离子束生物技术在生命科学中的应用

离子束生物技术在生命科学中的应用第29卷第2期2006年2月核技术NUCLEARTECHNIQUESVo1.29,No.2February2006离子束生物技术在生命科学中的应用曾宪贤,武宝山1,2吕杰,21(新疆大学离子束生物工程中心乌鲁木齐830008)2(新疆大学物理系乌鲁木齐830046)摘要我国科学家80年代发现了离子注入的生物效应,并将这一原理应用于诱变育种.本文介绍了离子束生物技术及原理,低能离子束注入生物学效应的研究,离子束生物技术在新疆的应用和发展.关键词离子注入,诱变育种,应用中图分类号TL503.4,Q691.$816_3受太空育种等辐射育种的启发,20世纪80年代中国科学院等离子体物理研究所开创了离子束注人生物新技术.经过二十多年的发展,该技术研究无论在理论还是实际应用方面都取得了一定进展.在诱变育种,转基因以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些重要的阶段性研究结果.其中在植物及微生物诱变育种的研究应用中,利用离子注入进行品种改良已在生产实践中得到广泛的推广应用.离子注入是一种具有能量沉积,动量传递,质量沉积和电荷中和与交换联合作用的诱变源,相当于一 种复合诱变源,使该技术比其它诱变方法能产生更为广泛的诱变图谱.因此,离子注人进行生物诱变育种已成为诱变育种研究的热点.本文对离子束生物技术的原理进行了概括,并对离子束生物技术在新疆的应用与发展进行了综述.1离子束生物技术及原理核技术是现代科学技术的重要组成部分,是当代最主要的尖端技术之一,也是社会现代化的标志之一.核技术的范围十分广泛,它包括核武器,核动力,同位素和辐射技术.民用非动力核技术应用产业包括的内容之一是辐射加工和材料改性.离子束在生物技术上的应用是我国在80年代中期由中国科学院等离子体物理研究所余增亮研究员等一批科技工作者开创的新的研究领域,是育种方法学的重要创新.离子束生物工程学自诞生以来,已成为名副其实的高新技术成果孵化器.在装置发明,方法学创新,新种质资源创建,新品(菌)种培育等方面,每年都有一批成果产出.离子束诱变技术,离子束DNA大分子转移技术,离子束辅助农杆菌遗传转化技术,离子束介导超远缘分子杂交技术和离子束细胞加工技术等,已成为具有我国自主知识产权的定向遗传改良的新方法,新途径….离子束诱变育种与传统的辐射法及化学诱变剂相比,具有损伤轻,突变率高,突变谱广,遗传稳定,易于获得理想新品(菌)种等特点,对品(菌)种的选育是较理想的方法.可以预言,离子束在科学中的应用研究正处在重大突破前夜,并将成为2l世纪生命科学研究的支撑技术之一. 重离子通常是指原子序数比氦大的,被剥离或部分剥离了轨道电子的原子核,带正电荷,如碳,氮,氖及氩离子等.低能重离子通常是指l0～lOOkeV的重离子.然而由于过去通常认为低能离子注人生物体组织的深度有限,对机体作用不大,因此国际上在这一领域内的研究主要限于l0.～10eV的高能重离子的辐射生物学及其在肿瘤治疗上的应用,而低能重离子的研究主要集中在半导体掺杂和离子注人金属材料表面改性方面.重离子与x射线,Y射线(都属于光子流)及电子束等低线性能量转移值(Linearenergytransfer.LET)辐射相比具有一些重要的特征:如传能线密度高以及能在生物组织内产生高密度的激发和电离作用等.在能量损失过程中在射程末端形成电离峰(又称Bragg峰),因而离子作用于生物体的主要效应是局部的,可控的,可选择的,相对生物学效应大,氧增比小,损伤可修复性小等.