生物化学实验五——醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白 山东大学实验报告

实验五醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白13生物基地201300140059刘洋2015-04-29同组者：张奕一、实验目的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。二、实验原理蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。三、实验器材1.醋酸纤维薄膜（2cm*8cm）2.人血清；3.烧杯及培养皿数只；4.点样器；5.镊子；6.玻璃棒；7.电吹风；8.恒温水浴锅；9.电泳槽；10.直流稳压电泳仪；11.剪刀四、实验试剂1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液2.染色液（可重复使用，使用后回收）3.漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml4.透明液（20ml每组）：无水乙醇14ml，冰醋酸6ml5.健康人血清（新鲜，无溶血现象） 五、实验步骤1.薄膜浸泡：提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上；2.电泳仪检查：水平检查，电源检查；3.电泳槽的准备：在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折，翻过来，用电极缓冲液完全浸湿，架在电泳槽的四个膜支架上，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。4.点样：取新鲜血清于载玻片上，将盖玻片掰呈适宜大小，使一边小于薄膜宽度。把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出，用滤纸吸去表面多余的液体，然后平铺在滤纸上，将盖玻片在血清中轻轻划一下，再在膜条一端1.5~2cm处轻轻地水平落下并迅速提起，即在膜条上点上了细条状的血清样品，呈淡黄色。5.电泳：用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。盖上电泳槽盖。接好电路，调节电压到90V，预电泳10min，再调电压至110V，电泳时间50min～1h。6.染色：将染液倒入大培养皿中，电泳完毕立即用镊子取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5~10min，然后取出。7.漂洗： 配制好漂洗液，将染色完毕的薄膜自染液中取出，直接放入漂洗液中，连续更换几次漂洗液，直到薄膜背景几乎无色为止。8.透明：配制好透明液，用镊子将薄膜取出，贴在容器壁上（烧杯壁或培养皿上等），注意不可有气泡，用吹风机稍吹干薄膜，用胶头滴管淋洗薄膜，至薄膜透明，再用吹风机将薄膜彻底吹干，此时薄膜透明，小心将薄膜自容器壁上取下。六、注意事项1.点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。2.两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面，否则会因虹吸影响电泳效果。3.醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。七、实验结果染色后的薄膜上应显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。然而由于一些问题，实际实验中得到的条带如下：正负八、讨论与结论本次实验得到的电泳带从效果来看不是太好，主要的问题有以下几个：1.有些电泳带参差不齐；2.个别电泳带的两条带之间界限不明显；分析可能导致实验失败或误差的原因有以下几点：1.将薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜；2.用镊子取薄膜并吸干、点样的过程中，薄膜可能受到了异物污染；3.缓冲液选择浓度不合适。因为缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨；4.电流强度控制的不好，因为电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散；5.染色时间控制不合适。因为时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均。