茉莉素的化学结构改造与其抗肿瘤作用的研究

'华中科技大学博士学位论文茉莉素的化学结构改造及其抗肿瘤作用研究华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科博士研究生：蒋国松指导教师：曾甫清赵军教授中文摘要一、茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物设计、合成及鉴定目的：设计、合成茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物，为进一步研究其活性奠定基础。方法：以马来酸酐为基础原料合成中间链接体；在茉莉酸的羧基端通过酯键连接上中间链接体；手工固相多肽合成法合成FITC标记TAT穿膜肽；通过结合反应将TAT穿膜肽以硫键与茉莉酸-中间体反应连接，合成茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物。结果：经核磁共振氢谱鉴定，茉莉酸与中间体链接成功；经高效液相色谱鉴定，新合成TAT-FITC多肽及茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物纯度均>95%；经质谱鉴定，TAT-FITC多肽及茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物分子离子峰与设计一致。结论：茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物成功合成，为进一步研究其抗肿瘤活性奠定了基础。二、茉莉素抗肿瘤生物活性及机制研究目的：比较分析茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物的抗肿瘤生物活性，并探讨其作用机制。方法：激光共聚焦显微镜观察茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物细胞内摄；MTT比色法检测细胞活性；克隆形成实验检测细胞增殖能力；Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡形态学改变；PE/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡率；RealtimeRT-PCR检测XIAPmRNA表达；Western-blot检测XIAP、caspase-3、caspase-9蛋白表达；裸鼠皮下瘤模型建立及给药处理后，测量肿瘤的大小及重量，TUNEL染色法检测肿瘤组5 华中科技大学博士学位论文织细胞凋亡。结果：0.05mmol/LTAT穿膜肽和0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用EJ、PC-3细胞3h后，细胞内均可见FITC发出的强烈绿色荧光；与茉莉酸相比，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物使EJ、PC-3细胞的ICB50B分别从3.24mmol/L降至0.05mmol/L、3.48mmol/L降至0.06mmol/L(P<0.05)；与空白对照相比，0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用后，EJ与PC-3细胞克隆形成能力分别下降81.3%和78.5%(P<0.05)，Hoechst33258荧光染色显示细胞核呈固缩或碎块状致密浓染的凋亡细胞数量明显增多，细胞凋亡率分别提升至45.3%和39.6%(P<0.05)；XIAPmRNA和蛋白表达显著下调，XIAP基因转录活性未受影响；与给与PBS对照组相比，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物抑瘤率达85.6%(P<0.05)，TUNEL染色显示细胞核染色阳性的凋亡细胞明显增多。结论：连接穿膜肽后茉莉酸活性显著提高，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物能抑制人肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，转录后降解XIAP是其作用机制之一。6 华中科技大学博士学位论文ChemicalmodificationofjasmonatesandthestudyoftheiranticancereffectsonhumancancercellsDepartmentofUrology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnologyDoctorCandidate:JiangGuosongSupervisor:Prof.ZhaoJun&Prof.ZengFuqingAbstractPart1Design,synthesisandidentificationofjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugateObjective：Todesign,synthesizeandpurifythejasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugate.Methods：Thecross-linkerwassynthesizedbasedonMaleicanhydride.Carboxylterminalofjasmonicacidwascoupledtothecross-linkerthroughtheesterlink.FITC-labeledTATcellpenetratingpeptidewassynthesizedbymanualsolidphasepeptidesynthesistechnique,andwaslinkedtojasmonicacid–intermediatewithsulfidebondthroughfixationreaction.Results：IdentifiedbyHNMR,jasmonicacidwassuccessfullylinkedtointermediate.Identifiedbyhighperformanceliquidchromatography,thepurityofnewlysynthesizedTAT-FITCpeptideandjasmonicacid-TATpenetratingpeptideconjugatewasmorethen95%.Identifiedbymassspectrometry,themolecularionpeakofTAT-FITCpeptideandjasmonicacid-TATpenetratingpeptideconjugatewasconsistentwiththeexpectations.Conclusion：Jasmonicacid-TATpenetratingpeptideconjugatewassuccessfullysynthesizedforfurtherstudyoftheanti-tumoractivity.7 华中科技大学博士学位论文Part2Effectsofjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugateonhumancancercellsanditsmechanismObjective：Tostudyoftheanticancereffectsandthemechanismofjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugateononhumancancercells.-1Methods：Afteradministrationof0.5-2mmol·LPPjasmonatesandjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugatefor6~24hrs,theactivityofEJandPC-3cellswerestudiedbyMTTcolorimetry.Cellproliferationwasassayedbycolonyformationassay.CellularapoptosiswasinspectedbyHoechst33258fluorescentstainingandwasquantifiedbynnexinV–Phycoerythrin(PE)and7-amino-actinomycinD(7-AAD)stainingflowcytometry.TheexpressionofXIAPmRNAwasdeterminedbyrealtimereversetranscriptionpolymerasechainreaction.ThelevelofXIAP,caspase-3andcaspase-9proteinwasdeterminedbywestern-blot.Afteradministrationofjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugateinsubcutaneoustumormodelofnudemice,tumorsizeandweightweremeasured,andapoptosisoftumorcellswasdetectedbyTUNELstaining.Results：Jasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugatewasaseffectiveasTATcellpenetratingpeptidepeptidesequenceinattachingontosurfaceofthecellmembraneandsufficientlyinternalizedinEJandPC3cells.JasmonatesinhibitedthegrowthofEJandPC-3cellsinadose-andtime-dependentmanner,whilethejasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugateshowedsignificantenhancedefficient.Afteradministration-1of0.05mmol·LPPofjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugatefor24hrs,cellcloneformationratewassignificantlydecreasedandapoptoticcellsweresignificantlyincreased.TheexpressionofbothXIAPmRNAandXIAPproteinweredown-regulatedbyadministrationofjasmonicacid-TATcellpenetratingpeptideconjugate,whiletheXIAPgenetranscriptionactivitywasnotaffected.ComparedwiththecontrolgroupgivenPBS,jasmonicacid-TATpenetratingpeptideconjugateinhibitedtumorgrowthrateby85.6%(P8 华中科技大学博士学位论文<0.05)andTUNELstainingshowedpositivenuclearstainingofapoptoticcellsincreasedsignificantly.Conclusion：Theresultsindicatedthatjasmonicacid-TATpenetratingpeptideconjugateinhibitthegrowthofcancercellsthroughsuppressingcellproliferation,downregulatingtheexpressionXIAPmightbeoneofitsmolecularmechanisms.9 独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日 华中科技大学博士学位论文前言膀胱癌和前列腺癌均为泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈增高态势。目前，膀胱癌的治疗以手术治疗为主，但膀胱癌具有多中心、易复发、易耐药、易侵袭等生物学特性，初发患者术后复发率仍高达50%～70%，部分复发性肿瘤恶性程度增加，发展为浸润性癌或转移癌。前列腺癌患者发现时多为晚期，死亡率高，虽然初期对激素治疗比较敏感，但之后会逐渐转变为激素非依赖性肿瘤，对激素产生抵1抗PP。化疗是提高晚期和术后膀胱癌及前列腺癌患者有效生存率的重要措施，但因毒副作用和耐药问题，现有化疗药物的临床应用受到很大限制，寻求选择性强、抗耐药2的新型药物并阐明其作用机理是改进膀胱癌和前列腺癌化疗效果的关键所在PP。天然植物成分一直都是化疗药物的主要来源之一。茉莉素是一类新型植物激素，可以通过多种信号转导途径调控植物生长发育和应激反应。近年来相关研究表明，茉莉素亦可以通过促进凋亡、诱导分化方式抑制多种肿瘤细胞生长，其机制与激活丝裂3原活化蛋白激酶、促进线粒体PT孔开放、产生活性氧诱导细胞内ATP耗竭等有关PP。进一步研究表明，茉莉素在杀伤各种肿瘤细胞的同时对正常细胞作用微弱；茉莉素对已产生多药耐药的肿瘤细胞同样具有杀伤作用，相关机制有待阐明。茉莉素的高选择、抗耐药特性显示了其广阔的临床抗癌应用前景，已被认为是一类新型化疗药物。但天然来源茉莉素杀伤肿瘤细胞的浓度一般需达mmol/L数量级，高于一般化疗药的有效浓4度，存在潜在的临床使用限制PP。有研究证实，通过在4，5位上引入双键改造茉莉酸5甲酯的化学结构，能够增强其诱导白血病细胞分化作用PP。研发出活性更高、强抗耐药性的衍生物将能显著提高茉莉素的临床应用价值。近来，一类称为穿膜肽或转导肽的多肽分子被发现可以有效携带与之相连的不同大小的分子进入细胞，该作用呈能量依赖性。这类多肽分子在一定浓度范围内自身无明显生物学活性，所携带的抗体、药物、生物活性肽等活性物质穿透细胞膜进入细胞后能够高效发挥各自生物学功能。TAT肽是目前应用最广泛的穿膜肽，已被证实能够6高效携带化疗药物阿霉素进入肿瘤细胞，对抗肿瘤泵出药物，逆转耐药PP。茉莉酸的羧基活性基团为链接穿膜肽提供了结构基础，本研究通过酯键在茉莉酸的羧基端连接上一以马来酸酐为基础合成的中间体，再将TAT穿膜肽通过结合反应以硫键与中间体3 华中科技大学博士学位论文反应连接，最终合成茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物。经此改造，穿膜肽能够携带茉莉酸进入细胞，继而在细胞内酯酶催化下酯键水解，茉莉酸得以游离并发挥抗肿瘤效应。研究结果证实，由于极性改变，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物能够溶解于水；在穿膜肽有效携带穿膜进入细胞后，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物抗肿瘤活性显著强于天然茉莉酸；茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物诱导肿瘤细胞凋亡能力显著提高，作用机制与转录后降解X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达有关。本研究成功开发出了具备水溶性、高活性和潜在强抗药性的茉莉酸衍生物，提高了茉莉素的临床抗肿瘤应用价值。4 华中科技大学博士学位论文正文第一部分茉莉酸-穿膜肽共轭物设计、合成及鉴定前言茉莉素是植物根、茎、叶中大量存在的新型植物激素，来源非常广泛。近年来研究提示，茉莉素亦可以通过抑制增殖、诱导分化、促进凋亡等方式作用于淋巴细胞白血病细细胞、乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤等肿瘤细胞，而对人正常白细胞、成纤维细胞、肾小管上皮细胞、平滑肌细胞等正常细胞作用相对微弱，对一些常规化疗7药物耐药的肿瘤细胞，茉莉素同样表现出有效的杀伤作用PP。茉莉素临床应用仍有两大关键问题待解决：其一，茉莉素杀伤肿瘤细胞的浓度一般需达mmol/L数量级，高于一般化疗药的有效浓度，活性有待提高；其二，茉莉素是脂溶性物质，此类药物在制作时需经过复杂的化学工艺处理才能溶于水、血液，溶解性有待改进。茉莉素进入细8胞能力较弱被认为是其活性相对较低的主要原因PP。穿膜肽是近年发现的一类具有特殊穿膜功能的多肽分子，是跨膜转运药物的有效6工具，且能对抗肿瘤细胞泵出药物，逆转耐药PP。TAT穿膜肽是迄今为止应用最广泛的穿膜肽，已被证实能够高效携带阿霉素进入肿瘤细胞，有效增强阿霉素的抗肿瘤活性，9对抗已产生的耐药PP。茉莉酸是茉莉素成员之一，化学结构中含羧基活性基团，我们根据有机化学反应原理提出改造方法：通过结合反应在茉莉酸的羧基端以酯键连接上一常用中间体（以马来酸酐为基础合成），再将TAT穿膜肽以硫键与中间体反应联连，形成茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物，以期能够增强其活性和抗耐药性，并通过改变极性使其易溶解于水。10 华中科技大学博士学位论文实验材料与方法1、实验材料1.1TAT-FITC多肽合成主要试剂和仪器保护氨基酸所使用原料及溶剂：Fmoc-L-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH（苏州天马医药集团精细化学品有限公司）；DMF（Dikma），乙腈（Fisher），DCM（Dikma）；缩合试剂：O-Benzotriazole-N,N,N",N"-tetr（苏州天马医药精细化学品有限公司），HOBT（苏州天马医药精细化学品有限公司），DIEA（国药集团上海化学试剂公司），荧光原料：FITC（SIGMA公司）哌啶（脱保护试剂）（国药集团上海化学试剂公司）；WangResin树脂（天津南开合成科技有限公司）；切割试剂：TFA（J.T.Baker），TIS（ALDRICH），TIS（ALDRICH），EDT（切割试剂）；无水乙醚（上海试一化学试剂有限公司）；氮气(上海比欧气体工业公司)。仪器设备：11 华中科技大学博士学位论文精密电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SYMPHONY型12通道多肽合成仪(型号：SYMPHONY，软件：Version.201厂家：ProteinTechnologies.Inc)；SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.SevialSystem，厂商：SHIMADZU)；LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)；离心机（上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B）1.2茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物合成主要试剂呋喃，马来酸酐；甲苯，乙醇胺，甲醇，二氯甲烷（CHB2BClB2B）；TCEP．