snt1151.2-2011 对虾白斑病检疫技术规范

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５１．２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２，ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４对虾白斑病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狑犺犻狋犲狊狆狅狋犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１前言ＳＮ／Ｔ１１５１系列标准共分为六部分：———虾桃拉综合征检疫技术规范———对虾白斑病检疫技术规范———斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）诊断方法———虾黄头病检疫技术规范———对虾杆状病毒（ＢＰ）检验方法———对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程本部分为ＳＮ／Ｔ１１５１的第２部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２《对虾白斑病毒（ＷＳＶ）聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检测方法》和ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４《对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２和ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４相比，主要技术变化如下：增加了临床症状和综合判定方法。本部分主要参考世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）中２．２．５章。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国水产科学研究院黄海水产研究所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：何俊强、刘荭、黄倢、杨冰、雷质文、岳志芹、高隆英、江育林、史秀杰。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１对虾白斑病检疫技术规范１范围ＳＮ／Ｔ１１５１的本部分规定了对虾白斑病的ＰＣＲ、斑点杂交和原位杂交等检测方法。本部分适用于对虾白斑病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３缩略语下列缩略语适用于本文件ＷＳＤ（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅ）：对虾白斑病ＷＳＶ（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｖｉｒｕｓ）：对虾白斑病毒ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）：氮蓝四唑ＢＣＩＰ（５ｂｒｏｍｏ４ｃｈｌｏｒｏ３ｉｎｄｏｙｌ）：５溴４氯３吲哚磷酸甲苯胺盐ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）：二甲基甲酰胺４概述ＷＳＤ是由ＷＳＶ引起的一种对虾传染性疾病，是全世界养殖对虾中危害最为严重的对虾病毒病，已被列入世界动物卫生组织（ＯＩＥ）水生动物疫病名录，同时被我国列入一类动物疫病名录。病毒粒子从杆状到椭圆状，带有三层囊膜，粒子较大（８０ｎｍ～１２０ｎｍ×２５０ｎｍ～３８０ｎｍ）。基因组大小为２９０ｋｂ。感染细胞肥大的核内能产生ＷＳＶ特征性的包涵体。５试剂材料及仪器设备本标准所用试剂如无特殊说明均为分析纯试剂。试验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２一级水的要求。５．１犜犪狇酶：－２０℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。５．２ｄＮＴＰ：ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏＬ／Ｌ。５．