nyt403-2000 脱毒苹果母本树及苗木病毒检测技术规程

'1i1中华人民共和国农业行业标准NY/T403-2000脱毒苹果母本树及苗木病毒检测技术规程Rulesforvirusdetectionofvirus-freemothertreeandseedlingapples2000一09一22发布2000一12一01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T403-2000前言为了有效地实施对脱毒苹果苗木质量检验和管理，规范脱毒苗木市场，促进脱毒技术的推广，实现脱毒苹果苗木病毒检测的规范化、标准化，特制定本规程。本规程在参照国内外苹果病毒检测技术最新研究进展的基础上，结合当前国内生产实际，力求达到快速、准确、可操作性强的检测要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、危害性大的病毒。检测方法主要采用指示植物检测和A蛋白夹心酶联免疫吸附检测。本规程内容包括脱毒苹果母本树及苗木病毒检测的适用范围、检测对象、抽样方法、检测方法和质量要求。本标准的附录A是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准主要起草单位:农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试中心(济南)、山东省植物保护总站。本标准主要起草人:李明立、刘敬东、商明清、华崇钊、孙作文、任宝珍。 中华人民共和国农业行业标准脱毒苹果母本树及NY/T403-2000苗木病毒检测技术规程Rulesforvirusdetectionofvirus-freemothertreeandseedlingapples1范围本标准规定了脱毒苹果母本树及苗木的病毒检测方法和操作规程。本标准适用于脱毒苹果母本树(砧木原种、接穗)、组培苗及脱毒苗木的病毒检测。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB12943-1991苹果无病毒母本树和苗木检疫规程NY329-1997苹果无病毒苗木3定义本标准采用下列定义。3.1苹果无病毒母本树用苹果无病毒原种材料繁育的用于提供品种接穗或营养系砧木的母株(见NY329-1997中3-1).3.2苹果无病毒苗木用无病毒接穗和无病毒砧木繁育的苹果嫁接苗或无病毒材料通过组织培养方法繁育的苹果自根苗(见NY329-1997中3.3),4检测对象苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)，苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV);苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV),5抽样5.1脱毒母本树抽样每株均需检测。春季从待检母本树上选取嫩芽或幼嫩叶片或花期的新鲜花瓣(休眠期取一年生枝条的皮层)作为检测样品。5.2组培苗的抽样5.2.1脱毒核心材料:每株均需检测。5.2.2扩繁组培苗:每次扩繁随机抽取l0o-2%的样品检测。中华人民共和国农业部2000一09一22批准2000-12一01实施 NY/T403-20003出圃苗木的抽样采用分层取样或随机取样等方法抽取样品，抽样数量见表1。将第一次抽取的样品混合后进行二次抽样，随机抽取10%的混合样品检测。表1苗木抽样数量标准表苗木总数量，株抽样百分率I%抽样最低数量，株镇100006-10100>100003^-5注:不足抽样最低数量的全部作为混合样品。6检测方法6.1指示植物检测法按GB12943-1991中5.4病毒检验方法执行。6.2A蛋白夹心酶联免疫吸附检测法。检测方法见附录A,7质量要求凡酶联免疫检测或指示植物检测呈阳性反应的为带毒株。母本树:病毒病株允许率为。。脱毒苗木:病毒病株允许率蕊3.0%. NY/T403-2000附录A(标准的附录)A蛋白夹心酶联免疫吸附检测法A1溶液配制所用化学试剂为分析纯级规格，用水为燕馏水。Al.1洗涤缓冲液(PBST,pH7.4)氯化钠(NaCI)8.00g磷酸二氢钾(KH,PO,)0.20g磷酸氢二钠(Na2HP0,·12H30)2.93g(或NazHPO=1.15g)氯化钾(KCl)0.20g吐温-20(Tween-20)0.50mL溶于蒸馏水中，定容至1000mL,4℃保存。Al-2抽提缓冲液聚乙烯毗咯烷酮(MWzso0。一‘。。。。)20.00g牛血清白蛋白1.00g溶于1000mLPBST中，4℃保存。A1.3包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na2CO3)1.59g碳酸氢钠(NaHCO,)2.93g叠氮钠(NaN,)0.20g溶于蒸馏水中，定容至1000mL,4℃保存。Al-4底物缓冲液二乙醇胺97mL叠氮钠(NaN,)0.20g溶于800mL蒸馏水中，用2mol/L盐酸调pH至9.8，定容至1000mL,4℃保存。A1.5底物溶液(现用现配)。·05g4-硝基苯酚磷酸盐溶于50mL底物缓冲液中。A2样品制备取待检样品。.5一1.0g，加人5mL抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5min，取上清液备用。A3操作步骤A勺‘︺井月包被A蛋白:每孔加100f.L用包被缓冲液按工作浓度稀释的A蛋白，37℃保湿孵育2h,A八八嘴/︺﹄洗板:用洗涤缓冲液洗板4次，每次3^-5min.A勺勺JJ包被第一抗体:每孔加100PL用PBST按工作浓度稀释的抗体，37℃保湿孵育2h,Aq月Jq洗板:同A3-2,A勺UJJ包被样品:每孔加100riL,4℃保湿过夜。同时设阳性、阴性和空白对照，可根据需要设置重复。A，工卜JU洗板:用洗涤缓冲液洗板4-8次，每次3^-5min,A，，JI包被第二抗体:每孔加100t4L用PBST按工作浓度稀释的抗体，37℃保湿孵育2h,A工JCOJ洗板:同A3.2, NY/T403-2000A3.9包被酶标A蛋白:每孔加100pL用PBST按工作浓度稀释的碱性磷酸醋酶标记的A蛋白，37"C保湿孵育2hoA3.10洗板:同A3.2.A3.11加底物:每孔加100CAL底物溶液，37"C反应1heA3.12酶联检测:用酶联检测仪测定405nm的光吸收值(OD,os)，记录反应结果。检测样品ODaos阳性判断标准:i2为阳性。阴性对照OD-'