snt1316-2011 牛海绵状脑病检疫技术规范

'版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３１６—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３牛海绵状脑病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫狅狏犻狀犲狊狆狅狀犵犻犳狅狉犿犲狀犮犲狆犺犪犾狅狆犪狋犺狔２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛海绵状脑病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１３１６—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张２字数５７千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８８定价３０．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３《牛海绵状脑病病理组织学检查方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３相比，主要的技术性变化如下：———增加了牛海绵状脑病的采样；———增加了蛋白免疫印迹方法；———增加了酶联免疫吸附试验方法（ＥＬＩＳＡ）；———增加了免疫层析试纸条检测方法。本标准参考了国际动物卫生组织（ＯＩＥ）的《诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）《ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ》）中第２．４．６章“牛海绵状脑病的诊断技术”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草。本标准主要起草人：马贵平、李炎鑫、李冰玲、刘全国、史喜菊、刘旭辉。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１牛海绵状脑病检疫技术规范１范围本标准规定了牛海绵状脑病的采样、组织病理学检查方法、免疫组织化学方法、蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法、免疫层析试纸条检测方法等检测方法的技术要求和操作规范。其中组织病理学检查方法为免疫组织化学方法的辅助方法，免疫组织化学方法和ＳＡＦ蛋白免疫印迹诊断为确诊方法，蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法和免疫层析试纸条检测方法为筛选方法。本标准适用于牛海绵状脑病的诊断，也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３临床诊断３．１牛海绵状脑病（ＢＳＥ）平均潜伏期为４年～５年。病牛临床表现为精神异常、运动障碍和感觉障碍。３．２精神异常：主要表现为不安、恐惧、狂暴等，当有人靠近或追逼时往往出现攻击性行为。３．３运动障碍：主要表现为共济失调、颤抖或倒下。病牛步态呈“鹅步”状，四肢伸展过度，后肢运动失调、震颤和跌倒、麻痹、轻瘫；有时倒地难以站立。３．４感觉障碍：最常见的是对触摸、声音和光过度敏感，这是ＢＳＥ病牛很重要的临床诊断特征。用手触摸或用钝器触压牛的颈部肋部，病牛会异常紧张颤抖，用扫帚轻碰后蹄，也会出现紧张的踢腿反应；病牛听到敲击金属器械的声音，会出现震惊和颤抖反应；病牛在黑暗环境中，对突然打开的灯光，出现惊吓和颤抖反应。４实验室诊断４．１采样及样品准备方法４．１．１材料４．１．１．１被检组织待检牛脑。４．１．１．２试剂１０％中性福尔马林溶液（见附录Ａ）；消毒液：２％次氯酸钠，２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠；９８％～９９％甲酸；无水乙醇；９５％乙醇溶液；７０％乙醇溶液；二甲苯；石蜡（熔点为５４℃～５６℃，５６℃～５８℃，５８℃～６０℃）。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．１．１．３仪器设备脱水包埋盒、镊子、吸水纸、ｐＨ计、手术刀、专用取样勺、刀板、剪刀、锯、载玻片（多聚赖氨酸或其他等效物质处理过）、自动脱水浸蜡机、包埋机、冰箱、切片机、展片槽、烘干台、天平、温箱（３７℃）、ｐＨ计、计时器、安全设施、ＢⅡ生物安全柜、通风橱、一次性腈手套、防护服、防护面罩或口罩、防护眼镜、防切割手套、鞋套、尖锐废弃物容纳盒、灭菌锅（１２１℃）、蒸汽灭菌器（温度不低于１３５℃，且蒸汽不外排）。４．１．２方法４．１．２．１牛脑组织的采集４．１．２．１．１疑似患有ＢＳＥ的病牛在必要的情况下可以先注射镇静剂，再用浓缩巴比妥盐溶液静脉注射处死。４．１．２．１．２将头部与躯体从枕骨大孔和第一颈椎之间分离，从断面孔可以看到脑干的尾部。４．１．２．１．３用锯锯开颅骨，取出整个脑组织（包括大脑、小脑和脑干）。４．１．２．１．４如果只取脑闩部位，可以不锯开颅骨，用特制取样勺直接从枕骨大孔处进行取样。具体方法是：将分离的牛头顶部朝下放置，用边缘锋利的特制取样勺从枕骨大孔处的脑和头骨之间的缝隙插入，贴着颅骨左右移动，切断两侧的颅神经，切记紧贴颅骨以避免损坏脑组织，插入大约７ｃｍ，然后向下切割，即将延髓尾部（可能会带有一些小脑的部分）与脑的其他部分分离。将勺子拔出，将分离的脑干从颅腔中滑出。脑闩部位的取材可按图１进行。图１脑闩部位的取材４．１．２．２牛海绵状脑病组织病理学、免疫组织化学诊断样品制备方法４．１．２．２．１修样４．１．２．２．１．１在ＢⅡ生物安全柜进行修样。４．１．２．２．１．２对于有神经症状的病例，取材方法为：在小脑脚处切除小脑，暴露脑干，沿神经轴的横向切下大约３ｃｍ～５ｃｍ长度的组织。采取的解剖学部位包括：脑闩部位延髓、小脑后脚部位延髓、脑桥、中脑包括前丘和红核部位、小脑（矢状切）、丘脑、大脑额叶和大脑枕叶。２标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．１．２．２．１．３对于进行普查的病例，取材方法为：在脑闩部位横向切下延髓的一段。如果所取组织包括小脑，则先去除小脑后，再取脑闩部位。脑干区域取材可按图２进行。建议切取的水平部位：ＡＡ＝延髓脑闩部位ＢＢ＝延髓小脑后脚部位ＣＣ＝中脑前丘部位图２切除小脑的脑干４．１．２．２．１．４将所取样品固定于１０倍体积的１０％的中性福尔马林溶液中。通常情况下（室温１８℃～２５℃），３ｄ后更换固定液。固定１周即可进行修样。４．１．２．２．１．５在刀板上将样品组织修成２ｍｍ～３ｍｍ厚的小块，装入脱水包埋盒中，放入１０％中性福尔马林溶液中固定过夜。４．１．２．２．１．６将装有组织的脱水包埋盒浸入９８％～９９％的甲酸溶液中，振荡１ｈ。４．１．２．２．１．７取出脱水包埋盒，自来水充分冲洗。４．１．２．２．１．８置于１０％中性福尔马林溶液中。４．１．２．２．２组织脱水、浸蜡将装有组织的脱水包埋盒放入自动脱水浸蜡机中，常规脱水浸蜡程序如下：ａ）１０％中性福尔马林溶液３０ｍｉｎ；ｂ）７０％乙醇７５ｍｉｎ；ｃ）９５％乙醇７５ｍｉｎ；ｄ）９５％乙醇７５ｍｉｎ；ｅ）１００％乙醇７５ｍｉｎ；ｆ）１００％乙醇７５ｍｉｎ；ｇ）１００％乙醇７５ｍｉｎ；ｈ）二甲苯３０ｍｉｎ；ｉ）二甲苯４５ｍｉｎ；ｊ）二甲苯４５ｍｉｎ；ｋ）石蜡（熔点５８℃～６０℃）７５ｍｉｎ；ｌ）石蜡（熔点５８℃～６０℃）１ｈ；ｍ）石蜡（熔点５８℃～６０℃）１ｈ。４．１．２．２．３包埋（使用包埋机或手工包埋，包埋石蜡熔点５８℃～６０℃）浸蜡后，使用包埋机进行常规石蜡包埋，包埋后的模具置于冷台上，至石蜡完全冷却。将模具与冷却的石蜡块分开。将制备好的组织石蜡包埋块放到４℃冰箱中待用。４．１．２．２．４切片、展片４．１．２．２．４．１切片：将制备好的脑组织石蜡包埋块固定到切片机上，调整切片厚度为５μｍ，匀速转动３标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１切片机手柄切片。４．１．２．２．４．２展片：将展片槽中的水加热到３７℃～４５℃，把石蜡包埋组织切片轻轻的移入展片槽中。４．１．２．２．４．３烘干：用处理好的载玻片将组织捞出，使之粘附于玻片的适当位置。将粘贴有石蜡包埋组织的载玻片放到烘干台（５０℃）上，烘干３０ｍｉｎ后置于３７℃温箱中过夜干燥。干燥后的组织切片在室温下保存，待检。４．１．２．２．５去除污染４．１．２．２．５．１将所有污染的平面喷洒２％次氯酸钠，放置１ｈ后用吸水纸拭干后，用水充分冲（擦）洗。４．１．２．２．５．２将所用器械浸泡于２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液中２ｈ后充分冲洗。