环烯醚萜类成分生物合成途径及关键酶基因探究进展

环烯醚萜类成分生物合成途径及关键酶基因探究进展　　【摘要】环烯醚萜类化合物是广泛存在于双子叶植物中的一类化合物，具有广泛的生物活性，如神经保护、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用。文章对药用植物环烯醚萜类化合物生物合成途径及三个可能的关键酶基因的研究进展进行综述，以期为进一步解析环烯醚萜生物合成途径以及挖掘功能基因奠定基础【关键词】药用植物；环烯醚萜类化合物；生物合成途径；关键酶基因【中图分类号】R284【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2017）08-0044-05Abstract：Iridoidsareaclassofcompoundswidelyfoundindicotyledonousplants，whichhaveawiderangeofbiologicalactivities，suchasneuroprotection，anti-tumor，antioxidant，anti-inflammatoryandothereffects.Inthispaper，thebiosyntheticpathwayofiridoidsinmedicinalplantsandthreekeyenzymegeneswerereviewed.Inordertolaythefoundationforfurtheranalysisofiridoidbiosynthesispathwayandtheestablishment16 offunctionalgenes.Keywords：MedicinalPlants；lridoid；Biosyntheticpathway；KeyEnzymeGenes�h烯醚萜类化合物（Iridoids）是一类环戊烷结构单元的环状单萜衍生物。具有环戊烷环烯醚萜（iridoid）和环戊烷在C7、C8处开环的裂环环烯醚萜（secoiridoid）两种基本骨架。此类化合物最基本的母核是环烯醚萜醇，具有环状烯醚及醇羟基，由于醇羟基属于半缩醛羟基，性质活泼，故此类化合物多以苷类存在虽然环烯醚萜首次从蚂蚁的分泌腺作为防御物质分离到，但目前已知的此类化合物多来自于植物，多见于木犀科、马鞭科、茜草科、龙胆科、玄参科、唇形科、山茱萸科等双子叶植物中，具有广泛的生物活性。如山茱萸科山茱萸环烯醚苷对糖尿病引发的心脏病变、肾功能与结构的改变以及血管并发症等多种并发症具有较好的防治作用[1]；茜草科巴戟天中的水晶兰苷，具有显著的抗炎镇痛作用，与巴戟天的祛风湿作用密切相关[2]；海巴戟中得到的citrifolinoside和citrifolinin16 A对紫外线诱导的、在肿瘤诱发和生长中起重要作用的蛋白活化剂AP-1有显著的抑制作用，是目前为止发现的两个具有此活性的环烯醚萜化合物[3]；海巴戟中的车叶草苷对铜绿假单胞菌、摩氏变形杆菌的抑制作用，与海巴戟用于治疗皮肤病、感冒、发烧等疾病有关[4]。环烯醚萜还是玄参科胡黄连属植物中主要的化学成分，胡黄连属含有二十多种环烯醚萜类成分，胡黄连苷-Ⅰ和胡黄连苷-Ⅱ是胡黄连环烯醚萜苷类成分中的主要活性物质[5]；玄参中桃叶珊瑚苷具有止痛、降血压、抗炎、抑制肿瘤生长、抗病毒、降血糖、抗氧化延缓衰老等多种作用[6]；地黄发挥疗效的主要物质基础如梓醇益母草苷、桃叶珊瑚苷、蜜力特苷、地黄苷A、D、E都属于环烯醚萜类化学成分[7]。龙胆科龙胆属和獐芽菜属中主要的成分也是环烯醚萜，龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷等成分具有保肝、抗胆碱、镇痛镇静等作用，已经开发作为抗肝炎和健胃药等[8]环烯醚萜类化合物多种多样的生物活性备受研究者的关注，一直是研究的热点。但研究主要集中在新化合物的分类鉴定、药理活性的研究[6，9-11]。随着对次生代谢成分生物合成以及功能基因的研究的开展，环烯醚萜类化合物的生物合成途径以及功能基因的挖掘研究也积累了很多成果。本文就这一方面的研究进行综述1环烯醚萜类成分代谢合成途径16 萜类化合物的合成过程可分为3个阶段，即中间体的生成（IPP和DMAPP生成）、萜类化合物的合成（催化IPP和DMAPP生成各种中间体或萜类）和最后的修饰（对萜类终产物进行复杂的结构修饰），环烯醚萜作为特殊的单萜类成分也具有类似的合成途径11中间体的生成公认的环烯醚萜中间体生成途径有两条：一条为甲羟戊酸途径（MVApathway），该途径在胞质中进行，由3分子乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A开始，共计6个酶的参与[12]。另一条途径为甲基�CD�C赤藓醇�C4�C磷酸途径（MEPpathway），它在质体中进行，由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸缩合开始，共计8个酶的作用，该途径所参与的8个酶已经有6个（除了HDS，HDR）成功结晶并进行了结构鉴定[13]。两个途径最终均合成IPP和其异构体体二甲基丙烯基焦磷DMAPP。