溶血为阳性；———被检血清１∶１０稀释＞５０％溶血为阴性；———介于阴、阳性之间为可疑，应重检，仍为可疑判为阳性。５．５阻断酶联免疫吸附试验５．５．１材料５．５．１．１试剂５．５．１．１．１磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）。５．５．１．１．２磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）。５．５．１．１．３氯化钠（ＮａＣｌ）。５．５．１．１．４柠檬酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ）。５．５．１．１．５邻苯二胺（ＯＰＤ）。５．５．１．１．６３０％过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）。５．５．１．１．７硫酸（Ｈ２ＳＯ４）。５．５．１．１．８吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）。５．５．１．１．９牛血清白蛋白（ＢＳＡ）。５．５．１．１．１０包被液、稀释液、洗液、酶底物溶液和终止液的配制见附录Ｈ。注：所有化学试剂均为分析纯。５．５．１．２仪器设备５．５．１．２．１９６孔酶标板。５．５．１．２．２多通道、单通道可调移液器及加样头。５．５．１．２．３天平（０．０００１ｇ）。７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１５．５．１．２．４低速离心机。５．５．１．２．５酸度计。５．５．１．２．６酶标仪。５．５．１．２．７恒温箱。５．５．１．３标准试剂５．５．１．３．１猪传染性胸膜肺炎标准抗原。５．５．１．３．２猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清。５．５．１．３．３标准猪阴性血清。５．５．１．３．４兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清。５．５．１．３．５辣根过氧化物酶标记的猪抗兔ＩｇＧ。５．５．２采样被检动物无菌采血５ｍＬ，待血液凝固后，以２０００犵离心１０ｍｉｎ，分离血清，血清－２０℃保存。５．５．３操作方法５．５．３．１包被抗原将猪传染性胸膜肺炎抗原用包被液稀释成工作浓度，包被酶标板，每孔１００μＬ，加盖后，放置４℃冰箱过夜。５．５．３．２封闭次日取出酶标板，置３７℃恒温箱或室温３０ｍｉｎ后，弃去包被液，每孔加２００μＬ稀释液，３７℃孵育１ｈ。５．５．３．３洗板取出酶标板弃去液体后，每孔加洗液３００μＬ，洗板，共３次，每次２ｍｉｎ。最后一次倒置拍干。５．５．３．４加样被检血清用稀释液作１∶４稀释，每份血清加２孔，每孔１００μＬ。设立下列对照：猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清（阳性对照）、标准猪阴性血清（阴性对照）、兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清（兔抗ＡＰＰ对照）、空白对照。阳性、阴性血清对照同被检血清一样，用稀释液作１∶４稀释，每个对照加２孔，每孔１００μＬ。兔抗ＡＰＰ对照和空白对照同样加两孔，每孔加１００μＬ稀释液，３７℃作用１ｈ。５．５．３．５加兔抗猪传染性胸膜肺炎高免血清用稀释液将兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清稀释成工作浓度，每孔１００μＬ，空白对照每孔加１００μＬ稀释液，３７℃作用３０ｍｉｎ。５．５．３．６洗板按５．５．３．３操作。５．５．３．７加猪抗兔犐犵犌辣根过氧化物酶结合物用稀释液将酶结合物稀释成工作浓度，每孔１００μＬ，３７℃作用１ｈ。８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１５．５．３．８洗板按５．５．３．３操作。５．５．３．９加酶底物溶液每孔加１００μＬ，３７℃作用２０ｍｉｎ。５．５．３．１０终止反应取出反应板，每孔加５０μＬ终止液终止反应。５．５．３．１１测吸光值用酶标仪在４９０ｎｍ波长下，以空白对照为参照，测定其吸光值（ＯＤ）。５．５．４数据计算５．５．４．１计算平均吸光值：被检样品和各对照的两孔吸光值之和除以２。５．５．４．２计算相对平均吸光值：被检样品及对照均按式（１）计算相对平均吸光值。犅犃＝×１００％…………………………（１）犆式中：犃———相对平均吸光值；犅———样品（对照）平均吸光值；犆———标准阴性平均吸光值。５．５．５结果判定阳性对照相对平均吸光值应小于２０％，兔抗ＡＰＰ对照相对平均吸光值应大于４０％。