微生物学实验备课笔记发

实验一显微镜的使用及微生物大小测定的方法一、实验目的1、学习并掌握油镜的原理和使用方法。2、复习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。3、学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。4、增强微生物细胞大小的感性认识。二、基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不同放大倍数而异，因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小。三、实验器材及药品大肠杆菌、金黄葡萄球菌、放线菌、曲霉等微生物染色标本；香柏油，二甲苯，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，擦镜纸等。四、操作步骤与方法(一)显微镜的使用(参见P17)1、观察前的准备(略)2、显微观察一般地，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。1)低倍镜观察2)高倍镜观察3)油镜观察(二)微生物大小的测定1、装目镜测微尺(由教师操作并演示)2、校正目镜测微尺1)放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。2)校正先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微的刻度后，转动目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。3)计算根据下列公式可计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度 两重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每格长度=两重合线间目镜测微尺格数3、菌体大小测定取下镜台测微尺，换上细菌染色制片，先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定金黄葡萄球菌的直径和大肠杆菌的宽度和长度各占目镜测微尺的格数，最后再乘上该放大倍数下目镜测微尺每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。4、测量完毕取出目镜测微尺后，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。五、原始数据记录与数据处理1、原始数据记录：包括微生物形态观察和微生物个体的大小测定两部分。每位同学观察3种微生物染色标本，其中大肠杆菌和金黄葡萄球菌染色标本必看，其它一种在青霉、曲霉、放线菌和酵母菌中任意选择。每位同学均测定大肠杆菌和金黄葡萄球菌2种染色标本中的微生物个体大小。记录你所选择的哪3种微生物染色标本进行形态观察的和大小测定的。2、数据处理：1)形态观察：要按从搜物镜→低倍镜→高倍镜→油镜的顺序画图描述(注意比例)观察到的微生物群体或个体形态。2)大小测定：A、将目镜测微尺校正结果埴入下表接物镜接物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度/um低倍镜高倍镜油镜10×40×100×接目镜放大倍数：B、将各菌测定结果填入下表(单位：/μm)微生物名称目镜测微尺每格代表的长度/um宽长菌体大小范围/um目镜测微尺格数宽度/um目镜测微尺格数长度/um大肠杆菌金黄色葡萄球菌六、思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？ 实验二　显微镜直接计数法一、目的要求1、明确血细胞计数的原理。2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），其优点是直观、快速、操作简单。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器及Hawksley计菌器等。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。此法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中。在显微镜下进行计数的，由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的（0.1mm3，万分之一毫升），所以可根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内的微生物总数目，包括死菌和活菌。三、实验器材1、菌种：酿酒酵母菌悬液2、仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。四、操作步骤1、菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。2、镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。3、加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用进入计数室，一般计数室均能充满菌液。　取样时要小心摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。4、显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当。一般地，在使用低倍物镜时，应尽量调弱光线，使视野变暗；使用高倍物镜时，再将光线调亮些，但也应尽量保证能看清视野中计数板上的纵、横格线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，则 需重新调节稀释度后再计数，一般样品稀释度要求每小格内约有5～10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。5、清洗血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行凉干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体后其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、原始数据记录与数据处理1、原始数据记录：每个班用同一浓度的酵母菌浓悬液，使用时由同学根据需要自行稀释，并确定稀释倍数B值。每个同学计二个室（即1个计数板），每个室选4个角和中央的一个中格这5个中格中的菌体进行计数，读出每个中格的16个小格中的菌体数（5～10），并将原始数据记录下来。2、数据处理：将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml12345第一室第二室　　每组同学可将各自测定的实验结果并写在一个表格中，最后结果则为四个室的平均值。只需计算一次，不要分别计算二个室的平均值后再求平均值。六、思考题根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？ 实验三　微生物学实验室常用器皿的清洗、包装与干热灭菌一、实验目的1、了解微生物学实验室常用的器皿和工具的种类、要求和应用。2、掌握微生物实验室常用的玻璃器皿的清洗及包装方法。3、了解干热灭菌的原理和应用范围。4、掌握干热灭菌的操作技术。二、基本原理微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；玻璃器皿的洗涤方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。