项目报告 DGGE法研究细菌群落结构及多样性分析

'北京亿鸣复兴生物细菌群落结构及多样性实验报告1材料与方法1.1样品2011年2月27日客户提供的12个PCR产物样品。样品编号分别为A0、A1、A2、A3、A4、A5和B0、B1、B2、B3、B4和B5。1.2细菌16SrDNA片段的PCR扩增以客户提供PCR产物为模板，采用引物GC-338F和518R扩增客户提供样品16SrDNAV3高变区序列。PCR扩增体系（50μL）为：10×PCRbuffer5μL；dNTP（2.5mM）3.2μL；rTaq（5U/μL）0.4μL；GC-338F（20mM）1μL；518R（20mM）1μL；模板DNA50ng；补ddH2O至50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环；最终72℃延伸10min。PCR产物采用OMEGA公司DNAGelExtractionKit纯化回收。PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。1.3PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析取10μLPCR的产物进行DGGE分析。采用变形梯度为40%～60%，浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7mol/L和40%（v/v）的去离子甲酰胺）在1×TAE缓冲液中200V60℃下电泳3小时。变形梯度凝胶电泳（DGGE）完毕后，采用银染法染色。1.6DGGE图谱中优势条带的回收与测序用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，并回收目的条带中的PCR产物。以2μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系（50μL）为：10×PCRbuffer5μL；dNTP（2.5mM）3.2μL；rTaq（5U/μL）0.4μL；F（20mM）1μL；R（20mM）1μL；模板DNA1μL；补ddH2O至50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后，72℃延伸10min。将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到pEASY-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，由北京亿鸣复兴生物科技有限公司对插入的细菌16SrDNA片段进行序列测定。 2结果与分析2.1细菌16SrDNA的PCR扩增以GC-338F/518R为引物扩增细菌16SrDNA序列，得到约200bp的DNA片段（图1）。图1引物GC-338F/518R扩增样品16SrDNA部分序列电泳检测图2.2PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）客户样品16SrDNAPCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析结果如图2。B0B1B2B3B4B51234567891011121314151617181920图2B样品细菌16SrDNA-PCR产物DGGE电泳图谱Note：红色数字对应条带为切胶回收条带 2.3主要电泳条带的序列测定及其序列分析将DGGE电泳图谱中的条带切胶回收后，用引物338F-518R对其进行重新扩增（图3），并将纯化后的扩增产物连接到pEASY-T载体中。每个回收条带选取3个阳性克隆进行了序列测定，见表2。图3引物338F/518R扩增样品细菌16SrDNA部分序列电泳检测图表2DGGE图谱中主要条带的序列分析DGGEband123456789101112131415Nearesttypestrain(accessionNo.)Unculturedbacterium(AB369002)Unculturedbacterium(FJ477325)Acinetobacterbaumannii(CP001172)Serratiasp.(EU781738)Dyellayeojuensis(DQ181549)Ochrobactrumanthropi(FJ374126)Pseudomonassp.(AJ512401)Sphingomonassp.(AY177366)Acinetobacterjohnsonii(GQ169068)Shewanellasp.(EU073095)Ochrobactrumgrignonense(FN298272)Devosianeptuniae(AF469072)Unculturedbacterium(EU805183)Unculturedbacterium(EU134714)Unculturedbacterium(AY321244)Numberofcolone126339333336121233Sequenceidentity100%93%100%98%99%99%100%94%100%92%100%99%99%98%88%利用MEGA4.0软件对细菌进行系统发育学分析，采用Neighbor-joining法构建系统发育树，如图4。 图4DGGE图谱中回收条带所代表细菌的系统发育树'