医学生物技术毕业论文

XXXXXXXXX本科生毕业论文题目：中药粉膜II号对HPV表达的影响姓名：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学号：20062104080专业：医学生物技术年级：06级实习单位：湖北XXXXXXXXXX指导老师：杨X完成日期：2010年5月17日 中药粉膜II号对HPV表达的影响【摘要】：<目的>观察中药粉膜II号对HPV表达的影响。<方法>用生理盐水将中药粉膜II号稀释为100%、80%、60%、40%4个浓度，分别与HPV混悬液混合，按试剂盒步骤提取DNA，制成HPV-DNA模板，绘制量标准曲线。<结果>随着作用时间的延长，中药粉膜II号对HPV表达的影响越明显。<结论>中药粉膜II号对HPV—DNA的扩增有抑制作用。关键字：尖锐湿疣中药粉膜II号HPV【Abstract】【Objective】ObservationofpowdermembraneIIexpressionofHPV.【Methods】UsesalinepowdermembraneIIwillbedilutedto100%,80%,60%,40%respectively,andtheconcentrationoffourHPVsuspensionliquidmixing,presskits,extractedDNAtemplates,drawingHPV-quantitystandardcurve.【Results】Withtheextensionoftime,theeffectofpowdermembraneIItheobviouseffectsofHPVexpression.【Conclusion】PowdermembraneIIofHPV-DNAamplification.【KeyWord】condylomaacuminatumPowdermembraneIIHPV尖锐湿疣（condylomaacuminatum，CA）是发病率仅次于淋病和非淋菌性尿道炎的性传播疾病，它由人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）感染所致，目前世界上还没有较理想的杀灭该病毒药物。临床上所能采用的治疗方法，无论化学的、物理的、或药物的，均以局部破坏瘤体为目的，不能杀灭病毒，除了形成局部的创面、痛苦、易感染外，且复发率极高，约为20%—40%。 中药粉膜II号选用黄柏、五倍子清热燥湿、解毒疗疮；辅以生黄芪益气固表、托毒排脓、敛疮生肌；乳香、没药活血祛瘀、消肿生肌止痛；枯矾、冰片杀虫止痒；五倍子、儿茶收湿敛疮生肌。诸药合用，共奏清热利湿、活血祛瘀、益气生肌、祛腐生新之疗效。现在药理学研究表明，中药粉膜II号具有抑菌、抗炎、抗病毒的作用，可抑制炎症组织异常增生。近年来，我们应用以中药粉膜II号为方药治疗尖锐湿疣取得了较好效果。为探讨中药粉膜II号有无抗人乳头瘤病毒的作用，我们采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）技术，观察不同浓度中药粉膜II号对离体尖锐湿疣皮损的HPV—DNA的影响，发现中药粉膜II号具有抗人乳头瘤病毒的作用。材料1药材：中药粉膜II号，药物组成：黄柏、五倍子、莪术等十味药。2试剂：HPV核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（包括DNA提取液1、DNA提取液2、PCR反应液、Taq酶、UNG），深圳匹基生物技术开发公司提供。3仪器：BIO-RADiCycler荧光定量PCR仪（美国PE公司）；离心机。方法1实验材料（实验药品制备）：中药粉膜II号，由湖北省中医院制剂室提供。用生理盐水将中药粉膜II号稀释为100%、80%、60%、40%4个浓度，另设生理盐水对照。2标本的采集与处理：从湖北中医院妇产科门诊采集来自于尖锐湿疣患者外阴部位的疣体标本，集中到一支离心管中，称重30mg，用玻璃匀浆器匀浆，再加入5ml生理盐水，配成6mg/ml的离体HPV混悬液，备用。 