清洗后的玻璃器皿、经包装后即可进行干热灭菌。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种（P59）。火焰烧灼灭菌适用于载玻片、试管口、玻棒、接种工具和金属用具如镊子等的灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内利用高温干燥空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。而细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固变越快，反之反之。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160－170℃），时间长（1-2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品、衣物等不能用干热灭菌。三、实验器材微生物实验室常用的器皿、接种工具、电热鼓风干燥箱等四、操作步骤1、微生物实验室常用的器皿简介（P2－6）试管、吸管、培养皿、三角烧瓶、载玻片、盖玻片、双层瓶、滴瓶、接种工具等。2、微生物实验室常用的器皿清洗方法（P6）1）新玻璃器皿的洗涤方法（P6）；2）使用过的玻璃器皿的洗涤方法（P6）。3、空玻璃器皿的包装（P7－8）1）培养皿的包装；2）吸管的包装；3）试管和三角烧瓶的包装注意：做棉塞的方法（P53－54）4、包装过的玻璃器皿的干热灭菌方法（P62-63）装入待灭菌物品；升温；恒温；降温；开箱取物；无菌检查。五、原始数据记录与数据处理　　1、原始数据记录　　　　领用了哪些玻璃器皿、清洗了哪些玻璃器皿、包装了哪些玻璃器皿。　　2、数据处理　　　　清洗效果、老师评价；包装效果、老师评价；干热灭菌条件及结果。六、思考题（P63）1、为什么在吸管的包装时要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？2、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？3、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？ 实验四培养基的制备及高压蒸汽灭菌一、实验目的1、明确培养基配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围4、学习高压蒸汽灭菌的操作方法二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。其配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.4~7.6。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。任何一种培养基，一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养微生物使用，一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，灭菌锅内的压力增加，使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。三、实验器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/LNaOH,1mol/LHCl;试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5.5~9.0）培养基分装器，棉花，纱布，棉绳，牛皮纸，报纸，记号笔，试管架，剪刀等。四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。2、溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀后在石棉网上加热溶解。将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，且不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足水分到所需的总体积。3、调pH值在未调前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如偏酸加适量NaOH,偏碱加适量HCl，直至达到要求。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4、分装 按要求可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。5、加塞在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性。6、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸或二层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。注明培养基名称、组别、配制日期。7、灭菌（1）加水：打开灭菌锅盖，取出内桶，再向外层锅内加入适量的水，使水位与三角搁架相平为宜。（2）装入待灭菌物品：放回灭菌桶，并装入上述培养基，注意不要装得太紧，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。关闭灭菌锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，　使蒸汽锅密闭，勿使漏气。（3）排气：打开排气口（放气阀）。用电加热，待水煮沸后排除锅内的冷空气，当有大量蒸汽排出时，维持5分钟，使锅内冷空气完全排净，关上排气阀。（4）升压、保压和降压：关闭排所阀后，锅内压力开始上升。当压力升到所需压力（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃20分钟）时，控制热源，维持压力到所需时间后，停止加热，待压力降至接近”0”时，打开排气阀排气。注意不能过急地排气，否则会由于锅内压力突然下降而造成锅内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，和使棉塞沾染培养基而发生污染。（5）无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24~48小时，经检查无菌生长，可保存备用。五、原始数据记录与数据处理1、原始数据记录记录本实验配制培养基的名称、配方及数量。记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。2、数据处理记录无菌检查结果。六、思考题1、培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？3、培养基配制完后，为什么要及时灭菌？若不能及时灭菌，应如何处理？4、高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压？ 实验五微生物的无菌接种技术及培养特征一、实验目的1、学习掌握微生物的几种接种技术。2、学习掌握倒平板的方法。3、建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。4、了解不同的微生物在斜面上平板上的生长特征。二、基本原理将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定经及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠。