nyt402-2000 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程

'B15N.,中华人民共和国农业行业标准NY/T402-2000脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程Rulesforvirusdetectionofvirus-freeseed(seedling)sweetpotatoes2000一09一22发布2000一12一01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T402-2000前言为了有效地实施对脱毒甘薯种薯(苗)质量检验和管理，规范脱毒甘薯种薯(苗)市场，促进甘薯脱毒技术推广，实现脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的规范化、标准化，特制定本规程。本规程在参照国内外甘薯病毒检测技术最新研究进展的基础上，结合当前国内生产实际，力求达到快速、准确、可操作性强的检测要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、危害性大的病毒。检测方法主要采用指示植物检测和斑点酶联免疫吸附检测方法。本规程内容包括脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的适用范围、检测对象、抽样方法、检测方法和质量要求。本标准的附录A、附录B都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准主要起草单位:农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试中心(济南)、山东省植物保护总站。本标准主要起草人:孙作文、商明清、李明立、刘敬东、杨勤民、任宝珍。 中华人民共和国农业行业标准脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程NY/T402-2000Rulesforvirusdetectionofvirus-freeseed(seedling)sweetpotatoes1范围本标准规定了脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测方法和操作规程。本标准适用于脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测。2定义本标准采用下列定义。2.1脱毒苗应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘落潜隐病毒(SPLV)，才确认是脱毒苗。2.2脱毒种薯(苗)从繁殖脱毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯(苗)数量的种薯(苗)生产体系生产出来的。分原原种、原种、生产用种三个级别。2.2.1原原种pre-elite用脱毒苗在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。2.2.2原种elite用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。2.2.3生产用种certifiedseedorseedling用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。2.3病毒病株允许率指各级甘薯种薯(苗)繁殖田中病毒病株的允许比率。3检测对象甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)=甘薯潜隐病毒(Sweetpotatolatentvirus,SPLV),4抽样41组培苗抽样4.1.1脱毒核心材料:每株必须检测。4.1.2扩繁苗:随机抽取l0o-2%的扩繁苗检测。4.2田间抽样4.2.1原原种和原种抽样:定植后30天、60天、收获前2周，在目测全田的基础上，采用五点取样法，中华人民共和国农业部200。一09.一22批准2000-12一01实施t NY/T402-2000抽样数量为。.1hm"以下200株;o.11一1hm2500株;超出1hm"面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取上、中、下部叶片1-5g，低温保湿存放，24h内检测。4.2.2生产用种抽样:定植后30天、收获前两周，在目测的基础上，采用随机取样法，0.1hm2以下检验2点，每点100株;0.11^-1hm，检验五点，每点100株;1.1^-5hm，检验10点，每点100株;超出5hm，面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。取样方法及样品保存同4.2.1,4.3商品种薯(苗)抽样没有经过田间检验的种薯(苗)必须进行块根或种苗检验。4.3.1根据甘薯种薯(苗)不同存放方式，采用分层设点取样或随机取样，抽样数量见表1,表1抽样数量标准表种类种薯(苗)总量抽样百分率,%抽样最低数量c10000株6--10100株薯苗>10000株3.5簇1ooookg6-10lookg种薯>10000kg3-5注不足抽样最低数量的全部作为混合样品。2将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取10%的混合样品检测。5检测方法5.1X点酶联免疫吸附(Dot-ELISA)检测法用于检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒，检测方法见附录A,5.2指示植物检测法用于辅助检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒，检测方法见附录B,检测甘薯病毒的指示植物及症状见表2,表2检测甘薯病毒的指示植物及症状病毒种类}指示植物}症状SPFMV巴西牵牛羽状斑驳SPLV巴西牵牛叶脉变黄6质t要求凡斑点酶联免疫吸附检测或指示植物检测呈阳性者为带毒薯(苗)。原原种:病毒病株允许率是。。原种:病毒病株允许率<-2.。%。生产用种:病毒病株允许率(10000 NY/T402-2000附录A(标准的附录)斑点酶联免痊检测法Al溶液配制所用化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。Al.1三经甲基氨基甲烷(TBS)(pH7.5)TrisBase4.84g氯化钠(NaCI)58.44g叠氮钠(NaN,)0.40g溶于1990mL蒸馏水中，用盐酸(37%)调pH至7.5，定容至2000mL,A1.2洗涤缓冲液(TTBS)1.0mL吐温一20(Tween-20)溶于2000mLTBS中。Al.3抽提缓冲液亚硫酸钠(NazSOO0.20g溶于TBS中.定容至100mL,A1.4封闭缓冲液(现用现配)脱脂奶粉0.50g粹通X-100(TritonX-100)0.5mLTBS25mL先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至25mL。加人TritonX-100混合均匀。Al.5抗体稀释缓冲液脱脂奶粉1.00gTBS50mL先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至50mL.Al.6底物缓冲液(pH9.5)TrisBase6.05g氯化钠(NaCI)2.92g氯化镁(M9C12·6H20)0.51g叠氮钠(NaN,)0.05g溶于450mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容至500mL,Al-7硝基蓝四哇盐(NBT)和5-PA-4-X-3-991*磷酸醋(BCIP)储备液NBT储备液:NBT0.04g70%N,N一二甲基甲酞胺1.2mL混合均匀，4"C避光保存。BCIP储备液:BCIP0.02g70%N,N一二甲基甲酞胺l.2mL混合均匀，4"C避光保存。A1.8底物溶液(现用现配)底物缓冲液25mL NY/T402-2000NBT储备液75pLBCIP储备液75KL先将NBT储备液溶于25mL底物缓冲液中，再逐滴加入BCIP储备液，边加边振摇混匀。A2样品制备将待测叶片用清水清洗千净，从每一样品叶片上各取一直径约1cm圆片，放人样品袋中，加入3mL抽提缓冲液充分研磨.4℃静置30^-40min，取澄清汁液点样。样品为块根时催芽处理后取幼芽、叶制样。A3操作步骤A3.，点样:将打好方格的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取17ftL上清液滴在膜上方格的正中，干燥15^30min。同时设阳性、阴性和空白对照，可根据需要设置重复。A3.2封闭:将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中，室温下摇床振荡(50r/min)1h,A3.3孵育第一抗体:将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡(50r/min)过夜。A3.4洗涤:用洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡(100r/min)3min.A3.5孵育第二抗体:将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡(50r/min)1h,A3.6洗涤:洗涤4次，方法同A3.4.A3.7显色:将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室温下摇床振荡(50r/min)孵育30min.A3.8终止反应:弃去底物溶液并用燕馏水洗膜3次，每次摇床振荡(100r/min)3min.A3.9阳性判断:晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。 NY/T402-2000附录B(标准的附录)指示植物检测法B1录育指示植物在防虫条件下盆栽巴西牵牛，至1-2片真叶时嫁接。B2嫁接以待测样品的茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木，在巴西牵牛的茎部(子叶以下)斜切。将待检样品茎蔓切成3^-5段，每段带有至少一个腋芽，去叶后将底端削成楔型，插入砧木的切口内，用封口膜扎紧，置26-32℃防虫网室内遮荫保湿2-3夭。每个样品重复3-5次。同时设阳性对照、阴性对照。嫁接10^-15天后观察记载症状。B3阳性判断根据指示植物症状，确定病毒有无及种类。在所有嫁接的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。'