1PCR检测方法：3.1HPV混悬液的制备：药品处理疣体的方法：用移液枪吸取25μl不同浓度的药品液和25μlHPV混悬液至15ml离心管中，振摇均匀，使药品与疣体能充分作用，置37℃水浴箱培养。在药品处理疣体1d、3d、5d、7d后，各取1组进行以下试验。3.2HPV-DNA的提取：从温浴箱中取出经药品处理的HPV混悬液，按试剂和步骤提取DNA：加入50μl生理盐水，混匀后再加入100μlDNA提取液1，振摇均匀，1200r/min离心10min，弃去上清液，再加入25μlDNA提取液2，充分混匀，100℃沸水煮10min，1200r/min离心10min，上清液即为HPV-DNA模板。3.3DNA扩增：取检测试剂盒中PCR反应液37.6μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，UNG0.03μl于PCR反应管中，再加入HPV-DNA模板2μl，扣严管盖，置于定量PCR仪上循环扩增。HOV-DNA经高温变性、低温退火及延伸进行循环扩增，循环程序设置为：37℃，5min：94℃，1min：95℃，sed;60℃，30sec，循环40次。3.4量标准曲线：用荧光探针检测定量，按照检测试剂盒要求，设立4个系列浓度的HPV-DNA定量阳性标准品，经PCR检测（其检测灵敏度为1×103/ml，结果小于该浓度者判定为阴性）。以起始拷贝数的自然对数为横坐标，循环阀值为纵坐标，得到的回归直线为标准曲线，据此对药品的扩增倍数进行定量。结果表中数据表示HPV经各样品作用后，FQ—PCR检测所测得的DNA数值，“—”为检测结果阴性，病毒DNA被破坏而扩增受到抑制；阳性结果以DNA扩增的定量对数平均值表示（单位为“拷贝/mL”），病毒没受到破坏，其DNA大量扩增。 不同浓度中药II号粉膜对HPV-DNA作用的结果浓度培养时间/d1357100%————80%6.8×1063.4×105——60%8.9×1072.4×1079.8×1064.2×10640%3.8×1086.5×1071.1×1078.7×106从表中可知，中药粉膜II号浓度为80%时，需作用5天后才对HPV—DNA起到破坏作用，而80%以下浓度时则为阳性，当浓度达100%时，PCR检测结果显阴性，对HPV—DNA有明显破坏作用。讨论中医认为，尖锐湿疣的病因是由于房事不洁或间接接触污秽之品，湿热淫毒从外侵入外阴皮肤黏膜，导致肝经郁热，气血不和，湿热毒邪搏结而成疣。由于湿毒为阴邪，其性黏滞，缠绵难去，容易耗伤正气，正虚邪恋以致容易复发，难于根治。现代医学认为，尖锐湿疣由人乳头瘤病毒引起，它容易复发与HPV的亚临床感染有关【1】，更与HPV潜伏感染有关。目前世界没有较理想的有效杀灭HPV 的药物，采用中医药防治尖锐湿疣成为热点。尖锐湿疣以局部病变为主，外治法在治疗中占重要地位。国内有文献报道应用内服与外洗法治疗尖锐湿疣，临床取得较好疗效【2,3】。也有文献报道从分子水平证实中药可以杀灭人乳头瘤病毒【4,5】。本研究采用FQ—PCR技术从药物浓度及作用时间两方面观察柴胡对离体尖锐湿疣组织中HPV—DNA的影响,结果显示中药粉膜II号对HPV—DNA有明显的破坏作用，其最有效浓度为100%，显示中药粉膜II号有较强杀灭HPV的作用，而且中药粉膜II号属于可溶于水的强极性物质，为探讨其抗病毒的物质基础作了初步研究。由于尖锐湿疣HPV感染有不同类型，中药粉膜II号是否对其他类型HPV感染有同样作用，有待扩大标本量，进一步深入研究。参考文献：【1】周华，杨帆，熊礼宽，等5尖锐湿疣人乳头瘤病毒潜伏感染的研究[J].中华皮肤科杂志，1995,28(3):168—169.【2】范瑞强，陈永锋，等.疣毒净治疗尖锐湿疣的多中心临床研究[J].广州中医药大学学报，1998,15(4):251—254..【3】池凤好，范瑞强5疣毒清胶囊及外洗液治疗尖锐湿疣激光术后复发疗效观察[J].中医杂志1999,40(4):231.【4】蔡有龄，谭淑珍，吴燕5中药“疣毒清”对尖锐湿疣病毒杀灭作用的实验研究[J]中国性病艾滋病防治，2002,8(2);108—109.