３引物：两对引物浓度为４０μｍｏＬ／Ｌ，其序列分别为：１４６Ｆ１：５’ＡＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＡＧ３’１４６Ｒ１：５’ＴＡＡＴＧＣＧＧＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡ３’１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１１４６Ｆ２：５’ＧＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡ３’１４６Ｒ２：５’ＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧＴ３’５．４乙醇：预冷的无水乙醇于－２０℃保存，不需预冷的无水乙醇于常温保存。５．５ＤＩＧ标记的核酸探针：按照国家发明专利ＺＬ１１１３３６．４和实用新型专利ＺＬ２１５０６８．９（专利权人为中国水产科学研究院黄海水产研究所）所提供的技术制备。５．６ＳＥＭＰｔｒｉｓ研磨液：按照国家发明专利ＺＬ１１１３３６．４和实用新型专利ＺＬ２１５０６８．９（专利权人为中国水产科学研究院黄海水产研究所）所提供的技术制备。５．７其他试剂：碱性磷酸酶标记的ＤＩＧ抗体（０．７５Ｕ／μＬ）、ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、ＤＭＦ、二甲苯、中性树胶。５．８ＰＣＲ扩增仪。５．９电泳仪。５．１０凝胶成像仪。５．１１程控石蜡切片机或常规手工切片：可切５μｍ～７μｍ厚的石蜡组织切片。５．１２水浴锅：４０℃～５０℃。５．１３烘片机：６０℃～１００℃。５．１４显微镜。５．１５恒温培养箱：８０℃±１℃。５．１６冷冻台式离心机：最高转速可达１２０００ｒ／ｍｉｎ以上。５．１７塑料封口机。５．１８微量移液器：量程０．５μＬ～１０００μＬ。５．１９电子天平：感量０．００１ｇ。５．２０水浴锅和电炉。５．２１普通冰箱（８℃～－２０℃）和低温冰箱（－２０℃～－４０℃）。６采样受精卵、３ｃｍ以下幼虾、仔虾、幼体采集整条对虾作为样品，成虾采集上皮、肝胰腺、肠或鳃作为样品。并根据ＧＢ／Ｔ１８０８８规定的数量取样，匀浆后取样品２５ｍｇ～１００ｍｇ置于１．５ｍＬ离心管中。７犠犛犇的诊断７．１犘犆犚检测７．１．１犇犖犃抽提除ＣＴＡＢ提取方法外，也可使用达到同等效果的商业提取试剂盒。先加入１５０μＬＣＴＡＢ溶液（见Ａ．１），用眼科剪剪碎后，用搅拌器将样品匀浆成糊状。加ＣＴＡＢ至９００μＬ。摇匀后，２５℃作用２ｈ。加６００μＬ抽提液１（见Ａ．２），用力混合３０ｓ，１４０００犵离心５ｍｉｎ，取上层水相。加６００μＬ抽提液２（见Ａ．３），用力混合３０ｓ，１４０００犵离心５ｍｉｎ，取上层水相。加不少于１．５倍体积的预冷无水乙醇，混匀后置于－２０℃５ｈ以上，以沉淀核酸。１４０００犵离心３０ｍｉｎ，小心弃上清，立即用滤纸充分吸干，３７℃干燥约２０ｍｉｎ，加１１μＬ水溶解后，作为ＰＣＲ模板。２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１７．１．２套式犘犆犚７．１．２．１第一次犘犆犚ＰＣＲ反应总体积１００μＬ，１０倍浓缩缓冲液（见Ａ．４）１０μＬ，氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１０μＬ，ｄＮＴＰ２μＬ，犜犪狇酶（５Ｕ）１μＬ，引物１４６Ｆ１和１４６Ｒ１各２．５μＬ，６２μＬ灭菌双蒸水，然后加入１０μＬ待测样品ＤＮＡ作为模板。设立阳性对照和阴性对照，以水为模板作为空白对照。阳性对照为已知受ＷＳＶ感染且ＰＣＲ检测为阳性的对虾组织样品研磨上清液，提取核酸后取１０μＬ作为阳性对照模板。阴性对照为已知未受ＷＳＶ感染且ＰＣＲ检测为阴性的对虾组织样品研磨上清液，提取核酸后取１０μＬ作为阴性对照模板。将以上反应混合液混匀后稍离心，按以下反应程序进行扩增：９４℃４ｍｉｎ，１个循环；然后９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，３０个循环；再７２℃１０ｍｉｎ；最后４℃保温。７．１．２．２第二次犘犆犚第一次ＰＣＲ后，如结果为阳性，根据阳性的强弱作１０～１０００稀释，如结果为阴性，则不稀释，取１０μＬ作为第二次ＰＣＲ反应的模板。同时设立阳性对照和、阴性对照和空白对照。按７．１．２．１加入各反应组分及引物１４６Ｆ２和１４６Ｒ２各２．５μＬ，进行第二次ＰＣＲ。７．１．３琼脂糖电泳将６μＬ样品和２μＬ电泳样品缓冲液（见Ａ．７）混匀后加入凝胶孔中。５Ｖ／ｃｍ电泳约３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。