对照成立才能对样品进行判定。阳性反应：被检血清相对平均吸光值小于２０％。疑似反应：被检血清相对平均吸光值２０％～４０％，疑似反应的样品进行重复试验，若仍为疑似反应则判为阳性。阴性反应：被检血清相对平均吸光值大于４０％。６废弃物处理和防止污染的措施检验过程中的废弃物，收集后高压灭菌或在焚烧炉中焚烧处理。检验过程中应采取必要的防止交叉污染的措施，特别是ＰＣＲ检测过程中应严格遵循ＰＣＲ操作要求。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犃（资料性附录）猪传染性胸膜肺炎简介犃．１地理分布及危害猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸系统的一种严重的接触性传染病。本病以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素坏死性胸膜肺炎为特性。目前，猪传染性胸膜肺炎广泛存在于世界上养猪地区，特别是养猪业发达的国家和地区，给养猪业造成巨大的经济损失，特别是近十几年流行有增加趋势，国际公认该病是危害现代养猪业的重要传染病之一。犃．２病原学本病病原为胸膜肺炎放线杆菌（犃犮狋犻狀狅犫犪犮犻犾犾狌狊狆犾犮狌狉狅狆狀犲狌犿狅犿犻犪犲），早称为副溶血嗜血杆菌（犎．狆犪狉犪犺犪犲犿狅犾狔狋犻犮狌狊）。胸膜肺炎放线杆菌为革兰氏染色阴性小球杆菌，并具有多形性，菌体表面被覆荚膜，在有的菌株培养物表面电镜观察到纤细的菌毛，无运动性，不形成芽孢。本菌为兼性厌氧菌，在１０％二氧化碳条件下，可生成粘液状菌落，巧克力琼脂上培养２４ｈ～４８ｈ，形成不透明淡灰色的菌落，直径１ｍｍ～２ｍｍ。在血琼脂平板上通常产生β溶血环，本菌产生的溶血素与金黄色葡萄球菌的β毒素具有协同作用。根据荚膜多糖分类，迄今已发现有１５个血清型，其中血清５型分成５ａ和５ｂ二个亚型。本病菌抵抗力不强，易被一般消毒药杀灭，但对结晶紫、杆菌肽、林肯霉素、壮观霉素有一定的抵抗力。犃．３流行病学易感性：各种年龄的猪均易感。通常以６周～６月龄的猪较为多发。传染源：病猪和带菌猪是本病的传染源。猪场或猪群之间的传播，多数由于引进或混入带菌猪、慢性感染猪所致。传播途径：病菌主要存在于患猪的支气管。肺脏和鼻汁中，病菌从鼻腔排出后形成飞沫，通过呼吸道传播，拥挤和通风不良可加速传播。流行特点：多在４月～５月和９月～１１月发生，具有明显的季节性。饲养环境突然改变、密集饲养、通风不良、气候的突变及长途运输等诱因可引起本病发生。犃．４临床症状和发病机理本病与动物的年龄、免疫状态、环境因素及对病原的感染程度等而致临诊症状差异。最急性：断奶猪群一头或几头猪只突然发病。体温升高达４１℃～４２℃。并可出现短期腹泻或呕吐。鼻、耳、眼及后躯皮肤常发绀，临死前常从口、鼻流出血性泡沫。有时未见任何症状即突然死亡。急性型：病猪体温升高，达４０．５℃～４１℃，皮肤发红，精神萎顿，喜卧少动，饮食不振。严重的表现１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１为咳嗽、喘气、呼吸困难。亚急性或慢性型：病猪体温常无明显变化，常呈现间隙性咳嗽。疾病暴发初期母猪常出现流产。个别猪只尚可出现关节炎、心内膜炎、中耳炎等。犃．５诊断本病发生突然，传播迅速，伴发高热和严重呼吸困难，死亡率高。死后剖检见肺脏和胸膜有特征性的纤维素性坏死性和出血性肺炎、纤维素性胸膜炎，以此可作出初步诊断。确诊需进行细菌学检查和血清学检查。细菌学检查：从鼻、支气管分泌物和肺部病变部采取病料进行染色好细菌分离培养，发现可疑细菌，作进一步鉴定。血清学检查：有补体结合试验、酶联免疫吸附试验等方法。１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犅（规范性附录）犘犆犚试剂配制犅．１狆犎７．２０．０１犿狅犾／犔犘犅犛的配制０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）的配制：Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ７１．６４ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬ０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）的配制：ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ３１．２１ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬ生理盐水的配制：氯化钠（ＮａＣｌ）８．５ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬｐＨ７．２０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ的配制：０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠７２ｍＬ０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠２８ｍＬ生理盐水１９００ｍＬ０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ，置４℃保存备用。犅．２犜狉犻狊乙酸电泳缓冲液（犜犃犈）的配制５０×ＴＡＥ的配制三（羟甲基）氨基甲烷（Ｔｒｉｓ碱）２４２ｇ冰乙酸５７．１ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１００ｍＬ加蒸馏水定容至１０００ｍＬ，混匀４℃保存备用。临用前作５０倍稀释。犅．３１×犜犃犈使用液的配制５０×ＴＡＥ２０ｍＬ加蒸馏水定容至１０００ｍＬ，混匀备用。犅．４１０犿犵／犿犔溴化乙锭（犈犅）的配制ＥＢ１ｇ加蒸馏水定容至１００ｍＬ，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。犅．５１．５％琼脂糖凝胶的配制琼脂糖１．５ｇ１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１加１×ＴＡＥ定容至１００ｍＬ，完全融化后，溶液冷却至６０℃，加１０ｍｇ／ｍＬＥＢ５μＬ（终浓度０．５μｇ／ｍＬ），轻轻混匀后，倒板。犅．６６×加样缓冲液的配制溴酚蓝０．２５ｇ蔗糖４０ｇ加蒸馏水至１００ｍＬ。置４℃保存备用。犅．７１０×犘犆犚反应缓冲液（１０×犫狌犳犳犲狉）ＴｒｉｓＨＣｌ１００ｍｍｏｌ／ＬｐＨ９．０氯化钾（ＫＣｌ）１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸氨（ＮＨ）２ＳＯ４８０ｍｍｏｌ／Ｌ乙基苯基聚乙二醇（ＮＰ４０）０．８％。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犆（规范性附录）犃犘犘的培养犆．１巧克力琼脂的配制取４０ｇＴＳＡ（ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＡｇａｒ）琼脂粉，溶于１０００ｍＬ去离子水中，搅拌加热溶解，煮沸１ｍｉｎ至完全溶解后０．１０３ＭＰａ高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却到４０℃～５０℃，加８％（体积分数）的脱纤绵羊血和０．１５％（质量浓度）的葡萄糖，于８０℃～８２℃水浴１０ｍｉｎ～１２ｍｉｎ，培养基颜色由血红色变为巧克力色，出现细小颗粒。冷却到６０℃左右，加１０％（体积分数）酵母浸液，混匀倒平皿，４℃保存备用。犆．２犃犘犘的培养将纯化后的细菌涂布接种于巧克力琼脂平板上，在５％二氧化碳条件下，３７℃培养２４ｈ后用灭菌三蒸水洗下平板上的细菌菌落，离心后收集菌体用于ＤＮＡ提取。犆．３营养琼脂的配制蛋白胨１０ｇ牛肉膏３ｇ氯化钠５ｇ琼脂１４ｇ蒸馏水１０００ｍＬ煮沸溶解后，０．１０３ＭＰａ高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却到约５０℃，倾注无菌平皿。犆．４血琼脂的配制营养琼脂１００ｍＬ脱纤维羊血８ｍＬ营养琼脂煮沸溶解后，０．１０３ＭＰａ高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却到约５０℃，以无菌方式加入脱纤维羊血，摇匀，倾注无菌平皿。犆．５类胸膜肺炎微生物（犘犘犔犗）琼脂的配制取３５ｇＰＰＬＯ琼脂粉，溶于７００ｍＬ去离子水中，搅拌加热溶解，煮沸１ｍｉｎ至完全溶解后０．１０３ＭＰａ高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却到５０℃～６０℃，加０．１５％（质量浓度）的葡萄糖，５％（体积分数）的马血清，１０％（体积分数）的酵母浸液，至１０００ｍＬ，混匀倒平皿，４℃保存备用。１４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犇（规范性附录）犇犖犃的提取犇．１犇犖犃提取液的配制犇．１．１狆犎７．６犜犈（犜狉犻狊犈犇犜犃）缓冲液的配制犇．１．１．１１犿狅犾／犔犜狉犻狊·犆犾（狆犎７．６）Ｔｒｉｓ碱１２１．１ｇ蒸馏水８００ｍＬ加浓盐酸６０ｍＬ，溶液冷至室温后调ｐＨ７．