大学生实验创新计划项目报告书

'大学生实验创新计划项目结题报告书项目名称：七彩山鸡源大肠杆菌产ESBLs的检测及药敏分析主持人：施冲旭所在学院：牧医工程学院专业年级：08级动物医学指导教师:潘玉善职称讲师起止年月：2009年10月至2010年3月填写日期：2010年4月14日 七彩山鸡源大肠杆菌产ESBLs的检测及药敏分析 施冲旭、杜艳丽、冯芬芬、黄旭东、翟明胜指导老师：潘玉善摘要：采用全自动微生物鉴定系统（Vitek-32）鉴定了8株七彩山鸡源大肠杆菌，并对分离菌进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测，及对14种抗菌药和2种复方药物进行敏感性测定。结果显示，分离的8株菌大肠杆菌均不产ESBLs，对药敏试验结果表明该珍禽养殖场分离的大肠杆菌对兽医临床中常用的3大类抗菌药（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类）9种药物均产生高度耐药，显示出严重的多重耐药性。关键词：七彩山鸡；大肠杆菌；超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）；药敏分析七彩山鸡是珍禽品种中养殖比较简单、抗病力强、市场销路大，已在我国南北各地得到普及发展的优良珍禽品种。但近年来，随着养殖规模和养殖区域的扩大，一些常见条件性致病菌如大肠杆菌，也像肉鸡场、蛋鸡场那样常发，给养殖户带来很大的损失。目前，鸡大肠杆菌病的治疗主要依靠抗菌药，但随着抗菌药的广泛、大量甚至不规范使用，细菌耐药性的产生越来越严重，给临床预防和控制该病造成很大困难。2009年7月，荥阳某珍禽有限公司饲养的七彩山鸡于20日龄时开始发病，经药物治疗无效后，送我室求诊，根据其发病情况、临床症状、剖检变化及Vitek-32全自动微生物鉴定仪鉴定，确诊为大肠杆菌感染。为探明该鸡场药物防治失败的原因，本试验对临床分离的8株鸡大肠杆菌进行了ESBLs检测，并用标准K-B纸片法测定了8株菌对14种抗菌药物及2种复方药物的敏感性，以便为掌握鸡大肠杆菌产ESBLs情况以及临床合理选择抗菌药提供科学理论依据。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株来源 8株试验菌源于2009年7月自荥阳某珍禽有限公司送检患病死亡的七彩山鸡肝脏和心脏分离，并经Vitek-32全自动细菌鉴定仪鉴定的大肠杆菌。质控菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922（由中国普通微生物菌种保存中心提供），肺炎克雷伯菌ATCC700603（由北京大学医学部提供）。1.1.2药敏纸片药敏纸片：头孢他啶CAZ、头孢噻肟CTX、氨曲南AZT均为30μg/片，头孢他啶/棒酸CAZ/CA、头孢噻肟/棒酸CTX/CA均为30/10μg/片；阿米卡星（AN）、氨苄西林(AM)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GM)、链霉素(S)、妥布霉素(TM)、新霉素(N)、米诺环素(MNO)、多西环素(DO)、氨苄西林/舒巴坦(AM/SU)、左氧氟沙星(LVF)、诺氟沙星(NOR)、磷霉素(FOS)、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT)，以上药物均为北京天坛药物生物技术开发公司生产。1.1.3培养基麦康凯琼脂、MH琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤均购自广东环凯微生物科技公司，SS琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.4仪器VITEK-32全自动微生物鉴定系统和GNI革兰氏阴性菌鉴定卡：法国生物梅里埃公司产品；超净工作台（苏净集团安泰公司制造），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）等。1.2方法1.2.1细菌的分离、鉴定无菌从病死鸡中挑取少许心、肝组织接种于TSB增菌液中增菌培养18h，再次划线接种于麦康凯琼脂平板上和SS琼脂平板上，37℃恒温培养18h后挑取在麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板上单个典型菌落进行纯培养。经涂片、染色、镜检，证实为纯培养物，将其作为试验受试菌株。然后经Vitek-32全自动微生物鉴定系统进行鉴定。1.2.2ESBLs的检测按美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的表型确证试验法进行：将浓度为0.5个麦氏单位的受试菌液用无菌棉签涂布于MH平板，分别两两对应贴上头孢他啶（CAZ，30　μg/片），头孢他啶/棒酸（CAZ/CA，30　μg/10　μg/片），头孢噻肟（CTX，30μg/片），头孢噻肟/棒酸（CTX/CA，30　μg/10　μg/片）纸片，37℃培养16 h，测量抑菌圈大小。当两组药物中有任意一组中有加CA的抑菌圈直径比不加CA的抑菌圈直径相差≥5mm，即确定为产ESBLs菌株。1.2.3药物敏感性试验采用标准K-B纸片法，测定药物对细菌的抑菌圈大小（mm），试验结果按照CLSI[7]标准判读敏感、中介和耐药。2结果与分析2.1细菌分离鉴定结果临床分离的8株细菌在麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板上均形成粉红色菌落；分离株经纯化培养后，经Vitek全自动细菌鉴定仪和GNI+革兰氏阴性菌鉴定卡鉴定，结果为大肠杆菌。2.2ESBLs检测结果8株山鸡大肠杆菌产ESBLs的表型确认试验结果见表1，从表1可以看出：在确证试验中8株菌由CTX或CAZ在加酶抑制剂与不加酶抑制剂的抑菌圈直径差均小于5mm，确认为不产ESBLs菌株。各药对质控菌的抑菌圈均符合CLSI规定的标准。表18株七彩山鸡大肠杆菌疑似产ESBLs的菌株的表型确认试验结果（抑菌圈直径单位：mm）菌株bacterial头孢噻肟CTX头孢噻肟/棒酸CTX/CA阴性/阳性（-/+）头孢他啶CAZ头孢他啶/棒酸CAZ/CA阴性/阳性（-/+）E.coli13232-2827-E.coli23232-2827-E.coli33332-2826-E.coli43132-2827-E.coli53131-2726-E.coli63031-2626-E.coli73031-2626-E.coli83233-2827- 2.3药敏试验结果用标准K-B纸片法测定14种药物和2种复方药对细菌的抑菌圈大小（mm），试验结果按照CLSI[7]标准判读敏感、中介和耐药。