HCl，三乙胺，DMF；茉莉酸（SIGMA公司）。2、实验方法2.1TAT-FITC多肽合成方法（1）树脂溶涨将WangResin树脂置入反应管中，加15ml/gDMF，振荡30min。（2）连接第一个氨基酸通过沙芯抽滤掉溶剂，先加入3倍摩尔过量的Fmoc-Tyr(tBu)-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。（3）去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液至15ml/g，5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液至15ml/g，15min，进行脱保护。（4）检测抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。（5）DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，进行洗涤。12 华中科技大学博士学位论文（6）缩合反应方法a：保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量．反应30min。方法b：保护氨基酸三倍过量，HOBt三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIC三倍过量．反应30min。（7）DMF(10ml/g)洗涤一次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次。（8）重复二至六步操作，从右到左逐个连接序列中的氨基酸。（9）用1：99（TFA:DCM）反应2h，脱去K侧链的保护基MTT。（10）最后加入1.5倍过量的FITC，在吡啶/DMF/DCM为12/7/5的溶液中避光反应4-6小时。（11）抽干，DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min，洗树脂。（12）从树脂上切割多肽配制切割液：（10/g）TFA94.5%；水2.5%；EDT2.5%；TIS1%，切割时间120min。（13）吹干洗涤将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，最后常温挥干。（14）用HPLC纯化多肽将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：PumpA:0.1%trifluoroaceticin100%water13 华中科技大学博士学位论文PumpB:0.1%trifluoroaceticin100%acetonitrileTotalFlow:1.0ml/minVolume:30ulwave-length:220nmGradient:TimeAB05.0090%10%30.0020%80%30.10StopColumn:VenusiMRC-ODSC1830x250mm（15）最后将纯化后的溶液冻干，得到成品。（16）鉴定分别取少量的成品多肽，进行HPLC纯度鉴定、MS分子量鉴定。（17）将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。2.2茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物合成10（1）化合物(1)的合成PPⅠ反应式：OOOOOOOO(1)Ⅱ物料：物质Mm（g）V（mL）n（mmol）nB比Bρ呋喃68.0710.4111.21531.50.93614 华中科技大学博士学位论文马来酸酐98.06101021甲苯150Ⅲ步骤：将10g马来酸酐溶于150mL甲苯中，加热至80℃，滴加11.2mL呋喃，反应6h后，冷却至室温，抽滤，得白色固体，真空干燥。Ⅳ鉴定：核磁共振氢谱鉴定11（2）化合物(2)的合成PPⅠ反应式：OOOHOHOOH2NONOO(1)(2)Ⅱ物料：物质Mm（g）V（mL）n（mmol）nB比Bρ（1）166.132.0212.161乙醇胺61.60.7490.7412.1611.108甲醇70Ⅲ步骤：15 华中科技大学博士学位论文将2.02g化合物（1）溶于50mL甲醇中，冰水浴冷却至10℃以下。将0.74mL乙醇胺溶于20mL甲醇中，缓慢滴加至上述反应液并控温至10℃以下，滴加完毕，缓慢升至室温，室温反应30min后，回流反应5h，冷却至室温，减压蒸出甲醇，加入50mL水，并用150mL二氯甲烷分三次萃取，油层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出二氯甲烷，得到产品。Ⅳ鉴定：核磁共振氢谱鉴定（3）化合物(3)的合成Ⅰ反应式：OOOHOHONNOO(2)(3)Ⅱ物料：物质Mm（g）V（mL）n（mmol）（2）209.731.04.768甲苯50Ⅲ步骤：称取1g（2）溶于50mL甲苯中，氮气保护回流6h，冷却至室温，减压蒸出甲苯，得到产品。Ⅳ鉴定：16 华中科技大学博士学位论文核磁共振氢谱鉴定（4）化合物A的合成Ⅰ反应式：OOOOOHNOHONOOOO(3)AⅡ物料：物质Mm（g）V（mL）n（mmol）nB比Bρ（3）141.660.53763.7951.2茉莉酸210.270.66493.1621EDC．HCl191.71.09135.6931.8DMAP122.170.04640.3760.12CHB2BClB2B70Ⅲ步骤：称取0.5376g（3）溶于50mLCHB2BClB2B中，通入氮气，同时加入1.0913gEDC．HCl和0.0464gDMAP，称取0.6649g茉莉酸溶于20mLCHB2BClB2B中，并滴入上述反应液，室温反应7h后，加入100mL水，用3×50mLCHB2BClB2B萃取，油层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出二氯甲烷，得产品A。Ⅳ鉴定：HPLC、MS、核磁共振氢谱鉴定17 华中科技大学博士学位论文（5）茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物（JA-TAT）的合成Ⅰ反应通式：OOOOTAT-FITCXHE-1OONNOOOOTAT-FITCXHE-1JA-TATAXHE-1-AⅡ物料：物质Mm（g）V（mL）n（mmol）nB比B（A）333.830.80342.412.5TAT-FITC2147.44211TCEP．HCl286.650.860033三乙胺101.190.144611DMFBBⅢ步骤：称取0.8034g（A）溶于10mLDMF中冷却10℃以下，同时加入TCEP．HCl和三乙胺，将TAT-FITC溶于5mLCH2Cl2中，并加入上述反应液，反应24h后，减压蒸出DMF，HPLC纯化得JA-TAT。Ⅳ鉴定：HPLC、MS鉴定18 华中科技大学博士学位论文结果图1-1为TAT穿膜肽的设计思路，FITC作为药物的示踪分子标记于多肽的赖氨酸上。经核磁共振氢谱鉴定，化合物(1)、化合物(2)、中间体化合物(3)及中间体与茉莉酸链接形成的化合物A均成功合成（图1-4、1-5）。经高效液相色谱鉴定，新合成TAT-FITC多肽（图1-6A）及茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物（JA-TAT）（图1-7A）纯度均>95%；经质谱鉴定，TAT-FITC多肽（图1-6B）及茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物（JA-TAT）（图1-7B）分子离子峰与设计一致，新药成功合成，为进一步研究其抗肿瘤活性奠定了基础。19 华中科技大学博士学位论文图1-1FITC标记TAT穿膜肽化学结构简图图1-2中间体合成步骤图1-3茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物合成步骤20 华中科技大学博士学位论文AB图1-4化合物(1)（A）及化合物(2)（B）核磁共振氢谱鉴定21 华中科技大学博士学位论文AB图1-5中间体化合物(3)（A）及中间体与茉莉酸链接形成的化合物（B）核磁共振氢谱鉴定22 华中科技大学博士学位论文ABA.高效液相色谱鉴定B.质谱鉴定图1-6FITC-标记TAT穿膜肽表征23 华中科技大学博士学位论文ABA.高效液相色谱鉴定B.质谱鉴定图1-7茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物表征24 华中科技大学博士学位论文第二部分茉莉素诱导膀胱癌、前列腺癌细胞凋亡及机制研究前言植物在受昆虫、真菌攻击及机械伤害等应激状态下，自身体内茉莉素生物合成增加，并通过相应信号转导途径诱导特定基因表达，这些基因编码的蛋白质在植物的抵抗应激和对抗发病过程中起着重要的作用。同样作为植物激素的水杨酸已被证实能够抑制多种肿瘤细胞生长，近年来研究对茉莉素的研究已证实其具备选择性杀伤肿瘤细12胞、对抗多药耐药等特性PP，应用前景广阔。