氧化锆全瓷材料生物安全性评价

　　氧化锆全瓷材料生物安全性评价【摘要】目的评估氧化锆全瓷材料组织相容性及生物安全性。方法用氧化锆全瓷材料试件的浸提液分别进行四氮唑盐比色法(MTT)体外细胞毒性试验和溶血试验。结果氧化锆全瓷材料组织相容性的细胞毒性评分小于I级，溶血率为2.16%（P<0.05），无急性毒性反应，无溶血反应。结论氧化锆全瓷材料具有良好的组织相容性及生物安全性，作为种植体基台材料具有极高的临床应用价值及发展前景。【关键词】氧化锆口腔种植溶血实验【Abstract】ObjectiveToevaluatethehistopatibilityandbiologicalsafetyofzirconiaceramicmaterials.MethordsUsingtheleachliquorofzirconiaceramicmaterialsspecimenstoconducttheexternalcytotoxicitytestandthehemolysistestseparately.ResultsThescoreofhistopatibilitycytotoxicityofZirconiaceramicmaterialsislessthanlevelI.Hemolysisrateis2.16%(P<0.05).Thereisnoacutetoxicityreactionandnohaemolyticreaction.ConclusionsZirconiaceramicmaterialshavegoodhistopatibilityandbiologicalsafety,andhavehighvalueofclinicalapplicationanddevelopmentprospecttobedrillbaseofimplants.【Keyplantologyhemolysistest牙种植修复技术作为牙列缺损﹑缺失修复的主要方法之一，目前广泛应用于临床。牙种植体基台作为种植义齿露在粘膜外的部分，起着将种植体与上部结构连接在一起的作用。其材料的好坏直接影响种植修复的结果。近年来，国内外有大量的学者对氧化锆陶瓷材料作为种植牙基台材料进行研究，本文从两种体外实验即MTT和溶血试验，来检测氧化锆陶瓷材料的组织相容性和生物安全性，初步评价其临床应用的可行性。1材料和方法1.1材料的制备与浸提液提取氧化锆陶瓷材料由康思特先进陶瓷有限公司与青岛大学医学院附属医院口腔科共同研究制备。将经过环氧乙烷灭菌的氧化锆陶瓷材料以1g材料／5ml介质的比例，放入小牛血中；以5g材料／10ml介质的比例，放入生理盐水中，分别制备成氧化锆陶瓷材料小牛血清浸提液和生理盐水浸提液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。1.2细胞毒性试验1.2.1实验方法采用L929细胞（青岛大学遗传实验室馈赠)经复苏、传代后，将细胞培养基配制1×104个／ml细胞悬液分注于96孔塑料培养皿中，每孔100μ l，每组每观察期至少8孔，细胞培养箱内培养24h。然后弃去原培养基，用PBS洗涤2次，试验组加入100μl小牛血清浸提液，阴性对照组加入100μl小牛血清，阳性对照组加入64g/L苯酚溶液，培养2、4d和7d。弃去培养皿中的浸提液和培养基，加入20μl/孔的MTT液，继续培养6h，吸去原液，加入150μl／孔二甲亚砜，振荡10min，在BECKMANDU640紫外分光光度计以500nm波长测定吸光度OD值，并计算细胞的相对增殖度(RGR)。RGR=(试验组OD值-空白OD值)／(阴性对照组OD值-空白OD值)。1.2.2细胞毒性分级与判定RGR≥100%评为0级；RGR在75%～99%之间评为I级；RGR在50%～74%之间评为II级；RGR在25%～49%之间评为Ⅲ级；RGR在1%～24%之间评为Ⅳ级；RGR为0时评为V级)。实验结果为1或0级反应为合格，实验结果为Ⅱ级反应时需结合细胞形态综合评价，实验结果为Ⅲ～V级反应为不合格。1.3溶血试验1.3.1制备新鲜稀释血抽取20ml新鲜兔全血中加入lml2％(20g／L)草酸钾生理盐水溶液，调整生理盐水用量，使稀释后的抗凝兔血0.2ml在10ml蒸馏水中于紫外分光光度仪545nm处的吸光度值为0.8±0.3。1.3.2实验方法取10ml生理盐水浸提液，滴加0.2ml新鲜抗凝兔血，混匀，置37℃恒温水浴箱中保持60分钟。所有试管经3000r/min750g离心5min，取上清液，于紫外分光光度仪下以545nm波长测定光吸收度，并计算溶血率。溶血率计算公式：溶血率=(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)／(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%。其中，阴性对照为生理盐水，阳性对照为蒸馏水。实验重复三次。1.3.3结果评定溶血率<5%为合格；溶血率≥5%为不合格。