７．１．４结果判定第一次ＰＣＲ后，阳性对照会出现一条１４４７ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该核酸带。第二次ＰＣＲ后，阳性对照会出现一条９４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品第一次ＰＣＲ扩增后能出现１４４７ｂｐ的目的带，或经第二次ＰＣＲ后在９４１ｂｐ的位置上出现目的带。取ＰＣＲ扩增产物测序，同参考序列（参见附录Ｂ）进行比较，序列相似性在９８％以上的判为阳性，二次ＰＣＲ均无目的带或测序不对者的均判为阴性。７．２核酸探针斑点杂交技术检测犠犛犞７．２．１在样品中加入０．３ｍＬＳＥＭＰｔｒｉｓ研磨液，用研磨棒将样品充分研磨，１４０００犵离心２ｍｉｎ，取上清液备用。每次实验设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为已知受ＷＳＶ感染且核酸探针斑点杂交检测为阳性的对虾样品组织研磨上清液，阴性对照为已知未受ＷＳＶ感染且核酸探针斑点杂交检测为阴性的对虾样品组织研磨上清液。７．２．２按样品数量以及阳性对照、阴性对照数量，隔着衬纸在硝酸纤维素膜上用软铅笔划格，每样为５ｍｍ×５ｍｍ小格，沿框线将所需大小的硝酸纤维素膜剪下，一式两张。左上角剪角的一张为测试膜，左上角用软铅笔点标记的为对照膜。７．２．３将测试膜和对照膜飘浮于双蒸水表面，将其吸水后沉入水中１０ｍｉｎ，然后浸泡于２０×ＳＳＣ（见Ａ．８）中５ｍｉｎ，取出膜置于滤纸上晾干。７．２．４将７．２．１中的样品上清液（包括阴性对照和阳性对照）在１００℃水浴中煮沸１０ｍｉｎ，迅速置于冰水浴中２ｍｉｎ以上直到点样。稍离心，在晾干的测试膜和对照膜相应方格内点样，每个样品１μＬ，自然晾干后，将膜夹于两张滤纸中间，置于８０℃烘箱中烘烤２ｈ。７．２．５将测试膜和对照膜分别置于两个杂交袋中，加入预杂交液（见Ａ．１７），封口，在６５℃水浴中孵育２ｈ。３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１７．２．６将探针于１００℃水浴中煮沸１０ｍｉｎ，再迅速置于冰浴中２ｍｉｎ，剪开测试膜和对照膜杂交袋一角，加入探针（２０ｎｇ探针／ｍＬ预杂交液），封口。混匀袋中液体，６５℃水浴中孵育６ｈ～１６ｈ。７．２．７完全剪开杂交袋，取出测试膜和对照膜，室温下在平皿中用２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（见Ａ．１９）洗涤测试膜和对照膜两次，每次５ｍｉｎ，间歇摇晃。７．２．８取出测试膜和对照膜，分别置于两只新的杂交袋中，加入０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ，６５℃水浴１５ｍｉｎ，然后换杂交袋，再加入０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ，在６５℃水浴１５ｍｉｎ。７．２．９取出杂交袋中的测试膜和对照膜，室温下，在平皿中用１×缓冲液Ⅰ（见Ａ．１４）洗涤测试膜和对照膜两次，每次２ｍｉｎ，间歇摇晃。７．２．１０将测试膜和对照膜分别装于两只新的杂交袋中，加入缓冲液Ⅱ（见Ａ．１８），室温放置３０ｍｉｎ。７．２．１１剪开两个杂交袋一角，分别加入杂交袋内缓冲液Ⅱ１∶５０００体积的碱性磷酸酶标记的ＤＩＧ抗体（０．２μＬ／ｍＬ），封口，在振荡器上室温振荡３０ｍｉｎ。７．２．１２完全剪开两个杂交袋，取出测试膜和对照膜，在平皿中用１×缓冲液Ⅰ洗涤２次，每次１５ｍｉｎ。取出测试膜和对照膜，在平皿中用１×缓冲液Ⅲ（见Ａ．１６）洗涤２ｍｉｎ间歇摇晃。２），封７．２．１３将测试膜和对照膜分别装于两只新的杂交袋中，加入显色液Ⅰ（见Ａ．２３）（０．２ｍＬ／ｃｍ口，置于暗处显色１５ｍｉｎ～２ｈ。可短时间取出观察，勿搅动。７．２．１４在测试膜上阳性对照样品明显出现颜色，且测试膜和对照膜变色时，立即剪开杂交袋，取出膜，置于蒸馏水中１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，终止显色。将膜置于滤纸上晾干。７．２．１５对光观察，记录结果。７．２．１６结果判定：检测结果的判定要将测试膜与对照膜对照进行。测试膜上阳性对照样品的显色应为淡蓝褐色，阴性对照样品应为无色。参照膜上阳性对照和阴性对照均无色或膜上出现黄色、红色等颜色都不是病毒导致的非特异性显色结果。