４．１．２．２．５．３将用过的吸水纸放入生物危险垃圾袋中，在安全柜中进行蒸发后，１３５℃高压３０ｍｉｎ。４．１．２．２．５．４剩余的样品重新放回福尔马林容器中，容器置于通风橱中至做出诊断。４．１．２．３蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法（犈犔犐犛犃）、试纸条检测方法准备方法４．１．２．３．１样品编号。４．１．２．３．２所有的样品通过完成检测记录能够追踪到。４．１．２．３．３在ＢⅡ生物安全柜中切割组织。４．１．２．３．４在ＢⅡ生物安全柜或安全罩内从延髓的脑闩部位切取一块组织，把脑闩切块放入天平上事先称量的匀浆管中，组织块应在０．４５ｇ～０．７０ｇ之间（最好是０．５ｇ～０．５５ｇ）。４．１．２．３．５在切板上修整组织块，用纸巾吸取多余的血液。用２％的漂白粉消毒切板和纸巾１ｈ，冲洗。把器械放入２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠浸泡２ｈ，冲洗。在生物安全柜中将纸巾放入开口的生物危害袋中，１３５℃，高压消毒３０ｍｉｎ。４．１．２．３．６在放入组织块的匀浆管中加入１０倍体积的１×匀浆缓冲液（质量浓度），盖上盖子。１）或ＭｅｄｉＦＡＳＴＨ１）匀浆机自动匀浆４５ｓ。４．１．２．３．７用ＦＡＳＴＨ４．１．２．３．８每份样品吸取９００μＬ～１０００μＬ匀浆组织液到９６孔１．２ｍＬ的样品主板里。主板可在４℃保存或在－２０℃或－７０℃长期保存（１２个月）。所有步骤在室温条件下进行，主板和消化板每板有４８份样品。４．２组织病理学诊断４．２．１材料４．２．１．１被检组织４．２．１．１．１待检牛脑组织切片。４．２．１．１．２对照组织切片（用于苏木素伊红染色质控）。４．２．１．２试剂４．２．１．２．１二甲苯。４．２．１．２．２无水乙醇、９５％乙醇溶液、７０％乙醇溶液。４．２．１．２．３苏木素染色液（Ｇｉｌｌ’ｓ）（见Ａ．１）。４．２．１．２．４饱和碳酸锂溶液。４．２．１．２．５伊红染色液（见Ａ．２）。１）ＦＡＳＴＨ是由瑞士Ｐｒｉｏｎｉｃｓ公司提供的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。４标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．２．１．２．６二级水（见ＧＢ／Ｔ６６８２）。４．２．１．２．７中性树胶。４．２．１．３仪器设备４．２．１．３．１自动染色机。４．２．１．３．２封片机。４．２．１．３．３光学显微镜。４．２．１．３．４盖玻片。４．２．１．３．５染色架。４．２．１．３．６温箱或恒温孵育器（５８℃～６０℃）。４．２．１．３．７移液器及适配吸头。４．２．１．３．８磁力搅拌器。４．２．２方法４．２．２．１熔蜡将待染切片置于５８℃～６０℃的温箱中至少１ｈ进行熔蜡。４．２．２．２苏木素伊红（犎．犈）染色将待检牛脑组织切片和对照组织切片置于染色架上，放入自动染色机，也可以手动染色。染色程序如下：ａ）二甲苯３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｂ）二甲苯３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｃ）１００％乙醇３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｄ）１００％乙醇３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｅ）９５％乙醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｆ）９５％乙醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｇ）７０％乙醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｈ）自来水洗１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｉ）苏木素１０ｓ（根据染色液状况调整）；ｊ）自来水洗４ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｋ）饱和碳酸锂１ｍｉｎ～２ｍｉｎ；ｌ）自来水洗４ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｍ）７０％乙醇１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｎ）伊红１ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｏ）９５％乙醇１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｐ）９５％乙醇１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｑ）１００％乙醇１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｒ）１００％乙醇１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｓ）二甲苯１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｔ）二甲苯１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｕ）二甲苯３ｍｉｎ～５ｍｉｎ。５标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．２．２．３封片染色完成后，用中性树胶封片，室温下干燥。可以手工封片，也可以使用封片机进行封片。４．２．２．４显微镜观察４．２．２．４．１显微镜下观察对照组织切片，正常的染色结果应为：细胞核为蓝色，胞浆ＲＮＡ为蓝色，胞浆为深浅不同的粉色，肌纤维为深粉色，胶原为浅粉色，红细胞为亮粉色。４．２．２．４．２显微镜下观察待检组织切片，观察特征性变化，做出诊断。４．２．２．４．３记录对照切片和待检切片的染色结果。４．２．３结果解释４．２．３．１阳性结果：在特定的解剖学部位（见图３）呈现如下特征性病理变化，包括：灰质神经纤维的空泡化、神经元空泡化、神经元变性和缺失、神经胶质细胞增生、淀粉斑（不常见）、非炎性变化。４．２．３．２阴性结果：在被检牛脑组织切片未呈现４．２．３．１所述的特征性病理变化。４．２．３．３不确定结果：如果样品不是来自推荐取样的解剖学部位或者由于样品自溶严重不能看到是否存在特征性病理变化。１———孤束核；２———三叉神经核；３———迷走背根神经核。图３脑闩部位的横断面（深颜色的区域显示用于牛海绵状脑病组织病理学和免疫组织化学诊断的关键目标区域）注：在特定的解剖学部位未见上述特征性病理变化不能排除待检样品为阳性的可能，应结合免疫组织化学染色结果进行确诊。４．３免疫组织化学诊断方法４．３．１材料４．３．１．１被检组织４．３．１．１．１待检牛脑组织。４．３．１．１．２阴性对照脑组织切片。６标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．３．１．１．３阳性对照脑组织切片。４．３．１．２试剂４．３．１．２．１二甲苯。４．３．１．２．２无水乙醇、９５％乙醇溶液、７０％乙醇溶液。４．３．１．２．３９８％～９９％甲酸。４．３．１．２．４磷酸盐吐温缓冲液（ＰＢＳＴ），（ｐＨ７．４）（见附录Ａ）。４．３．１．２．５抗原修复缓冲液（见附录Ａ）。４．３．１．２．６正常羊血清工作液。４．３．１．２．７抗体稀释缓冲液。４．３．１．２．８３％过氧化氢甲醇溶液。４．３．１．２．９自来水。４．３．１．２．１０二级水（见ＧＢ／Ｔ６６８２）。４．３．１．２．１１苏木素染色液（Ｇｉｌｌ’ｓ）。４．３．１．２．１２抗ＰｒＰ单克隆抗体工作液（按照该抗体使用说明书的要求进行稀释）。４．３．１．２．１３辣根过氧化物酶标记的二抗（或其他商品化检测系统）。４．３．１．２．１４二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色试剂盒。４．３．１．２．１５饱和碳酸锂溶液。４．３．１．２．１６中性树胶。４．３．１．２．１７消毒液：２％次氯酸钠，２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠。４．３．１．３仪器设备４．３．１．３．１全自动免疫组化仪。４．３．１．３．２自动染色机。４．３．１．３．３封片机４．３．１．３．４光学显微镜。４．３．１．３．５盖玻片。４．３．１．３．６温箱或恒温孵育器（３７℃，５８℃～６０℃）。４．３．１．３．７染色架。４．３．１．３．