测定结果如表2和表3。表214种药物和2种复方对8株山鸡大肠杆菌的抑菌圈大小（单位：mm）药物AntimicrobialagentE.coli1E.coli2E.coli3E.coli4E.coli5E.coli6E.coli7E.coli8氨苄西林（AM）66666666氨苄西林/舒巴坦（AM/SU）1715151716151420头孢他啶（CAZ）2828282827262628头孢噻肟（CTX）3232333131303032阿米卡星（AN）66666666庆大霉素（GM）66666666链霉素（S）66666666妥布霉素（TM）66666666新霉素（N）2120141918181818米诺环素（MNO）202061119191714多西环素（DO）1818661918186环丙沙星（CIP）666966610左氧氟沙星（LVX）666969610诺氟沙星（NOR）6661066610磺胺甲恶唑/甲氧苄啶（SXT）666969610磷霉素（FOS）3535333531323030表38株临床分离菌对试验中所用抗菌药的耐药情况药物Antimicrobialagent敏感株中介株耐药株耐药率（%）氨苄西林（AM）008100氨苄西林/舒巴坦（AM/SU）7100头孢他啶（CAZ）8000头孢噻肟（CTX）8000 阿米卡星（AN）008100庆大霉素（GM）008100链霉素（S）008100妥布霉素（TM）008100新霉素（N）70187.5米诺环素（MNO）51225多西环素（DO）50337.5环丙沙星（CIP）008100左氧氟沙星（LVX）008100诺氟沙星（NOR）008100磺胺甲恶唑/甲氧苄啶（SXT）008100磷霉素（FOS）8000注：新霉素是按阿米卡星的判断标准按照CLSI的耐药判断标准，由表3可见，分离的8株大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素中头孢菌素类药物高度敏感，而氨苄西林全部耐药；本次分离的鸡大肠杆菌对氟喹诺酮类药物（环丙沙星、加诺氟沙星、左氧氟沙星）全部耐药；对氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、阿米卡星、链霉素、妥布霉素、新霉素）除新霉素外其余全部耐药，提示这几株菌对氨基糖苷类抗生素高水平耐药；对磺胺类药物也全部耐药，仅对多西环素和米诺环素敏感。由此可以看出，该鸡场分离的大肠杆菌对兽医临床中常用的3大类抗菌药（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类）9种药物均产生高度耐药，显示出严重的多重耐药性。3讨论　本次试验分离、鉴定的七彩山鸡源大肠杆菌，通过ESBLs的检测发现分离菌全部不产ESBLs，该养鸡场存在的鸡大肠杆菌产ESBLs并不严重，但是药敏试验结果表明分离的大肠杆菌对兽医临床中常用抗菌药呈现严重的多重耐药性。分离的鸡大肠杆菌对3大类抗菌药（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类）9种药物均产生高度耐药，这种严重的多重耐药现象也解释了该鸡场药物无法控制大肠杆菌发病的原因。一些文献都报道了对七彩山鸡源大肠杆菌的药敏试验，但与药敏结果差异比较大，这可能与不同地区养殖场的用药习惯有关，也可能是随着时间推移，细菌的耐药不断传播和扩散，应引起足够的重视。 针对一些养殖场，在疾病发生时缺乏有效的药物进行治疗现状，为避免耐药性的进一步发展，防止对人类造成危害，应尽量减少抗生素的使用，加强生物安全措施的实施，走健康、生态养殖。即使要用，临床上也应做到合理使用抗菌药物，如采取联合用药、轮换用药等方式，每次用药前，最好结合药敏试验来选择最合适的、有针对性的抗菌药物。此外，还可以考虑使用中草药、微生态制剂等其它产品来部分替代目前常用的抗菌药，达到少用抗菌药，从而降低或减缓细菌耐药性的产生和扩散，促进养禽业的健康快速发展。根据产ESBLs和药敏结果，推荐该珍禽公司用复方氨苄西林、复方阿莫西林、多西环素进行治疗，如果肠道感染才考虑使用新霉素。参考文献：[1]BradfordPA.Extended-spectrumbeta-lactamasesinthe21stcentury:characterization,epidemiology,anddetectionofthisimportantresistancethreat.[J].ClinMicrobiolRev,2001,14(4):933-951.[2]NeuHC.Thecrisisinantibioticresistance[J].Science,1992,257(5073):1064.[3]Clinicalandlaboratorystandardsinstitute:PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;EighteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S18[S].WaynePennsylvania,CLSI,2008,28(1):1-83.[4]宋立,宁宜宝,张秀英,等.中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究[J].中国农业科学,2005,38(7):1466-1473.[5]刘晓华,张林波,沙里金,等.吉林省部分地区鸡源大肠杆菌耐药性监测[J].吉林农业大学学报,2006,28(3):338-341.[6]樊国燕,臧金灿,边传周.规模化猪场大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测[J].河南农业科学,2008:110-112.[7]许兰菊,蒋媛媛,刘红英,等.鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定与药敏试验研究[J].河南农业大学学报,2003,37(4):392-395.[8]徐景峨,王璇,李干洲.七彩山鸡感染大肠杆菌的诊治[J].上海畜牧兽医通讯,2009,6:113.'