现有研究结果认为茉莉素的抗肿瘤作用机制与激活丝裂原活化蛋白激酶、开放线粒体PT孔促使线粒体通透性增加、产生活性13氧诱导细胞内ATP耗竭等有关PP。茉莉酸甲酯、茉莉酸和顺式茉莉酮是天然茉莉素家14族的三种活性成分，其中茉莉酸甲酯的抗肿瘤效应最强，茉莉酸作用相对较弱PP。15与现有顺铂、阿霉素等常用化疗药物相比，这三种茉莉素的有效浓度均较高PP，虽然体外实验和动物实验未发现产生抗肿瘤作用浓度无相关毒副作用，但其临床仍可能存在潜在不良反应和毒性。已有研究对茉莉素的活性基团进行改造，但尚不能显著提高其活性。我们用有机化学方法将茉莉酸与TAT穿膜肽偶联形成茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物，并通过高效液相色谱和质谱鉴定已证实其合成成功。本研究通过将三种天然来源茉莉素和茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物分别作用于膀胱癌EJ细胞和前列腺癌PC-3细胞，比较分析新合成药物的活性并探讨其作用机制。实验材料与方法1、实验材料1.1主要试剂和仪器人膀胱癌细胞株EJ(上海中科院细胞库)；人前列腺癌雄激素非依赖性细胞株PC-3(美国ATCC)；25 华中科技大学博士学位论文1640培养液(Gibco公司)；小牛血清(Gibco公司)；四甲基偶氮唑盐（MTT）(Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)；DiI染料(江苏碧云天公司)；Hoechst33258荧光染料(Sigma公司)；AnnexinV–Phycoerythrin(PE)and7-amino-actinomycinD(7-AAD)双染凋亡检测试剂盒((BDPharmingen,SanDiego,CA,USA))；TrizolTM(Gibco公司)；逆转录试剂盒(Fermentas公司)。荧光定量PCR试剂盒(北京全式金公司)；1×细胞蛋白提取液(Promega,USA)；抗人caspase-3抗体、caspase-9抗体、XIAP抗体（美国CellSingnal公司）；抗人GAPDH抗体（美国SantaCruz公司）；Caspase抑制剂z-DEVD-fmk、z-LEHD-fmk(Sigma公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；酶标仪(瑞士TECAN公司)；荧光分光光度计(LumatLB9507,BertholdTech.,BadWildbad,德国)WB-blot曝光系统(Amersham,USA)；ABI7700荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；荧光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)；流式细胞仪(FCM)(BectonDickinson公司)；激光共聚焦显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)。1.2三种茉莉素及TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物的配制(1)分别吸取取22μl茉莉酸甲酯、17.5μl顺式茉莉酮、20.5μl茉莉酸溶于等体积DMSO中，分别加入1640培养液至5ml，配制成20mmol/L母液备用，使用时以26 华中科技大学博士学位论文1640培养液分别稀释至0.5mmol/L,1mmol/L,2mmol/L。(2)TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽直接用1640培养液稀释至0.01mmol/L,0.025mmol/L,0.05mmol/L使用。2、实验方法2.1人膀胱癌细胞株EJ、前列腺癌雄激素非依赖性细胞株PC-3的培养采用含有10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的1640培养液，置于37℃、通5%CO2培养箱中进行培养。当细胞培养液的颜色变为黄色时给予更换培养液；当单层细胞生长到覆盖培养瓶底约90%面积时，使用0.25%胰酶配以0.02%EDTA消化传代，按自己实验所需的比例传代后继续培养或接种于培养板以便进一步进行药物干预。2.2激光共聚焦显微镜观察茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物细胞内摄将EJ和PC-3细胞集中于激光共聚焦显微镜专用6孔玻底培养板，集中密度以使细胞24h后生长融合占培养板面积50%左右为宜；之后每孔分别加入终浓度为0.05mmol/L的TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽，并设置未加药空白对照组；药物作用3h后，PBS冲洗两次，然后加入终浓度为10umol/L的细胞膜荧光探针染料DiI，避光染色10min，再次用PBS液冲洗两次后置于激光共聚焦显微镜下观察。2.3MTT比色法检测细胞活性-1(1)取3×107·LPP人肿瘤细胞接种于96孔培养板，每孔加入100μl，每组设5个复孔；(2)待细胞贴壁后分别以0.5,1,2mmol/L的茉莉酸甲酯、顺式茉莉酮、茉莉酸及0.01,0.025,0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用；并分别设空白对照组与5mmol/LDMSO溶剂对照组、空白对照组与0.05mmol/LTAT穿膜肽对照组；-1(3)待上述各组药物分别作用6h、12h和24h后，每孔加入5g·LPPMTT共20μl，继续培养3h；27 华中科技大学博士学位论文(4)彻底去除上清，加入DMSO100μl/孔，振荡10min使结晶充分溶解；(5)酶标仪测定570nm波长处吸光度A值；肿瘤细胞生长抑制率=(1-实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)×100%。2.3克隆形成实验(1)将细胞以500个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板；(2)待细胞贴壁后，分别加入终浓度为0.05mmol/L的茉莉酸、TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽，并设置未加药空白对照组，继续培养；(3)药物作用24h后更换成普通培养基，继续培养12天；(4)甲醇固定15min；(5)0.2%结晶紫染色10min；(6)倒置显微镜下逐个计数大于50个细胞的克隆，克隆形成率(%)=(集落形成数/接种细胞数)×100%。2.4Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡形态学改变将对数生长期细胞以3×105/ml共2ml每孔接种于6孔板，待细胞生长24h贴壁后，加入终浓度为0.05mmol/L的茉莉酸、TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽，并设置未加药空白对照组，继续培养24h，4%多聚甲醛4°C固定20min，PBS洗两次，加1ml浓度为10ug/ml的Hoechst33258染色液，4°C避光染色15min，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学改变，凋亡细胞胞核呈固缩致密浓染，或呈碎块状致密浓染。2.5PE/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡率6(1)分别收集1×10PP个0.05mmol/L的茉莉酸、TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽、茉莉酸-TAT穿膜肽联合z-DEVD-fmk、茉莉酸-TAT穿膜肽联合z-LEHD-fmk作用24h后及空白对照组的EJ、PC-3细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，4℃条件下离心800rpm×5min，弃上清收集细胞。(2)PBS洗涤细胞2次后，4℃条件下800rpm×5min再次离心收集细胞。28 华中科技大学博士学位论文(3)PBS洗涤细胞1次后，将细胞重新悬浮于200µl缓冲液中，加入10µlAnnexinV-PE和5µl7-AAD，并轻轻混匀，室温避光染色反应。(4)染色15min后立即使用流式细胞仪检测凋亡细胞率。活细胞为流式细胞分析图左下方细胞簇，PE及7-AAD均低染；早期凋亡细胞为流式细胞分析图右下方细胞簇，PE高染而7-AAD低染；晚期凋亡细胞及部分坏死细胞为流式细胞分析图右上方细胞簇，PE和7-AAD均高染；坏死细胞及细胞碎片为流式细胞分析图左上方细胞簇，PE低染而7-AAD高染。2.6Real-timeRT-PCR检测基因表达(1)收集106接种于六孔板的空白对照组及各药物作用24h后细胞,每孔加入1mlTrizol，按TrizolTM说明书提取细胞总RNA，凝胶电泳鉴定RNA质量，核酸检测分光光度计测定RNA浓度。(2)进行逆转录反应，配置体系：模板RNA2µg、OligodT181µl、10mmol·L-1dNTP1µl、RNA酶抑制剂(RNasin)20U、AMV逆转录酶200U、5×逆转录酶缓冲液5µl，终体积为25µl，70℃5min，42℃60min，70℃10min。