2018学年高中生物第一章基因工程第一节基因工程概述第1课时基因工程的发展历程和工具同步备课教学案浙科版选修

第1课时　基因工程的发展历程和工具[学习导航]　1.结合教材P7～9，简述基因工程的发展历程。2.结合教材P9～12，举例说出限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用、特点。3.概述质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。[重难点击]　基因工程的基本工具的作用和特点。方式一　抗虫棉的研究开发是我国发展农业转基因技术，打破跨国公司垄断，抢占国际生物技术制高点的成功事例。抗虫棉的应用使棉铃虫得到了有效控制，使杀虫剂用量降低了70%～80%，有效保护了农业生态环境，减少了农民喷药中毒事故，为棉花生产和农业的可持续发展做出了巨大贡献。师：要实现抗虫基因在棉花中的表达，提前要做哪些关键工作？生：要将抗虫基因切割下来；要将抗虫基因整合到棉花的DNA上。师：这里存在一个基因转移的实际问题，就是如何将控制抗虫的基因转入棉花细胞的问题。师：中国有句俗语叫“没有金刚钻儿，不揽瓷器活儿”。科学家们在实施基因工程之前，苦苦求索，终于找到了实施基因工程的三种“金刚钻儿”，使基因工程的设想成为了现实。这三种“金刚钻儿”是什么？有什么特点和具体作用？下面我们就来学习这方面的内容。方式二　科学设想，能否让禾本科植物也能固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？能否让微生物产生人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？经过多年努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。这一技术是在DNA分子水平上进行的，在微小的DNA分子上进行的操作，需要专用的工具。这些工具是什么？各自的作用是什么？让我们一起来了解一下吧！一、基因工程的发展历程1．理论与技术基础的发展1953年：沃森和克里克建立DNA分子双螺旋结构模型。↓1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。↓1958年：梅塞尔森和斯塔尔发现DNA半保留复制的机理。克里克提出中心法则。↓1961～1966年：尼伦伯格等破译遗传密码。-18- ↓1967年：罗思和赫林斯基等发现运转工具质粒和DNA连接酶。↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。史密斯等人分离到限制性核酸内切酶。↓1977年：桑格首次完成基因组的测序工作。2．重组DNA技术的发展(1)1972年科学家伯格等实验①过程重组的杂种DNA分子②成就：世界上首次DNA分子体外重组。(2)1973年科学家科恩等实验重组DNA分子大肠杆菌―→子代大肠杆菌(双重抗性)(3)不同物种间DNA重组实验①过程：非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段＋大肠杆菌质粒―→重组DNA―→大肠杆菌―→转录出相应mRNA。②成就：打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重壁垒，开创了基因工程。3．基因工程的概念方法人工“剪切”和“拼接”等原理对生物的基因进行改造和重新组合(基因重组)操作水平基因(分子)水平目的产生人类需要的基因产物操作环境体外优点定向改造生物的遗传性状1．有性生殖中的基因重组是随机的，且只能在同一物种间进行。基因工程操作导致的基因重组与前述基因重组有何区别？-18- 答案　基因工程可以在不同物种间进行基因重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。2．基因工程的理论基础(1)不同生物的DNA分子能拼接起来的原因分析①基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。③DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。(2)外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应的性状的原因分析①基因的功能特点：控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性。②遗传信息的传递方向都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。1.科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是(　　)A．定向提取生物体内的DNA分子B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”C．在生物体外对DNA分子进行改造D．定向地改造生物的遗传性状答案　D解析　基因工程能按照人们的意愿通过相关技术操作赋予生物以新的遗传特性。2．目前，科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列不是这一先进技术的理论依据的是(　　)A．所有生物共用一套遗传密码B．基因能控制蛋白质的合成C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先答案　D-18- 解析　题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的信使RNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因是通过转录出信使RNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。二、基因工程操作的两种工具酶1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(又称限制酶)(1)来源：主要从原核生物中分离出来。(2)特点：具有特异性(专一性)。①识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。②断开每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)识别序列①组成：大多数由6个核苷酸组成。②特点：一般具有回文序列。(4)作用结果：产生黏性末端或平口末端。2．“分子针线”——DNA连接酶(1)作用：连接DNA分子基本骨架之间的磷酸二酯键。(2)结果：形成重组DNA分子。1．仔细观察下列两种限制酶作用示意图，尝试回答下列问题：(1)两种限制酶的识别序列和切割位点分别是什么？答案　EcoRⅠ的识别序列为GAATTC，切割位点是在G和A之间。HaeⅢ的识别序列有AGGCCT，切割位点在G和C之间。(2)由以上分析可知限制酶的作用是什么？有何作用特点？答案　限制酶的作用是：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。特点是特异性地识别和切割双链DNA分子。2．如图1所示，E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶均可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来。DNA连接酶和限制性核酸内切酶的关系如图2所示：-18- 由图可知DNA连接酶的作用部位是“①”还是“②”，形成了什么化学键？与限制性核酸内切酶相比作用部位和作用结果有何异同？答案　DNA连接酶的作用部位为①，形成了磷酸二酯键。DNA连接酶和限制性核酸内切酶作用部位都是磷酸二酯键，但作用结果不同，前者是断裂磷酸二酯键，形成DNA片段，后者是形成磷酸二酯键，连接DNA片段。3．DNA连接酶和DNA聚合酶的异同(1)DNA连接酶和DNA聚合酶均能形成磷酸二酯键，二者的作用对象相同吗？为什么？答案　不相同。DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上。