转染人btla基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究论文

　　转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究论文.freelentofcelllinetransfectedanBTLAgeneandpreliminarystudyonitsbiologicalfunctionAbstractAIM:Toestablish293TcellsexpressinghumanBTLAgene,anovelattenuatorforBandTlymphocyte.METHODS:ThegeneencodinghumanBTLAplifiedbyRTPCRfromPHAactivatedTcells,andthenthetargetgenefragmentafterbeingdigestedHI.TherebinantvectorethodsofMTTandcytometry.RESULTS:ThestableexpressionofhumanBTLAonthetransfectedcelllineetryanalysis.Invitro,293T/BTLAcellshadaninhibitoryeffectontheproliferationofTcellsstimulatedbyantiCD3mAbanddoarkerCD25onthesurfaceofTcellsanddecreasedthesecretionofIFNγandIL10.CONCLUSION:Acellline293T/BTLAstablyexpressingthehumanBTLAproteinhasbeenobtainedanditcanpartiallyinhibittheproliferationandactivationofTcellsinvitro.Keyphocyte;genetransfection;Tcell;proliferation摘要目的:构建B、T淋巴细胞衰减子（BTLA）基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RTPCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoRI和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZTerm中构建成重组载体pEGZTerm/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体（mAb）刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFNγ和IL10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。关键词B、T淋巴细胞衰减子;基因转染;T细胞;增殖B、T淋巴细胞衰减子（BandTlymphocyteattenuator,BTLA）是2003年新发现的一个重要的负性共信号分子1,属于CD28超家族成员。BTLA表达于外周血成熟的淋巴细胞（包括B细胞、αβT、δγT、CD4+CD25+T细胞）,脾脏巨噬细胞和髓系树突状细胞（DCs）,以及NK细胞呈微弱表达2。研究表明, BTLA对T细胞的活化、增殖起着重要的负调控作用1-3。BTLA相应配体为TNFR超家族中的疱疹病毒入侵介质（HVEM）,其表达于包括T细胞在内的多种免疫细胞表面5。HVEM的胞外段有4个富含半胱氨酸的结构域（CRD1,CRD2,CRD3和CRD4）,其中CRD1可与BTLA结合从而介导负性信号3。有趣的是,HVEM同时又可作为LIGHT（homologoustolymphotoxins,inducible,petesphocyte）4的受体（LIGHT与HVEM的CRD2和CRD3结合5）介导正性信号。BTLA/HVEM/LIGHT这种复杂的相互作用可能有助于实现T细胞的精确调控和适度活化,因此,探讨BTLA的负性调控作用及其机制具有重要的理论意义。由于该新分子尚缺乏相关的研究材料,如功能性抗人BTLA的单克隆抗体（mAb）,对人BTLA的生物学效应与作用机制知之甚少。本研究旨在通过克隆人BTLA编码区全长基因,并建立能稳定表达人BTLA基因的293T细胞株,为研制抗人BTLAmAb提供免疫原;并探讨了其对T细胞增殖与活化的影响。1材料和方法1.1材料293T细胞株购自ATCC公司,由本所保存。克隆载体pMD18T购自TaKaRa公司。逆转录病毒载体pEGZTerm由德国Sefling教授惠赠。脂质体LipofectAMIM2000和Zeocin购自Invitrogen公司。植物血球凝集素（PHA）购自Sigma公司。TaqDNA聚合酶、Pyrobest高保真DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶及逆转录试剂盒,均购自TaKaRa公司。小量质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒,均购自杭州维特洁公司。胎牛血清（FCS）购自美国Hyclone公司。