６，加蒸馏水定容至１０００ｍＬ。犇．１．１．２０．５犿狅犾／犔狆犎８．０乙二胺四乙酸二钠（犈犇犜犃二钠）ＥＤＴＡ二钠１８６．１ｇ蒸馏水８００ｍＬ磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节ｐＨ至８．０（约２０ｇ氢氧化钠颗粒），加蒸馏水定容至１０００ｍＬ。０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ备用。犇．１．１．３狆犎７．６１０×犜犈缓冲液的配制１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·Ｃｌ（ｐＨ７．６）１０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ二钠（ｐＨ８．０）２ｍＬ加蒸馏水至１００ｍＬ０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ备用。犇．１．１．４狆犎７．６１×犜犈缓冲液的配制１０×ＴＥ缓冲液（ｐＨ７．６）１０ｍＬ加蒸馏水９０ｍＬ０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ，４℃保存备用。犇．１．２１０％十二烷基硫酸钠（犛犇犛）的配制ＳＤＳ１０ｇ加蒸馏水９０ｍＬ６８℃加热助溶，用浓盐酸调ｐＨ至７．２，蒸馏水定容至１００ｍＬ。犇．１．３１０犿犵／犿犔蛋白酶犓的配制蛋白酶Ｋ１００ｍｇ加蒸馏水１０ｍＬ溶解分装后，－２０℃保存备用。犇．１．４５犿狅犾／犔氯化钠（犖犪犆犾）的配制ＮａＣｌ２９．２ｇ１５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１加蒸馏水８０ｍＬ加热，搅拌溶解后定容至１００ｍＬ，０．１０３ＭＰａ灭菌１５ｍｉｎ备用。犇．１．５犆犜犃犅／犖犪犆犾的配制ＮａＣｌ４．１ｇＣＴＡＢ１０ｇ用蒸馏水８０ｍＬ溶解ＮａＣｌ，缓慢加入ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵），同时加热并搅拌，溶解后定容至１００ｍＬ。犇．２犇犖犃的提取取少许菌体于１．５ｍＬ的离心管中，加入５７６μＬｐＨ７．６ＴＥ缓冲液悬浮菌体。加ＳＤＳ（１０％）３０μＬ和蛋白酶Ｋ（１０ｍｇ／ｍＬ）６μＬ，混匀，３７℃水浴温育１ｈ。加入１００μＬ５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，充分混匀，再加入８０μＬＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液，混匀，于６５℃水浴温育１０ｍｉｎ。加入等体积的三氯甲烷／异戊醇（２４∶１），混匀，离心１３０００犵１０ｍｉｎ，小心将上清液转入一个新管中。加入０．６倍体积异丙醇，轻轻混合直到ＤＮＡ沉淀下来（冰上放置３０ｍｉｎ以上沉淀ＤＮＡ），１００００犵离心１０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀为ＤＮＡ。用１ｍＬ的７０％冷乙醇（４℃预冷）洗涤沉淀，共三次。沉淀干燥后，重溶于１００μＬ的灭菌三蒸水中，作为ＰＣＲ对照。１６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犈（规范性附录）巴比妥缓冲液（犞犅犇）的配制犈．１５倍储藏缓冲液的配制将下列试剂按次序加入２０００ｍＬ体积的容器中：氯化钠８３ｇ蒸馏水５００ｍＬ巴比妥钠１０．１９ｇ１ｍｏｌ／Ｌ盐酸２０ｍＬ～３０ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ氯化镁溶液５ｍＬ０．３ｍｏｌ／Ｌ氯化钙溶液５ｍＬ蒸馏水加到刻度处，充分混匀，取样，用蒸馏水作１∶５稀释，检查ｐＨ值应为７．３～７．４，然后置低温冻存。犈．２明胶水溶液的配制将１．０ｇ明胶加入１００ｍＬ蒸馏水中，煮沸溶解。用蒸馏水稀释到８００ｍＬ，４℃冰箱内保存，１周内使用。犈．３犞犅犇液的配制将１份体积的５倍储藏缓冲液加到４份体积明胶水溶液中，摇匀置４℃冰箱保存，供当日使用。ＶＢＤ的ｐＨ值应为７．３～７．４。１７ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犉（规范性附录）致敏红细胞制备犉．１阿氏液配制柠檬酸钠（Ｎａ３Ｃ６Ｈ６Ｏ７·５Ｈ２Ｏ）８．００ｇ葡萄糖１８．８６ｇ氯化钠４．１８ｇ柠檬酸０．５５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ将上述成分混匀溶化，１２１℃１５ｍｉｎ灭菌备用。犉．