2结果2.1细胞毒性试验氧化锆陶瓷材料试验组及阴性对照组，随着培养时间延长，OD值均有增加，阳性组OD值无增加。实验组与阴性对照组同一时间OD值比较差异无显著性(P>0.05)，与阳性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。氧化锆陶瓷材料小牛血清浸提液对L929细胞的细胞毒性均为1级(表1)，符合国家医用生物材料细胞毒性要求［2］。表1细胞毒性实验各组OD值、RGR及细胞毒性分级3讨论 牙种植体基台是种植义齿露在粘膜外的部分，将种植体与上部结构连接在一起的装置。自20世纪60年代至今，种植牙所使用的基台都是金属钛制成的，但是在临床使用过程中，人们逐渐发现钛金属会释放离子，引起流电效应；产生牙龈黑线而影响了美学效果，降低了牙种植的修复成功率。而陶瓷材料由于克服了钛等金属材料的缺点，在口腔修复领域应用日益增多。在众多陶瓷材料使用中，人们逐步发现稳定性氧化锆陶瓷（PSZ）的某些性能可能在一定程度上能改善陶瓷材料的脆性使其已有可能可作为种植牙基台材料。目前国内外许多学者都对其组织相容性和生物安全性进行了大量的研究。本实验通过体外实验即四氮唑盐比色法(MTT)体外细胞毒性试验和溶血试验测定氧化锆陶瓷材料生物安全性。MMT法是一种国际标准检测细胞存活和生长的实验方法，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在活细胞中，而死亡细胞因对MTT不起作用而不会被染色。由于MTT结晶物形成量与细胞数呈正比，故OD值就能间接反映活细胞数量。通过计算出不同浓度试验材料浸提液作用下的细胞增殖度，可以对该材料的细胞毒性作用作出可靠的定量评价。早在1995年，Harmand[3]等证明了氧化锆粉末对人体巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞的毒性很低，细胞可以贴壁生长。Covacci[4]等于1999年通过体外细胞培养证明了高纯度氧化锆陶瓷不引起细胞转化。C.Piconi[5]等亦认为氧化锆材料无诱变和致癌作用。本实验结果显示2d、4d、7d后的氧化锆陶瓷材料小牛血清浸提液细胞毒性分级均为0级，7d后的氧化锆陶瓷材料小牛血清浸提液细胞毒性分级0或1级别，与阴性对照组相比无明显差异，这表明氧化锆陶瓷材料无细胞毒性作用。本实验还通过溶血试验从临床方面研究氧化锆陶瓷材料组织相容性，实验结果提示氧化锆陶瓷材料在生物体内化学性质稳定，无组成元素溶出，故不会因材料可溶性残余分子的化学作用导致生物体急性反应及溶血作用，说明氧化锆陶瓷材料组织无全身急性毒性及溶血反应。本实验通过MTT体外细胞毒性试验和溶血试验发现氧化锆陶瓷材料具有较好的组织相容性及生物安全性，初步证实其作为种植基台材料具有广阔的临床应用前景。今后尚需对其作进一步的研究。参考文献[1]王喜云.生物材料的生物学评价方法研究进展[J].生物医学工程学杂志,2007,26（2）：95-97. [2]金恩，焦艳军.氧化锆陶瓷在口腔医学领域中的应用[J].国际口腔医学杂志，2007，34（1）:62-64.[3]张斌，陈吉华.牙科用Ce-Y-Mg复合稳定氧化锆增韧陶瓷的基本性能[J]口腔医学纵横杂志，2002，18（1）：8-10[4]ArikoK,Evaluationofthemarginalfitnessoftetragoniapolycrystalall-ceramicrestorations[J]KokubyoGakkaiZasshi,2003,70(20)：114-123.[5]LiJ,LiuY,HermanssonL.Evaluationofbiopatibilityofvariousceramicpoanfibroblastsinvitro[J].ClinMater,1993,12(4):197-201.[6]McleanJicrostrusturalandmechanicalstudyofzirconia-hydroxyapatite(ZH)positeceramicsforbiomedicalapplications[J].positesSciTech,2001,61:301-310.[8]SivakumarM,ManjubalaI.Preparationofhydroxyapatitefluroapatite-zirconiapositesusingIndiancoralsforbiomedicalapplications[J].MaterLett,2001,50:199-205.[9]KimHedicalapplications[J].Biomaterials,2002,23:4113-4121.[10]KimHaterials,2003,24:3277-3284.[11]黄慧，李静，张富强.5种着色氧化锆陶瓷的细胞毒性评价[J].临床口腔医学杂志,2007，23(7):7405-407.