(3)采用专业软件Primerpremier5.0设计PCR扩增引物序列：XIAP上游引物5’-GAACCTTGTGATCGTGCCT-3’，下游引物5’-AGGGTCTTCACTGGGCTTC-3’；以管家基因GAPDH作为内参照：上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’（均由上海英骏生物技术有限公司合成）。(4)反应体系：模板cDNA0.8μl、2×荧光染料缓冲液混合液5μl，加纯水至50μl，于ABI7700实时定量PCR仪上进行反应，数据采用StepOneSoftwarev2.1软件分析，得出基因相对表达量。2.7Westernblot检测蛋白表达6收集10PP接种于六孔板的空白对照组及各药物作用24h后细胞分别，加入1×lysisbuffer60~80μl，用细胞刮刮下的细胞悬着液并转置于1.5mlEP管中，冰浴5min后震荡1min，重复6次，离心15min后取上清进行蛋白定量。每管加入1:4体积的5×上样缓冲液稀释样本，于水浴锅中95°C条件下变性10min。以20μg蛋白在12%聚丙29 华中科技大学博士学位论文烯酰胺凝胶中120V恒流电泳，至溴酚蓝到分离胶底部取下，200mA恒压电泳30~50分钟转至PVDF膜，丽春红染色十分钟后蒸馏水洗膜并观察蛋白质条带。脱脂奶粉室温封闭1h后，分别加入一抗为抗人caspase-3抗体、caspase-9抗体、XIAP抗体、GAPDH抗体4℃孵育过夜，之后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h，运用PIRCEECL底物反应试剂盒显色，照相。2.8双荧光素酶报告基因表达载体转染将萤火虫荧光素酶XIAP基因启动子报告基因载体pGL3/XIAP和海肾荧光素酶载体pRL-TK(Promega,Madison,WI)共转染入PC-3细胞，并设立pGL3/Basic对照，0.05mmol/L茉莉酸、0.05mmol/LTAT穿膜肽及0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物分别作用24h后，用被动裂解液裂解细胞，荧光分光光度计检测荧光值，每个样本均采用萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶相对荧光量进行标准化处理。具体检测方法参照Dual-Luciferase®ReporterAssaySystem(Promega)说明书进行。2.9裸鼠皮下瘤模型建立及给药处理所有动物实验均经华中科技大学同济医学院动物伦理委员会审批。将0.2ml含5×106个肿瘤细胞的细胞悬液以1ml注射器注入体重20-22g的4-6周龄BALB/c-nu/nu裸鼠左侧背部皮下，待肿瘤直径长至0.5cm时（约两周时间），分PBS对照组、TAT穿膜肽组、茉莉酸组、茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物组进行药物瘤内多点缓慢注射，每组6只裸鼠，隔日注射一次，三周后处死，取下瘤组织测量称重并进行DNA切口末端标记法(TUNEL)免疫组化细胞凋亡检测。结果1.茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物细胞内摄观察0.05mmol/LTAT穿膜肽和0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用EJ、PC-3细胞3h后，细胞内均可见FITC发出的强烈绿色荧光，表明穿膜肽能够有效促使茉30 华中科技大学博士学位论文莉酸细胞内摄；部分绿色荧光与细胞膜探针DiI发出的红色荧光重叠，显示出穿膜肽携带茉莉酸-穿膜进入细胞过程。(图2-1)2.各组药物作用后肿瘤细胞生长活性检测与空白对照组相比，5mmol/LDMSO对照组未显示明显毒性作用，0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L三种天然茉莉素（茉莉酸甲酯、顺式茉莉酮、茉莉酸）分别处理6h、12h及24h后，EJ、PC-3细胞呈时间、浓度依赖性生长抑制(P<0.05)(图2-2、图2-3)，其中三种药物活性从强到弱依次为茉莉酸甲酯、顺式茉莉酮和茉莉酸。0.05mmol/L茉莉酸和0.05mmol/LTAT穿膜肽对EJ、PC-3细胞均无明显毒性作用，而0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用24h后，细胞生长抑制率分别达到51.1%和46.8%；与使用茉莉酸相比，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物使EJ、PC-3细胞的IC50分别从3.24mmol/L降至0.05mmol/L、3.48mmol/L降至0.06mmol/L(P<0.05)。3.茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对肿瘤细胞克隆形成能力的影响与空白对照组相比，0.05mmol/L茉莉酸及0.05mmol/LTAT穿膜肽作用后，细胞克隆形成能力无明显变化(P>0.05)；0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用后，EJ(图2-4A)与PC-3(图2-4B)细胞克隆形成能力分别下降81.3%和78.5%(P<0.05)。4.茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物诱导肿瘤细胞凋亡检测与空白对照组、0.05mmol/L茉莉酸组及0.05mmol/LTAT穿膜肽组相比，0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用24h后，Hoechst33258荧光染色显示细胞核呈固缩或碎块状致密浓染的凋亡细胞数量明显增多(图2-5A，2-5B)；PE/7-AAD双染流式细胞术检测显示，空白对照组、0.05mmol/L茉莉酸组及0.05mmol/LTAT穿膜肽组EJ细胞和PC-3细胞凋亡率分别为5.1%、7.1%、6.7%和4.8%、6%、5.6%，三组之间比较均无统计学意义(P>0.05)，0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物组细胞凋亡率分别显著升至45.3%和39.6%(P<0.05)，而泛caspase抑制剂z-DEVD-fmk和caspase-9抑制剂z-LEHD-fmk均能逆转茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物诱导的细胞凋亡(图2-5C)。31 华中科技大学博士学位论文5.茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物及茉莉酸甲酯对XIAP基因转录、表达的影响与空白对照相比，0.05mmol/L茉莉酸及0.05mmol/LTAT穿膜肽作用24h对XIAPmRNA和蛋白表达均无明显影响(P>0.05)；0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用24h后，实时定量PCR检测显示PC-3细胞XIAPmRNA表达显著下调67.7%(P<0.05)（图2-6A），Western-blot检测显示XIAP蛋白表达亦明显下降（图2-6B）；双荧光素酶XIAP基因启动子报告基因表达载体转染显示，0.05mmol/L茉莉酸、0.05mmol/LTAT穿膜肽及0.05mmol/L茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对XIAP基因的转录均无明显影响（图2-6C），提示茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对XIAPmRNA和蛋白表达的抑制XIAP基因转录活性无关。与此同时，1mmol/L茉莉酸甲酯作用24h可引起22.6%的PC-3细胞凋亡(P<0.05)，联合给予XIAP抑制物SmacN7多肽能够使凋亡率增至51.1%(P<0.05)，而SmacN7多肽对照组（Antp多肽）对茉莉酸甲酯诱导的细胞凋亡无明显影响(P>0.05)（图2-7A）；Western-blot检测显示单独给予茉莉酸甲酯或联合使用SmacN7多肽均可促使caspase-3和caspase-9蛋白活化，但单独给予茉莉酸甲酯对XIAP蛋白表达无显著影响(P>0.05)，只有联合使用SmacN7才能有效下调XIAP蛋白表达(P<0.05)（图2-7B）。6.茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对裸鼠皮下移植瘤生长、细胞凋亡的影响与空白对照、茉莉酸及TAT穿膜肽作用相比，瘤内多点注射茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物可以显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达85.6%(P<0.05)；TUNEL染色显色茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物组细胞核染色阳性的凋亡细胞明显增多。32 华中科技大学博士学位论文讨论茉莉素是广泛存在于植物界的一类新型植物激素，其可以通过信号转导途径调控植物生长发育和应激反应。