由于这些独特的性质,低能重离子在生物学,医学和农业上正展现出美好的应用前景,成为辐射生物学发展的一个新领域并日益引起人们的兴趣l2】.1986年,中国科学院等离子体物理研究所余增亮率先把低能重离子注入技术应用于水稻诱变育国家自然科学基金项目(19865001),岛鲁木齐巾重大基金项目(YO010),崮家发改委高技术产业化示范工程项Lt(发改高计[200412077号)第一作者:曾宪贤,男,1942年5月出生,1964年毕业于北京大学,教授,硕十研究生导师,主要从事核物理和离子束生物工程方面的研究收稿日期:200510.09第2期曾宪贤等:离子束生物技术在生命科学中的应用 种,表现出生理损伤小,突变谱广,突变频率高的统计结果,并有一定的重复性和方向性的诱变效应,开辟了低能离子与生物体相互作用的新的研究方向,建立了质量,能量,电荷三因子作用的机制体系,创立了"离子束生物工程学"(也叫低能重离子生物学).这一新型的交叉基础学科被认为是中国兴起的辐射生物学发展的新领域,填补了辐射生物学的空白,受到国内外专家的关注.经过十余年的努力,离子束生物工程学在基础研究领域为分子生物学,遗传工程等方面的研究提供了新的研究手段,同时新的实验证据使得人们对低能离子在生命中的作用有了新的认识.1.1低能离子束注入生物学效应的研究加速后的重离子具有一定的静止质量,注入生物体后可使质量,动量,能量和电荷共同作用于生物体,且注入离子同时还具有高LET和尖锐的Bragg峰.不同的质量数,电荷数和能量又可根据需要进行组合,这种离子注入生物体后质,能,电的联合作用比核辐射对生物体的作用内容更为丰富,它将会对生物细胞乃至生物大分子的生理,生化功能产生重大影响,从而引起染色体突变I引.注入离子与生物体作用的原初过程可分四个方面,即能量的沉积,动量的传递,质量沉积和电荷的交换,此过程大约在10-一lOS内同时发生,很难区分各自的独立作用.1.2离子束生物工程学的应用进展离子束注入作为新的诱变源表现出损伤轻,突变谱宽,突变率高的统计结果,因此具有良好的应用前景【5】.在遗传改良上应用开展最早的是诱变育 种.据统计,仅1994年至1997年,经离子束处理选育出的8个新品种,新增经济效益就达l5亿元【6J.众所周知,作物产量,品质,抗性等性状往往是由多基因控制的.传统的诱变技术在对这些性状的改良上效果不佳,而离子束诱变技术对这些性状的改良效果显着.其原因在于离子注人除了像一般辐射一样由于能量作用引起DNA链断裂外,还由于质量,能量,电荷的三因子协同引起大量受体原子移位,重组,形成新的分子结构和基因,产生丰富的基因突变.因而,可以在损伤轻的情况下获得较高的突变率.这种诱变技术自应用以来,一直倍受青睐.目前,在农作物诱变育种方面,离子注入改良的范围几乎涉及所有的主要粮食和经济作物.离子束在改良微生物方面也取得了可喜的成果.淮南制药厂林可霉素出发效价2600u/mL,经过中国科学院等离子体物理研究所离子束生物工程实验室微生物攻关小组一年的诱变筛选后,效价达到3100u/mL,提高了25%.经过两年的筛选,之江霉素发酵水平由200单位提高到500单位[4】.经过离子注入筛选的花生四烯酸生产菌发酵水平高于出发菌70.5%,中试效果良好,AA产量最高达4.59g/LJ.利用离子注入单宁酶菌产生菌——黑曲霉选育高产菌株,获得高产菌株酶活可达34.5u/mL,较原始出发菌提高近5倍.远缘杂交是创造新物种和向异源物种转移有利基因的重要途径,具有重大的理论和实践意义,但由于亲缘关系较远的物种间存在生殖隔离,会出现远缘杂交中的不亲和现象,使杂种不结实.因此, 有关提高远缘杂交结实率的研究是十分有意义的.离子束生物工程在创造新资源和远缘杂交方面取得了较大的进展.用紫玉米全DNA转化水稻得到的玉米稻新品系,茎杆粗,抗倒伏,光合速率比原品系提高84%,区域试验中亩产在650kg以上.