影响下一步工作的进行。微生物的培养特征是指微生物在固体、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体生长特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。固体培养基又分平板和斜面两种形式。在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘状况（如P75图C）斜面上主要观察菌苔的形态。三、实验器材1、菌种和培养基菌种：大肠杆菌和金黄葡萄球菌平板培养物培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（已灭菌）2、仪器或其他用具酒精灯（芯）、火柴、标签纸、工业乙醇、无菌培养皿、接种环（针）、记号笔、微波炉或加热装置（电炉、石棉网和升降台）、生化培养箱。四、操作步骤1、写标签（P10）任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿(培养皿或试管)用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期、样品类别及来源，字尽量小些。写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。注意：培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。2、倒平板（P70）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基用微波炉或电炉加热融溶，混合均匀后分别倒平板，每位同学倒2皿。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边用左手将试管赛或瓶赛轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰，然后用右手手撑边缘或小指夹住管（瓶）塞（若试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即为平板。3、接种1）斜面接种法(参见P76)2）平板接种法(参见P72)A、点燃酒精灯。B、挑菌落：右手持接种针柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧灭菌后，用左手将菌种平板培养基（简称菌种板）将皿盖在火焰附近打开一缝，以杀灭可能玷污的微生物。将灼烧的灭菌的接种针伸入菌种板内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从平板上刮取少许菌苔取出。C、接种：1）接种平板：左手迅速放下菌种板，在火焰附近迅速拿起待接种的新鲜平板培养基（简称接种板）。右手中接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种板。用接种针在平板上自平板底部向上端轻轻地作“之”字划线：先在平板培养基的1/2的一边做第一次划线，再转动培养皿，在1/4的一边做第二次划线，再转动培养皿，在剩下的1/4的一边做第三次划线。（或每次作“平行”划线3或4条，再转动培养皿约70度，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平等划线，再用同样的方法通过第二次划线部分做第三次平等划线和通过第三次划线部分做第四次平等划线（见P73图6），此法在实际操作上不易把握，易出现接种不到微生物的可能，故推荐同学统一划“之”字形）接种完毕，接种针应通过火焰抽出平板，并迅速盖上皿盖。再重新仔细灼烧接种针后，放回原处。将接种板放入培养箱中置于37℃培养24-48小时。注意：①为了尽可能多地得到单个菌落，在挑菌落时一定要尽量少挑，同时在划线时要尽量划得长些、多些。②每次转动培养皿时都要在火焰附近，且不要将接种针拿出培养皿外。2）接种斜面：左手迅速放下菌种板，在火焰附近迅速拿起待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管）并松开管帽或拔下棉塞，注意保持斜面向上并使管口略向下倾斜。右手中接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管中。用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划一直线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞（或盖上管帽）。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处。将接种管放入试管架后置于37℃培养箱中培养。注意：所划直线尽可能的直，切莫划几条线或蛇形，不要将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口。3）液体接种法（略讲，学生不做）4）穿刺接种法（略讲，学生不做）4、培养与观察将上述已接种的平板和斜面放置于37℃培养箱内培养1-2d后取出对照P75细菌的培养特征图进行观察。五、原始数据记录与数据处理 1、原始数据记录：　所接种的两种微生物：大肠杆菌和金黄葡萄球菌的平板培养物。　每位学生的接种要求：两种微生物各接种一皿。2、数据处理：平板上样品名称菌落特征描写大小形态干湿高度透明度颜色边缘大肠杆菌12金黄色葡萄球菌12在斜面上样品名称菌苔特征描写形态透明度颜色大肠杆菌12金黄色葡萄球菌12六、思考题1、用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？2、接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧过的接种环已冷却？3、试述如何在操作中贯彻无菌操作的原则？ 实验六　革兰氏染色法一、目的要求1、学习并初步掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理革兰氏染色将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，革兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫——碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性不同，由于细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高。所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫——碘的复合物比较容易被洗脱，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分重要的。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。2、试剂：革兰氏染色液，95%的乙醇，灭菌蒸馏水（生理盐水）3、仪器或其他用具酒精灯（芯）、火柴、接种环（针）、圆头镊子、滴管、记号笔、载玻片、吸水纸、洗瓶、显微镜、香柏油、擦镜纸、小标签四、操作步骤1、制片（1）涂片取两片载玻片，各滴一小滴生理盐水于玻片中央，用接环以无菌操作分别从枯草杆菌和大肠杆菌的斜面上挑取少许菌苔于水滴中混匀并涂成薄膜。若用菌悬液涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性（2）干燥室温下自然干燥（3）固定涂面朝上，通过火焰2～3次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，病使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。