目前研究表明，茉莉素亦可以通过促进凋亡、诱导分化方式抑制多种肿瘤细胞生长，是一类潜在的新型抗肿瘤药物。茉莉素对多种人肿瘤细胞株均有毒性作用，对某些耐药的肿瘤亦有作用，而对人正常细胞株无毒性，这种作用呈浓度和时间依赖性。动物实验表明，茉莉素可以明显延长肿瘤模型动物的生存期，在体内有明显的抗肿瘤作用，具有潜在的临床应用前景。各种茉莉素对肿瘤细胞的抑制强度不尽相同，其中以茉莉酸甲酯的作用最强，而一些人工合成衍生物可以使其抗肿瘤作用显著提高。将茉莉素用于临床尚需进行大量的药代动力学实验，对其给药剂量、剂型、给药方式、临床疗效等进行深入的研究。目前研究中，茉莉素对肿瘤细胞产生毒性的浓度-10一般在10PPmmol/L～10PPmmol/L数量级，明显高于一般化疗药的有效浓度。虽然该浓度区间对正常细胞无毒性，但若用于临床需要较大的给药剂量，可能存在潜在的副作用。因此，仍需在自然界寻找或人工合成更为有效的茉莉素。茉莉素的自身化学结构特性导致其穿透细胞膜进入细胞能力较弱被认为是茉莉素活性较低主要原因之一。近来，一类称为穿膜肽或转导肽的多肽分子被发现可以有效携带与之相连的不同大小的分子进入细胞，该作用呈能量依赖性。这类多肽分子在一定浓度范围内自身无明显生物学活性，所携带的抗体、药物、生物活性肽等活性物质穿透细胞膜进入细胞后能够高效发挥各自生物学功能。穿膜肽是是跨膜转运药物的有效工具，且能对抗肿瘤细胞泵出药物，逆转耐药。TAT穿膜肽是迄今为止应用最广泛的穿膜肽，已被证实能够高效携带阿霉素进入肿瘤细胞，有效增强阿霉素的抗肿瘤活性，对抗已产生的耐药。本研究通过化学键将茉莉酸与TAT穿膜肽相连，新构建合成了茉莉酸-穿膜肽共轭物。激光共聚焦显微镜显示，在穿膜肽的穿膜引导作用下，该共轭物能够有效进入细胞。细胞实验和裸鼠动物实验证实，与天然茉莉酸相比，茉莉酸-穿膜肽共轭物抑制膀胱癌和前列腺细胞增殖、促进细胞凋亡能力显著提高。由此可见，本研究成功开发出了具备高活性的新型茉莉素抗肿瘤药物，穿膜肽的对抗肿瘤细胞泵出药物性能能够33 华中科技大学博士学位论文增强茉莉素的抗耐药潜能。研发出穿膜能力更强的多肽分子是近来穿膜肽研究领域的热点，将茉莉酸与活力更强的穿膜肽相链接有望获得更高活性的茉莉素衍生物。茉莉素是脂溶性物质，此类药物在制作时需经过复杂的化学工艺处理才能溶于水、血液，溶解性有待改进。本研究通过将多肽分子与茉莉酸链接，改变了茉莉酸的极性，使其易溶解于水，该方法可以简化茉莉素制剂工艺，突破茉莉素的临床给药限制。IAP家族是近年发现的一类细胞内凋亡调控蛋白,能通过阻止Caspases原的激16,17活和成熟Caspases的催化活性,对程序性细胞死亡的阻滞起关键作用PP。其中,XIAP可以通过阻断线粒体细胞色素C释放,抑制caspase-9、caspase-3的活性抑制线粒体途18,19径细胞凋亡XIAP是活性最强的抗凋亡蛋白家族成员PP，XIAP基因定位于Xq25，分子结构含有3个BIR结构域和1个RING锌指结构域，XIAP可通过直接抑制caspases或20参与信号转导途径抑制细胞凋亡PP，XIAP过度表达是膀胱癌和前列腺癌进展、复发以21及化疗耐药的主要原因之一PP，以化学抑制剂、siRNA干扰、新型药物等方法降低XIAP16,22,23水平和功能一直都是抗肿瘤研究主要方向之一PP。本研究显示，茉莉酸甲酯对XIAP蛋白表达无显著影响，而联合给予XIAP抑制物SmacN7能有效下调XIAP蛋白表达。SmacN7通过与XIAP蛋白结合，拮抗XIAP对caspase的抑制作用，对XIAP的转录、表达无明显影响。有研究显示，活化的caspase能够水解切割XIAP蛋白。由此分析，茉莉酸甲酯和SmacN7联合作用引起的XIAP蛋白表达下调可能是caspase活化作用的结果。与茉莉酸甲酯不同，茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物自身即能够显著抑制XIAPmRNA和蛋白表达，而这种抑制作用与XIAP基因转录活性无关，提示茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物促使XIAP表达下调与转录后降解有关。近年来研究发现，miRNA是一类细胞内分布广泛的长约21-25nt的非编码小RNAs，主要通过与靶mRNA完全或不完全的互补配对，促进目标mRNA降解或抑制蛋24-26白翻译，参与基因转录后水平调控PP。近年来，大量与肿瘤发生相关的miRNA相继被发现，超过50%的人类microRNA基因定位于与肿瘤相关的基因区域或者染色体脆27性位点，可作为肿瘤治疗的潜在靶点，相关研究已成为抗肿瘤领域关注的焦点PP。成熟的单链miRNA可以与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合27,28到mRNA的3′UTR发挥负性调控作用PP。miRNA对XIAP的调控目前尚无相关报道，34 华中科技大学博士学位论文转录产物XIAPmRNA全长约9kb，但实际编码区仅有1.5kb,其5’和3’非翻译区(untranslatedRegions,UTRs)分别为1.5kb和6kb，这种长UTRs在真核细胞转录本中很少见。其中5’UTR的内部核糖体进入位点序列(IRES)已被证实是促进在XIAPmRNA在不利的应激条件下（如低氧、病毒感染、生长因子去除、γ照射等)保持高效19,29-31翻译的机制PP，起正向调控作用，而长为6kb的mRNA3′UTR对XIAP表达的调控尚不明确。因此，深入探讨miRNA在茉莉酸-穿膜肽共轭物诱导XIAP基因转录后沉默中的作用，将能够进一步阐明茉莉酸-穿膜肽共轭物的抗肿瘤作用机制，是本课题下一步研究的方向。35 华中科技大学博士学位论文DiIFITCMergeContolTATEJJA-TATContolTATPC-3JA-TAT图2-1激光共聚焦显微镜观察茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物进入肿瘤细胞36 华中科技大学博士学位论文A.B.100100905mMDMSO0.5mMMJ1.0mMMJ2.0mMMJ905mMDMSO0.5mMCJ1.0mMCJ2.0mMCJ)80)807070606050504040Cytotoxicity(%Cytotoxicity(%303020201010006h12h24h6h12h24hC.D.1001000.05mMTAT0.01mMJA-TAT905mMDMSO0.5mMJA1.0mMJA2.0mMJA900.025mMJA-TAT0.05mMJA-TAT)80)80707060605050Cytotoxicity(%40Cytotoxicity(%40303020201010006h12h24h6h12h24hA.茉莉酸甲酯（MJ）B.顺式茉莉酮（CJ）C.茉莉酸（JA）D.茉莉酸-TAT共轭物（JA-TAT）图2-2三种天然茉莉素及茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对EJ细胞的生长抑制作用37 华中科技大学博士学位论文A.B.100100905mMDMSO0.5mMMJ1.0mMMJ2.0mMMJ905mMDMSO0.5mMCJ1.0mMCJ2.0mMCJ)80)807070606050504040Cytotoxicity(%Cytotoxicity(%303020201010006h12h24h6h12h24hC.D.1001000.05mMTAT0.01mMJA-TAT905mMDMSO0.5mMJA1.0mMJA2.0mMJA900.025mMJA-TAT0.05mMJA-TAT)80)80707060605050Cytotoxicity(%40Cytotoxicity(%40303020201010006h12h24h6h12h24hA.茉莉酸甲酯（MJ）B.顺式茉莉酮（CJ）C.茉莉酸（JA）D.茉莉酸-TAT共轭物（JA-TAT）图2-3三种天然茉莉素及茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对PC-3细胞的生长抑制作用38 华中科技大学博士学位论文A.100)EJ8060对照0.05mMJA40#20CloneFormationRate(%0对照JATATJA-TAT0.05mMTAT0.05mMJA-TATB.100)PC-38060对照0.05mMJA40#20CloneFormationRate(%0对照JATATJA-TAT0.05mMTAT0.05mMJA-TAT#PP与空白对照组比较，P<0.05图2-4茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对EJ（A）和PC-3（B）细胞克隆形成的影响39 华中科技大学博士学位论文ABEJPC-3对照0.05mMJA对照0.05mMJA0.05mMTAT0.05mMJA-TAT0.05mMTAT0.05mMJA-TATC60EJPC-3#50#4030Apoptosis(%)20100对照JATATJA-TATJA-TAT+JA-TAT+z-DEVD-fmkz-LEHD-fmk#PP与空白对照组比较，P<0.05图2-5茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物作用24细胞凋亡检测40 