８镊子。４．３．１．３．９天平。４．３．１．３．１０ｐＨ计。４．３．１．３．１１湿盒。４．３．１．３．１２移液器（２５μＬ，１００μＬ，１０００μＬ）和适配枪头。４．３．１．３．１３计时器。４．３．１．３．１４磁力搅拌器。４．３．２方法４．３．２．１熔蜡将待染切片置于５８℃～６０℃的温箱中至少１ｈ进行熔蜡。４．３．２．２脱蜡、脱二甲苯将放有切片的染色架放入自动染色机脱蜡、脱二甲苯，也可手动进行。程序如下：７标准分享网www.bzfxw.com免费下载 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１ａ）二甲苯５ｍｉｎ；ｂ）二甲苯５ｍｉｎ；ｃ）１００％乙醇４ｍｉｎ；ｄ）１００％乙醇４ｍｉｎ；ｅ）９５％乙醇３ｍｉｎ；ｆ）７０％乙醇３ｍｉｎ；ｇ）自来水洗２ｍｉｎ；ｈ）二级水１ｍｉｎ。４．３．２．３过氧化氢甲醇溶液处理将切片从切片机中取出，放入３％过氧化氢甲醇溶液中１０ｍｉｎ。４．３．２．４冲洗二级水冲洗１ｍｉｎ。４．３．２．５甲酸处理放入９８％～９９％甲酸中５ｍｉｎ。４．３．２．６冲洗二级水冲洗２次，每次１ｍｉｎ。４．３．２．７犘犅犛犜浸泡ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４），３ｍｉｎ。４．３．２．８犘犅犛犜浸泡ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４），５ｍｉｎ。４．３．２．９抗原修复液处理将放有切片的染色架置于抗原修复液中，１２１℃高压２５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ（根据使用的一抗来确定高压时间）。４．３．２．１０冷却取出染色架，使玻片冷却至室温后放入ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中，至少５ｍｉｎ。取出玻片，可以放入全自动免疫组化仪中继续以下步骤，也可以手动进行。４．３．２．１１免疫组织化学手动染色４．３．２．１１．１在玻片组织上滴加正常羊血清１００μＬ，室温湿盒中孵育１５ｍｉｎ。４．３．２．１１．２滴加一抗工作液１００μＬ，４℃过夜。４．３．２．１１．３从冰箱中取出玻片室温下放置１５ｍｉｎ。４．３．２．１１．４ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中洗５ｍｉｎ，其间振荡。４．３．２．１１．５滴加辣根过氧化物酶标记的二抗（或其他检测系统）１００μＬ，室温湿盒中孵育３０ｍｉｎ（或根据说明书调整）。４．３．２．１１．６ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）中洗２ｍｉｎ×３次，其间振荡。８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．３．２．１１．７滴加３００μＬＤＡＢ，室温反应１５ｍｉｎ。４．３．２．１１．８二级水洗２ｍｉｎ。４．３．２．１２免疫组织化学自动染色全自动免疫组化仪程序设定如下：ａ）正常羊血清１００μＬ，１５ｍｉｎ；ｂ）吹去羊血清；ｃ）一抗工作液１００μＬ，１ｈ；ｄ）ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）洗３次；ｅ）辣根过氧化物酶标记的二抗（或其他检测系统）１００μＬ，３０ｍｉｎ（或根据说明书调整）；ｆ）ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）洗３次；ｇ）ＤＡＢ３００μＬ，１５ｍｉｎ；ｈ）二级水洗３次；ｉ）从免疫组化仪中取出玻片。４．３．２．１３复染、脱水（可以放入自动染色机中进行，也可以手动进行）４．３．２．１３．１自来水２ｍｉｎ。４．３．２．１３．２苏木素１０ｓ（根据染色液状况调整）。４．３．２．１３．３自来水洗５ｍｉｎ。４．３．２．１３．４饱和碳酸锂１ｍｉｎ。４．３．２．１３．５自来水洗４ｍｉｎ。４．３．２．１３．６７０％乙醇１ｍｉｎ。４．３．２．１３．７９５％乙醇１ｍｉｎ。４．３．２．１３．８９５％乙醇１ｍｉｎ。４．３．２．１３．９１００％乙醇１ｍｉｎ。４．３．２．１３．１０１００％乙醇１ｍｉｎ。４．３．２．１３．１１二甲苯１ｍｉｎ。４．３．２．１３．１２二甲苯１ｍｉｎ。４．３．２．１３．１３二甲苯３ｍｉｎ。４．３．２．１４封片染色完成后，用中性树胶封片，室温下干燥。可以手工封片，也可以使用封片机进行封片。４．３．２．１５显微镜观察显微镜下观察阴性对照、阳性对照组织切片以及待检脑组织切片，记录对照切片和待检切片的染色结果。４．３．３结果判定４．３．３．１诊断标准阴性对照、阳性对照结果成立的情况下，进行阴、阳性结果判定。４．３．３．２阳性结果４．３．３．２．１牛海绵状脑病通常感染的目标区域包括三叉神经核、孤束核和迷走背根神经核，灰质神经９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１纤维的颗粒状染色是该病典型的染色模式。４．３．３．２．２被检牛脑组织切片目标解剖区域的神经元内有细小均匀的或颗粒状的阳性反应物；在神经元的边缘和树突呈现颗粒状阳性染色，沿神经元突起有ＰｒＰＲｅｓ沉积的线型染色，有时在神经元的核周体或空泡周围也会有强阳性的蛋白酶抗性朊蛋白（ＰｒＰＲｅｓ）沉积。小胶质细胞形成多中心的星形或网状结构；血管或室管膜周围出现纤维状的、颗粒状的或微粒状的染色；少数情况下会出现强阳性染色的Ｒｅｓ淀粉样斑。ＰｒＰ４．３．３．３阴性结果被检牛脑组织切片没有呈现特异性的ＰｒＰＲｅｓ阳性染色，显微特征与阴性对照片或无一抗对照片相似。４．４犛犃犉犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋检测方法４．４．１材料４．４．１．１被检组织牛脑组织。４．４．１．２仪器设备４．４．１．２．１解剖刀柄和一次性刀片。４．４．１．２．２切板。４．４．１．２．３上皿天平。４．４．１．２．４匀浆机（ＦＡＳＴＨ或ＭｅｄｉＦＡＳＴ）。４．４．１．２．５均质管（ＰｒｙｐｃｏｎｓＦＡＳＴＨ工作站专用）。４．４．１．２．６移液器吸头。４．４．１．２．７５ｍＬ注射器。４．４．１．２．８移液器：５ｍＬ，１０ｍＬ。４．４．１．２．９单孔道移液器：２０μＬ，１００μＬ。４．４．１．２．１０快封超速离心管。４．４．１．２．１１适配器（Ｓｐａｃｅｒｓ）（快封超迷离心管专用）。４．４．１．２．１２热封器（Ｃｏｒｄｌｅｓｓｔｕｂｅｔｏｐｐｅｒ）（快封超速离心管专用）。４．４．１．２．１３超速离心机。４．４．１．２．１４离心管：５０ｍＬ，１５ｍＬ。４．４．１．２．１５水浴锅。４．４．１．２．１６带犀角杯的超声破碎仪。４．４．１．２．１７２ｍＬ微离心管。４．４．１．２．１８加热器（ｄｒｙｂｌｏｃｋｈｅａｔｅｒ）为２ｍＬ微离心管加热到１００℃。４．４．１．２．１９６５℃孵育器。４．４．１．２．２０镊子平头，剪刀，凝胶刀。４．４．１．２．２１电泳槽。４．４．１．２．２２电转印仪（ＴｒａｎｓｂｌｏｔＳＤＤｒｙｔｒａｎｓｆｅｒＣｅｌｌ）。４．４．１．２．２３电源供应器。４．４．１．２．２４ＰＶＤＦ转印膜（０．４５μｍ）。４．４．１．２．２５沃特曼滤纸。１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．４．１．２．２６塑料孵育盘。４．４．１．２．２７振荡器。４．４．１．２．２８胶片（ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬｆｉｌｍｓ）。４．４．１．２．２９塑料或玻璃插入物可嵌入胶片盒中。４．４．１．２．３０胶片盒。４．４．１．２．３１保鲜膜（Ｓａｒａｎｗｒａｐ）。４．４．１．２．３２显影液。４．４．１．２．３３定影液。４．４．１．２．３４磁力搅拌器，搅拌棒。４．４．１．２．３５玻璃器皿：１００ｍＬ，５００ｍＬ玻璃瓶，烧杯，量筒。４．４．１．２．３６安全设备：一次性手套，防护衣，防护面罩，塑料挡板。４．４．１．２．３７实验室定时器。４．４．１．２．３８微离心机。４．４．１．２．３９纸手巾，纸垫。４．４．１．２．４０酸度计和电极试剂。４．４．１．２．４１４℃冰箱。４．４．１．２．４２－２０℃冰柜。４．４．１．２．４３ＢⅡ生物安全柜。４．４．１．２．４４纯水机。４．４．１．３材料和试剂４．４．１．３．１１２％ＢｉｓＴｒｉｓ，１．０ｍｍ１２孔预制凝胶（或自制１２％Ｔｒｉｓ甘氨酸ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶）。４．４．１．３．２ＰｒＰ单克隆抗体（鼠抗ＰｒＰＩｇＧｌ，由指定单位提供）。４．４．１．３．３碱性磷酸酶标记山羊抗鼠ＩｇＧ。ｃ和分子量标准。４．４．１．３．４对照样品含有一支正常ＰｒＰ４．４．１．３．５ＳＤＳＭＯＰＳ电泳缓冲液。４．４．１．３．