2、初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2min，水洗。 3、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。4、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20～30s。5、复染用番红液复染约2min，水洗6、镜检干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。7、混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。五、原始数据记录与数据处理1、原始数据记录：进行革兰氏染色的微生物菌种：大肠杆菌和金黄葡萄球菌的新鲜斜面培养物。每组同学的染色要求：单一微生物染色和混合微生物染色各一片，在油镜下观察，绘图并记录微生物的形态和颜色。　　2、数据处理：根据所观察到的染色结果，说明两种微生物分别是何种革兰氏染色反应。六、思考题1、你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2、你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。3、革兰氏染色时，初染前加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？ 实验七　用菌落计数法测水中细菌总数一、目的要求1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2、了解源水的平板菌落计数的原则。二、基本原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于其最大的优点是可以获得活菌的信息，所以广泛应用于生物制品检测，食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测）本实验是用源水的平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、实验器材1、水源水（河水），灭菌蒸馏水，工业酒精。2、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。3、仪器或其他用具：酒精灯（芯）、火柴、灭菌的带玻璃塞的三角瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管（10ml,1ml），灭菌试管、试管架、生化培养箱等。四、操作步骤1、水样的采取水源为盐城工学院化工楼西侧河水，采取方法：应去距水面10～15cm的深层水样，先将灭菌的带塞三角烧瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2、细菌总数测定①写标签：每组同学取6套灭菌培养皿和4个灭菌试管分别写标签（试管为1组，分别编号为10-1，10-2，10-3，10-4，培养皿分2组，分别对应编号为10-2，10-3，10-4）②水样的稀释与接种　取4个灭菌试管，分别用10ml的灭菌吸管加入9ml灭菌水。用1号1ml灭菌吸管取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再用2号1ml灭菌吸管自第一管取1ml至下一管灭菌水内，摇匀，并立即取1ml稀释水加入空的对应编号的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。如此稀释到第三管、第四管（稀释度分别到0.1、0.01、0.001、0.0001），并接种到对应编号的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。稀释倍数看水样浑浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计算或少到无法计算，则需继续稀释或减少稀释倍数。一般中等污秽水样，取0.1、0.01、0.001三个连续稀释度，污秽严重的取0.01、0.001、0.0001三个连续稀释度（根据试做实验，本实验取0.1、0.01、0.001这三个稀释度为宜）。 ③向每个培养皿中各倾约15ml已溶化并冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌子上摇匀。④凝固后倒置于37℃培养箱中培养48h。3、菌落计数方法（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。（2）首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则去其中较小的菌落总数。（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个/ml）备注0.10.010.0011136516420−16400或1.6×104两位以后的数字采取四舍五入的方法去掉22760295466.429500或3.0×10432890271604.527100或2.7×1044无法计数1650513−513000或5.1×105527115−270或2.7×1026无法计数30512−30500或3.1×104五、原始数据记录与数据处理1、原始数据记录：水样来源：每组同学稀释用试管数和接种水样的培养皿数　　2、数据处理：稀释度0.10.010.001平板121212菌落数平均菌落数计算方法菌落总数/ml六、思考题1、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？2、你所测的水源的污秽程度如何？　3、试比较平板菌落计数衍和显微镜直接计数法的优缺点及应用。 实验八　酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别一、目标要求1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。2、掌握酵母菌的一般形态特征及其细菌的区别。二、基本原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝有蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。三、实验器材1、菌种：酿酒酵母新鲜平板菌悬液、干酵母粉菌悬液2、染料：0.1%吕式碱性美蓝染色液和0.05%吕式碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液3、其他：显微镜，载玻片，盖玻片、小标签、吸水纸四、操作步骤1、美蓝浸片的观察（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕式碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。（5）用0.05%吕式碱性美蓝染色液重复上述操作。2、水一碘液浸片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。五、原始数据记录与数据处理1、原始数据记录：绘图说明你所观察的酵母菌的形态，颜色和数量。2、数据处理：　　根据观察结果，说明不同染色时间和不同染液浓度对酵母菌死、活数量的变化。六、思考题1、吕式碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别与一般细菌？