生物人工肝研究进展和应用前景探讨

　　生物人工肝研究进展和应用前景探讨-->　　摘要急性肝功能衰竭是最具挑战性的一种临床综合征,肝移植是唯一可治愈急性肝功能衰竭的方法,但供体匮乏是肝移植的主要问题,人工肝可作为肝移植过渡支持手段.非生物人工肝在提高论文下载急性肝功能衰竭患者存活率方面作用有限,生物人工肝具有肝细胞的代谢、解毒和合成功能,典型的生物人工肝包括细胞、细胞培养方式及生物反应器.本文主要论述目前进入临床试验的生物人工肝,并对生物人工肝替代治疗的将来作一展望.　　关键词:急性肝功能衰竭生物人工肝肝脏支持0引言人工肝支持系统(artificialliversupportsystem,ALSS)简称人工肝,是20世纪50年代逐渐发展起来的用来为肝衰竭患者提供体外肝脏功能支持的技术方法.经过50余年的发展,目前人工肝治疗技术已逐渐成熟,基本形成3大类:(1)非生物型人工肝(non-bioartificialliver,NBAL):指各种以清除毒素功能为主的装置,如血液透析、血液滤过、全血/血浆灌流、血液置换、分子吸附循环系统等;(2)生物型人工肝(bioartificialliver,BAL):一般专指人工培养的肝细胞为基础构建的体外生物反应装置;(3)混合生物型人工肝(hybridbioartificialliversupportsystem,HBALSS):由生物及非生物部分共同构成的人工肝支持系统[1]　　.　　1963年Nose教授等在成功通过血液透析系统治疗肾功能衰竭50年后,首次报道一种替代肝脏合成和代谢功能的装置,该装置含200g猪肝细胞,滤过膜采用肾透析所用的50kDa凝胶纤维素膜,这是生物人工肝早期雏型.1986年Demetrion教授首先提出BAL的概念,即由肝细胞和人工解毒装置共同组成的循环系统,能发挥肝细胞的作用[2]　　.构建BAL三要素为细胞、细胞培养方式及生物反应器,这些一直是人们研究的重点,虽取得一些进展,但至今仍存在许多理论和临床实践上迫切需要解决的问题,如最佳细胞、体外细胞长期稳定性、活性的提高和生物反应器重建肝脏的三维结构等,但生物型人工肝作为肝移植过渡支持手段的效果是肯定的,并且对严重肝衰竭患者肝功能自然恢复也起到重要作用,同时在肝移植供体匮乏的当今时代,生物性人工肝有可能成为替代肝脏的一种方法[3-4] 　　.本文主要就上述BAL三要素研究进展和应用前景作一述评.　　1BAL的细胞肝组织主要由两种类型细胞组成:实质细胞和非实质细胞.肝实质细胞是肝脏主要功能细胞,具有非常复杂的代谢功能,包括代谢、凝血、蛋白合成和解毒.非实质细胞如星状细胞、Kuppfer细胞、内皮细胞、胆管内皮细胞等对维护肝脏的结构和功能极其重要.　　目前,所有临床实验的BAL都尝试着去模仿肝细胞的功能,从而来实现对患者的治疗作用.　　这些肝细胞获取方法大多是采用肝细胞外基质释放的胶原蛋白酶经肝脏脉管系统灌注[5]　　.　　但是,人体肝细胞是表皮细胞源性的,需要细胞与细胞之间的接触以及与非实质细胞的接触才能发挥其生理功能[6]　　.现有BAL装置大多缺乏这一要求即微环境,因此BAL中肝脏细胞多表现为功能降低,关键酶活性丧失以及最后导致繁殖能力丧失[7]　　.另外,这些BAL系统大多采用常规一层膜培养细胞技术,其模拟代谢转化梯度和矢量与体内相比较差.因此,理想的BAL细胞是当前迫切需要解决的问题之一.目前,BAL的细胞主要有下列几种.　　1.1人类原代肝细胞较理想BAL细胞是自体肝细胞.自体肝细胞从分化起源上来讲,有着相同的免疫原性,不会发生免疫排斥反应.但临床上终末期肝病患者其肝细胞胞的数量和质量均不能满足BAL肝细胞的要求,这些病态的肝细胞一旦离开体内微环境会失去他们全部功能.所以人类自体细胞虽然有免疫方面的优势,但不能作为一种满意的细胞.　　同种异体肝细胞是另一个比较好的细胞,但异体肝细胞有三方面的因素限制了其使用.一是有限,在临床上很难立刻获得足量健康肝细胞;二是同种异体存有免疫排斥;三是从人类组织中提取,可能会传播一些疾病.　　为了克服上述不足,有研究人类肝细胞永生化技术,即建立人类永生化肝细胞株,其原理是通过在细胞中导入含肿瘤基因的病毒/质粒,从而使细胞逃避M1衰老期,再通过诱导端粒酶保持端粒的长度,从而使细胞逃避M2危机期,最终达到永生化.目前主要使用SV40T和hTRET这两种肿瘤基因.这类细胞广,免疫并发症少,但肝功能保留不全,还存在致癌及病毒感染的风险.近年来,有学者研究了一种可恢复性肝细胞株,他是在将肿瘤基因导入原代细胞获得永生化后, 再以特异性位点重组技术切除该基因,使细胞恢复到永生化前的状态,从而避免了其致癌性及病毒感染,但该技术仍处于基础研究阶段,有望使同种异体肝细胞作为BAL的最好的细胞[8]　　.　　