【5】吴元胜，范瑞强等.核酸荧光定量PCR检测“疣毒净”洗剂对体外人乳头瘤病毒清除作用的实验研究[J].实用中西医结合临床,2003,3(1):1-2. 人类乳头瘤病毒检测方法的研究概况人乳头瘤状病毒(HPV)属乳多空病毒科亚群内多一组DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，外壳有72个衣多体，直径约45nm-55nm,分子量5×106道尔顿。基因组为环状双链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。它具有高度组织特异性和宿主特异性，至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于形态学方法和分子生物学技术。无论用何种检测方法，HPV表达概率受很多因素，例如年龄，月经周期，外源性激素应用及宿主免疫潜能的影响，例如正常年轻女性使用口服避孕药者，怀孕，免疫抑制患者HPV检出率也较高。文献报道，细胞学正常的妇女宫颈HPV感染率为10.2%—40.0%[1]。HPV感染也是CIN、宫颈癌的明确病因，99%以上的宫颈癌有HPV感染。HPV检测广泛用于HPV相关恶性病变的自然史和病因学研究，目前它正在成为宫颈癌的另一种或是附加的筛检方法，对宫颈癌的预防及治疗有着非常重要的意义。本文仅就近年来关于其检测方法的研究综述如下。1细胞形态学检查1.1细胞学技术是检测HPV感染的一种简便而经济的方法，常用于HPV的过筛检查。该方法通过HPV感染所致宿主细胞发生的形态学改变而推断HPV的感染。细胞学检查HPV感染主要有三类细胞构成：①挖空细胞，即核周空穴细胞，表现为中表层细胞核增大，染色质增多，核周有大的不规则透亮区；②角化不良细胞；③ 湿疣外底层细胞。就实际操作而言，临床上应用较多的是传统的巴氏涂片法，目前巴氏分级法由于其局限性已逐渐被TBS分类法代替，TBS分类法相比巴氏分级法有明显的优点，其不但要对细胞病理学检查情况有该属性的诊断，而且要有具体的详细描述，同时还对标本取材、图片制作提出要求，对送检标本质量作出评价。但实际工作中由于刮片、固定方法或阅片技术等多种因数的影响常造成较高的假阴性率。且细胞学几时不能直接检测到HPV本身，无法对HPV进行分型。近年来，随着标本采集及制片、阅片技术的进步出现了薄层液基制片技术、计算机辅助检测技术等，主要有：TCT法、PAPNET法等。TCT法事通过将宫颈拭子收集的标本置于ThinprepPC缓冲液中，用于HPVDNA检测。研究认为[2]TCT法对检测子宫颈癌比不同的细胞血检查有较高的敏感度（87%VS55%）。此法被美国食品与药物管理局（FDA）批准用于筛查HSIL和LSIL。PAPNET法事应用宫颈脱落细胞薄层涂片自动筛查系统检测HPV感染的方法。该方法是在计算机辅助下对宫颈细胞学涂片进行自动化快速图像分析，极大的提高了特异性和敏感性，诊断的敏感性为90%—100%。阳性预测值为34%—94%，阴性预测值为89%—100%。但这些方法仍有不足之处，即检查所需费用高，需额外工作量，操作人员需专门的训练等。1.2阴道镜阴道镜在放大10—40倍作用下检查宫颈和下生殖道上皮病变，通过对HPV所致子宫颈病变的观察及对典型不为的组织进行活检以诊断HPV感染的发生。它可对生殖道上皮病变，尤其是子宫颈上皮病变进行定位，而且能对局部病变进行活检的同时予与治疗。弥补了细胞学检查的不足，敏感性也大大提高，对于诊断外生湿疣和CIN1级的假阴性率均为5%。有学者认为[3]对于检出CIN最经济有效的方法仍是细胞学检查和阴道镜指导下的活检。但阴道镜形态与病毒类型之间无明显的联系，不能对HPV进行分型检测，且阴道镜检查的准确性通常受病人自身及检查者经验和水平的影响。2免疫组化检测2.1直接法 将酶标记在特异性一抗上，但是这种方法的弊端是显而易见的，除了放大作用非常有限之外，制作成本也很大。2.2间接法将酶标记在第二抗体上，形成抗原/一抗/二抗-酶复合物，最后用酶底物显色来放大信号。