安徽农业大学用离子束处理玉米得到的高光效多穗型材料一对生玉米,对玉米高产育种是一种极其宝贵的中间材料.安徽农业大学利用离子注入技术注入海岛棉和陆地棉杂交F1种子,其后代遗传性稳定,从中选育出了结合海岛棉和陆地棉性状的稳定优良品系J.因此,离子注人对于生物体的作用是多方面的.离子束外源基因转移技术是低能离子束注入在生物工程上应用的重大进步.这种技术的原理是利用离子束对植物细胞的刻蚀作用【9J,造成受体细胞表面的损伤和穿孔,从而引起细胞膜透性和跨膜电场的改变,将外源基因引入植物细胞.转基因的方法很多,但作为一种新的导入外源基因的方法,低能离子束介导的外源基因转移技术的突出优点是:(1)利用种子胚和愈伤组织等作为外植体,便于取材和批量操作,同时也省去了原生质体制备和再生植株的麻烦,是一种方便,有效的外源基因转移技术.(2)由于向生物细胞注人的是带电荷的离子,带正电的离子注人后,电荷交换使微通道积累正电荷,便于吸引带负电的外源DNA主动进人细胞.(3)利用离子束作用细胞体时存在峰值,如果对峰值控制得当,就可以对微通道内的部分染色体造成损伤,便于外源DNA与受体细胞DNA的重组和整合.在总结多种植物的多品种转化经验的基础上,离子束介 导转基因技术体系已经初步形成.2离子束生物技术在新疆的应用和发展2.1离子束注入装置新疆大学离子束生物工程中心科研人员从114核技术第29卷1997年开始借用中港合资新疆贝肯工业发展有限公司的LCD.1000多功能离子注入机对新疆农作物种子进行改良.该机主要用于金属材料改陛,其本身的结构(靶室,离子源,真空系统,操作控制,机电能源)不适合离子束生物工程的研究与应用.为此,本中心需对离子束生物工程装置的智能化,小型化和特殊靶室进行设计,加工和安装,其目标为:研制能处理含水量高的特殊样品靶室,靶室直径不小于900mln,并有可自动控制转速,角度的转盘,转盘上可放6__8个直径为200m/n的样品盘.设计,加工用于微生物,植物细胞离子束处理的无菌操作环境的小靶室.2.2离子束农作物育种新疆长绒棉l7万亩,品质优良,但产量只有1.5X10t;陆地棉1485万亩,产量1.4X10.t,而品质急需提高;甜菜165万亩,产糖5.31×10.t,而含糖率逐年下降;甜瓜22万亩,产量2.95X105t;西瓜26万亩,产量4.95X10t.在这些新疆特色农业中,提高含糖量,产量,早熟,抗病是急需解决的课题.新疆的红色食品,如西红柿,辣子,红花,枸杞子,红枣以及新疆特有的食(药)菌均可用离子束生物技术培育新品种(系),使其更加发挥新疆特 色农产品及特色食品加工业的优势.(1)《离子注入对新疆甜菜品种的改良和生物效应研究》已于2002年6月通过自治区科技成果鉴定.该项研究在甜菜育种上做了开创性工作,获得甜菜早熟亲本材料一份,甜菜产量和含糖量同时增加的亲本材料二份,填补了国内外在甜菜育种上应用离子束技术的空白,达到国际同类研究的先进水皿[1O,l1】l0(2)离子注入的加工番茄比对照早熟20d,产量提高25%,番茄红素等七项品质因素略有提高,当代效应十分明显.Mz代稳定遗传,今年产量提高到3O%【.(3)四平头辣椒经离子注入后显着提高了对疫霉病的抗性,有望解决多年来一直困扰生产的辣椒抗病难题.今年处理的四平头辣椒继续表现出对疫霉病的抗性.(4)不同注量的低能离子注入五叶茄种子,通过M1代和M2代的筛选,分离,筛选,M3代已出现了完全不同的性状表现.座果数高达4.6-_6个,最大果重1.9—3.45,同时,两处理的M3代外形和果色也有明显区别u引.(5凝离子注入的麻黄草种子的发芽率和出苗率从原来的20%提高到了90%以上.正在进一步研究和开发右旋麻黄素的含量.