６抗氧化剂（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）。４．４．１．３．７电转印缓冲液。４．４．１．３．８ＨＰＬＣ级１００％甲醇。４．４．１．３．９氯化钠。４．４．１．３．１０氯化钾。４．４．１．３．１１过滤水，１８．２ＭｅｇａＯｈｍｓ。４．４．１．３．１２吐温２０。４．４．１．３．１３犖ｌａｕｒｏｙｓａｒｃｏｓｉｎｅ。４．４．１．３．１４磷酸氢钠。４．４．１．３．１５磷酸二氢钠。４．４．１．３．１６ＴｒｉｓＢａｓｅ，ＦＷ１２１．１４ｇ。４．４．１．３．１７３７％盐酸。４．４．１．３．１８苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）。４．４．１．３．１９正丙醇（１Ｐｒｏｐａｎｏｌ）。４．４．１．３．２０犖乙基甲酰胺［犖ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）］。４．４．１．３．２１蛋白酶Ｋ（ＰＫ）。４．４．１．３．２２蔗糖。１１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．４．１．３．２３氢氧化钠（５．２５％或１２％）。４．４．１．３．２４正辛醇。４．４．１．３．２５即用型ＣＤＰＳｔａｒ碱性磷酸酶底物（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）。４．４．１．３．２６脑组织裂解缓冲液、０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ、ＴＢＳ（１Ｘ）（ｐＨ７．４）、ＴＢＳＴ（ＴＢＳｗｉｔｈＴｗｅｅｎ，ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ、１００ｍｍｏｌ／ＬＮＥＭ、２０％蔗糖、１５％和１０％ＫＩ高盐缓冲液（ＫＩＨＳＢ）、ＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液、电泳缓冲液、电转缓冲液、ＰＶＤＦ封闭缓冲液、化学发光缓冲液、染色液等配制方法见附录Ａ，其他常用化学试剂均为分析纯以上。４．４．２方法４．４．２．１按以下方法从脑干的脑闩区获得的样品：阴性对照：４ｇ脑干组织（分成ＰＫ处理和ＰＫ未处理两份）。阳性对照：见阳性对照单。测试样品：ＥＬＩＳＡＯＤ值大于２．５１ｇ脑干组织（全部ＰＫ处理）ＥＬＩＳＡＯＤ值１～２．５２ｇ脑干组织（全部ＰＫ处理）。注：如果ＥＬＩＳＡＯＤ值大于３，可使用０．５ｇ阳性样品和０．５ｇ阴性样品制成总量为１ｇ测试样品。４．４．２．２在１０ｍＬ的脑组织裂解缓冲液（ＢｒａｉｎＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ，ＢＬＢ）含有１０μＬ的ＮＥＭ和１０μＬ的ＰＭＳＦ进行匀浆，后两种物质应在化学通风柜中加入裂解缓冲液，为了避免匀浆时溢出可按如下方法分装样品：ａ）４ｇ组织：１ｇ组织在２．５ｍＬ×４个均质管；ｂ）２ｇ组织：１ｇ组织在５ｍＬ×２个均质管；ｃ）１ｇ组织：０．５ｇ组织在５ｍＬ×２个均质管。阳性对照和测试样品应使用ＭＥＤＩＦＡＳＴ在生物安全柜中匀浆。阴性对照可使用ＭＥＤＩＦＡＳＴ或ＦＡＳＴＨ匀浆。匀浆之后每份样品加２滴～３滴正辛醇减少产生的气泡。４．４．２．３转移匀浆到快封管里，再用ＢＬＢ进行平衡。封口，在放入转头前使表面消毒。４．４．２．４以１７０００ｒ／ｍｉｎ在１０℃条件下离心３０ｍｉｎ。在生物安全柜中打开转头，取出离心管。４．４．２．５转移上清液至一个干净的快封管里。４．４．２．６用ＢＬＢ充填至管颈处（同时用ＢＬＢ进行平衡），封口，在放入转头前使表面消毒。４．４．２．７以４６０００ｒ／ｍｉｎ在１０℃条件下离心３０ｍｉｎ。放样品在转头里一起置于冰箱中过夜。４．４．２．８次日继续以４６０００ｒ／ｍｉｎ在１０℃条件下离心１０５ｍｉｎ。在生物安全柜中打开转头，取出离心管。４．４．２．９去除上清液，按以下方法悬浮沉淀：ａ）４ｇ组织＋３ｍＬ水＋５０μＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ；ｂ）１ｇ～２ｇ组织＋１．５ｍＬ水＋２５μＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ。转移至１５ｍＬ离心管。４．４．２．１０在３７℃孵育样品１５ｍｉｎ。偶然搅拌样品。４．４．２．１１按以下方法加１５％ＫＩＨＳＢ，在３７℃孵育样品３０ｍｉｎ。偶尔搅拌样品。ａ）４ｇ组织＋６ｍＬ１５％ＫＩＨＳＢ；ｂ）１ｇ～２ｇ组织＋３ｍＬ１５％ＫＩＨＳＢ。４．４．２．１２将阴性对照分成两份到１５ｍＬ离心管里，每份４．５ｍＬ进行ＰＫ＋和ＰＫ－处理对ＰＫ＋处理的样品分别按以下方法加ＰＫ：ａ）１ｇ～２ｇ组织＋４５μＬ１ｍｇ／ｍＬＰＫ；ｂ）４ｇ组织＋９０μＬ１ｍｇ／ｍＬＰＫ。在３７℃孵育样品６０ｍｉｎ。偶然搅拌样品。１２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．４．２．１３对ＰＫ－样品分别按以下方法处理：ａ）加４．５ｍＬ１０％ＫＩＨＳＢ，转移到快封管里；ｂ）小心加２ｍＬ２０％蔗糖液到离心管底部，用１０％ＫＩＨＳＢ加到离心管颈部，平衡后，封口，在放入转头前使表面变白；ｃ）以５１０００ｒ／ｍｉｎ在１０℃条件下离心６０ｍｉｎ。离心后在生物安全柜中打开转头，取出离心管。４．４．２．１４ＰＫ处理后，及４．４．２．１３步骤ａ）、ｂ）、ｃ）后。４．４．２．１５去除上清液，悬浮沉淀于４０μＬＰＡＧＥ样品缓冲液。转移到２ｍＬ离心管。４．４．２．１６超声设定超声能量为１０级，超２０ｓ，操作时戴保护耳机或隔音箱中进行。４．４．２．１７快速离心使样品聚集到底部。４．４．２．１８在－２０℃储存样品过夜。４．４．２．１９加热样品到９５℃５ｍｉｎ。加热控制梯度为每２ｍｉｎ６５℃。４．４．２．２０加载２μＬ样品至１２％ＢｉｓＴｒｉｓ胶。加载８μＬ的对照和１μＬｍａｒｋｅｒ。４．４．２．２１加５００μＬ抗氧化剂到内层电泳槽，电泳２００Ｖ４０ｍｉｎ。４．４．２．２２在甲醇中浸泡转移膜５ｍｉｎ，然后使膜在转移缓冲液中平衡至少１０ｍｉｎ。４．４．２．２３准备半干转移三明治按以下方法：———３片滤纸侵入转移缓冲液；———ＰＶＤＦ膜侵入转移缓冲液；———胶侵入转移缓冲液；———３片滤纸侵入转移缓冲液。４．４．２．２４半干转移在１５Ｖ５０ｍｉｎ。４．４．２．２５用封闭液封闭３０ｍｉｎ。４．４．２．２６用一抗液孵育膜１ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３次，每次５ｍｉｎ。４．４．２．２７用二抗液孵育膜３０ｍｉｎ，ＴＢＳＴ洗涤５次，每次５ｍｉｎ。４．４．２．２８在化学发光缓冲液里平衡膜５ｍｉｎ。４．４．２．２９转移膜至玻璃盘中，在２ｍＬ的０．２５ｍｍｏｌ／ＬＣＤＰＳｔａｒ孵育膜５ｍｉｎ。４．４．２．３０移出多余的ＣＤＰＳｔａｒ，用保鲜膜包裹膜。４．４．２．３１放Ｘ光片在膜上。４．４．２．３２曝光３０ｓ，或２ｍｉｎ，５ｍｉｎ，８ｍｉｎ。４．４．３结果判定４．４．３．１阴性结果未经ＰＫ处理时在３３ｋＤａ～３５ｋＤａ有条带。ＰＫ处理时无条带。４．４．３．２阳性结果未经ＰＫ处理时在３３ｋＤａ～３５ｋＤａ有条带。ＰＫ处理时在２７ｋＤａ～３０ｋＤａ有条带（有时可见到标准的三条带）。详细的结果判定可参照４．５．４进行。４．５蛋白免疫印迹试验４．５．１设备与材料４．５．１．１单道移液器和合适枪头：１０μＬ，１００μＬ，１０００μＬ。１３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．５．１．２８道移液器：５μＬ～５０μＬ，５０μＬ～３００μＬ。４．５．１．３天平，上皿式，能称量０．４５ｇ～０．７０ｇ。４．５．１．４ＤｉｓｐｅｎｓｅｔｔｅⅢＥａｓｙＣａｌ１ｍＬ～１０ｍＬ分配器。４．５．１．５主板９６孔板，每孔至少容纳１ｍＬ。４．５．１．６消化板０．２ｍＬ９６孔ＰＣＲ板。４．５．１．７封板模。４．５．１．８干式加热器：４８℃和９６℃９６孔ＰＣＲ板。４．５．１．９电泳槽。４．５．１．１０Ｎｕｐａｇｅ１２％ＢｉｓＴｒｉｓｇｅｌｓ，１７ｗｅｌｌｓ。４．５．１．１１电源：最低达到２００Ｖ，２．０Ａｍｐｓ（需２个～３个）。４．５．１．１２转印滤纸。４．５．１．１３转印膜：ＰＶＤＦ，０．４５μｍ。４．５．１．１４正方形的带盖的孵育盘。４．５．１．１５镊子（平头）、剪刀、开胶刀。４．５．１．１６转印槽有盒、海绵、冷却旋管。４．５．１．１７冷却装置。４．５．１．１８磁搅拌器和搅拌子。４．５．１．１９板振荡器：可调速的。４．５．１．２０塞入胶片盒的塑料或玻璃垫。４．５．１．２１塑料膜。４．５．１．２２胶片ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ８×１０。