nyt401-2000 脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程

'B15.1"1中华人民共和国农业行业标准NY/T401-2000脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程Rulesforvirusdetectionofvirus-freeseed(seedling)potatoes2000一09一22发布2000一12一01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T401-2000前言为了有效地实施对脱毒马铃薯种薯质量检验和管理，规范脱毒马铃薯种薯市场，促进马铃薯脱毒技术推广，实现脱毒种薯病毒检测的规范化、标准化，特制定本规程。本规程在参照国内外马铃薯病毒检测技术最新研究进展的基础上，结合当前国内生产实际，力求达到快速、准确、可操作性强的检测要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、危害性大的病毒。检测方法主要采用指示植物检测和双抗体夹心酶联免疫吸附检测方法，而类病毒检测采用指示植物检测、往返电泳或反转录一聚合酶链反应检测方法。本规程内容包括脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测的适用范围、检测对象、抽样方法、检测方法和质量要求。本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准主要起草单位:农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试中心(济南)、山东省植物保护总站。本标准主要起草人:孙作文、王同伟、商明清、杨勤民、徐鲁、刘敬东。 中华人民共和国农业行业标准脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程NY/T401-2000Rulesforvirusdetectionofvirus-freeseed(seedling)potatoes1范围本标准规定了脱毒马铃薯种薯、组培苗的病毒检测方法和操作规程。本标准适用于脱毒马铃薯种薯、组培苗的病毒检测。2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB7331-1987马铃薯种薯产地检疫规程GB18133-2000马铃薯脱毒种薯3定义本标准采用下列定义。3.1脱毒苗应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带马铃薯x病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)，才确认是脱毒苗。3.2脱毒种薯从繁殖脱毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯数量的种薯生产体系生产出来的。脱毒种薯分为基础种薯和合格种薯两类。基础种薯是指用于生产合格种薯的原原种和原种;合格种薯是指用于生产商品薯的种薯。3.2.1基础种薯(分为三级)3.2.1.1原原种pre-elite用脱毒苗在容器内生产的微型薯(microtuber)和在防虫网室、温室条件下生产出的符合质量标准的种薯或小薯(rninituber).3.2.1.2一级原种eliteI用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯3.2.1.3二级原种eliteI用一级原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。3.2.2合格种薯(分为二级)3.2.2.1一级种薯certifiedgrateI用二级原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。3.2-2.2二级种薯certifiedgrateI中华人民共和国农业部2000一09一22批准2000一12一01实施1 NY/T401-2000用一级种薯作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。3病毒病株允许率脱毒种薯繁殖田中病毒病株的允许比率。检测对象马铃薯x病毒(PotatovirusX,PVX);马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY);马铃薯S病毒(PotatovirusS,PVS);马铃薯卷叶病毒(Potatoleafrollvirus,PLRV);马铃薯纺锤块茎类病毒(Potatospindletuberviroid,PSTVd),5抽样51组培苗抽样5.1511脱毒核心材料:每株必须检测。2扩繁苗:随机抽取10o-200的扩繁苗检测。5.2田间抽样田间抽样数量及抽样时期应符合GB18133-2000中6.2的规定。商品种薯抽样没有经过田间检验的种薯必须进行块茎检验。1根据种薯不同存放方式，采用分层设点取样或随机取样法，抽样数量见表1,表1抽样数量标准表种薯总量，kg抽样百分率，%抽样最低数量,kg簇100006^10100>100003-5注:不足抽样最低数量的全部作为混合样品。.2将第一次抽取的样品混合后，进行二次抽样，随机抽取10%的混合样品检测。检测方法指示植物检测法按GB7331-1987中F4规定的方法执行。双抗体夹心酶联免疫检测法检测方法见附录A.往返电泳检测法或反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测法用于检测马铃薯纺锤块茎类病毒，检测方法见附录B和附录C,质t要求凡指示植物检测、酶联免疫检测、往返电泳检测或RT-PCR检测呈阳性反应者为带毒种薯(苗)。各级种薯病株病毒允许率应符合GB18133-200。中第5章的规定。 NY/T401-2000附录A(标准的附录)双抗体夹心酶联免疫检测法A1溶液配制所用化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。Al.1洗涤缓冲液(PBST,pH7.4)氯化钠(NaCI)8.00g磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20g磷酸氢二钠(Na2HP0,·12H,0)2.93g(或Na2HP0,1.15g)氯化钾(KCI)0.20g吐温-20(Tween-20)0.50mL溶于蒸馏水中，定容至1000ml,,4℃保存A1.2抽提缓冲液(PH7.4)20.00g聚乙烯A比咯烷酮(MWznoa。一‘。。。。)溶于1000mLPBST中。A1.3包被缓冲液(pH9.6)碳酸钠(Na,C0,)1.59g碳酸氢钠(NaHCO,)2.93g叠氮钠(NaNO0.20g溶于蒸馏水中，定容至1000mL,4℃保存。Al.4封板液牛血清白蛋白(或脱脂奶粉)2.00g聚乙烯A比咯烷酮(MWz