TRIZOLRNA抽提液和RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司。鼠抗人CD3激发型mAb购自法国Immunotech公司。人HVEMFc融合蛋白购自ALEXIS公司。激发型抗人CD28mAb为本所研制。PE鼠抗人CD25mAb、FITC抗人CD4mAb、FITC抗人CD8mAb、PE羊抗鼠IgG及PE羊抗人IgG,均购自广州晶美公司。人IFNγ和IL10检测试剂盒购自BIOSOURCE公司。1.2引物设计与合成根据GenBank中已知BTLA基因的序列,针对其编码区分别设计用于逆转录扩增的上游引物BTA:5′ATGAAGACATTGCCTGCCATGCT3′,下游引物BTB:5′TTAACTCCTCACACATATGGATGC3′;以及进一步用于酶切构建重组载体的上游引物BTEcoRI:5′CTGGAATTCACCATGAAGACATTGCCTGCCATG3′,下游引物BTBamHI:5′CTCGGATCCTTAACTCCTCACACATATGGATGC3′,下划线部分分别为EcoRI和BamHI的酶切位点,引物由上海博亚（英骏）生物技术有限公司合成。 1.3方法1.3.1人外周血T淋巴细胞的分离与活化取健康志愿者外周全血（来自苏州红十字血站并经检测合格）,经Ficoll密度梯度分离获得单个核细胞,再用绵羊红细胞结合实验纯化获得纯度为95%的T淋巴细胞。1.3.2人BTLA基因的克隆与鉴定取1×107的T细胞铺于6孔板中,加入PHA至终浓度为10mg/L刺激培养64h后离心收集T细胞,以PBS洗3次后,采用TRIZOL一步法提取总RNA,按TaKaRa公司的逆转录试剂盒中说明书将mRNA逆转录成cDNA,取5μL为模板,用BTA、BTB引物进行PCR扩增,反应条件为94℃变性30s,57℃退火40s,72℃延伸1min,共35个循环后,再于72℃延伸10min。PCR产物经试剂盒纯化后,在T4DNA连接酶的作用下与pMD18T载体连接,并转化感受态细菌Top10。用含氨苄青霉素平板筛选阳性菌落,扩增后抽提质粒,经PCR和EcoRI、BamHI双酶切鉴定后,送上海博亚（英骏）公司测序验证。1.3.3重组逆转录病毒载体的构建以测序正确的pMD18T/BTLA质粒为模板,以引物BTEcoRI和BTBamHI用Pyrobest高保真酶同上述条件进行PCR扩增,经纯化后用EcoRI和BamHI进行双酶切,同时双酶切pEGZTerm,回收目的片段进行连接并转化感受态细菌Top10,按上述方法鉴定获得重组逆转录病毒载体pEGZTerm/BTLA。1.3.4稳定表达人BTLA的293T细胞株的构建参照文献6,将重组逆转录病毒载体pEGZTerm/BTLA用脂质体法转染预铺于6孔板中的293T细胞,48h后,以500mg/L浓度的Zeocin抗生素进行筛选,将获得的293T/BTLA阳性克隆亚克隆后扩大培养。同时制备转空载体pEGZTerm的阴性对照293T/mock细胞。收集293T/BTLA和293T/mock细胞,用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达。进一步利用HVEMFc融合蛋白与293T/BTLA结合,以PE羊抗人IgG为二抗用流式细胞信检测BTLA蛋白在细胞膜上的表达。1.3.5淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的检测参照文献7,将T细胞以1×105个/孔加入到预先用抗人CD3激发型mAb（02mg/L,0.4mg/L）以及联合或不联合抗人CD28激发型mAb（05mg/L）包被的96孔板中。同时加入经丝裂霉素（50mg/L）预处理的293T/BTLA或293T/mock细胞,2×104个/孔,每组设3个复孔。于37℃、50mL/LCO2培养3d后用MTT比色法测定T细胞的增殖。另外,用04mg/L抗人CD3激发型mAb包板,将T细胞（1×106个/孔）与293T/BTLA或293T/mock细胞（2× 105个/孔）加于24孔板中共培养。3d后,用流式细胞术测定T细胞表面活化标记CD25的表达,并采用ELISA试剂盒测定IFNγ和IL10的分泌。2结果2.1人BTLA编码区全长基因的克隆、重组逆转录病毒载体的构建及其鉴定通过RTPCR法,从经PHA活化的人T淋巴细胞中扩增出大、小不同的两个基因片段（图1A）。测序结果表明,870bp的大片段为BTLA编码区全长基因,而726bp的小片段为缺失第3个外显子的BTLA基因的一种剪接体（结果未显示）。构建的重组逆转录病毒载体pEGZTerm/BTLA经EcoRI和BamHI双酶切后,能够释放出870bp的目的基因片段（图1B）,DNA测序进一步证明插入载体中的基因片段与BTLA基因的序列完全一致。2.2稳定表达人BTLA基因的293T细胞的制备及鉴定用Zeocin抗生素加压获得的转染BTLA基因的293T细胞,用激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测pEGZTerm载体中所带GFP报告基因的表达。结果显示,GFP高表达于mock细胞和BTLA基因转染的293T细胞上（图2、图3）。将融合蛋白HVEMFc与转染的293T细胞共孵育后,以PE羊抗人IgG为二抗,用流式细胞术检测转染细胞上BTLA的表达。