４．５．１．２３胶片盒８×１０。４．５．１．２４显影液。４．５．１．２５定影液。４．５．１．２６匀浆机ＦＡＳＴＨ或ＭｅｄｉＦＡＳＴＨ。４．５．１．２７匀浆管。４．５．１．２８４℃±３℃的冰箱。４．５．１．２９－２０℃±５℃和－７０℃±１０℃冰箱。４．５．１．３０生物安全柜。４．５．１．３１达到１３５℃的高压灭菌锅。４．５．１．３２干烤箱。４．５．１．３３酸度计。４．５．１．３４解剖刀柄和可调换式刀片。４．５．１．３５玻璃器皿：烧杯、可高压的玻璃瓶、量筒、标本瓶、漏斗。４．５．１．３６纸制品：纸巾、面纸。４．５．１．３７安全装置：腈纶手套、外套、带有防护面具的松紧带、塑料围裙、鞋套。４．５．１．３８实验室定时器。４．５．１．３９纯水系统。４．５．１．４０切板。４．５．１．４１耐酸瓶。４．５．１．４２蓄试剂槽。４．５．１．４３离心抗体管的小型离心机。１４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．５．２材料和试剂４．５．２．１１２％ＢｉｓＴｒｉｓ，１．０ｍｍ１２孔预制凝胶（或自制１２％Ｔｒｉｓ甘氨酸ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶）。４．５．２．２ＰｒＰ单克隆抗体（由指定单位提供）。４．５．２．３碱性磷酸酶标记山羊抗鼠ＩｇＧ。ｃ和分子量标准。４．５．２．４对照样品含有一瓶正常ＰｒＰ４．５．２．５ＳＤＳＭＯＰＳ电泳缓冲液。４．５．２．６抗氧化剂（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）。４．５．２．７电转印缓冲液。４．５．２．８甲醇１００％ＨＰＬＣ级ＣＨ３ＯＨ，Ｆ．Ｗ．３２．０４ｇ。４．５．２．９氯化钠，Ｆ．Ｗ．５８．４４ｇ。４．５．２．１０氯化钾，Ｆ．Ｗ．７４．５５ｇ。４．５．２．１１去离子水１８．２Ωｃｍ。４．５．２．１２吐温２０，Ｆ．Ｗ．１２２７．５４ｇ。４．５．２．１３犖ｌａｕｒｏｙｓａｒｃｏｓｉｎｅ。４．５．２．１４磷酸氢钠。４．５．２．１５磷酸二氢钠。４．５．２．１６ＴｒｉｓＢａｓｅ，ＦＷ１２１．１４ｇ。４．５．２．１７３７％盐酸。４．５．２．１８苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）。４．５．２．１９正丙醇（１Ｐｒｏｐａｎｏｌ）。４．５．２．２０犖ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）。４．５．２．２１蛋白酶Ｋ。４．５．２．２２甘氨酸Ｃ２Ｈ５ＮＯ２，Ｆ．Ｗ．７５．０６ｇ。４．５．２．２３氢氧化钠（５．２５％或１２％）。４．５．２．２４正辛醇（１Ｏｃｔａｎｏｌ）。４．５．２．２５ＣＤＰＳｔａｒ碱性磷酸酶底物（ＡＰＳ）（１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ或２５ｍｍｏｌ／Ｌ）。４．５．２．２６ＰｏｎｃｅａｕＳＣ２２Ｈ１２Ｎ４Ｎａ４Ｏ１３Ｓ４，Ｆ．Ｗ．７６０．６０ｇ。４．５．２．２７脑组织裂解缓冲液、０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ、ＴＢＳ（１×）（ｐＨ７．４）、ＴＢＳＴ（ＴＢＳｗｉｔｈ吐温２０，ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ、１００ｍｍｏｌ／ＬＮＥＭ、２０％蔗糖、１５％和１０％ＫＩ，高盐缓冲液（ＫＩＨＳＢ）、消化缓冲液、消化终止液、ＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液、电泳缓冲液、电转缓冲液、ＰＶＤＦ封闭缓冲液、化学发光缓冲液、染色液等配制方法见附录Ａ，其他常用化学试剂均为分析纯以上。４．５．３方法４．５．３．１样品准备４．５．３．１．１样品编号。４．５．３．１．２所有的样品通过完成检测记录能够追踪到。４．５．３．１．３在ＢⅡ生物安全柜中切割组织。４．５．３．１．４在ＢⅡ生物安全柜或安全罩内从延髓的脑闩部位切取一块组织，把脑闩切块放入天平上事先称过皮重的匀浆管中，组织块应在０．４５ｇ～－０．７０ｇ之间（最好是０．５ｇ～０．５５ｇ）。４．５．３．１．５在切板上修整组织块，用纸巾吸取多余的血液。用２％的漂白粉消毒切板和纸巾１ｈ，冲洗。把器械放入２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠浸泡２ｈ，冲洗。在生物安全柜中将纸巾放入开口的生物危害袋１５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１中，１３５℃，高压消毒３０ｍｉｎ。４．５．３．１．６在放入组织块的匀浆管中加入１０倍体积的１×匀浆缓冲液（质量浓度），盖上盖子。４．５．３．１．７用ＦＡＳＴＨ或ＭｅｄｉＦＡＳＴＨ匀浆机自动匀浆４５ｓ。４．５．３．１．８每份样品吸取９００μＬ～１０００μＬ匀浆组织液到９６孔１．２ｍＬ的样品主板里。注：从现在开始，每一步骤要做两个重复，主板可在４℃保存或在－２０℃或－７０℃长期保存（１２个月）。所有步骤在室温条件下进行，主板和消化板每板有４８份样品。４．５．３．２在０．２ｍＬ９６孔ＰＣＲ板上进行样品消化。４．５．３．３在消化板的每个０．２ｍＬ的孔中加入１０μＬ消化缓冲液。４．５．３．４在消化板的每个０．２ｍＬ的孔中１０μＬ蛋白酶Ｋ，确保在样品加入之前每一个孔中已加入消化缓冲液和蛋白酶Ｋ。４．５．３．５用多道移液器从主板中取各份裂解液１００μＬ转入消化板中，吹打混匀（８次～１０次），吸取每一组样品后要换枪头。４．５．３．６用封板膜盖上消化板，放入加热器中，４８℃加热４０ｍｉｎ。注：在孵育期准备１７孔１２％ＮｕＰＡＧＥ胶，首先小心地把梳子拔出，撕掉胶底部的白色塑料箔，每４８份样品（一个主板）需６块胶，在左边孔下标号（１～６），放入电泳槽中，用ＳＤＳＭＯＰＳ冲洗胶孔准备上样，加入ＭＯＰＳ至距离胶槽３ｃｍ～５ｃｍ，在转印槽中加入１×转印缓冲液，打开冷却装置预冷转印缓冲液。４．５．３．７孵育后，移去封板膜，消化板的每个０．２ｍＬ的孔中加入１０μＬ消化终止液终止酶消化反应，可以使用同一个枪头，但要避免枪头接触到孔而造成交叉污染。４．５．３．８在消化板的每个０．２ｍＬ的孔中加入１００μＬＰＡＧＥ上样缓冲液，吹打混匀，每一组样品吹打后要更换新枪头。４．５．３．９在加热器中９６℃孵育５ｍｉｎ，不要使用封板膜。消化板可以盖上封板膜在－２０℃至－８０℃之间放置５ｄ（以前在９６℃孵育过的旧样品要加热到６５℃２ｍｉｎ）。４．５．３．１０对照样品加热６５℃２ｍｉｎ（可以在烤箱中操作）。４．５．３．１１在左边的第一道中加入８μＬ（１０μＬ）对照样品（仅用８μＬ就有强的信号）。４．５．３．１２每道中加入１０μＬ加热过的样品。４．５．３．１３在内槽中加入１×ＳＤＳＭＯＰＳ电泳缓冲液中，确保缓冲液覆盖胶的顶端。４．５．３．１４在内槽中加入５００μＬ抗氧化剂。４．５．３．１５２００Ｖ电泳，至染色线距离胶底部１ｃｍ～２ｃｍ。（大约３０ｍｉｎ）。４．５．３．１６在电泳的同时，准备ＰＶＤＦ膜，剪切ＰＶＤＦ膜到合适尺寸，放入塑料浅盘中，在甲醇中浸润几秒钟，倒掉甲醇，在１×转印缓冲液中至少平衡１０ｍｉｎ，在转印槽中加入预冷的１×转印缓冲液。４．５．３．１７在装有１×转印缓冲液的容器中，弄湿一块海绵，在海绵上放一块一张滤纸，使滤纸也湿润，再把ＰＶＤＦ膜放在滤纸上，在膜的左上角写上板号，确保在容器中有足量的缓冲液，以致在放胶时膜不会干。４．５．３．１８用胶刀裂开ＮｕＰＡＧＥ胶的塑料框，切掉胶的含有孔的顶端部分，切掉超过染色线的底端部分。在有胶号的角处剪个切口，有助于把胶定向到膜上。４．５．３．１９按图４所示将海绵垫、滤纸、电泳后的凝胶、ＰＶＤＦ膜、海绵垫、滤纸依次放好，确保在胶和膜之间没有气泡，气泡会干扰转印。４．５．３．２０在胶上放已湿润的滤纸，再放第二块海绵。４．５．３．２１小心地把转印三明治转入转印盒里，避免在三明治中产生气泡。４．５．３．２２在有连续致冷和混合的４℃条件下，１４０Ｖ～１５０Ｖ转印１ｈ。４．５．３．２３转印完成后，把转印膜从三明治中取出放在塑料孵育盒中完成剩余检测，在现在这种情况下，不用染色ＰＫ带可能能看到，加入１×ＰｏｎｃｅａｕＳ到膜上，放置在振荡器上直到染色显示出结合的对照蛋白。１６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１图４蛋白质从凝胶转移到犘犞犇犉膜装载示意图４．５．３．２４用ＴＢＳＴ冲洗ＰｏｎｃｅａｕＳ直至红色消失（大约２×１ｍｉｎ）。４．５．３．２５倒掉ＴＢＳＴ，根据膜的大小加入适量的ＰＶＤＦ封闭缓冲液，在板面摇床上室温下振荡３０ｍｉｎ。４．５．３．２６倒掉ＰＶＤＦ封闭缓冲液，根据膜的大小用ＴＢＳＴ配制适量的一抗（６Ｈ４），加入膜上在板面摇床上室温下振荡１ｈ或４℃过夜。４．５．３．