测试膜上斑点显蓝褐色，而对照膜对应斑点不显色或颜色比测试膜上浅得多时，该样品判断为阳性，该结果提示活虾和敏感宿主已被ＷＳＳＶ感染，或对虾产品及其他产品曾被ＷＳＳＶ感染；测试膜斑点不显色，该样品判断为阴性；测试膜与对照膜均有明显的颜色，则该样品存在明显的非特异性反应干扰，测试结果无法判断。结果可疑时，可补充组织病理学诊断或ＰＣＲ技术诊断或原位杂交技术诊断。７．３核酸探针原位杂交检测犠犛犞７．３．１组织切片制备：将活的对虾个体（适用于仔虾、幼体或受精卵）置于Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓＡＦＡ固定液中固定；对于活幼虾或成虾，则用洁净锋利的刀片将其头胸部切为两半，将其中一半置于Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓＡＦＡ固定液中固定，２４ｈ后置于７０％乙醇中。再将样品置于组织脱水机中进行脱水、透明、浸蜡，完毕后取出在组织包埋机上进行包埋（也可使用手工脱水和包埋步骤）。用石蜡切片机进行切片，厚度５μｍ，用毛笔将切片移入展片机内展片，用经５００μｇ／ｍＬ多聚赖氨酸包被的载玻片捞起，置于烘片机４２℃烘烤３０ｍｉｎ。每次实验设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为受ＷＳＶ感染且原位杂交为阳性的对虾样品，阴性对照为未受ＷＳＶ感染且原位杂交为阴性的对虾样品。７．３．２组织切片（包括阳性对照和阴性对照）依次通过二甲苯（３次，５ｍｉｎ／次）、无水乙醇（２次，１ｍｉｎ／次）、９５％乙醇（２次，１ｍｉｎ／次）、８５％乙醇（２次，约１ｍｉｎ／次）、５０％乙醇（约１ｍｉｎ）、蒸馏水冲洗６次（勿让切片干燥）。７．３．３组织切片平放在湿盒中，吸５００μＬ蛋白酶Ｋ工作液（见Ａ．２７）于每张组织切片上，３７℃下温浴１５ｍｉｎ。７．３．４把组织切片上的蛋白酶Ｋ工作液吸干，然后将其放入０．４％的冷甲醛溶液中室温浸洗５ｍｉｎ。７．３．５室温下，用２×ＳＳＣ（见Ａ．１０）浸洗组织切片５ｍｉｎ。７．３．６将上述组织切片平放在湿盒中，吸５００μＬ杂交缓冲液（见Ａ．２９）于每张组织切片上，４２℃温浴４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１３０ｍｉｎ。７．３．７按每张切片需要２５ｎｇ核酸探针计算，取出总核酸探针需用量，置于一只微量离心管中，在１００℃沸水中煮探针１０ｍｉｎ，尔后置于冰水中猝冷。７．３．８取核酸探针与相应量（每张切片需５００μＬ）的杂交缓冲液充分混合，吸５００μＬ溶有核酸探针的杂交缓冲液，滴加于每张组织切片上，然后将组织切片置于８５℃～９０℃切片烘片机上保温６ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，使组织ＤＮＡ变性。７．３．９将组织切片放在冰上猝冷２ｍｉｎ～５ｍｉｎ。７．３．１０在湿盒内４０℃～４２℃下温浴过夜（１６ｈ～１８ｈ）。７．３．１１吸去组织切片上溶有核酸探针的杂交缓冲液，然后在染色缸中，用缓冲液２×ＳＳＣ（１５ｍｉｎ，室温）、１×ＳＳＣ（见Ａ．１１）（５ｍｉｎ，室温）、０．５×ＳＳＣ（见Ａ．１２）（２次，１５ｍｉｎ／次，４２℃）、缓冲液Ⅰ（５ｍｉｎ，室温）浸洗组织切片。７．３．１２３７℃下用缓冲液Ⅱ封闭组织切片（５００μＬ／片），温浴３０ｍｉｎ。７．３．１３吸去组织切片上的缓冲液Ⅱ，用缓冲液Ⅱ按１∶１０００（１μＬ／ｍＬ）稀释碱性磷酸酶标记的ＤＩＧ抗体（ａｎｔｉＤＩＧＡＰ），把组织切片平放在湿盒中，每片组织切片上加２５０μＬ稀释的ＡｎｔｉＤＩＧＡＰ，３７℃下孵育３０ｍｉｎ。７．３．１４吸去组织切片上的缓冲液Ⅱ，在染色缸中，依次用１×缓冲液Ⅰ（２次，１０ｍｉｎ／次，室温）和１×缓冲液Ⅲ（５ｍｉｎ，室温）浸洗组织切片。７．３．１５每片组织切片上加５００μＬ显色液Ⅱ（见Ａ．３６），室温下黑暗中温浴１ｈ～３ｈ。在显色过程中，可短时间取出组织切片在显微镜下观察，当阳性对照明显显色时可终止反应。７．３．１６吸去组织切片上的显色液Ⅱ，室温下把组织切片置于１×缓冲液Ⅳ（见Ａ．３５）中１５ｍｉｎ，以终止反应。７．３．１７在染色缸中，组织切片依次通过蒸馏水（１ｍｉｎ）、０．５％俾斯麦棕Ｙ（见Ａ．３７）（１ｍｉｎ）、９５％乙醇（３次，１ｍｉｎ／次）、无水乙醇（３次，１ｍｉｎ／次）、二甲苯（４次，１ｍｉｎ／次）。７．３．１８用中性树胶封片。７．３．１９在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色细胞沉淀物并拍照。７．３．２０结果判定：受ＷＳＶ感染的细胞显示阳性反应，即细胞核内有较深的蓝黑色沉淀，而阴性对照的细胞核着色为浅棕色。感染程度越深，则着色越明显。