２红细胞悬液采成年公绵羊血液，于阿氏液中稳定３ｄ～５ｄ后使用。使用前用ＶＢＤ液（见附录）洗３次～４次，最后一次以６００犵离心１０ｍｉｎ，去上清液，取下层红细胞泥，用ＶＢＤ液配２．８％的标准红细胞悬液。犉．３敏化红细胞于试验前取标准红细胞悬液加等量的１单位溶血素混合，３７℃水浴１５ｍｉｎ即成。１８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１附录犌（规范性附录）标准溶血管的制备犌．１血红蛋白溶液的制备取１．０ｍＬ２．８％标准羊红细胞悬液，加入装有７．０ｍＬ蒸馏水的试管中，充分振荡，使红细胞全部裂解，再加入２．０ｍＬＶＢＤ储藏液，充分混合。犌．２０．２８％标准羊红细胞悬液的制备将２．８％羊红细胞悬液作１∶１０稀释。犌．３标准溶血管配制标准溶血管按表Ｇ．１配制。表犌．１标准溶血管配制溶血度０１０２０３０４０５０６０７０８０９０１００血红蛋白溶液００．１０．２０．３０．４０．５０．６０．７０．８０．９１．００．２８％红细胞悬液１．００．９０．８０．７０．６０．５０．４０．３０．２０．１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１４４７—２０１１１１０—２７附录犎４４（规范性附录）／１犜阻断犈犔犐犛犃试剂配制犖犛犎．１包被液（０．０１犿狅犾／犔狆犎７．２磷酸盐缓冲液，犘犅犛）取２３．８７６ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至１０００ｍＬ配制成１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）。取９．０７４ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至１０００ｍＬ配制成１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）。取８．５ｇ氯化钠溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至１０００ｍＬ配制成生理盐水。取１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）溶液７３ｍＬ、１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）溶液２７ｍＬ、生理盐水５６６ｍＬ混匀后，用１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐调ｐＨ值至７．２即成包被液。犎．２稀释液（犘犅犛＋犜＋犅犛犃）每１００ｍＬ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２ＰＢＳ溶液中加牛血清白蛋白（ＢＳＡ）０．２ｇ～１ｇ，加５０μＬ吐温２０（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０），即成ＰＢＳ＋Ｔ＋ＢＳＡ稀释液。犎．３洗液（犘犅犛＋犜）每１００ｍＬ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２ＰＢＳ溶液中加５０μＬ吐温２０，即成ＰＢＳ＋Ｔ洗液。犎．４酶底物溶液的配制取２１ｇ柠檬酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ）加蒸馏水溶解并定容至１０００ｍＬ配制成０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸。取７１．６ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）加蒸馏水溶解并定容至１０００ｍＬ配制成０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠。取０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸２４．３ｍＬ、０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠２５．７ｍＬ，两液混合后加入２０ｍｇ邻苯二胺，充分溶解，临用前加２０μＬ３０％Ｈ２Ｏ２，即成酶底物溶液。犎．５终止液（２犿狅犾／犔犎２犛犗４）取分析纯硫酸（Ｈ２ＳＯ４）２２．２ｍＬ（含量９５％～９８％）缓慢加入到１７７．８ｍＬ蒸馏水中，混匀即成２ｍｏｌ／Ｌ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液。书号：１５５０６６·２２２６１１定价：２４．００元'