华中科技大学博士学位论文A120PC-3100806040#ReletiveXIAPmRNA200对照JATATJA-TATB对照JATATJA-TATXIAPWBGAPDHCpGL3/Basic10pGL3/XIAP98)3765RLU(1x1043210对照JATATJA-TAT#PP与空白对照组比较，P<0.05图2-6茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对XIAP基因转录、表达的影响41 华中科技大学博士学位论文AB*#PP与空白对照组比较，P<0.05;PP与单独使用MJ比较，P<0.05图2-7茉莉酸甲酯对PC-3细胞凋亡及蛋白表达的影响42 华中科技大学博士学位论文空白JATATJA-TATA)300250200150100#50Tumorweight(mg0对照JATATJA-TATB空白JATATJA-TAT注：箭头所示为凋亡细胞图2-8茉莉酸-TAT穿膜肽共轭物对裸鼠皮下移植瘤生长（A）、细胞凋亡（B）的影响43 华中科技大学博士学位论文参考文献1.Krajewska,M.;Krajewski,S.;Banares,S.;Huang,X.;Turner,B.;Bubendorf,L.;Kallioniemi,O.P.;Shabaik,A.;Vitiello,A.;Peehl,D.;Gao,G.J.;Reed,J.C.,Elevatedexpressionofinhibitorofapoptosisproteinsinprostatecancer.ClinCancerRes2003,9,(13),4914-25.2.Stavridi,F.;Karapanagiotou,E.M.;Syrigos,K.N.,Targetedtherapeuticapproachesforhormone-refractoryprostatecancer.CancerTreatRev2010,36,(2),122-30.3.Fingrut,O.;Flescher,E.,Plantstresshormonessuppresstheproliferationandinduceapoptosisinhumancancercells.Leukemia2002,16,(4),608-16.4.Goldin,N.;Arzoine,L.;Heyfets,A.;Israelson,A.;Zaslavsky,Z.;Bravman,T.;Bronner,V.;Notcovich,A.;Shoshan-Barmatz,V.;Flescher,E.,Methyljasmonatebindstoanddetachesmitochondria-boundhexokinase.Oncogene2008,27,(34),4636-43.5.Ishii,Y.;Kiyota,H.;Sakai,S.;Honma,Y.,Inductionofdifferentiationofhumanmyeloidleukemiacellsbyjasmonates,planthormones.Leukemia2004,18,(8),1413-9.6.Drin,G.;Cottin,S.;Blanc,E.;Rees,A.R.;Temsamani,J.,Studiesontheinternalizationmechanismofcationiccell-penetratingpeptides.JBiolChem2003,278,(33),31192-201.7.Flescher,E.,Jasmonatesincancertherapy.CancerLett2007,245,(1-2),1-10.8.Rotem,R.;Heyfets,A.;Fingrut,O.;Blickstein,D.;Shaklai,M.;Flescher,E.,Jasmonates:novelanticanceragentsactingdirectlyandselectivelyonhumancancercellmitochondria.CancerRes2005,65,(5),1984-93.9.Liang,J.F.;Yang,V.C.,Synthesisofdoxorubicin-peptideconjugatewithmultidrugresistanttumorcellkillingactivity.BioorgMedChemLett2005,15,(22),5071-5.44 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华中科技大学博士学位论文18.Ng,C.P.;Bonavida,B.,X-linkedinhibitorofapoptosis(XIAP)blocksApo2ligand/tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand-mediatedapoptosisofprostatecancercellsinthepresenceofmitochondrialactivation:sensitizationbyoverexpressionofsecondmitochondria-derivedactivatorofcaspase/directIAP-bindingproteinwithlowpl(Smac/DIABLO).MolCancerTher2002,1,(12),1051-8.19.Berezovskaya,O.;Schimmer,A.D.;Glinskii,A.B.;Pinilla,C.;Hoffman,R.M.;Reed,J.C.;Glinsky,G.V.,IncreasedexpressionofapoptosisinhibitorproteinXIAPcontributestoanoikisresistanceofcirculatinghumanprostatecancermetastasisprecursorcells.CancerRes2005,65,(6),2378-86.20.Srinivasula,S.M.;Hegde,R.;Saleh,A.;Datta,P.;Shiozaki,E.;Chai,J.;Lee,R.A.;Robbins,P.D.;Fernandes-Alnemri,T.;Shi,Y.;Alnemri,E.S.,AconservedXIAP-interactionmotifincaspase-9andSmac/DIABLOregulatescaspaseactivityandapoptosis.Nature2001,410,(6824),112-6.21.Hasenjager,A.;Gillissen,B.;Muller,A.;Normand,G.;Hemmati,P.G.;Schuler,M.;Dorken,B.;Daniel,P.T.,SmacinducescytochromecreleaseandapoptosisindependentlyfromBax/Bcl-x(L)inastrictlycaspase-3-dependentmannerinhumancarcinomacells.Oncogene2004,23,(26),4523-35.22.Morizane,Y.;Honda,R.;Fukami,K.;Yasuda,H.,X-linkedinhibitorofapoptosisfunctionsasubiquitinligasetowardmaturecaspase-9andcytosolicSmac/DIABLO.JBiochem2005,137,(2),125-32.23.Probst,B.L.;Liu,L.;Ramesh,V.;Li,L.;Sun,H.;Minna,J.D.;Wang,L.,SmacmimeticsincreasecancercellresponsetochemotherapeuticsinaTNF-alpha-dependentmanner.CellDeathDiffer2010.46 华中科技大学博士学位论文24.Wach,S.;Nolte,E.;Szczyrba,J.;Stohr,R.;Hartmann,A.;Orntoft,T.;Dyrskjot,L.;Eltze,E.;Wieland,W.;Keck,B.;Ekici,A.B.;Grasser,F.;Wullich,B.,MiRNAprofilesofprostatecarcinomadetectedbymulti-platformmiRNAscreening.IntJCancer2011.25.Vencio,E.F.;Pascal,L.E.;Page,L.S.;Denyer,G.;Wang,A.J.;Ruohola-Baker,H.;Zhang,S.;Wang,K.;Galas,D.J.;Liu,A.Y.,EmbryonalcarcinomacellinductionofmiRNAandmRNAchangesinco-culturedprostatestromalfibromuscularcells.JCellPhysiol2011,226,(6),1479-88.26.Shi,X.B.;Xue,L.;Yang,J.;Ma,A.H.;Zhao,J.;Xu,M.;Tepper,C.G.;Evans,C.P.;Kung,H.J.;deVereWhite,R.W.,Anandrogen-regulatedmiRNAsuppressesBak1expressionandinducesandrogen-independentgrowthofprostatecancercells.ProcNatlAcadSciUSA2007,104,(50),19983-8.27.Schaefer,A.;Jung,M.;Miller,K.;Lein,M.;