由于一抗基本上来源于兔、小鼠等有限的几种种属的动物，所以仅需要制备几种酶标抗体就可以检测众多的抗体，放大效果也有所提高。为了追求更大的放大效果，想到多级放大，出现了PAP等方法，用二抗作“桥梁”，即与一抗结合，又与PAP复合物连接。但是这些追求多级放大的方法除了放大效果有所提高外，也带来了非特异性背景、产品成本高、假阳性等问题。2.3多步法具有代表性的是生物素-卵白素检测系统。其代表如ABC、SP等检测系统，ABC方法是美国VECTOR公司最早推出的经典产品，它利用生物素和卵白素具有极高的亲和性这一生物学特征，将卵白素和生物素化辣根过氧化物酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物(卵白素-生物素-过氧化物酶)。在生物素化的二抗结合一抗后，即可与上述ABC复合物形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC，最后用相应的底物显色。此种方法已经沿用了几十年，得到普遍认可，物美价廉，背景干净，但是缺点是操作比较麻烦，灵敏度没有目前一些新的检测系统高。SP方法在此基础上进行了许多改进，将链霉卵白素和酶直接耦合在一起，减少了操作步骤，增加了灵敏度，是目前基层医院中广为使用的检测系统。2.4二步法其原理是用高分子葡聚糖作为载体将多个二抗分子和酶结合在一起，代替传统方法中的二抗和三抗，使得检测变得异常简单。临床对病理切片通过检测HPV的衣壳抗原来进一步确诊HPV感染，其所得阳性反应定位明确，判断可靠，但须在HPV—DNA复制成熟后才有衣壳装备，其敏感性及阳性强度均低。而现在抗体多针对病毒衣壳蛋白，而此蛋白仅在病毒复制晚期出现，这种情况只出现在HPV生活周期中的一个阶段。因此，对早期HPV感染有一定漏诊率。3以杂交法为基础的检测方法 3.1核酸杂交（nucleicacidhybridization）法是利用放射性核素或生物素标记已知的核酸片段，在一定条件下，与待测的具有一定同源性的核酸片段按碱基互补配对的原则退火形成双链，根据放射性同位素及生物素的检测基恩过来判定标本中是否存在互补的核酸链，以确定HPV—DNA。HPV的核酸分子技术具有较高诊断特异性及敏感性。不仅能对HPV感染进行较为准确的诊断，而且能对HPV进行分型[4]。用于检测HPV—DNA核酸杂交技术的方法有核酸印迹法（Southernblot）和原位杂交（Insituhybridization，ISH）法等。但该技术操作程序繁杂、花费大、耗时且需要一定的实验室条件。另外，由于取材部位不同，病变时间长短不一，在有些病变组织中因DNA降解，所能检测到得DNA量较少，故其灵敏度、检测阳性率还有待进一步提高。3.2杂交捕获（Hybzridcapture，HC）法是美国Digene公司发明的一种检测HPV—DNA的技术，其原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测以诊断HPV的感染。到目前为止，杂交捕获技术经历了三个阶段的发展，即杂交捕获技术—1、杂交捕获技术—2和杂交捕获技术—3。其中杂交捕获2代技术用96孔平板法，能同时检测13种高危型HPV（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型）和5种低危型HPV（HPV6、11、42、43和44型），是唯一通过美国FDA认证的检测方法。HC—II法操作简单，无需基因扩增，重复性好，对高危HPV检测的敏感性可达89%~98%，阴性预测值可达99%[5],实验结果客观不受人为和地理条件限制，但不能测定具体的HPV型别，不能判断多重感染。此外HC—II作为杂交反应，存在交叉杂交的问题，易引起假阳性结果而降低特异性。3PCR为基础的检测方法该方法以基因扩增为基础检测HPV—DNA，是目前最灵敏的检测方法，可检测出低水平的病毒感染，并且能够比较准确地对HPV感染状态进行分类，是进行HPV— DNA检测及分型最好的方法。