结果表明,人BTLA基因已成功转入293T细胞中并能稳定高表达（图4）。图1人BTLA基因的克隆及重组逆转录病毒载体的酶切鉴定（略）Fig1CloningofhumanBTLAgeneandrestrictionenzymedigestionanalysisofrebinantretrovirusvectorA.M:DL2000DNAmarker;1:RTPCRproductofhumanBTLAgene(fulllengthbeing870bp,splicevariantbeing726bp,aspecificbandapproximatelybeing250bp).B.M:DL2000DNAmarker;1:LooplockedsupercoilpEGZTerm/BTLA(9527bp);2:DigestedproductofpEGZTerm/BTLA/EcoRI+BamHI(humanBTLAgenefulllengthbeing870bp,linearpEGZTermbeing8757bp).图2BTLA基因转染的293T细胞中GFP表达的激光共聚焦显微镜观察（略）Fig2ObservationofGFPexpressionin293Tcellstransfectedicroscope(×400)A:293T/mockcells;B:293T/BTLAcells.图3GFP在293T/BTLA细胞中表达的流式细胞术检测（略）Fig3DetectionofGFPexpressionin293T/BTLAcellsbyFCMA:293T/mockcells;B:293T/BTLAcells.图4BTLA基因转染的293T细胞中BTLA表达的流式细胞术检测（略） Fig4DetectionofBTLAexpressionin293T/BTLAcellsbyFCMA:293T/mockcellsbindingtoHVEMFc;B:293T/BTLAcellsbindingtoHVEMFc.2.3293T/BTLA细胞对T细胞的抑制作用以293T/BTLA细胞或293T/mock细胞（对照）为效应细胞,以纯化的T细胞为靶细胞,与04mg/L鼠抗人CD3激发型mAb或04mg/L抗CD3mAb+05mg/L抗CD28mAb共培养3d后,分别检测T细胞增殖和T细胞表面CD25的表达以及IFNγ和IL10的分泌。结果表明,与对照组相比,293T/BTLA细胞对经激发型抗CD28mAb和抗CD3mAb活化的T细胞的体外增殖具有一定的抑制效应(P005,图5）,并能一定程度地下调活化的CD4+、CD8+T细胞上CD25的表达（图6）,IFNγ与IL10的分泌也有所降低（图7）。图5293T/BTLA基因转染细胞对T细胞体外增殖抑制作用（略）Fig5Inhibitoryeffectof293T/BTLAonproliferationofTcells图6293T/BTLA细胞对T细胞CD25表达的影响（略）Fig6Influenceof293T/BTLAcellsonCD25expressiononTcells图7293T/BTLA细胞抑制T细胞分泌细胞因子的ELISA检测（略）Fig7Detectionofinhibitingcytokinesecretionby293T/BTLAcellsbyELISAA:0.4mg/LantiCD3mAb;B:0.4mg/LantiCD3mAb+0.5mg/LantiCD28mAb.3讨论BTLA不仅低表达于静止T细胞,而且T细胞活化后呈上调性表达2。研究表明,BTLA与其配体HVEM作用可诱导其胞浆段酪氨酸磷酸化,进一步募集含蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1,SHP2的Src同源结构域,从而传递抑制信号1,8。本研究用PHA刺激人外周血T细胞活化后,以RTPCR克隆了人BTLA全长基因。将其插入带有GFP报告基因的逆转录病毒载体中,并转染293T细胞,用Zeocin抗生素长期筛选后,通过激光共聚焦显微镜观测GFP的表达,用流式细胞术检测细胞膜上BTLA蛋白进行验证,结果表明,成功地建立了可稳定高表达人BTLA基因的转染细胞,提供了为研制抗人BTLA的mAb免疫原。将BTLA基因转染的293T细胞与T细胞混合,加入抗CD28mAb和激发型抗人CD3mAb激活T细胞后,发现BTLA基因转染的293T细胞可抑制T细胞增殖,下调CD25的表达及IFNγ与IL10的分泌。因此,该基因转染细胞对T细胞在体外的增殖与活化具有一定的负性调节作用。近期研究表明:共信号受体/配体分子间的信号普遍存在双向传递现象9,10,即受体与配体间可相互传递信号,引发生物学效应。故推测, 293T/BTLA细胞对T细胞的抑制效应一方面会不会存在这样一种可能:通过BTLA与HVEM的相互作用,由HVEM向T细胞内传递抑制性信号？也可能是,活化的T细胞表达的HVEM能上调另一配体LIGHT的表达,通过HVEM/LIGHT介导的正性信号进一步促进T细胞增殖与细胞因子分泌4。虽然研究已表明,在蛋白水平上BTLA和LIGHT能同时与HVEM结合11,但由于BTLA基因转染的293T细胞上的BTLA与T细胞上的HVEM结合后,可能由于在细胞之间的空间位阻限制了LIGHT与HVEM的结合,从而降低了HVEM/LIGHT信号途径对T细胞增殖的促进作用,尚待于进一步研究。