第二届吉林省大学生生物学科目指南

附件3:第二届吉林省大学生生物学实验技能竞赛科目指南第二届吉林省大学生生物学实验技能竞赛组委会2014年3月6 科目一：Hucker改良的革兰氏染色法鉴定微生物一、实验器材1、设备：显微镜（尼康YS100、YS2-H）2、材料：酒精灯、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、载玻片、盖片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液（结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液）、生理盐水3、菌种：（1）大肠杆菌；（2）枯草芽孢杆菌二、实验步骤1、涂片取一块洁净载玻片，在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐水，且均匀分布，用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中，从大肠杆菌斜面和枯草芽孢杆菌斜面上各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中，分别混匀并涂成薄膜。2、干燥室温自然干燥。3、固定涂面朝上，通过火焰2-3次。此操作目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。4、初染滴加结晶紫液，以刚好将菌膜覆盖为宜，染色1-2min，水洗。5、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。6、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。7、复染用番红液复染约2min，水洗。8、镜检6 干燥后，用油镜观察，比较。正确结果：菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。三、要求1、竞赛选题内容应在2小时内完成；2、载玻片要洁净无油迹；要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。3、固定操作中，火焰不宜过热，以玻片不烫手为宜。4、革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌；脱色时间一般为20-30s。5、在显微镜视野下观察出两种菌（大肠杆菌；枯草芽孢杆菌）的形态，在混菌中区分革兰氏阴性菌和阳性菌，并作图。6、写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论。6 科目二：胰蛋白酶比活力的测定一、实验原理胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，该酶对于由碱性氨基酸（如精氨酸，赖氨酸）的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度专一性。本实验利用胰蛋白酶能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）的原理，进行胰蛋白酶的活力测定。由于BAEE在253nm处的紫外吸收远低于BA，而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐渐生成BA，反应体系在253nm的紫外吸收值随之增加，因此可以以⊿A253nm来计算胰蛋白酶的酶活力。胰蛋白酶的酶活力单位定义（底物BAEE）：在本实验条件下，以BAEE为底物，每分钟使⊿A253nm增加0.001所需的酶量定义为1个酶活力单位。二、实验器材1、设备：分光光度计（UVmini-1240）、旋涡混合器（QL-901）、微量移液器(200微升)。2、材料：试管、试管架、石英比色皿、记号笔、枪头（200微升）、5mL移液管、吸耳球、擦镜纸、滤纸、洗瓶、烧杯。3、试剂：胰蛋白酶样品（浓度为1mg/mL）、0.05mol/LpH7.8Tris-HCl缓冲液、2mmol/LBAEE、20%稀醋酸。三、实验步骤1、取2支试管，分别标号为1、2，1号为空白，2号为测定，按照表1顺序加入各相关试剂。表1.胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂空白/mL测定/mL0.05mol/L，pH7.8Tris-HCl缓冲液2mmol/LBAEE去离子水待测胰蛋白酶总体积3.002.800.18—5.983.002.80—0.185.982、以空白管校正A253nm值至0，测定管中加入待测胰蛋白酶后立即混匀。在30秒时间内，6 向石英比色皿中准确加入3mL待测样品，在UVmini-1240分光光度计上测定光吸收值A253nm，同时记录时间。3、每间隔1min读取A253nm值一次，至6min终止读数。4、测定组测得⊿A253nm/min在0.05-0.10之间数据视为有效。5、计算每分钟平均A253nm增加值即⊿A253nm/min。⊿A253nm=【(A6min-A3min)/3+(A5min-A2min)/3+(A4min-A1min)/3】/3四、要求1、竞赛选题内容应在2小时内完成；2、微量移液器在吸取液体时避免平置、倒置等状态，防止液体流入移液器腔体内；3、微量移液器用后要调至最大量程放置；4、测吸光度之前要分别用水和样品润洗比色杯；5、滤纸用于吸干比色杯上残留的液体，擦镜纸用于擦试比色杯的光面；6、比色杯用完后要用水清洗干净，并倒扣在平皿上；7、写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论；8、实验报告需计算出⊿A253nm/min、所用胰蛋白酶的总活力、胰蛋白酶的比活力。6 科目三：离体蛙心及蟾蜍坐骨神经—腓肠肌标本制作一、实验器材1、材料：铁支架（共用）、双凹夹、竹试管夹、蛙板、玻璃板（或光面瓷砖）、杭剪(大剪刀)、组织剪、有齿组织镊、眼科剪、眼科镊、脊髓探针、玻璃分针、器械盘、吸管、小烧杯、蛙心插管、手术线、培养皿。2、试剂：任氏液3、动物：蟾蜍二、实验步骤1、破坏脑和脊髓取蟾蜍一只，左手持蟾蜍，用食指按压其头部前端，拇指按压背部，使其脊柱伸直，右手持脊髓探针从枕骨大孔处垂直向下刺入，转向前刺入颅腔，充分捣毁脑组织。然后将探针退至枕骨大孔处，转向后刺入椎管捣毁脊髓。此时如蟾蜍的四肢无肌张力、呼吸消失，即表明脑和脊髓已破坏完全。将蟾蜍仰卧位置于蛙板上，用有齿组织镊从剑突下夹起上腹部皮肤V型剪开；提起胸骨柄，V型剪开胸骨并剪断，暴露心脏；用眼科镊夹起心包膜．剪开心包膜。2、心室插管在左右主动脉下穿一条手术线打活结备用。用眼科剪在左主动脉剪一斜口，将盛有任氏液的蛙心插管插入主动脉，至动脉圆锥时略向后退，于心室收缩时经主动脉瓣进入心室。若插管成功，管内液面会随着心跳波动。结扎、固定插管，并将结扎线固定于插管侧钩上；提起蛙心插管剪断周围血管等组织，使心脏离体。吸净插管内血液，用任氏液反复冲洗致液体澄清，液面高度应为1-2厘米。3、剪除躯干上部和内脏　在骶髂关节水平上1cm处剪断脊柱，左手提起蟾蜍的后肢，将骶骨向上，使蟾蜍头和内脏自然下垂，右手持剪刀，沿脊柱两侧剪除一切内脏和头胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。4、皮肤剥离　用有齿组织镊夹住脊柱断端，右手提起其上的皮肤边缘，用力向下剥去全部后肢的皮肤，把标本置于盛有任氏液的培养皿中。5、分离后肢6 　将标本腹面朝上放于蛙板，沿正中线用杭剪沿脊柱和耻骨联合正中线将标本一分为二，将分离后的标本浸入盛有任氏液的培养皿中。6、制备坐骨神经腓肠肌标本　（1）游离坐骨神经　用玻璃分针沿脊柱旁游离坐骨神经，并沿坐骨神经沟继续分离坐骨神经至腘窝处。用玻璃分针仔细剥离，眼科剪剪断坐骨神经的所有分支，然后用杭剪剪断脊柱，仅保留约1cm与坐骨神经相连的脊柱。（2）完成坐骨神经小腿标本　将已手术分离的坐骨神经置于腓肠肌上，剪掉膝关节以上的全部肌肉，然后在股骨中部用杭剪剪去上段股骨，保留约1cm的股骨，剩余的部分即为坐骨神经小腿标本。（3）完成坐骨神经腓肠肌标本　将上述坐骨神经小腿标本在跟腱处穿线结扎后，于远心端剪断跟腱。游离腓肠肌至膝关节处，然后用组织剪剪掉其余的小腿部分，完成坐骨神经腓肠肌标本的制备。三、要求1、竞赛选题内容应在2小时内完成；2、制成的标本应该具有生物活性；3、手术器械的握持与使用方法应该安全、标准、规范，避免自伤或伤及他人；4、参赛学生自行准备口罩和乳胶手套等生活用品；5、实验后废弃物的处理要符合规范。6、写出实验报告，包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论。6