(2)比较DNA连接酶和DNA聚合酶的异同点比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要DNA的一条链为模板作用对象游离的DNA片段单个的脱氧核苷酸作用结果形成完整的DNA分子形成DNA分子的一条链用途基因工程DNA分子复制4.在下图中标出限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和DNA解旋酶的作用部位。答案　如图所示限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶作用于a处化学键，而解旋酶作用于b处化学键。-18- 3．下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，正确的是(　　)限制性核酸内切酶识别序列和切割位点限制性核酸内切酶识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠG↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注：Y表示C或T，R表示A或GA．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列B．限制酶切割后一定形成黏性末端C．不同的限制酶可以形成相同的黏性末端D．限制酶的切割位点在识别序列内部答案　C解析　根据表格内容可以推知，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，但不一定只能识别一种序列，如限制酶HindⅡ，A项错误；限制酶切割后能形成黏性末端或平口末端，如限制酶HindⅡ切割后露出平口末端，B项错误；不同的限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后露出的黏性末端相同，C项正确；限制酶的切割位点可以位于识别序列的外侧，如Sau3AⅠ，D项错误。一题多变判断正误：(1)一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列(　　)(2)限制性核酸内切酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件(　　)(3)限制性核酸内切酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键(　　)(4)限制性核酸内切酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体(　　)答案　(1)×　(2)√　(3)√　(4)√解析　限制性核酸内切酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，(1)错误；同其他的酶一样，限制性核酸内切酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，(2)正确；限制性核酸内切酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，(3)正确；限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核细胞的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，(4)正确。4．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是(　　)A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键-18- B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平口末端进行连接答案　B解析　DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸分子加到已存在的DNA片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。三、基因工程中的工具——载体1．常用的载体：质粒、λ噬菌体的衍生物、动、植物病毒等。质粒是最早应用的载体，它是细菌细胞中的一类祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状DNA分子。2．质粒的基本结构(1)重组质粒进入受体细胞后要扩增产生更多的带有目的基因的质粒，因此应具备复制原点。(2)重组质粒进入受体细胞后要进行鉴定和筛选，一般利用质粒上特殊的标记基因。(3)为了便于外源DNA分子的插入，要求质粒必须有一个至多个限制性核酸内切酶的切割位点。下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图探究以下问题：1．a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质都是什么？-18- 答案　DNA。2．某目的基因切割末端为，为使质粒和目的基因连接在一起，质粒应有的一段核苷酸序列及被限制酶切割的末端分别是什么？答案　－ACGCGT－　CGCGT－　－TGCGCA－；　　A－3．氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上能起什么作用？答案　用作标记基因，供重组DNA的鉴定与选择。4．由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？答案　作为载体必须具备的条件：(1)必须有一个至多个限制酶切割位点；(2)必须具备自我复制的能力；(3)必须有标记基因。拓展提升　标记基因的筛选原理(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，然后在培养基中加入该抗生素。(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。如下图：5．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(　　)-18- 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A.①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b答案　A解析　①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是c。对②细菌来说，能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，插入点为b。③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。一题多变判断正误：(1)为供外源DNA插入质粒，质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点(　　)(2)质粒上的特殊标记基因可以供外源DNA片段插入质粒(　　)(3)细菌核区的DNA也常被用做载体(　　)答案　(1)√　(2)×　(3)×-18- 1．下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是(　　)A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据D．基因工程必须在同物种间进行答案　D解析　基因工程可在不同物种间进行，它可打破生殖隔离的界限，定向改造生物的遗传性状。2．下列关于限制酶和DNA连接酶的说法中，正确的是(　　)A．其化学本质都是蛋白质B．DNA连接酶可恢复DNA分子中的氢键C．在基因工程中DNA聚合酶可以替代DNA连接酶D．限制酶切割后一定能产生黏性末端答案　A解析　限制酶和DNA连接酶的化学本质都是蛋白质。3．已知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是(　　)A．3B．4C．9D．12答案　C解析　解本题的关键是要理解“在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断”，即一个DNA分子可能被切了一个位点，也可能被切了两个或三个位点，要分开考虑，不要遗漏和重复。