富勒烯及其衍生物在生物方面的应用

武汉大学学报(自然科学版)J.WuhanUniv.(Nat.Sci.Ed.)Vol146No12Apr.2000,133～136第46卷第2期2000年4月文章编号:0253,9888(2000)02一0137一05α富勒烯及其衍生物在生物方面的应用肖春华,吴采樱(武汉大学化学学院,武汉430072)摘要:介绍了富勒烯及其衍生物对人体免疫缺陷病毒酶(HIVp-1)的抑制、DNA的裂解、消除自由基和对生物膜的双重作用等方面的应用,及可能存在的作用机理1关键词:富勒烯;富勒烯衍生物;应用中图分类号:O634.5文献标识码:A富勒烯(C60)是除金刚石、石墨以外碳的第三种同素异形体,自1990年Huffman和Kratschmer等找到克量级制备方法以来C60的研究得到了飞速发展.C60是由12个五元环和20个六元环组成的三十二面体结构,有30个共轭双键,它提供了制备不同化学或生物化合物的机会,并具有广阔的应用前景,其中最有前景的应用领域之一是建立在它们的生物是一种病毒,称为HIV,这种病毒侵犯人的T淋巴细胞,引起大量T细胞死亡,从而导致严重的细胞免疫缺陷,人体兔疫缺陷病毒酶的活性部位,可被大致描述为一个周围全部排列着疏水氨基酸的无底圆筒形1与这种疏水趋势明显例外的是在活性部位尚存在两个能催化水进攻底物使肽键断裂的天冬氨酸(Asp25,Aspl25).Friedman等人4假设C60分子半径与所描述的人体兔疫缺陷病毒酶活性部位的圆筒形有相同的半径,由于C60(及其衍生物中C60的部分)主要是疏水性的,因而C60和人体兔疫缺陷病毒酶活性部位存在着一个强的疏水相互作用1这种相互作用使得C60衍生物成为HIVP的抑制剂,动力学分析也支持了HlVP和C60衍生物结合的驱动力是病毒酶中非极性活性表面和C60表面的疏水相互作用1除此,通过引入独特的静电相互作用,可以增加两者的结合能1在病毒酶的活性部位,催化性的天冬氨酸盐和C60表面上阳离子之间的盐桥具有明显的静电相互作用1已经发现几种二价金属阳离子是HlVP的抑制剂,通过在C60上引入一个酰胺盐桥可使配体和受体的结合能增加约17KJƒmol,使C60与HIVP的结合能力增大1000倍,大大加强了C60的抑制活性1特性基础之上1,如具有细胞毒性2,能促使DNA的选择性分裂3,抗病毒活性4和药理学特性5等1直接将富勒烯和生物活性物质相连,研究其在生理学上的应用前景也十分诱人,然而,由于富勒烯固有的疏水性,无法与人体内“靶分子”作用,使得它们在生物化学领域中的研究和应用受到很大的限制1近年来,对合成水溶性富勒烯衍生物方面的突破和成功,大大加速和扩宽了C60衍生物在生物方面的应用范围1本文针对C60及其衍生物在对细菌的抑制、DNA的裂解、消除自由基和对生物膜的双重作用等方面的应用作一简要评述1对人体免疫缺陷病毒酶(HIVP)和1细菌的抑制51993年Sijbesma等人又设计合成了水溶性的具有生物活性的二氨基二酸二苯基C60的衍生物,设计考虑要求这些化合物一端有极性官能团,对对人体免疫缺陷病毒酶(HIVP21)的抑制,是抗病毒疗法的一个可行的目标,也是治疗艾滋病的关键1艾滋病是一种新传染病,1984年证明它的病原α收槁日期:1999-07一10基金项目:教育部博士点基金资助项目作者简介:肖春华(1972)女,博士研究生,现从事固相微萃取涂层的研究1 年Ros和Prato8将N2取代的甘氨酸、醛和C60缩合HIVP而言,则含有正离子更好.合成的化合物1(见图1)溶于pH≥7的水中,使其成为一个评估C60衍生物的生理和药理活性的理想底物1它既是HIVP的抑制剂,在低浓度范围内又是人体兔疫缺陷病毒HIV21和HIV22反转录酶的抑制剂,化合物1的合成,为探索C60衍生物在生物医学方面的实际应用获得了突破性进展,该化合物对HIVP的抑制为人们展示了极为广阔的前景,从分子结构上看,化合物1键连的极性梭基一端是其水溶性的物质基础1而衍生物中C60母体又是其疏水性的依赖,C60表面和HlVP中非极性的活性表面的疏水相互作用,有效地阻断了病毒酶的活性,而化合物1结构的C60衍生物的极性链段部分,因其水溶而具有较好的生物化学特征1因而它是人们合成有潜在应用前景的抗病毒C60衍生物的一个很好的借鉴1得到新颖C60稠合功能化的吡咯烷2～4(图2).