对虾甲壳上的显色是非特异性反应所致。如果加有核酸探针和杂交缓冲液的切片在８５℃～９０℃平板烘片机上保温６ｍｉｎ～１０ｍｉｎ过程中，因缓冲液蒸发而使组织干燥，干燥部分亦会出现非特异性反应。若阳性对照样品不出现蓝黑色到黑色细胞沉淀物，或阳性和阴性对照样品均出现显色反应相当的明显非特异性反应，判断检测结果无效，应重新取样检测。８综合判定８．１有临床症状的样品（参见附录Ｃ），ＰＣＲ检测、斑点杂交和原位杂交等三种方法中的任何一种方法的检测结果为阳性的均可判为阳性。８．２无临床症状的样品，当ＰＣＲ检测为阳性时，还需要进行测序正确后才能判为阳性。５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１附录犃（规范性附录）试剂配制犃．１ＣＴＡＢ溶液（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）：按２％ＣＴＡＢ，１．４ｍｏＬ／Ｌ氯化钠，２０ｍｍｏＬ／ＬＥＤＴＡ，２０ｍｏＬ／ＬＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５配制。用前加巯基乙醇到终浓度为０．２５％。犃．２抽提液１酚／三氯甲烷／异戊醇（用１ｍｏＬ／ＬｐＨ７．９±０．２Ｔｒｉｓ饱和过的重蒸酚∶三氯甲烷∶异戊醇按２５∶２４∶１的比例混合，密闭避光保存）。犃．３抽提液２三氯甲烷／异戊醇（将三氯甲烷和异戊醇按２４∶１的比例混合，密闭避光保存）。犃．４犜犪狇酶用１０倍浓缩缓冲液（１０×ｂｕｆｆｅｒ）ＴｒｉｓＨＣｌ５００ｍｍｏＬ／ＬｐＨ８．８ＫＣｌ５００ｍｍｏＬ／ＬＴｒｉｔｏｎＸ１００１％犃．５ＥＢ（ＥｔｈｉｄｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ，核酸染色剂）用水配制成１０ｍｇ／ｍＬ的浓缩液。用时每１０ｍＬ电泳液或琼脂中加１μＬ。犃．６ＴＢＥ电泳缓冲液（５倍浓缩液）Ｔｒｉｓ５４．０ｇ硼酸２７．５ｇＥＤＴＡ２．９ｇ加双蒸水溶解至１０００．０ｍＬ，用５ｍｏＬ／Ｌ的盐酸调ｐＨ到８．０。犃．７电泳样品缓冲液每１００ｍＬ溶液中含溴酚蓝０．２５ｇ，蔗糖４０ｇ。犃．８２０×ＳＳＣＮａＣｌ１７５．３２ｇ柠檬酸三钠·２Ｈ２Ｏ８８．２３ｇ加双蒸水定容至１０００ｍＬ调节ｐＨ至７．０，高压灭菌后４℃贮存。犃．９５×ＳＳＣ２０×ＳＳＣ２５０ｍＬ双蒸水７５０ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。犃．１０２×ＳＳＣ２０×ＳＳＣ１００ｍＬ双蒸水９００ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。犃．１１１×ＳＳＣ２０×ＳＳＣ５０ｍＬ双蒸水９５０ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１犃．１２０．５×ＳＳＣ２０×ＳＳＣ５０ｍＬ双蒸水１９５０ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。犃．１３１０×缓冲液Ⅰ（１０×ｂｕｆｆｅｒⅠ）Ｔｒｉｓ１２１．１ｇＮａＣｌ８７．７ｇ加双蒸水溶解，定容至１０００ｍＬ用浓盐酸调节ｐＨ至７．５，高压灭菌后４℃贮存。犃．１４１×缓冲液Ⅰ（１×ｂｕｆｆｅｒⅠ）１０×缓冲液Ⅰ１００ｍＬ双蒸水９００ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。犃．１５１０×缓冲液Ⅲ（１０×ｂｕｆｆｅｒⅢ）Ｔｒｉｓ１２１．１ｇＮａＣｌ５８．４ｇ加双蒸水溶解至８００ｍＬＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ１０１．６ｇ用浓盐酸调节ｐＨ至９．５，加双蒸水定容至１０００ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。犃．１６１×缓冲液Ⅲ（１×ｂｕｆｆｅｒⅢ）１０×缓冲液Ⅲ１００ｍＬ双蒸水９００ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃贮存。犃．１７预杂交液ＢｌｏｃｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔⅡ１０ｍｇ５×ＳＳＣ１ｍＬ２０％十二烷基肌氨酸钠（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）１５μＬ１０％ＳＤＳ２μＬ在６０℃～８０℃水浴中间歇晃动５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，完全溶解。