(6)百日草经离子束注入后,由一种颜色变为五种颜色,可为花卉市场提供新材料.2.3离子束微生物育种(1)国内外将离子束生物技术应用于谷氨酸高 产菌株的选育,经过一年多的努力,获得了产酸率比出发菌株提高了二个百分点以上的优良菌株2株,中试后,可进行技术转让ll.(2腐子注入纤维分解细菌的研究在国内外也已经提出.N注入后,FPA活性提高了4.1倍,CMCase活性提高了2.5倍;N注入后,纤维素酶的pH稳定性,温度稳定性和对底物的适应性均有不同程度的提高Il引.设计了引物Pl,P2,以高酶活菌株和出发菌株总DNA为模板,用引物Pl及P2进行PCR扩增,得到大小约1500bp的扩增产物.序列分析测序结果与GeneBank中的相关序列进行同源性比较,表明获得所要的纤维素酶基因序列其全长为1500bp,该序列已被GeneBank,收录登录号是AY766381.基因序列部分碱基发生了变化【I制.目前正在进行真核表达载体的构建和表达工作.(3)利用离子注入技术改良阿魏菇,猴头菇,香菇等食(药)用菌的品质,选育耐高温新品种进行反季节生产,同时进行食(药)用菌的液体深层发酵和深加工等研究,并实现产业化.通过简易组织分离,筛选得到一株阿魏菇低温型品种.以此为基础,通过离子束诱变,分离,筛选得到2株在33~C菌丝生长正常的耐高温阿魏菇新品系.目前针对实验室筛选得到的3株阿魏菇新品种,正进行出菇小试和液体发酵试验.(4)以黑曲霉最优菌种为出发菌,在实验室条件下发酵水平的基础上,经离子束诱变筛选后,实现以下三项技术指标的任意两项:①产酸能力提高两个百分点,②发酵周期缩短5h,③糖酸转化率提高六个百分点. 2.4离子束介导DNA大分子转移"离子束介导麻黄碱基因组DNA的遗传转化"课题,今年又得到国家自然科学基金委的资助.通过离子束介导麻黄DNA大分子转移,研究麻黄碱基因组DNA在酵母菌中的高效表达和稳定移传途径,创建麻黄碱新基因型材料,为微生物发酵生产麻黄碱奠定基础,将对我国干旱半干旱地区生态环境的保护和民族制药业的发展产生深远的影响.3结束语新疆地域辽阔,资源丰富.根据新疆自治区党第2期曾宪贤等:离子束生物技术在生命科学中的应用l15委和人民政府对新疆经济建设和社会发展的战略部署,本中心以"种子工程"为切入点,联合新疆地方和兵团,农,牧,草,林,微生物,食品等科研单位,紧紧围绕新疆种植业,畜牧业,发酵行业的产业结构调整,培育新的增长点,带动产业群的发展,促进新疆自身科技的创新能力,促进新疆自身的科技和交叉学科的发展,促进新疆自身高层次科技人才的培养,并实现环境效益,社会效益和经济效益的统一.使离子柬生物工程学这一新的交叉学科得到进一步的充实和发展.参考文献l陈佳洱.核技术.北京:科学出版社,1991.14O一156CHENJiaer.NuclearTechniques.Beijing:SciencePress,1991.14一1562余增亮.物理,1997,26(6):333--338YUZengliang.Physics,1997,26(6):333--3383宋道军,余汛,姚建铭,等.生物化学与生物物理, 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methodtothemutationbreeding.Thearticlegivesabriefintroductiontothetheoryofionbeambio—technology,thebiologicaleffectoflowenergyionbeamandtheprogressofstudiesonionbeambio.engineeringinXinjiang-KeywordsIonimplantation,Mutationbreeding,ApplicationCLC1103.4,Q691,$816.3