与富勒烯尼古丁相比,这些化合物在比率为9:1的水2二甲亚矾(DMSO)中显示了适宜的溶解性,其中4的溶解性优于2和3.在初步的生物测试中,发现4对一系列微生物有活性1在修饰的琼脂扩散测试中,不同种的细菌和霉菌菌种均被杀死1图2化合物2～4的分子式2致使DNA裂解核酸含有生物遗传信息,是一类重要的生物分子1它包括脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA两大类,DNA构成遗传信息物质,RNA直接参与蛋白质的合成,而DNA的裂变将引起细胞调亡,致使生物体变异1富勒烯具有光物理特性,有很深的颜色,在UV和可见光区显示了丰富的光化学行为,图1化合物1的分子式研究人员认为,在C60衍生物作为人体免疫缺陷病毒酶抑制剂时,含肽的抑制剂比非肽抑制剂有更强的活性,前者在亚毫微摩尔范围(10212)有活性,后者在毫微摩尔范围(1029)有活性1将1,22二在光的激发下,三线态C60可产生约一个单位能量,1O2.通过能量转换,可形成高产量的单线态氧(三线态也能氧化富电子底物.)而Tokuyama等人比较了几个C60衍生物(图3)的氢21,22亚甲基富勒烯602612梭酸共价连接到肽T的亲水的4～8序列(H2Thr2Thr2Asn2Tyr2Thr2OH)上,一方面使其更易溶于水;另一方面在人的单核细胞趋药性检测中能显示出活性1Toniolo等报道了该富勒烯肽的生物活性:6,并评价了富勒烯2肽的4～8序列,通过CD4ƒT4抗原激活单核细胞趋药性和对HIV21蛋白酶的活性抑制1结果表明,由于肽T是一个有效的人的单核细胞趋药性的兴奋剂,使得与肽相连的富勒烯也显示了高的向化特性1抑制剂XM323(即DPM323)抗HIV21蛋白酶的活性与二甲亚矾(DMSO)ƒ水溶液中的富勒烯2五肽相比,从峰面积积分计算的抑制率看,XM323可达55%,而富勒烯2五肽则可达40%.Prato等也报道了具有潜在生物活性片段的C60肽的衍生物7,并对其生物活性进行了表征,在对细菌的抑制方面,1996©1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net图3化合物5～8的分子式 光诱导生物活性2,发现将化合物7和超螺旋位置裂解1Yi2ZhongAn等人10PBR322DNA一起在黑暗中和可见光照射下保温通过实验证实鸟嘌呤时,光照射下的保温使共价键紧密联合的超螺旋DNA产生裂纹,在同样实验条件下,化合物6显示和3C60之间是单电子转移造成了DNA的选择性裂解1通过连接极性官能团到C60结构上可得到一些水溶性C60衍生物如化合物10～12(图5),这些二氢富勒烯类的光物理和化学特性与C601相似1低的DNA裂解能力,而部分溶于极性溶剂的化合物5和缺少富勒烯片段的参考化合物8则不能裂解DNA1Yamakoshi等人将C60和化合物9(图4)分别和PVP一起溶于水中,研究C60及带有吖啶基的C60衍裂解活性9.发现化合物9显生物的光诱导DNA示了比C60更强的对DNA的裂解能力1他们据此推测DNA的裂解可能是由于化合物9的C60部分产生的单线态氧引起的,而活性的增强可归于吖啶部分对DNA分子的亲和力的作用1图5化合物9的分子式由化合物12,他们得到了二氢富勒烯2脱氧低聚核苷酸(DHF2DON21).这个共轭化合物杂化到互补的单链DNA上,该体系和光及氧反应只破坏单链中最靠近C60的鸟嘌呤.通过与曙红连接的脱氧低聚核苷酸(Eosin2DON21)的对比实验发现,虽然与曙红和与C60相连的脱氧低聚核苷酸都引起单链鸟嘌呤的特定修饰,但两者在D2O中光解反应却明显不同,通常在D2O中光解能加强1O2的反应,假如C602脱氧低聚核苷酸修饰的鸟嘌呤产生的选择性位置裂解是由单线态氧1O2致活,则其裂解产率在D2O光解中应显著增加.实际情况却相反,Eosin2DON21对被修饰的鸟嘌呤的裂解产率显著增加,而对DHF2DoDoN21修饰的鸟嘌呤的裂解产率却没有明显影响,而且反应中也不被1O2的猝灭剂所抑制1图4化合物9的分子式用低能量的光照射DNA和C60羧酸的混合物时可产生选择性含鸟嘌呤链的裂解1实验证实C60羧酸在含水DMSO中产生单线态氧,并发现它对细胞生长和酶的活性有抑制作用,此水溶性的C60衍生物在可见光的照射下在鸟嘌呤的位置破坏DNA的行为,最开始被认为是在溶液中单线态氧和DNA的反应1即单线态氧通过4+2或2+2环加成,加成到嘌呤碱的五元咪唑环上修饰鸟嘌呤,这种修饰将极大地增强DNA中磷酸二酯键的碱水解速率.