犃．１８缓冲液Ⅱ（１×ｂｕｆｆｅｒⅡ）ＢｌｏｃｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔⅡ１０ｍｇ缓冲液Ⅰ１ｍＬ在６０℃～８０℃水浴中间歇晃动５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，完全溶解。犃．１９２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ２０×ＳＳＣ１０ｍＬ１０％ＳＤＳ１ｍＬ加双蒸水定容至１００ｍＬ犃．２００．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ２０×ＳＳＣ０．５ｍＬ１０％ＳＤＳ１ｍＬ加双蒸水定容至１００ｍＬ７ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１犃．２１ＮＢＴ试剂四氮唑蓝（ＮＢＴ）１００ｍｇ二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）０．９３１ｍＬ双蒸水０．４０２ｍＬ－２０℃贮存。犃．２２ＢＣＩＰ试剂５溴４氯３吲哚磷酸甲苯胺盐（ＢＣＩＰ）１００ｍｇ二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）２ｍＬ－２０℃贮存。犃．２３显色液Ⅰ缓冲溶液Ⅲ（ＢｕｆｆｅｒⅢ）９０ｍＬＮＢＴ４．５μＬＢＣＩＰ３．５μＬ４℃保存。犃．２４１０×ＴＮＥ三羟甲基氨基甲烷（ＴｒｉｓＢａｓｅ）６０．５７ｇ氯化钠（ＮａＣｌ）５．８４ｇ乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）３．７２ｇ双蒸水９００ｍＬ用５ｍｏＬ／Ｌ盐酸调ｐＨ至７．４。定容至１０００ｍＬ。高压灭菌，４℃保存。犃．２５１×ＴＮＥ１０×ＴＮＥ１００ｍＬ双蒸水９００ｍＬ用前以０．４５μｍ的滤器过滤。犃．２６蛋白酶Ｋ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）原液（１０ｍｇ／ｍＬ）蛋白酶Ｋ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）１００ｍｇ双蒸水１０ｍＬ分装于无菌离心管中（０．２５ｍＬ／管），－２０℃下保存。犃．２７蛋白酶Ｋ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）工作液（１００μｇ／ｍＬ）蛋白酶Ｋ原液０．１ｍＬ１×ＴＮＥ１０ｍＬ分装于无菌离心管中，４℃保存。犃．２８０．４％甲醛（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）３７％甲醛（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）５．４ｍＬ双蒸水５００ｍＬ４℃保存，倒掉前可重复使用５次。犃．２９杂交缓冲溶液（ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ）（终体积５０ｍＬ）２０×ＳＳＣ１０ｍＬ１００％甲酰胺（Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）２５ｍＬ２０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ２．５ｍＬ１０ｍｇ／ｍＬ鲑鱼精ＤＮＡ溶液２．５ｍＬ２５％硫酸葡聚糖（Ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ）１０ｍＬ４℃保存。８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１犃．３０２０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ试剂牛血清白蛋白（组分５）０．４ｇ菲可４００（Ｆｉｃｏｌｌ４００）０．４ｇ聚乙烯吡咯烷酮３６０（ＰＶＰ３６０）０．４ｇ双蒸水１００ｍＬ０．４５μｍ的滤器过滤，４℃保存。犃．３１２５％硫酸葡聚糖（Ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ）硫酸葡聚糖（Ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ）２５ｇ双蒸水定容至１００ｍＬ低热搅拌片刻，使之溶解，－２０℃保存。犃．