２７用５０ｍＬＴＢＳＴ洗膜，每次５ｍｉｎ，洗３次。４．５．３．２８倒掉最后一次的ＴＢＳＴ洗涤液，根据膜的大小用ＴＢＳＴ配制适量的二抗（ＡＰ），加入膜上在板面摇床上室温下振荡３０ｍｉｎ。４．５．３．２９用５０ｍＬＴＢＳＴ洗膜，每次５ｍｉｎ，洗５次。４．５．３．３０倒掉最后一次的ＴＢＳＴ洗涤液，用去离子水配制５０ｍＬ一倍发光缓冲液，取适量的发光缓冲液加入另一个单独的管中，加入膜上振荡５ｍｉｎ。４．５．３．３１加入适量的ＣＤＰＳｔａｒ（１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ；５０×）或（２５ｍｍｏｌ／Ｌ；１００×）到已倒掉部分的发光缓冲液中，黑暗中保存直至使用。４．５．３．３２倒掉发光缓冲液，把膜从塑料孵育盒中拿出，放置在塑料或玻璃平板插入物上。在上面均匀地涂上适量的稀释过的ＣＤＰＳｔａｒ溶液中，室温５ｍｉｎ，确保整个过程中整个膜处于湿润状态。４．５．３．３３用软的面巾纸从膜上移去剩余的发光缓冲液（不要使膜完全变干），立即用塑料膜覆盖，消除塑料膜下面折痕和气泡，放入胶片盒中。４．５．３．３４进入暗室，使膜曝光到Ｘ光片（ＨｙｐｅｒＦｉｌｍ），直到阳性对照的强信号出现和膜背景或蛋白酶Ｋ带出现，（大约４ｍｉｎ～８ｍｉｎ），为达到出现最佳可见信号曝光时间可以更长或更短。也可使用ＣＣＤ照相机检测系统。４．５．４结果判定４．５．４．１图５分别表明ＢＳＥ阴性、ＢＳＥ阳性和对照样品预期的带型。对照样品（Ｋ）含有朊病毒蛋白ｃ的正常构型，通过免疫检测可以显现出来，由于ＰｒＰｃ糖基化的不同造成的异类分布，相应的分散ＰｒＰ带在２５ｋＤａ～３５ｋＤａ之间分布。４．５．４．２阴性样品（Ｎ）没有特异信号带。由于二抗非特异地结合蛋白酶Ｋ形成的３１ｋＤａ带（不一定出现），可以用来定位。４．５．４．３阳性样品（包括强阳性和弱阳性）显示的信号包括３条带，最上面的带（Ａ）对应大约为１７ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１３０ｋＤａ的蛋白质，所有带的信号强度可能比此处描述的要弱（尤其是低点的Ｂ带和Ｃ带），但顶端的带（Ａ）应该能明显看到。箭头Ｄ阐明了消化的病理性朊病毒蛋白和未消化的正常蛋白的分子量差异。图５蛋白免疫印迹试验结果判定示意图４．６酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）４．６．１仪器和设备４．６．１．１手术刀片或可适修整设备和切板。４．６．１．２组织匀浆机：ＴｅＳｅＥＰｒｅｃｅｓｓ（２４或４８）。４．６．１．３２ｍＬ聚丙烯微型离心管和管架。４．６．１．４自动或半自动可调移液器（２０μＬ和５００μＬ）和枪头。４．６．１．５有刻度注射器和针头（１００个／盒）。４．６．１．６微型检测管加热孵育器３７℃。４．６．１．７微型检测管加热孵育器１００℃。４．６．１．８合适的加热孵育器架（２０×２ｍＬ管）。４．６．１．９２ｍＬ微型离心管的离心机（１５０００犵，２０℃）。４．６．１．１０Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ转子离心架（最少６）。４．６．１．１１２Ｌ废液容器。４．６．１．１２５０ｍＬｆａｌｃｏｎ管。４．６．１．１３钝针。４．６．１．１４可调移液器（５０μＬ，１００μＬ，２００μＬ和１０００μＬ）和枪头。４．６．１．１５１０ｍＬ，２０ｍＬ和１００ｍＬ刻度管或１５ｍＬ和５０ｍＬＦａｌｃｏｎ管。４．６．１．１６３７℃微量板孵育器。４．６．１．１７自动或半自动微板洗板机４．６．１．１８带有４５０ｎｍ和６２０ｎｍ滤光片的酶标仪。４．６．１．１９６８０微量板读板仪机附件串口连接线。４．６．１．２０６８０微量板读板仪６２０ｎｍ滤光片。４．６．１．２１冰箱（４℃～８℃）／低温冰箱（－２０℃）。４．６．１．２２ＢⅡ生物安全柜。４．６．１．２３天平（毫克精确到小数点后两位）。１８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．６．１．２４蒸汽灭菌器（温度不低于１３５℃，且蒸汽不外排）。４．６．１．２５各种尺寸的锐利工具盒。４．６．１．２６一次性吸液管（１０ｍＬ，２５ｍＬ）。４．６．１．２７温度计。４．６．１．２８高压废物柜。４．６．１．２９能存贮２０Ｌ废液的塑料桶。４．６．１．３０吸水纸。４．６．１．３１腈手套。４．６．１．３２一次性实验服。４．６．２试剂４．６．２．１纯化和检测试剂盒包含的材料４．６．２．１．１纯化试剂盒４．６．２．１．１．１配有磁珠的研磨管，里面有含０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００的葡萄糖缓冲液，两包，２×９６管。４．６．２．１．１．２试剂Ａ，配制ＰＫ溶液的变性溶液，即用。４．６．２．１．１．３试剂Ｂ，含有溴酚蓝的澄清液，一瓶（５５ｍＬ），即用。４．６．２．１．１．４试剂Ｃ，溶解缓冲液，一瓶（７ｍＬ），即用。４．６．２．１．１．５含有苯酚做为指示颜色的蛋白酶Ｋ，一瓶（０．５ｍＬ）。４．６．２．１．２检测试剂盒４．６．２．１．２．１Ｒ１，微量板：１２条，每条８孔，包被有抗ＰｒＰ的单抗，２块板。４．６．２．１．２．２Ｒ２，洗涤液：１０倍浓缩含有０．０１％硫柳汞钠的ｐＨ７．４ＴｒｉｓＮａＣｌ（２５０ｍＬ）。４．６．２．１．２．３Ｒ３，阴性对照：含０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００的ＢＳＡＰＢＳｐＨ７．４，一瓶（４ｍＬ）。４．６．２．１．２．４Ｒ４，阳性对照：含０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００和无感染合成肽（冻干）的ｐＨ７．４的ＰＢＳ，一瓶。４．６．２．１．２．５Ｒ６，样品稀释液，含酚红和０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００的ｐＨ７．２的ＢＳＡＰＢＳ，一瓶（３５ｍＬ）。４．６．２．１．２．６Ｒ７，酶结合物：１０×过氧化物酶标记的抗ＰｒＰ单抗，用含有牛蛋白、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００和酚红的ｐＨ７．４的ＴｒｉｓＮａＣｌ溶解，一瓶（３５ｍＬ），用新鲜配制的洗涤液以１∶１０稀释。４．６．２．１．２．７Ｒ８，过氧化物酶底物缓冲液：含有０．０１５％Ｈ２Ｏ２和４％二甲基亚砜的ｐＨ４．０的柠檬酸和乙酸钠溶液。１瓶（６０ｍＬ），用来配底物溶液。４．６．２．１．２．８Ｒ９，显色剂：四甲基联苯胺（ＴＭＢ）溶液，１瓶（６０ｍＬ），用Ｒ８以１∶１１稀释来配制底物溶液。４．６．２．１．２．９Ｒ１０，终止液：１Ｎ硫酸，１瓶（２８ｍＬ）。４．６．２．２必需试剂４．６．２．２．１去离子水。４．６．２．２．２２％次氯酸钠。４．６．２．２．３２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠。４．６．３试验前准备４．６．３．１蛋白酶Ｋ：用试剂Ａ做为蛋白酶Ｋ的稀释缓冲液。配制见表１。１９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１表１试剂配制样品数量试剂Ａ蛋白酶Ｋ２１ｍＬ４μＬ１０３ｍＬ１２μＬ１８５ｍＬ２０μＬ２６７ｍＬ２８μＬ３４９ｍＬ３６μＬ４２１１ｍＬ４４μＬ５０１３ｍＬ５２μＬ５８１５ｍＬ６０μＬ６６１７ｍＬ６８μＬ７４１９ｍＬ７６μＬ８２２１ｍＬ８４μＬ９０２３ｍＬ９２μＬ４．６．３．２洗涤液（Ｒ２）：１∶１０溶解Ｒ２１００ｍＬＭｉｌｌｉＱ９００ｍＬ４．６．３．３阳性对照（Ｒ４）加４ｍＬＲ６到瓶子中。在加入Ｒ６之前，在实验台上轻轻拍打阳性对照瓶，使沾在橡皮塞上的掉下来。加入后，盖上橡皮塞，使竖起约１ｍｉｎ，时不时地轻轻混合以加速溶解。４．６．３．４结合物（Ｒ７）：１∶１０溶解Ｒ７０．１ｍＬＲ２（稀释过的）０．９ｍＬ１ｍＬ即用的结合物够用１排。轻轻混合，不要旋涡。４．６．３．５底物溶液（Ｒ８＋Ｒ９）：１∶１１溶解Ｒ９０．１ｍＬＲ８１．０ｍＬ１排需１．１ｍＬ的酶显色溶液，轻轻混合，不要旋涡。４．６．４样品的准备４．６．４．１在ＢⅡ罩下从延髓的脑闩部位切取一块组织，把脑闩切块放入天平上事先称过皮重的碟中，组织块应在３１０ｍｇ～３９０ｍｇ之间（最好是０．３５ｇ），如果首选的话，样品也可直接在称过重的研磨管中称量。４．６．４．２小心将样品放置到研磨管中，避免转移任何缓冲液，拧上盖，把样品摇到研磨管的底部。４．６．４．３把这些管放入到ＴｅＳｅＥＰｒｅｃｅｓｓ４８的顶部中，用程序１执行１个搅动循环（Ｐｒｅｃｅｓｓ４８）。２０ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．６．５试验操作４．６．５．１样品纯化４．６．５．１．１从匀浆器中取出研磨管。４．６．５．１．２打开管之前，颠倒重悬起匀浆。