4.1型特异性PCR法（Type—SpecificPCR,TSPCR）是通过具有型特异性的引物，对病变组织提取的DNA进行特异性扩增，再用凝胶电泳的方法进行检测，然后通过检验阳线条带的扩增结果与扩增效率，从而对HPV感染进行诊断。该方法具有一定局限性，且劳动强度大、费用昂贵，无法检出新的HPV亚型。4.2通用引物PCR法该法是使用通用引物来扩增广谱的HPV，引物针对不同HPV型别之间的保守区域，这个保守序列的确定需要来自每个HPV基因型的许多序列。总的来说，各引物有各自不同的特性，都能对广谱HPV类型进行检测和分型。4.3实时荧光定量PCR法该法是近年来发展起来的新的核酸检验技术[6]，它把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全部过程均在单管封闭条件下进行，并通过计算机控制，实现对PCR扩增产物进行实时动态检测和结果自动分析，较好的解决了传统PCR扩增产物污染和不能定量的问题[7]，是检测HPV感染的理想手段。该方法无需进行PCR产物的后处理，定量范围广，无需做梯度稀释，为临床诊断和治疗提供可靠的依据。利用实时荧光定量PCR法进行HPV感染的临床检测和分型，迅速、便捷，且敏感性和特异性高，已经被广泛用于科研和临床。其缺点：①扩增前需要经过对HPVDNA的提取，对实验条件要求较高，操作不慎易导致样本间污染；②所能检测的型别有限，只有8种；③由于技术原因，其中33、52、58和67型共用一根探针，18和45型共用一个探针，仍不能具体分型。4.4DNA基因芯片技术通过将cDNA文库中的已知或未知序列固定于玻片上，同时检测比较生物样品中多个已知或未知序列的表达情况。它具有通量高、速度快、信息量大、所需样品量少、污染少等优点。另外其灵敏度和特异性较高，其敏感性（96.0%）高于细胞学检测的敏感性（83.6%）[8]，与目前应用的杂交捕获—II的灵敏度大致相同。此外，Lee等[9] 曾证明HPV—DNA芯片的精确性和重复性几乎高达100%。用基因芯片来诊断HPV，不仅可用于分型，而且可以对多个型别的混合感染情况同时进行监控，较杂交捕获法更具优势。但目前基因芯片技术成本昂贵，其实用性还有待于验证。4.5导流杂交基因芯片技术由香港科学家谭荣安教授发明，将导流杂交技术（hybrimax）与低密度基因芯片技术相结合，能同时对HPV6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304等21种基因型进行快速分型诊断，且可判断多重感染，弥补了HC—II不足，是目前世界上最前沿的HPV基因分型检测平台。与其他方法相比，具有很多优点：①能确切分型，有利于进行HPV亚型相关问题的深入研究；②利用芯片高通量的特点可一次性检测21种亚型，增加了HPV感染的检出率及不同亚型复合感染的检测率，尤其是高危型的检出；③芯片设计考虑了中国人感染HPV的特点，包含了中国人常见的3个亚型（53、66和CP8304亚型），有利于在我国筛查HPV感染；④该方法有良好的质量控制体系，基因芯片上包括了阴性对照点、内对照点和biotin对照点，对基因扩增和杂交实行了全程控制；⑤整个检测过程仅需3.5h就可出具检验报告，检测时间短，能满足临床需要；⑥每次检测的样本量可根据实际情况在1~15个之间随意调整，灵活方便，更适合于中小规模临床样本的检测。其缺点在于杂交前需经过HPV—DNA的提取及PCR扩增，对实验条件要求较高，操作不甚易导致样本间的交叉污染，所以操作必须严格按要求进行。5HPV血清抗体检测 宫颈癌血清中HPV16E6、E7抗体阳性率约为41%~55%，且抗体滴度随着宫颈癌临床分期的增加呈上升趋势，当治疗有效时抗体水平下降。故认为HPV16E6、E7抗体在宫颈癌诊断、治疗、监测及随访中起标志物作用。理论上，HPV感染的血清学检测包括免疫组织化学法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法等。免疫组织化学法通过抗L1蛋白抗体与外壳蛋白反应检测HPV。放射免疫沉淀法测定CIN和宫颈癌患者血清中HPV16抗体水平。