低聚核苷酸结合到RNA或DNA上,能阻塞靶RNA的翻译或通过与DNA形成三链螺旋结构阻止靶基因的转录1BOUTorine等人3认为含鸟嘌呤1这表明C60衍生物和单链鸟嘌呤的反应不是靠O2传递的,也即C60衍生物对单链DNA的光诱导,位1置选择性修饰不是通过O2作为活化剂,而是鸟嘌3呤和C60之间的单电子转移机理.C60诱导鸟嘌呤裂解的高选择性和与其它增敏剂相比的高活性使它成链的随机裂解,很有可能由于C60分子对DNA的非选择性的疏水结合,并认为若将有识别能力的基团连到C60核上,可增强对鸟嘌呤裂解位置的选择性1为验证这个想法,他们合成了有机官能化C60支承的142mer低聚核苷酸侧链,它可通过Watson2Crick氢键相互作用结合到单链靶RNA上,或通过由形为DNA裂解反应中的选择试剂1DNA裂解也会使有病或异常增殖的细胞调亡,通过连接靶向性的官能团,可能使富勒烯的作用发生在特定的部位,这为治疗某些癌症和一些疑难杂症提供了一条新途径,而从单线态氧1O2到单电子转移机理,标志着对作用机理认识的深入,随着富勒烯作用机理的进一步揭示,必将会给富勒烯及其衍生物在DNA裂解方面的应用带来深远的影响1成Hoogsteen氢键结合到双链靶DNA上1实验证明裂解发生在限定的鸟嘌呤碱基位置1这类富勒烯2低聚核苷酸共轭物具有较高位置特定性,能通过形成双或三链螺旋结构有效地修饰DNA,致使其特定 结合入微粒中,暴露在UV的类脂过氧化物1光下,诱导产生了显著3除去自由基Kamat等的研究显示由C60(OH)18光敏化作用产生了显著的膜过氧化作用,并用不同参数评价和某些情况下生物体需要活性氧来完成生理过程,如吞噬细菌,前列腺素合成,凝血酶原合成,肝脏对外来毒物的解毒等1但许多情况下,活性氧积累过剩时,又会产生损伤作用,如氧自由基和H2O2能研究了膜的过氧化作用鸟嘌呤机理1认为这种作用是基于l型和¦型的反应1在l型反应期间,是在敏化剂的三线态状态和底物产生的基团离子之间的除氢或电子转移,从激发的敏化剂到分子氧的能量够损伤细胞中DNA和膜,致使一些细胞坏死,人们1转移导致了02的产生,形成了¦型反应,试验显示已经发现许多疾病是由氧自由基触发的,机体衰老也与此密切相关.Chiang等人最近报道水溶性的多羟基富勒烯衍生物(fullerenols)对消除由黄嘌呤由单线态氧粹灭剂Β2胡萝卜素,叠氮化钠等产生的抑制百分率非常低(10%～11%),这意味着在氧化1产物的形成中,O2的作用是微不足道的;另一方和黄嘌呤氧化酶产生的超氧基O-2有很好的效果11面,自由基清除剂叔了醇、甘露糖醇(对-OH起作该富勒烯醇化合物比母体C60减少了它们固有的生物毒性1一些具有电子亲和力的富勒醇成为合适的试剂,用于生物体系的自由基去除和水溶性的抗氧化剂以减少有病血液中的自由基的浓度和抑制不正常或有病细胞的生长,实验表明,当溶液中富勒醇的2用)和超氧化物的歧化酶(对O2起作用)在相当程度上(30%～50%)抑制了过氧化的破坏,过氧化氢酶,H2O2的抑制剂也显著地抑制了过氧化作用1这说明膜破坏发生主要由l型机理支配1对蛋白质的氧化破坏以蛋白质氧化作用和膜酶浓度为50mg·L21时,对O-基的清除率可近达2损失为例也是由C60(OH)18诱导的,这个现象独立80%1同时通过光谱吸收实验和化学发光技术实验还显示富勒烯醇的存在对由黄瞟呤氧化而产生的尿酸的量没有影响,这意味着它对黄嘌呤氧化酶没有于类脂过氧化作用之外,直接地影响细胞的蛋白质和细胞的完整,因此Kamat等认为这个富勒烯衍生物具有诱导生物体系决定性分子破坏的能力1同抑制作用,而直接对O-2起抑制作用1时,类脂过氧化作用也产生了稳定和有毒的产物1李文铸、黄文栋等采用逆相蒸发技术得到了水对生物膜的双重作用4溶性的C602脂质体包结物,当该包结物与体外培养的人子宫颈癌细胞融合后,用卤素灯照射,发现对癌生物膜与众多生命过程密切相关,而它是由双层脂和蛋白质组成,最常见的是卵磷脂.UV、敏化剂和氧的光敏作用,因能产生大量破坏不同决定性生物分子的反应性氧,造成了生物体系里潜在的破坏反应1例如在光敏化作用中产生的过氧化氢(ROO),羟基(OH)和单线态氧(1O2)都具有诱导类脂过氧化作用的能力,而类脂的过氧化作用能惊人地改变膜的结构和功能,对有机物产生严重后果1除了膜类脂的过氧化作用,蛋白质的氧化作用也是具有强破坏性,它能够改变细胞膜的完整,引起流动性的损失,膜效能的降低,对离子渗透性的增加,这种破坏性的积累最终将导致细胞及细胞中类脂质含量的释放等等1研究表明富勒烯能传递电子通过类脂双层;能致钝病毒的被膜和调节免疫效果.Sera等人最近报道富勒烯诱导鼠肝脏微粒体的诱变是通过形成类脂过氧化物产生的1Kamat等使用鼠肝脏微粒体作为模型体系,评估了由C60(OH)18诱导的对类脂和蛋白质的生物化学的改变12.