４．６．５．１．３用带有刻度的注射器吸取２５０μＬ样品，确信在磁珠的下面，防止取出没有匀浆好的组织碎块。４．６．５．１．４把这２５０μＬ样品加入到２ｍＬ离心管中。４．６．５．１．５加２５０μＬ配好的蛋白酶Ｋ溶液（见４．６．３．１）到每个离心管中，颠倒混合（１０次），在孵育器中，３７℃，１０ｍｉｎ。４．６．５．１．６把离心管从孵育器中取出，每个管中加入２５０μＬ试剂Ｂ，颠倒混合（１０次）直至蓝色出现。遵守同一加样顺序。４．６．５．１．７在加入试剂Ｂ３０ｍｉｎ之内，２０℃，２００００ｇ５ｍｉｎ离心此离心管，或１５０００ｇ７ｍｉｎ离心。４．６．５．１．８离心完后，在废液罐上颠倒弃去上清液，颠倒放置在吸水纸上最少５ｍｉｎ干燥离心管。４．６．５．１．９每个离心管中加入２５μＬ试剂Ｃ。４．６．５．１．１０立即在１００℃下孵育５ｍｉｎ，在吸取试剂Ｃ和开始孵育之间不要超过２ｍｉｎ。４．６．５．１．１１从孵育器中取出离心管，旋涡５ｓ。４．６．５．２样品检测４．６．５．２．１取１２５μＬ试剂Ｒ６稀释纯化过的样品。４．６．５．２．２在加入微量板之前旋涡５ｓ。４．６．５．２．３从带有保护的包装中移去微量板架，取出需要的条数，把不用的条和干燥袋都放回微量板袋中，密封好。４．６．５．２．４准备阳性对照Ｒ４（见４．６．３．３）。４．６．５．２．５对于每次检测和每一块板，按下列顺序加样：———孔Ａ１，Ｂ１，Ｃ１，Ｄ１：１００；μＬ阴性对照Ｒ３———孔Ｅ１，Ｆ１：１００；μＬ阳性对照Ｒ４———剩余孔：１００。μＬ用试剂Ｒ６稀释的样品４．６．５．２．６用封口膜盖上板子，３７℃孵育７５ｍｉｎ。４．６．５．２．７准备洗涤液Ｒ２（见４．６．３）。４．６．５．２．８准备结合物溶液Ｒ７（见４．６．３）。４．６．５．２．９移去封口膜，洗涤３次，最后一个循环洗后不要让微量板放置超过５ｍｉｎ，通过在吸水纸上颠倒并轻拍来干燥。４．６．５．２．１０每孔加入１００μＬ酶结合物溶液。４．６．５．２．１１用封口膜覆盖２℃～８℃下孵育６０ｍｉｎ。４．６．５．２．１２准备底物溶液（过氧化物酶底物缓冲液Ｒ８和显色剂Ｒ９，见４．６．３），配好的试剂在检测使用前要防光。４．６．５．２．１３移去封板膜，洗涤５次，最后一个循环洗后不要让微量板放置超过５ｍｉｎ，通过在吸水纸上颠倒并轻拍来干燥。４．６．５．２．１４每孔加入１００μＬ底物溶液，室温下黑暗中孵育３０ｍｉｎ，不要使用封板膜。４．６．５．２．１５以加入底物溶液同样的顺序和速度每孔加入１００μＬ终止液。４．６．５．２．１６彻底擦一下板子的底部，然后放入读板仪。终止反应后３０ｍｉｎ内在４５０ｎｍ～６２０ｎｍ下２１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１测量吸光值。在读板之前板子要防光。４．６．６试验结果判定４．６．６．１读板４．６．６．１．１计算阴性对照平均光密度值（犗犇）ＯＤＲ３＝４个Ｒ３孔的ＯＤ值的平均值４．６．６．１．２计算临界值临界值等于：ＯＤＲ３＋０．２１０如：ＯＤＲ３＝０．０２０临界值＝０．０２０＋０．２１０＝０．２３０４．６．６．１．３对照４．６．６．１．３．１阴性对照（犚３）ａ）确认每一份阴性对照值：每一份阴性对照的光密度值应低于０．１５０，但当一个光密度值高于或等于０．１５０时，要排除这个最大异常值。如果一个以上的阴性对照超出这个界限，则需重做试验。ｂ）阴性对照值的同质性：用每一个剩余值来计算阴性对照的平均值，如果大于阴性平均值＋４０％（ＯＤＲ３＋４０％）的值应排除；———如果某个值在ａ）中排除，另外的一个值能在ｂ）中排除；———如果没有阴性对照值在ａ）中排除，在ｂ）中两个最大值能被排除。如果超过两个阴性对照值被排除，则要重做试验。［标准ａ）＋ｂ）］。４．６．６．１．３．２阳性对照（犚４）阳性对照光密度平均值（Ｒ４ＯＤ’ｓ）应大于或等于１．０００，如果阳性对照光密度平均值（Ｒ４ＯＤ’ｓ）确实低于此限则应重做试验。４．６．６．２结果判定４．６．６．２．１如果样品的光密度值低于临界值，则为阴性，当结果刚好低于临界值（临界值－１０％），则相对应的样品要从最初的脑组织匀浆开始，重新重复检测。４．６．６．２．２如果样品的光密度值高于或等于临界值，则判为初步阳性样品，所有发现为初步阳性的样品要重新检测，并送国家指定ＢＳＥ实验室确证，最终判定结果。４．７免疫层析试纸条检测法４．７．１仪器和设备４．７．１．１一次性手术刀，镊子，剪刀，或手术刀柄和一次性刀片，切板。４．７．１．２安全设备：手套、外套、安全眼镜、防切手套。４．７．１．３生物安全柜：ＢⅡ。４．７．１．４纸质产品：纸巾、拭纸（ｋｉｍｗｉｐｅｓ）。４．７．１．５天平。４．７．１．６Ｐｒｙｐｃｏｎｓ。２２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．７．１．７分液器ⅢＥａｓｙＣａｌ１ｍＬ～１０ｍＬ。４．７．１．８匀浆机ＦＡＳＴＨ或ＭｅｄｉＦＡＳＴＨ。４．７．１．９单道移液器和合适枪头：２０μＬ，１００μＬ，２００μＬ，１０００μＬ。４．７．１．１０８道移液器：５μＬ～５０μＬ，５０μＬ～３００μＬ。４．７．１．１１主板９６孔板，每孔至少容纳１ｍＬ。４．７．１．１２封板膜。４．７．１．１３蓄试剂池。４．７．１．１４纯水系统（１８ＭＳ）。４．７．１．１５干式加热器：４８℃９６孔板。４．７．１．１６Ｆａｌｃｏｎ管（１５ｍＬ和５０ｍＬ）。４．７．１．１７定时器。４．７．１．１８冰箱５℃±３℃。４．７．１．１９－２０℃±５℃和－７０℃±１０℃冰箱。４．７．１．２０达到１３５℃的高压灭菌锅。４．７．１．２１旋涡器。４．７．１．２２扫描仪或试纸条专用读数仪器。４．７．２试剂４．７．２．１化学试剂４．７．２．１．１匀浆缓冲液浓缩液（５×）：５倍浓缩，使用前稀释。４．７．２．１．２消化缓冲液（１×）：即用。４．７．２．１．３消化终止液（１×）：即用。４．７．２．１．４试验缓冲液（１×）：即用。４．７．２．１．５结合物缓冲液（１×）：即用。４．７．２．２免疫学试剂４．７．２．２．１蛋白酶Ｋ：即用。４．７．２．２．２阳性对照（冻干）：加水和试验缓冲液复原（见４．７．３）。４．７．２．２．３阴性对照（冻干）：加水和试验缓冲液复原（见４．７．４）。４．７．２．２．４结合物（冻干）：加水和试验缓冲液复原（见４．７．５）。４．７．２．２．５试纸条梳子：即用。４．７．２．３一次性用品４．７．２．３．１消化板：无色板。４．７．２．３．２封板膜。４．７．２．３．３检测板：白板４．７．３试验前准备４．７．３．１试剂准备４．７．３．１．１匀浆缓冲液（１×）：取２００ｍＬ５ｘ匀浆缓冲液浓缩液，加入８００ｍＬ去离子水，混合，５℃±３℃条件下可保存１周。４．７．３．１．２消化液见表２。２３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１表２消化液配制消化液体积匀浆工作液体积消化缓冲液体积蛋白酶Ｋ体积板子数量ｍＬｍＬｍＬｍＬ１排０．６０．３６０．１２０．１２６排３１．８０．６０．６１６３．６１．２１．２２１２７．２２．４２．４３１８１０．８３．６３．６４２４１４．６．３．１４．８４．８５３０１８６６按照上表在塑料Ｆａｌｃｏｎ管中混合。在２２℃±３℃下可保存１５ｍｉｎ±１ｍｉｎ。４．７．３．１．３阳性对照：一小瓶里面加入２００μＬ去离子水和２００μＬ试验缓冲液复原，通过旋涡充分混合，并来回颠倒几次。使用前复原，在２２℃±３℃下可保存１２ｈ。４．７．３．１．４阴性对照：一小瓶里面加入２００μＬ去离子水和２００μＬ试验缓冲液复原，通过旋涡充分混合，并来回颠倒几次。使用前复原，在２２℃±３℃下可保存１２ｈ。４．７．３．１．５结合物：一小瓶里面加入９ｍＬ结合物缓冲液复原，每次使用前至少１５ｓ剧烈旋涡，在５℃±３℃下可保存１周。４．７．３．２准备样品４．７．３．２．１给样品编一个追踪号码，并记录样品的识别信息。４．７．３．２．２完善的工作表能够追踪到所有样品。４．７．３．２．３在ＢⅡ生物安全柜中修整组织。４．７．３．２．４从延髓的脑闩部位切一块组织，在ＢⅡ生物安全柜中放到已称量好的Ｐｒｙｐｃｏｎ中在天平上称量。组织块应在０．４５ｇ～０．７０ｇ之间（最好０．５ｇ～０．５５ｇ）。４．７．３．２．５在切板上修整组织块，用纸巾吸掉多余的血液，修整完后用２％的漂白剂对切板和纸巾消毒１ｈ，充分冲洗切板。可再次使用的工具用２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠浸泡１ｈ，充分冲洗。把纸巾放入开口的生物危害袋子中，一旦干燥，封袋，在高压锅中１３４℃±２℃处理３０ｍｉｎ。４．７．３．２．６加入１０倍体积的１ｘ匀浆缓冲液到盛有组织块的Ｐｒｙｐｃｏｎ中，封闭Ｐｒｙｐｃｏｎ（此步骤在安全柜中完成）。４．７．３．２．７使用ＦＡＳＴＨ或ＭｅｄｉＦＡＳＴＨ匀浆机对组织自动匀浆４５ｓ。４．７．３．２．８对每一个样品。吸取１０００μＬ匀浆过的样品加入到９６孔主板里。４．７．４试验操作４．