切一个位点情况下可得到a和bcd、ab和cd、abc和d；切两个位点情况下可得到a、b和cd；a、bc和d；ab、c和d；切三个位点情况下可得到a、b、c、d。一共可以得到九种片段，分别是a、b、c、d、ab、abc、bc、bcd、cd。4．下列有关细菌质粒的叙述，正确的是(　　)A．质粒是存在于细菌细胞中的一种颗粒状的细胞器B．质粒是细菌细胞中能自我复制的小型环状DNA分子-18- C．质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内才能复制D．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行答案　B解析　质粒是细菌细胞质中能自我复制的小型环状DNA分子，可以在细菌细胞内或宿主细胞内复制。5．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，如图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是—G↓GATCC—，请回答下列问题：(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是________________________________。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是________________。(2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。—G↓GATCC—　　　　　　　―→(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是________________________________________，“插入”时用的工具是___________________________________，其种类有______________________________________________。答案　(1)限制酶　DNA连接酶(2)(3)基因的组成、碱基配对方式和空间结构是相同的　载体　质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等解析　基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶。不同生物的基因之所以能整合在一起，是因为基因的组成、碱基配对方式和空间结构是相同的。将目的基因导入受体细胞，离不开载体的协助，基因工程中用的载体除质粒外，还有动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等。-18- 课时作业[学考达标]1．切取动物控制合成生长激素的基因，注入鲇鱼受精卵中，与其DNA整合后产生生长激素，从而使鲇鱼比同种正常鱼增大3～4倍。此项研究遵循的原理是(　　)A．基因突变B．基因重组C．细胞工程D．染色体变异答案　B解析　将动物控制合成生长激素的基因注入鲇鱼受精卵中，通过DNA复制、转录、翻译合成特定的蛋白质，表现出特定的性状，此方法依据的原理是基因重组。2．以下有关基因工程的叙述，正确的是(　　)A．基因工程是细胞水平上的生物工程B．基因工程的产物对人类都是有益的C．基因工程产生的变异属于基因突变D．基因工程育种的优点之一是目的性强答案　D解析　基因工程是对基因(分子结构)的操作而非细胞水平的操作；基因工程可以创造出符合人们要求的新产品，但并非一定是对人类有益的；基因工程产生的变异属于基因重组而不是基因突变；基因工程育种是按照人们的需要进行的，因而目的性强。3．下列关于限制酶的叙述中，错误的是(　　)A．它能在特定位点切割DNA分子B．同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能够很好地进行碱基配对C．它能任意切割DNA，从而产生大量DNA片段D．每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列答案　C解析　限制酶是基因工程的重要工具之一；每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子；同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能进行互补配对。4．下列关于限制酶识别序列和切割部位的特点，叙述错误的是(　　)A．所识别的序列都可以找到一条中轴线B．中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列C．只识别和切割特定的核苷酸序列D．在任何部位都能将DNA切开答案　D-18- 解析　一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子。5．下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是(　　)A．DNA连接酶、限制酶、解旋酶B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶C．解旋酶、限制酶、DNA连接酶D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶答案　C解析　限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平口末端；DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；解旋酶能使DNA分子双螺旋结构解开，氢键断裂；所以①处是解旋酶作用部位，②处是限制酶作用部位，③处是DNA连接酶作用部位。6．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　)A．质粒只分布于原核细胞中B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定选择答案　D解析　质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因，D项正确。[高考提能]7．下列说法中不正确的有(　　)①限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的　②DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的　③所有限制酶识别的核苷酸序列均由6个核苷酸组成　④不同限制酶切割DNA的位点不同　⑤有的质粒是单链DNAA．①②④⑤B．①②③⑤C．②③④⑤D．①③④⑤答案　B-18- 解析　限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，有很少量是来自真核生物——酵母菌，①错误；T4DNA连接酶来源于T4噬菌体(一种病毒)，②错误；EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶识别的序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成，③错误；不同限制酶切割DNA的位点不同，切割出不同的黏性末端或平口末端，④正确；所有的质粒都是双链的环状DNA分子，⑤错误。故选B。8．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓TTAAG－和－G↓AATTC－。如图表示的是四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)答案　A解析　目的基因两侧有MunⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列，用这两种酶切割都可得到目的基因；B中质粒无标记基因，不符合作为载体的条件；C、D中的标记基因都会被破坏。9．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。