这两条途径发生于细胞的不同位置，起始物完全不同，但产物却完全一致，而且存在着IPP和DMAPP在胞质和质体之间的交互使用，有学者认为MEP途径合成的IPP和DMAPP主要用于单萜、双萜、四萜的生物合成[13]自然界中的萜类化合物虽然种类繁多、结构多样，但都以异戊二烯为基本单位，都起始于共同的前体：IPP或DMAPP[14-15]12环烯醚萜的骨架构成IPP和DMAPP以“头-尾”或“头-头”的缩合方式在香叶基焦磷酸合酶（geranyldiphosphatesynthase，GPPS）催化下缩合成香叶基焦磷酸（geranylpyrophosphate，GPP）。GPP是重要的分界点，不同的萜类合成自GPP开始通过不同的代谢方向流向单萜、二萜、三萜和生物碱等合成途径。16 　　对于环烯醚萜合成，GPP先去磷酸基团而成香叶醇（geraniol），继而在香叶醇-10-羟化酶（geraniol10-hydroxylase，Gl0H）的作用下在C-10位置上羟基化而生成10-羟基-香叶醇（10-hydroxygeraniol），接着C1和C10部位被氧化成10-氧香叶醛，至此，以上反应都属于链式的。10-氧香叶醛再经过关键的一步环化，而成环烯醚萜的骨架琉蚁二醛（iridodial），作用于此步的酶直到2012年才发现和获得，即环烯醚萜合酶（iridoidsynthase，IS）[16]13后修饰阶段一种植物体内一般存在多种不同形式的环烯醚萜类物质，主要是因为萜类生物合成途径中后修饰酶的存在，这些结构修饰包括羟基化、糖基化、甲基化、环氧化等、酰基化或者结合小分子等修饰多种反应[17]环烯醚萜类化合物具有环戊烷环烯醚萜（iridoid）和环戊烷开裂的裂环环烯醚萜（secoiridoid）两种基本骨架。所以环烯醚萜类成分的生源途径主要有两种：从表伊蚁二醛（epi-iridodial）经表去氧番木鳖酸（epi-deoxyloganic）生成桃叶珊瑚苷（aucubin）和类似的脱羧化合物[8]。龙胆科龙胆属和獐牙菜属中的主要成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷以及长春花中多样的吲哚生物碱均来自裂环烯醚萜类合成途径，裂环番木鳖苷是形成獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、吲哚生物碱等的关键中间体16 相比于环烯醚萜而言，裂环环烯醚萜的生物合成途径的研究相对深入，尤其长春花的吲哚生物碱生物合成途径进行了40多年的研究，合成途径得到比较多的解析，因而裂环番木鳖苷之前的生物合成途径的研究有助于其他植物裂环环烯醚萜的生物合成途径的解析。近几年，龙胆、秦艽和獐牙菜属等龙胆科多种植物的研究也积累了不少成果。伊蚁二醛（iridodial）经7-deoxyloganeticacid、去氧番木鳖酸（deoxyloganicacid）、番木鳖酸（loganicacid）、番木鳖苷（loganin）而成裂环番木鳖苷。这里面涉及到的酶分别是（7-Deoxyloganeticacidsynthase，7DLS）、DLGT（7-deoxyloganeticacidglucosyltransferase）、DL7H（7-deoxyloganicacid7-hydroxylase）、LAMT（loganicacido-methyltransferase）、SLS（secologaninsynthase）5�N酶[18-19]2环烯醚萜类成分三个重要功能基因研究进展IPP和DMAPP生成之前相关途径中的关键酶已有很多表述，此文重点综述IPP和DMAPP生成之后即萜类化合物的合成和修饰的相关功能基因的研究G10H基因香叶醇是环烯醚萜类化合物生物合成途径的重要组分。此反应是生成番木鳖苷的第一个专属步骤，G10H在裂环番木鳖苷的形成过程中起关键性的调控作用，是烯醚萜类化合物合成途径中第一个限速步骤[20-21]。G10H属于膜结合的依赖NADPH细胞色素p450单加氧酶（cytochrome16 P450monooxygenase）家族中CYP76B亚家族的成员[22]。除此之外，G10H还具有较弱的催化3′-羟基柚皮素（3′-hydroxylationofnaringenin）生成圣草酚（eriodictyol）的活性，参与植物黄酮类物质的合成[23]G10H基因首次从长春花中被纯化出来[24]。由于植物体内的多种多样的P450基因，克隆G10H基因比较难。第一个基因cDNA2001年从长春中克隆出来[25]。目前，G10H酶编码基因已从长春花[26]、川西獐牙菜、秦艽、黑紫獐牙菜[27]等植物中克隆得到，且已证明G10H在长春花中的长春花碱和川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷等物质合成过程中起着重要调节作用[28]。G10H基因cDNA全长1578-1637bp，开放阅读框为1488-1491，编码495-496个氨基酸。预测G10H无跨膜或者部分跨膜结构域，在植物不同器官中的表达量不同，如主要在秦艽的根和花表达，而在叶、茎总表达量很低，在川西獐牙菜中，主要在叶中表达，茎和根表达微弱。