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定针对型特异性L1类病毒颗粒（VLP）的lgG和lgM抗体。但目前临床上尚还不能用血清学方法对HPV进行确诊及分析。不能确定是近期感染疑或既往感染，因为人感染HPV后，机体产生的抗主要衣壳蛋白抗体在体内可长期存在[10]。另外多数人感染过HPV后均有可能在血清中出现抗体，并非宫颈癌所特有，所以HPV的血清学检测用于宫颈癌的诊断有待于进一步的研究。综上所述可知，目前HPV分型检测技术主要基于聚合酶链式反应、杂交原理和基因芯片技术，这些技术具有灵敏度高、特异度高，能对多重感染进行检测等优点，但这些技术对实验条件要求高，检测费用比较高，不适用于大量的临床检测和大规模的流行病学筛选。所以，目前研究的重点应该是开发出一种具有较高灵敏度、特异度，成本低，适合大多数国家，特别是发展中国家进行临床检测和流行病学筛查的技术。相信随着分子生物学和其他学科的发展，更加简单、快速、有效地HPV分型检测技术将应用于实践中。参考文献1HerreroR,HildesheimA,BrattiC,etal.Population-basedstudyofhumanpapillomavirusinfectionandcervicalneoplasiainruralcostarica[J].NatlCancerInst,2000;92:464-474.2SchorgeJO,SaboorianMH,HynanL,atal.THinprepdetetionofcervicalandendometrialadenocarcinoma:aretrospectivecohortstudy[J].Cancer,2002;96:338-343.3DuensingS,MungerK.Centrosomeabnormalitiesandgenomicinstabilityinducedbyhumanpapillomavirusoncoproteins[J].ProgellCycleRes,2003;5:383-391.4赵方辉，马俊飞，乔友林，等。人乳头瘤病毒DNA载量与子宫颈病变的关系。中华流行病学杂志，2004，25（11）：921. 5LevertM,ClavelC,GraesslinD,etal.Humanpapillomavirustypinginroutinecervicalsmears:resultsfromaseriesof3778patients.GynecolObstelFertil,2000,28(10):722.6ZhengY,PengZL,LouJY,etal.Detectionofphysicalstatusofhumanpapillomavirus16incervicalcancertissueandSiHacelllinebymultiplexreal-timepolymerasechainreaction.IntJCancer,2006,25(3):373.7MasumotoN,FujiiT,IshikawaM,etal.Dominanthumanpapillomavirus16infectionincervicalneoplasiainyoungJapanseswomen;studyof881outpatients.GynecolOncol,2004,94(2):509.8StankovicA,ZivkovicM,GlisicS,atal.AngiotensinIItype1receptorgenepolymorphismandessentialhypertensioninSerbianpopulation.ClinChimActa,2003,327(122):181.9LeeHK,LeeM,RohHW,atal.DNAchipevaluationasadiagnosticdevice.CurrentAppliedPhysics,2005,5(5):433.10何桂荣，李芳芳，何林，等。反向斑点杂交技术应用于人乳头瘤病毒基因分型的研究。中华检验医学杂志，2006，29（7）：685.