结果表明,将C60(OH)18细胞具有很强的杀伤力13.对其杀伤机理的研究,认为同时存在单线态氧和自由基两种机制14.这一结果使人们有可能用C60及其衍生物修饰的生物膜体系作为癌症早期诊断和治疗的手段1因为癌是由于一种以膜为基础的组织、生物膜在细胞分裂、游动和增殖的过程中起着极其重要的作用,研究认为,来自初生肿瘤的转移细胞进入血液中,虽然绝大部分都被天然杀伤细胞杀死,但极少数癌细胞作为信号细胞在循环中或在凝块的癌细胞中游走,当发现了适当的进攻位置之后,转移癌细胞侵入内皮和膜之间的区域1在穿过膜时,转移细胞倍增并成为新的肿瘤,对于长成直径0.5cm大小的肿瘤,大约需要910个细胞,其中大部分都是潜在性转移来的,到这时,对于有效的治疗来说就太晚了,因此,治愈癌症的难题之一就是早期诊断1C60及其衍生物在这方面将具有潜在应用前景1从以上的例子不难看出,富勒烯及其衍生物在生物方面的应用,始终伴随着溶解性的要求1只有©1994-2013ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net 有效地溶解C60或得到可溶性的C60衍生物,才可能产生理想的生物活性.同时,生物体也是一个复杂的有机体,从各方面的相互协调,相互制约中达到平衡C60对HIV病毒的抑制,对自由基的清除,及对癌细胞的杀伤等有有利的影响,亦可能对生物体产生不利甚至是有害的负作用,如何最大程度地利用富勒烯及其衍生物趋利避害,仍然是化学家和生物学家一个挑战性的任务14562.PratoM,BiancoA,MagginiM7,etal.SynthesisandCharacterizationoftheFirstFullerene2peptide.JOrgChem,1993,58:557825580.8RosTD,PratoM,NovelloF,etal.EasyAccesstoWater2solubleFullereneDerivativesvia1,32dipolarCycloadditionsofAzomethineYlidestoC60.JOrgChem,1996,61:907029072.YamakoshiYN,YagamiT,SueyoshiS,etal.Acri2dineAdductof60FullereneWithEnhancedDNA2cleaving9参考文献:,1996,61:723627237.Activity.JOrgChemAnYZ,ChenCHB,AndersonJL,etal.Se2quence2specificModificationofGuanosineinDNAbyaC602linkedDeoxyoligonucleotide:EvidenceforaNon2singlet101KurzA,HalliwellCM,DavisJJ,etal.AFullerene2modifiedProtein.JChemSocChemCommun,1998,(3):4332434.TokuyamaH,YamagoS,NakamuraE.PhotoinducedBiochemicalAciivityofFullereneCarboxylicAcid.J1996,52(14):OxygenMechanism.Tetrahedron,517925189.211ChiangLY,LuFJ,LinJT.FreeRadicalScaveng2ingActivityofWater2solubleFullerenols.JChemSocChemCommun,1995,(12):128321284.KamatJP,DevasagayamTPA,MohanH,etal.EffectofC60(OH)18onMembranesofRatLiverMi2crosomesDuringPhotosensitization.FullSciandTech,1998,6(4):663.LIWZ,QIANKX,HUANGWD,etal.WaterSol2ubleC602liposomeandtheBiologicalEffectofC60,toHumanCervixCancerCells.ChinPhysLeu,1994,11(4):2072210(Ch).LUCY,YAOSD,ZHANGDD.Supramolecular1993,115:791827919.AmChemSoc,3BoutorineAS,TokuyamaH,TakasugiM,etal.Fullerene2oligonucleotideConjugates:Photoinduced12Sequence2specificDNACleavage.AngewChemintEdEng1,1994,33:246222465.FriedmanSH,DeCampDL,SijbesmaRP,etal.InhibitionoftheHIV21ProteasebyFullereneDeriva2tives:ModelBuildingStudiesandExperimentalVerifi2cation.JAmChemSoc,1993,115:650626509.SijbesmaR,SrdanovG,WudlF,etal.SynthesisofaFullereneDerivativefortheInhibitionofHIVEn24135141993,115:651026512.zymes.JAmChemSoc,ChemistryofFullereneC60、C70.1998,(1):126(Ch).HuaXueTongBao,6TonioloC,BiancoA,MagginiM,etal.ABioactive,1994,37:45582FullerenePeptide.JMedChemApplicationofFullereneanditsDerivativesinBiologyXIAOChun-hua,WUCai-ying(CollegeofChemistryandEnvironmentScience,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)Abstract:Fullerene(C60)hassttractedincreasingattentionsinceitwasdiscoveredin1985.IthasbeenxpectedthatC60hasabiologicalactioncausedbyitsuniqueshapeandcharacteristicphysicochemicalproperties,suchasinafacialredoxreactionandphotosensitization.However,biologicalstudieshavebeenhinderedbecauseofthehydrophobicnatureoffullerene.Inanattempttoovercomeproblemsassociatedwiththeirinsolubilityinaqueoussolution,thescopeofapplicationoffullereneanditsderivativesinbiologyhasbeenbroaden.Thearticleintroducedapplicationoffullereneanditswater2solublederivativesinbiology,suchasinhibitionofHIV21protease,cleavageofDNA,free2radicalremoverorinfluenceoncellularmembranes,andreviewedthepossibleinteractionmechanismbetweenfullereneandthematrix.Keywords:Fullerene;derivativeoffullerene;application