Kristiansen,G.;Erbersdobler,A.;Jung,K.,SuitablereferencegenesforrelativequantificationofmiRNAexpressioninprostatecancer.ExpMolMed2010,42,(11),749-58.28.Theodore,S.C.;Rhim,J.S.;Turner,T.;Yates,C.,MiRNA26aexpressioninanovelpanelofAfricanAmericanprostatecancercelllines.EthnDis2010,20,(1Suppl1),S1-96-100.29.Foster,P.A.;Ho,Y.T.;Newman,S.P.;Leese,M.P.;Potter,B.V.;Reed,M.J.;Purohit,A.,STX140andSTX641causeapoptosisviatheintrinsicmitochondrialpathwayanddown-regulatesurvivinandXIAPexpressioninovarianandprostatecancercells.AnticancerRes2009,29,(10),3751-7.30.Gill,C.;Dowling,C.;O"Neill,A.J.;Watson,R.W.,EffectsofcIAP-1,cIAP-2andXIAPtripleknockdownonprostatecancercellsusceptibilitytoapoptosis,cellsurvivaland47 华中科技大学博士学位论文proliferation.MolCancer2009,8,39.31.Golovine,K.;Makhov,P.;Uzzo,R.G.;Kutikov,A.;Kaplan,D.J.;Fox,E.;Kolenko,V.M.,Cadmiumdown-regulatesexpressionofXIAPatthepost-transcriptionallevelinprostatecancercellsthroughanNF-kappaB-independent,proteasome-mediatedmechanism.MolCancer2010,9,183.48 华中科技大学博士学位论文撰写及发表文章目录1.JiangGS,ZhaoJ,ZengFQ,etal.ANN-terminalSmacpeptidesensitizeshumanprostatecarcinomacellstomethyljasmonate-inducedapoptosis.CancerLett,2011,302(1):37-46.（SCI收录,IF3.741）2.ZhengLD,JiangGS（共同第一作者）,HongM,etal.SmallRNAinterference-mediatedgenesilencingofheparanaseabolishestheinvasion,metastasisandangiogenesisofcancercells.BMCCancer,2010,10(1):33.（SCI收录,IF2.736）3.TongQS,JiangGS,ZengFQ,etal.Methyljasmonatedownregulatesexpressionofproliferatingcellnuclearantigenandinducesapoptosisinhumanneuroblastomacelllines.AnticancerDrugs,2008,19(6):573-581.（SCI收录,IF2.230）4.TongQS,JiangGS,ZengFQ,etal.NaturaljasmonatesofdifferentstructuressuppressthegrowthofhumanneuroblastomacelllineSH-SY5Yanditsmechanisms.ActaPharmacolSin,2008,29(7):861-869.（SCI收录,IF1.783）5.蒋国松，曾甫清，董继华，等．靶向人肝素酶短发卡状RNA表达载体的构建及其沉默作用.中华实验外科杂志,2010,27(5):623-625.6.蒋国松，童强松，曾甫清，等．茉莉酸甲酯对人神经母细胞瘤细胞株XIAP和Survivin表达的影响．药学学报,2008,43(6):584-590.7.蒋国松，童强松，曾甫清，等．茉莉素对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH的抑制增殖及诱导凋亡作用.中华实验外科杂志,2008,25(6):772-774.8.蒋国松，曾甫清．茉莉素抗肿瘤作用及其机制的研究进展．国际肿瘤学杂志,2007,34(3):167-170.49 华中科技大学博士学位论文科研体会我近六年一直在导师曾甫清教授、赵军教授和实验指导老师童强松教授的教导下从事肿瘤靶向治疗研究。所在课题组前期研究已证实，凋亡抑制蛋白过度表达是膀胱癌进展、复发以及化疗耐药的主要原因，而穿膜肽携带凋亡抑制蛋白拮抗剂进入膀胱癌细胞能够有效诱导细胞凋亡、逆转耐药。在此基础上，我们进一步研究发现新型植物激素茉莉素能够抑制凋亡抑制蛋白表达，具备抗耐药、选择性杀伤肿瘤细胞特性，是一种具有广阔临床应用前景的化疗药物。我们继而提出了将茉莉酸与穿膜肽反应联连形成茉莉酸-穿膜肽共轭物的研究思路，并最终成功开发出了具备高活性、高选择性、强抗耐药的膀胱癌靶向治疗药物。在实验的设计和实施过程中，我们充分体会到创新是科研工作的灵魂，创新思维对调动自己的科研兴趣、挖掘课题的深度及提高研究成果的学术认可度都十分重要。创新不是凭空想象，创新是在具备相应研究背景基础上，以现有工作基础为基石，广泛而有选择性地深入阅读相关文献，提出研究方向的切入点，并通过前期实验反复论证实验方案的可行性。有了扎实的理论知识和相关研究经验，才会有灵机一动，才会有豁然开朗。对于我们学生来说，我们的创新思路不需要去解决重大难题，也不需要去攻克技术难关，有时我们只需要就某个问题提出新的观点或就某个方法做出一些改进，关键在于要有不同于现有研究报道的亮点和公认的研究价值。照搬别人的思路去换一种研究对象（比如换一种细胞株进行实验）的意义不大，只注重研究现象而不继续深入探讨背后的机制也不可取，均不能够发表高质量的文章。在文献检索阅读的过程中，有选择性的阅读很重要。对于一些不了解的领域我们可以先通过阅读中文综述了解一些相关概念；再通过阅读外文综述全面掌握研究现状和新近研究进展；最后通50 华中科技大学博士学位论文过重点精读该领域的相关高影响因子文章，理顺自己的研究思路和掌握一些实验方法的细节。积极寻找整合校内外合作资源能够促进项目的顺利开展，如茉莉酸-穿膜肽共轭物前药合成路线由中科院上海药物研究所和本项目组联合设计，在此过程中利用了上海药研所的专业设备和丰富的药物设计经验，拓展了我们的思路，巩固了本项目的设计合理性和操作可行性。平时遇到一些难题时，我们常常积极地与向国外从事相关领域前沿工作的师兄请教，往往都能够及时得到专业的建议，为课题的顺利实施提供了保障。定期分析总结现有实验结果在研究的过程中也很重要，能够及时为下一步研究提供方向，避免走不必要的弯路，并可以为最后的论文撰写打下基础，理想的情况应该是实验完成的同时论文也随即撰写完成。论文的撰写关键在于清晰完整地对研究内容、结果和意义进行科学阐述，就像讲故事一样将故事真实的来龙去脉有条理地讲清楚，要能够让别人对这个故事感兴趣，听得懂也听得下去，最后觉得你讲的故事挺有意义，这样这篇文章就撰写成功了。当然，在论文的撰写过程中一定要保持从事科研工作的严谨作风，保证结果的真实性，杜绝抄袭，不能有任何侥幸心理。以上是老师们多年来对我的教导中我体会较深的一些地方，衷心感谢导师曾甫清教授、赵军教授和实验指导老师童强松教授对我的精心栽培，我的体会是恩师们为人、做学问的真实写照，恩师们的教诲使我受用一生。51 华中科技大学博士学位论文致谢衷心感谢我的导师曾甫清教授对我的谆谆教诲、严格要求和多年来的精心栽培，您豁达的处世胸怀、严谨的治学态度、审慎缜密且富于创新的思维方式、广博而深厚的知识素养和不倦的探索精神是我毕生学习的典范，将永远激励我奋发图强，永不懈怠，谨致以深深的敬意和谢意!衷心感谢我的导师赵军教授多年来对我的辛勤指导、悉心教诲和无私关怀，您兢兢业业的工作作风，严谨求真务实的科研态度，以及在临床、科研及学习生活中对我的言传身教让我终身受益匪浅，谨致以深深的敬意和谢意!衷心感谢小儿外科童强松教授对我无微不至的关怀和帮助，在实验过程中，从课题的选题、设计，实验操作到结果的分析总结，论文的撰写，都得到了你的鼎力相助，谨致以深深的敬意和谢意!衷心感谢肖传国教授、张齐钧教授、张润清教授、肖亚军教授、陈敏教授、庞自力教授、张小平教授、李兵教授、李恒教授、朱朝晖教授、鞠文教授、邢毅飞教授、苏昌明教授、范民教授、陈朝晖教授、杨军教授、汪良老师、李文成老师、韩晓敏老师、王振迪老师、石瑛老师在理论学习和临床实践等方面给予的指导和教育。衷心感谢杨荆艳、胡丹护士长等泌尿外科全体护理部的老师在临床实习期间给予的帮助。衷心感谢协和医院中心实验室董继华老师、卢银平老师、邢诗安老师、刘朝老师等在实验技术和材料等方面提供的指导和帮助。衷心感谢邬喻、夏伟、白杨、王竞、张士龙等师兄在实验、生活及学习等方面给予过的帮助，衷心感谢顾朝晖、何远桥、王智宇、郭炬、梁铸林、魏卓、吕磊、肖行52 华中科技大学博士学位论文远、罗兵锋等师兄弟的帮助和协作。衷心感谢父母三十年来的养育和资助。衷心感谢妻子陶丹多年来的理解与支持。祝所有关心和支持我的人们一生平安！53'