７．４．１样品的消化在９６孔干净的消化板中完成，消化板由试剂盒提供。４．７．４．２准备消化液（见４．７．３），加入５０μＬ工作消化液到消化板的每个孔中，除两个试剂盒对照孔（Ａ１和Ｂ１）和不需ｐＫ消化的对照孔（在没有用完的板中是紧接检测样品的第一空，在用完的板中是倒数第二孔）。４．７．４．３用多道移液器从主板吸取每一份匀浆１００μＬ（首先来回吹打至少三次来混匀）转移到消化板相对应的孔中，用转移匀浆的１００μＬ枪头来回吹打８次～１０次来混匀，确保每一排样品后更换枪头。２４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１４．７．４．４加入１００μＬ已知阴性对照牛脑组织匀浆到两个消化对照孔中，第一孔没有消化液，第二孔应有５０μＬ消化液。４．７．４．５用封口膜盖住消化板，放入加热器中４７℃±１℃６０ｍｉｎ±２ｍｉｎ，消化板在－２０℃下可存放５天。注：装有试纸条梳子的小袋在打开前要在室温下放置３０ｍｉｎ。４．７．４．６孵育完后，移去封口膜，消化板的每个孔中加入１０μＬ消化终止液终止蛋白水解反应，来回吹打至少三次来混匀，确保每一排样品后更换枪头。４．７．４．７加入１５０μＬ试验缓冲液（使用前至少涡旋１０ｓ彻底混匀）到消化板的每个孔中，来回吹打至少三次来混匀，确保每一排样品后更换枪头。仅加入到检测样品和消化对照孔中，不要加入到两个试剂盒对照孔中（Ａ１和Ｂ１）。４．７．４．８室温下孵育１５ｍｉｎ±１ｍｉｎ。４．７．４．９在孵育期复原实用阳性和阴性对照（见４．７．３）。４．７．４．１０在孵育期复原冻干的结合物（见４．７．３）。４．７．４．１１分别取１２μＬ复原好的阴性对照和阳性对照加入检测板（白板）的Ｂ１孔和Ａ１孔。４．７．４．１２从消化板取１２μＬ已孵育好的样品（用移液器再次混合至少５次）加入到检测板里。４．７．４．１３在使用前１５ｓ剧烈旋涡（至少１０ｓ）复原的冻干结合物，取８０μＬ复原好的冻干结合物加入到检测板的每个孔中，用移液器轻轻均匀混合２次。４．７．４．１４从小袋中取出试纸条梳子并标记。４．７．４．１５把梳子放入到检测板的样品混合物中。４．７．４．１６室温下作用２０ｍｉｎ。４．７．４．１７１０ｍｉｎ内肉眼观察变化或用专用的仪器读数并分析来判定结果。４．７．５试验结果判定４．７．５．１在所有的样品中对照线一定要出现。阴性样品：仅对照线出现（见图６）。阳性样品：对照线和检测线（对照线下１ｍｍ～２ｍｍ）都出现（见图６）。无效结果：没有线出现或仅有检测线出现。如果阳性对照、阴性对照不成立，结果为无效，需要重新进行试验。图６免疫层析试纸条试验结果判定示意图４．７．５．２肉眼判定结果需要两人，一人或两人发现为阳性的所有样品都要进行再次检测，如果测试结果为阴性，就判定为阴性；如果重复试验的结果为阳性或无效，需用确证试验确证或送国家指定ＢＳＥ实验室确证。４．７．５．３一人或两人发现结果是无效的所有样品也要进行再次检测，再次检测仍然需要两人分别进行试验。如果两人再次检测的结果，均为阴性，则判定为阴性；如果一人或两人的结果均为无效，需送权威检测单位进行确证；如果一人或两人的结果为阳性，需要按照上述４．７．５．２的要求再次重复和判定。２５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１附录犃（规范性附录）试剂的配制犃．１１０％中性福尔马林溶液称取磷酸氢二钠１１７ｇ，磷酸二氢钠７２ｇ，溶解于１６．２Ｌ二级水中。在通风橱中向配好的缓冲液中加入３７％的甲醛溶液１．８Ｌ。搅拌均匀，将ｐＨ值调至７．０±０．２。犃．２苏木素染色液按以下顺序依次加入试剂：７３０ｍＬ去离子水＋２５０ｍＬ乙烯基甘油＋２．０ｇ苏木素＋０．２ｇ碘酸钠＋１７．６ｇ硫酸铝＋２０ｍＬ冰醋酸。室温条件下用磁力搅拌器搅拌１ｈ，使用前用滤纸过滤溶液。犃．３伊红染色液０．５ｇ～１ｇ伊红（醇溶）＋１００ｍＬ９５％乙醇。犃．４磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），（ｐＨ７．４）ＮａＣｌ８ｇＫＣｌ０．２ｇＮａ２ＨＰＯ４１．４４ｇＫＨ２ＰＯ４０．２４ｇ加８００ｍＬ蒸馏水溶解，用盐酸调ｐＨ值至７．４，再加蒸馏水至１０００ｍＬ，１２１℃±２℃，２０ｍｉｎ高压蒸汽灭菌后，室温保存。犃．５磷酸盐吐温缓冲液（ＰＢＳＴ），（ｐＨ７．４）１０００ｍＬ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）加入５００μＬ吐温２０，混匀。犃．６抗体稀释缓冲液为含１％ＢＳＡ的ＰＢＳＴ。犃．７抗原修复缓冲液０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ缓冲液（ｐＨ８．０）：７００ｍＬ水中溶解１８６．１ｇＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠调至ｐＨ８．０，加水至１０００ｍＬ。犃．８脑组织裂解液的配制称取１０ｇ犖十二烷基肌氨酸钠（犖ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ）溶于１００ｍＬ０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳｐＨ７．４中。此溶液应新鲜配制，当加入犖ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ后保存期不超过３ｄ。犃．９１００ｍｍｏｌ／ＬＮＥＭ犖乙基甲酰胺０．３１３ｇ正丙醇２５ｍＬ混匀，－２０℃避光保存。犃．１０ＫＩＨＳＢ硫代硫酸钠１．５ｇ犖十二烷酰基肌氨酸１．０ｇ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ／ＨＣｌ缓冲液ｐＨ７．４（见Ａ．１６）１ｍＬ１０％碘化钾１０ｇ或１５％碘化钾１５ｇ用去离子水加至１００ｍＬ，混匀，４℃保存。２６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１犃．１１２０％蔗糖蔗糖２０ｇ１０％ＫＩＨＳＢ８０ｍＬ混匀，用１０％ＫＩＨＳＢ加至１００ｍＬ，４℃保存。犃．１２１×ＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液Ｔｒｉｓｂａｓｅ１．５１ｇＳＤＳ８．０ｇ蔗糖２０．０ｇ溴酚蓝０．１％（终浓度）加蒸馏水并调节酸碱度至终体积９５ｍＬ，ｐＨ６．８。使用前每９５μＬＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液加入５μＬβ巯基乙醇。犃．１３１０×电泳缓冲液Ｔｒｉｓｂａｓｅ３０．３ｇ甘氨酸１４４．０ｇＳＤＳ１０．０ｇ用蒸馏水定容至１０００ｍＬ。犃．１４１０×转印缓冲液Ｔｒｉｓ碱３０．２８ｇ甘氨酸１４４．１３ｇ去离子水１０００ｍＬ混匀，冷藏。犃．１５工作转印缓冲液（１×）（Ｔｒｉｓ终浓度为２５ｍｍｏｌ／Ｌ，甘氨酸终浓度为１９２ｍｍｏｌ／Ｌ）１０×转印缓冲液２００ｍＬ去离子水１６００ｍＬ甲醇（１００％）２００ｍＬ冷却到４℃使用，工作溶液在４℃可存放１周。犃．１６Ｔｒｉｓ盐缓冲液ＴＢＳ（１×）ｐＨ７．４ＮａＣｌ８ｇＫＣｌ０．２ｇＴｒｉｓｂａｓｅ３ｇ去离子水１０００ｍＬ在磁力搅拌台上混合，用盐酸调ｐＨ值到７．４±０．０５，室温保存。犃．１７含有Ｔｗｅｅｎ的Ｔｒｉｓ盐缓冲液（０．０５％）（ＴＢＳＴ）每１ＬＴＢＳ（４．１．２）加入０．５ｍＬＴｗｅｅｎ２０［终浓度为０．０５％（体积分数）］，４℃±２℃保存。犃．１８ＰｏｎｃｅａｕＳ（２０×）ＰｏｎｃｅａｕＳ２．５ｇ冰醋酸２５ｍＬ去离子水４７５ｍＬ混匀，室温保存。犃．１９考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝Ｒ２５０１．０ｇ甲醇４００ｍＬ冰醋酸１００ｍＬ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１３１６—２０１１１１０—２蒸馏水５００ｍＬ犃．２０脱色液６１甲醇２００ｍＬ３１冰醋酸５０ｍＬ／犜加蒸馏水至终体积为５００ｍＬ犖犛犃．２１蛋白酶Ｋ贮存液：以可溶性粉剂购入的蛋白酶Ｋ应以灭菌的去离子水溶解，配制成浓度为１ｍｇ／ｍＬ的溶液，分装，在－２０℃下保存。犃．２２ＥＣＬ：增强化学发光免疫印迹检测试剂，包括Ａ液和Ｂ液。使用前等量混合Ａ液和Ｂ液，混合后尽快使用。每平方厘米转印膜至少需要０．１２５ｍＬ混合液。犃．２３１００ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ０．４３５ｇＰＭＳＦ溶解在２５ｍＬ正丙醇中，混匀，４℃避光保存。犃．２４ＰＶＤＦ封闭缓冲液（１×）５×浓缩ＰＶＤＦ封闭缓冲液１０ｍＬ去离子水４０ｍＬ现用现配。犃．２５发光缓冲液（１×）发光缓冲液（１０×）５ｍＬ去离子水４５ｍＬ现用现配。书号：１５５０６６·２２２５８８定价：３０．００元'