３２鲑鱼精ＤＮＡ（ｓａｌｎｏｎｓｐｅｒｍＤＮＡ）溶液，１０ｍｇ／ｍＬ鲑鱼精ＤＮＡ（ｓａｌｎｏｎｓｐｅｒｍＤＮＡ）２５０ｍｇ双蒸水２５ｍＬ将ＤＮＡ慢慢加入水中，加热并搅拌，直至完全溶解。高压灭菌。分装于无菌离心管中，－２０℃保存。犃．３３１０％聚乙烯醇（ＰｏｌｙｖｉｎｙｌＡｌｃｏｈｏｌ）ＰＶＡ（３００００～７００００ＭＷ）１０ｇ双蒸水１００ｍＬ搅拌使之溶解，如有必要需加热。分装于无菌离心管，１０ｍＬ／管。－２０℃保存。犃．３４１０×缓冲液Ⅳ（１０×ｂｕｆｆｅｒⅣ）ＴｒｉｓＢａｓｅ１２．１ｇＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ３．７ｇ加双蒸水定容至１０００ｍＬ，用盐酸调ｐＨ至８．０，高压灭菌。４℃保存。犃．３５１×缓冲液Ⅳ（１×ｂｕｆｆｅｒⅣ）１０×缓冲液Ⅳ１００ｍＬ加双蒸水９００ｍＬ０．４５μｍ滤膜过滤除菌，４℃保存。犃．３６显影液Ⅱ（ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｏｌｕｔｉｏｎ）缓冲溶液Ⅲ（ＢｕｆｆｅｒⅢ）９０ｍＬ１０％ＰＶＡ１０ｍＬ左旋咪唑（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）２４ｍｇ４℃保存，用前在每１ｍＬ以上混合液中加入４．５μＬＮＢＴ和３．５μＬＢＣＩＰ。犃．３７０．５％俾斯麦棕Ｙ（ＢｉｓｍａｒｋＢｒｏｗｎＹ）俾斯麦棕Ｙ（ＢｉｓｍａｒｋＢｒｏｗｎＹ）２．５ｇ双蒸水５００ｍＬ把染料溶于水中，过滤，室温保存。９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１附录犅（资料性附录）扩增产物的参考序列１ａｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔａｔｃｔａｇｔａａａａｃａａｇｃｔａａａａｇａｔｔｃｇａｃｇｇａｇ５１ｔｔｇａｃｃｃａｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃｃｔｃａｃｃｔｇｃｇｃｔｔｃｔｃａｃｃｔｃａｔｇｃｔｔ１０１ｔｃｔｔｃｃａｔｇｇａｔｔｃｃｃａｔａｃａａａｇｔｃａｔｃｔｔｔｃａｔｇｇａｃａａｃａｔｃａａａｔｔ１５１ｇｃａｃａｔｇａｃｔｇａｔａｃｔｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｃａａｇａａｃａｔｔｇａａｃｇａｔｔｔｇａｇａ２０１ａａｔｔｃｔｔｇｇｇａａｇａｔａｔｇｇｇｇａｃｇａａｔａｃｇｃｃａｔｇｔｃｃｃａｃａａｇｃａａａａｔ２５１ｔｇｔａａｃｔｇｃｃｃｃｔｔｃｃａｔｃｔｃｃａｃｃａｃａｃｔｔｔｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇａｔａａｃｇａ３０１ｇｃａｔｃｔｇｇｔａｔｃｃｔｃｔｔｔｃｇｃａｔｔｃｇｃｃｃｇｃｃｃａｇａａｇｔｃｔｃｃａｔｇｇａａｇ３５１ａａａｔｔａｇａｇｃｃａｃａｃｃｃｔａｔｃａｇｇｃｃａａｃａａｇｃｔｔａｔｔａｇｔｇａｃａａａｃａｔ４０１ｔａｃｇｔｇａｔｇａａｃａｔｇｔｃｃａａｇａｔｃｇａｔｔｃｔａｇａｇｔａａｃａｇｇａｔｃｔｔｃｃｃｔ４５１ｃｃｔｔａａｇａａｇｇｔｔａｇｃｇａａｔｇｇａｃｔｇａａａｔｇａｇａａｔｇａａｃｔｃｃａａｃｔｔｔａ５０１ａｔｇｇａａｃａｔｔｔｇａａｃｃａｔｃａａｇａｃｔｃｇｃｃｃｔｃｔｃｃａａｃｔｃｔｇｇｃａｔｇａｃａ５５１ａｃｇｇｃａｇｇａｇｔｃａａｃｃｔｃｇａｃｇｔｔａｔｔｇｔｃａａａｃｃａａａｔａａｔｇｃａａｇａａｇ６０１ｔｇｔａｃｔａｇｇａａｔａｔｔｇｇａａｔｇｔｃａｔｃｇｃｃａｇｃａｃｇｔｇｔｇｃａｃｃｇｃｃｇａｃｇ６５１ｃｃａａｇｇｇａａｃｔｇｔｃｇｃｔｔｃａｇｃｃａｔｇｃｃａｇｃｃｇｔｃｔｔｃｃａｇｇｃａａｃｃｇａｔ７０１ｇｇａａａｃｇｇｔａａｃｇａａｔｃｔｇａａｃｔｇａｔｃｃａｇａａｔｇｃｔｃｔｇｃｃａａｇｇａａｃａｇ７５１ａｔａｃａｔｃｃａａａａｇａｇｃａｃａａｔｇａａｃｇｃｔｃａａａｃｔｇｔｃｇｔｇｔｔｔｇｃｔａａｔｇ８０１ｔｔｔｔｇｇａａｃａａｃｔｔａｔｃｇｃｃｇａｔｃｔｔｇｇａａａｇｇｔｔａｔｃｇｔｇａａｃｇａａｃｔｇ８５１ｇｃｃｇｇｃａｃｃａｔｃｇｃｔｇａａｔｃｔｇｔａｃｃａｇａａａｇｃｇｔａｔａｔｇａａａａｃａｃｃａａ９０１ｇｇａａａｔｇａｔｔｇａｔａｇａｃｔａｇｇｃｔｃｔｇａｃｇａｃｃｔｃｔｔｃａａａｔｃｔａａｔａａｔａ９５１ａｔｇｇａｇｇａｇｔａｇａａｔｃａａｔｇｇａｔｔａｔｇａａｇａｔａｇｃｇａａａｃａａｃａｔｃｃａａｃ１００１ａａｔｇｇｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃａｔｃｔｃａｇａａｇｃｃａｔｇａａｇａａｔｇｃｃｇｔｃｔａｔｃａｃａｃ１０５１ａｃｔａａｔｔｔｃｃｇｇｃａａｇｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｇａａａａｔｇｔａｃｃａｔｔｃｇｃｃｔｃａｔ１１０１ｇｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｃｔｃｇｃｃｔｔｔｇａｔｔｔｃｃｔｔｃｔｇｔｃａａａｇｇｇａｇａｔａｃａ１１５１ｔｔｃｇａａｇａａａａｇａａｃｇｃｃｇａａｃａａｇｇｔｇｃａｇｃａｇｃｔｇｃｃｇｔａｔｃｃｔｃｔａｃ１２０１ｃｔａｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｔａａｃａｃｔａｃｔｃｔｔｃｇｔａａｇｃａｔｔｔｇｇｃｔｃｇａｇｔｔｔ１２５１ｔｃｇａａｇｃｃａｔｃｔｃｔａａｇｃａａｇｔａａｃｔｇａｔｇｃｔｇａａｔｔｃａａｇｇａｔａｔｃｃｔｃ１３０１ａａｃｇａｔａｔｃｇａａｃｇｔａａｔａｔｔｔｃｔｔｃｔｇａｃｔａｔａｃｔａａｃｔｇｔｃｃａｃｃａａａ１３５１ｔａｃｔａａｃｃａａａａｔｇｃｃｔｔｔｇｃｔｃｔａｇｃｔａｔｃａａｇａｇａｇａａｔｔｃａｇｃａｇａａ１４０１ｔｔｇｔｔｔｃｃｔｔｃｔｔａａｃｃａｔｔｃｔｔｃｇｔａａｇａａｃａｔｔａｃａｃｃｃｇｃａｔｔａ１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１５１．２—２０１１附录犆（资料性附录）对虾白斑病毒对虾白斑病（Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅ，简称ＷＳＤ）是由白斑病毒（ＷＳＶ）引起的一种对虾传染性疾病，该病的发病特征为死亡率高，死亡快，常见的症状是濒死的虾，先是在表皮处出现圆形的白色颗粒或白斑，有些患病虾群变红或粉红。患病虾出现嗜睡、体色变红或变黄，或者聚集在池塘边，摄食急剧减少，并出现较高的死亡率的临床症状。或用鳃和表皮压片看到肥大的核，或用暗视野观察血淋巴异常凝集，或靶组织的组织切片中看到包涵体，均可判断为可疑。ＷＳＤ是全世界养殖对虾中危害最为严重的对虾病毒病。ＦＡＯ将该病和对虾黄头病以及对虾桃拉综合症一起成为“影响世界对虾养殖的三大病害”。ＯＩＥ１９９７年出版的《水生动物疾病诊断手册》中首次将白斑病列为“其他有重要意义的疾病”之一，由于其严重性和广泛性，在２０００年以及之后出版的《水生动物疾病诊断手册》中将它列为“必需向ＯＩＥ申报的疾病”之一。白斑病的病原是白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）或叫白斑病毒（ＷＳＶ），是一种双链ＤＮＡ病毒，属于线头病毒科，白斑病毒属的唯一代表种。病毒粒子从棒状到椭圆状，有三层的囊膜，粒子较大（８０ｎｍ～１２０ｎｍ×２５０ｎｍ～３８０ｎｍ）。从对虾血淋巴中提纯出病毒粒子，负染后可见一个独特的尾状附着物。基因大小约２９０ｋｂｐ。受感染细胞的肥大的核内产生病毒粒子，产生ＷＳＳＶ特征性包涵体。白斑病的组织病理学变化很独特，在疾病暴发时可用来初步诊断濒死虾。濒死虾呈现出全身由外胚层和中胚层起源的组织坏死，受感染细胞的核肥大，程度不一的嗜碱性核中心包涵体（通过伊红苏木精染色）被迁移到边缘的染色质所包围。开始很象是考德氏（Ｃｏｗｄｒｙ）Ａ型包涵体。取鳃或皮下组织压片，或制备组织切片后快速染色，可见这些包涵体。组织切片中，最适合用来检查的是鳃组织和胃的皮下组织或头胸部。要确诊感染了白斑病需要用ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ或ＤＮＡ原位杂交做更详细的分析。使用这些技术，已经证实了从捕获的幼虾和亲虾或其他携带者中分离到的白斑病毒是相同的或很相近的。通过这些分子生物学技术证实有４０多种对虾和非对虾的甲壳动物，可能还有些水生昆虫幼虫携带者白斑病毒，在感染实验中已经表明它们可将白斑病毒传染给对虾。仅靠组织学方法不能可靠地在对虾或其他甲壳动物携带者中检测到白斑病毒，还需要使用其他较为成熟的方法。 版权所有·禁止翻制、电子发售１１０—２２１５１１／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准对虾白斑病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２３千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５９５定价１８．００元'