川西獐牙菜中对胚性细胞的愈伤组织进行了过表达研究，验证了G10H对裂环烯醚萜的上调作用[28]16 IS基因环烯醚萜合酶是环烯醚萜生物合成的关键酶，是孕酮5β-还原酶（P5βR）家族的成员，属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超基因家族成员[29]。其底物为线状单萜10-oxogeranial，首次从长春花中发现和鉴定。该酶与所有已知的利用香叶二磷酸作为底物并产生一种阳离子中间产物的单萜环化酶相反，新的环烯醚萜苷合成酶使单萜在两个主要步骤中环化，前驱10-氧香叶醛（10-oxogerania1）经过一个传统的还原反应形成一种烯醇中间体，然后通过一个Diels-Alder环加成反应或迈克尔（Michael）加成反应进行环化[30]。环烯醚萜合酶是科学家的一个重大发现，这使得研究人员通过生物技术合成环烯醚萜类化合物整体成为可能。Hu等[31]首次解析了环烯醚萜合酶及其复合体结构，并对IS的催化机理进行了研究，有反式机制与顺式机制两种催化机制。LiliQin等[32]为了进一步揭示IS的催化机制，通过从长春花中克隆、表达、纯化、结晶的方法分析了环烯醚萜合酶载脂蛋白和结合了NADP+/8-oxogeranial的结构，发现活性中心缺少在SDR中经典的结构保守区Tyr/Lys/Ser，Tyr178具有重要的催化功能，IS具有底物专一性。目前，张成珏[33]已在川西獐牙菜中克隆得到SLS基因SLS可以催化番木鳖苷的环戊烯环氧化裂解而成开联番木鳖苷[34]，也是一个细胞色素P450超家族成员，最早是由Vetter等[35]于1993年发现。喂饲实验表明这个反应发生在液泡中[20]，在长春花悬浮细胞中分离并进行了功能分析，它是一种与细胞膜相关的对氧气和NADPH依赖的细胞色素P450单加氧酶[36]。作为直接催化合成开联番木鳖苷的酶，是长春花吲哚生物碱生物合成途径中的一个关键酶，也是裂环烯醚萜类生物合成的一个关键酶。16 　　韩梅等[26]采用两步Gateway-PCR反应法从2周龄长春花幼苗中克隆SLS1481bp的基因片段。Yamamoto等[34]从忍冬的细胞悬浮培养粒体的准备中物中检测到SLS。SLS在反应中的作用依赖于NADPH和分子氧，能被一氧化碳和细胞色素P450抑制剂阻断，表明该反应受细胞色素P450调节。免疫组织化学和原位杂交试验表明SLS定位于长春花叶片的表皮细胞中[36]。目前仅从长春花、喜树[37]、滇龙胆[38]中克隆到SLS基因。喜树中SLS基因cDNA长度1706bp，具1575bp完整的开放阅读框，编码524个氨基酸。GrSLS1基因开放阅读框长1560bp，编码519个氨基酸3小结与展望鉴于环烯醚萜类成分的重要生物活性，深入解析生物合成途径和挖掘相关功能基因，可以为将来通过基因工程方法进行酶的体外改造、筛选获得高效生产的环烯醚萜类的工程菌奠定重要基础，或者调控活性成分的积累，提高药材的品质奠定基础药用植物中环烯醚萜类化合物的生物合成途径尤其是下游途径的解析以及相关功能基因的研究还处于起步阶段，目前只有对长春花、喜树、獐芽菜属等少数植物进行过研究。虽然目前推测环烯醚萜合酶、开联番木鳖苷合成酶可能是关键酶，但其16 研究还不够深入，尚需要结合基因组学和转录组学，对这些关键酶基因克隆、表达及功能鉴定、次生代谢途径的影响及调控进行继续深入的研究。参考文献[1]褚思娟，张兰，刘港，等.山茱黄环烯醚萜苷主要药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（9）：1331-1334.[2]徐吉银，楚桐丽，丁平.巴戟天属植物环烯醚萜类化学成分和药理活性研究进展[J].广州中医药大学学报，2006，23（3）：268-271.[3]SangSM，LiuGM.NewunusualiridoidsfromtheleavesofNoni（MorindacitrifoliaL.）showinhibitoryeffectonUltravioletB-inducedtranscriptionalactivatorprotein-1（AP-1）activity[J].Bioorganic&MedicinalChemistry，2003（11）：2499.[4]AtkinsonN，BriceHE.Antibacterialsubstancesproducedbyfloweringplants（II）.TheantibacterialactionofessentialoilsfromsomeAustralianplants[J].AustJExpBiolMedSci，1955，33（5）：547.[5]�炜伟，李鹏，姚仲青，等.胡黄连苷-Ⅰ和胡黄连苷-Ⅱ研究进展[J].中药材，8（38）：1756-1760.[6]高鑫，董婉茹，陈平平，等.玄参中环烯醚萜苷不同构架的药理学研究[J].哈尔滨商业大学学报，2016，32（6）：656-658.16 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