下列有关这一过程的叙述不正确的是(　　)A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①B．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②C．基因a进入马铃薯细胞后，可随马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞D．通过该技术人类实现了定向改造马铃薯的遗传性状答案　B解析　限制酶和DNA连接酶的作用部位都是图中的①，但两者作用相反；载体具有在宿主细胞中复制的能力，与目的基因结合后，目的基因也会在宿主细胞中一起复制；基因工程的目的就是定向改造生物的遗传性状。10．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是(　　)-18- 答案　C解析　A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏，能在氨苄青霉素培养基上生长而不能在四环素培养基上生长。11．基因工程中，需要使用限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。(1)根据已知条件和上图回答下列问题：①上述质粒用限制酶________切割，目的基因用限制酶__________切割。②将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，还要加入适量的______________。③请指出质粒上至少要有一个标记基因的理由：_______________________________________________________________________________________________________。(2)不同生物的基因可以拼接的结构基础是_____________________________________________________________________________________________________________。答案　(1)①Ⅰ　Ⅱ　②DNA连接酶　③检测重组质粒(或目的基因)是否导入受体细胞　(2)DNA结构基本相同(其他合理答案亦可)解析　要形成重组质粒，质粒只能出现一个切口，并且至少保留一个标记基因，因序列在GeneⅡ上，因此用限制酶Ⅰ切割质粒，保留GeneⅠ标记基因；目的基因必须切割两次，切割后产生的黏性末端能与质粒的黏性末端互补，序列中有酶Ⅱ的切割序列，因此用酶Ⅱ，产生的黏性末端互补。12．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。请据图回答下列问题：-18- (1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________________________________________________________________________________________________________。(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列－GAATTC－，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端：_______________________。(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复____________键，成功获得了重组质粒，说明__________________________________________________________________________________________________________________________。(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_______________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________________________________________。答案　(1)筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞(2)如图所示：目的基因－G　AATTC－……－G　AATTC－－CTTAA　G－……－CTTAA　G－(3)磷酸二酯　两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素　pBR322质粒解析　(1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞。(2)同一种限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，图见答案。(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。(4)由题意知：由于有图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamHⅠ作用后，标记基因Tetr-18- 被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。[真题体验]基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________________________________________________________________________________________________________；并且________________和________________________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________________________________________________________________________。答案　(1)能自我复制、具有标记基因、含一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素(3)受体细胞解析　(1)作为载体必须具备如下特点：①能自我复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和选择；③具一个至多个限制性核酸内切酶切割位点以便外源DNA片段插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr，因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr-18- ，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。14．(2012·新课标全国，40改编)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有______________和________________。(2)质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATTC……G　　　G……CTTAA为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_________________________________________________________________________________________________________。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)基因工程中除质粒外，______________________和________________也可作为载体。答案　(1)黏性末端　平口末端　(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同　(3)E·coli　T4(4)λ噬菌体的衍生物　动植物病毒　-18-