1.2肝细胞株在体外,具有无限生长潜能的肝细胞株被证实是BAL一个有希望的细胞.这些细胞大多是从人类肝脏肿瘤细胞分化而来,而且在体外培养时显示出了很好的耐受性.　　最常用于BAL研究的细胞株是HepG2-C3A细胞株.选择这一细胞株的原因是他具有正常细胞的大多数功能,包括白蛋白的合成,P450活性和尿素的代谢,由于他是肿瘤源性的,可产生AFP,作为HepG2功能的一个标志.由于这些细胞是从恶性肿瘤分离而得到的,有可能转移到免疫妥协的患者身上[9]　　.因此,采用这些细胞作为细胞的BAL,常需要一个滤过系统来阻止细胞离开生物反应器.　　肿瘤源性肝细胞包括C3A、HepG2等细胞株,充足,增殖能力强,且具有良好的合成功能[10]　　,但目前只有C3A有应用于临床的报道,这可能是由于其代谢解毒功能较弱,并存在潜在的致癌性所致.目前一个研究方向就是对这类细胞株进行改良,增加其代谢功能,如Enosawaetal用谷氨酰胺合成酶基因转染HepG2细胞,转染后的细胞(GS-HepG2)具有良好的氨清除能力.但是这些系统在临床上广泛使用之前需要更多的临床试验.　　1.3异种肝细胞由于人肝细胞的短缺,很多异种动物肝细胞成为BAL的细胞,包括猪、犬、兔、鼠等哺乳动物.异种肝细胞是从其他物种肝脏分离出来的.使用这些细胞的优势在于他们有足够多的数量,而且他们的生产可以被严密的控制.　　其中,猪肝细胞非常有吸引力,因为他们显示出了诸如尿素合成,白蛋白合成以及P450活性等功能论文下载与人类肝细胞相似.这些细胞可以耐受大部-->分的操作步骤来变得容易获得和储存几个月以备使用.故目前应用较多,很多进入临床的BAL应用的就是猪肝细胞.异种细胞的使用需要关注的是动物源性传染病传播,特别是猪内源性逆转录病毒.在20世纪90年代中期,来自英国的两篇报道提出了关于动物传染性疾病在体外传播,结果导致了欧洲异种肝细胞的临床使用完全被禁止.而在美国,异种细胞的使用法律法规要求进行预筛选,没有动物性传染病的优先使用,而且需长期监视异种细胞植入后的患者.　　但他也存在着缺点,比如猪逆转录病毒(PERV)的感染问题, 虽然目前临床应用的人工肝还没有发现1例感染该病毒,这可能与人血浆中的补体通过经典途径灭活PERV以及异源性抗Gal-a-1,3Gal抗体可以在体外阻止PERV感染人等有关[11-12]　　.但动物试验证实培养液中还是能检测到该病毒的存在,2003年SARS的流行引起人们对人兽共患疾病更加关注.另外异种肝细胞还能出现免疫排斥反应,而且其生物合成功能也不能完全代替人肝细胞,上述因素大大限制了猪肝细胞在BAL中的应用.因此,随着其他组细胞关键性技术的突破可能会逐步淘汰异种细胞的使用.　　1.4干细胞干细胞是另一类很有希望的BAL细胞,在去分化状态下无限增值,而且具有良好的分化能力,多种起源的干细胞在组织动员方面显示有一定的前景,特别是在BAL,包括胚胎干细胞、祖细胞、造血干细胞、骨髓干细胞以及转分化干细胞.但是,这些细胞还没有正式用于BAL.而且应用于BAL的干细胞还处于未成熟阶段.其存在的问题是还没有一种完全有效的纯化和鉴别干细胞的方法,而且目前尚无法使干细胞在体外扩增至107数量级,这是其临床应用最大的“瓶颈”　　[13]　　.　　2BAL的细胞培养BAL所需肝细胞数量应相当于受体肝质量的1/10-1/5,即1-2×1010,如此大规模的体外细胞培养是BAL应用的一个挑战.为了尽可能的保持细胞的活性及功能,人们不断改进细胞的培养方法,包括细胞悬液培养、单层贴壁培养、微载体培养、微囊化培养、反应器培养及共培养等多种模式,下面对其中主要的几种进行介绍.　　2.1微载体培养微载体是指直径在60-250μm的由天然葡聚糖或其他聚合物组成的微球,目前最常用的是Cytodex-3.该方法是将肝细胞黏附于微载体表面生长,由于微载体具有较大的表面积与体积比,可以在有限的培养空间培养更多的细胞,而细胞聚集后相互间紧密的接触,也可以增强肝细胞的功能表达[14]　　.　　2.2微囊化培养微囊实质上是一种半透膜,其分子截留量一般为75-100kDa,用这种半透膜做成的微囊包被肝细胞,既具有良好的通透性,又能起到免疫隔离屏障的作用.目前常用的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊已被证实具有良好的生物相容性和通透性,从而得到广泛的应用[15]　　.　　2.3球形聚集培养 该方法是通过被覆培养瓶、旋转培养箱、液喷流槽等多种方法,限制肝细胞的贴壁生长,从而使新分离的肝细胞聚集成球.研究表明,该聚集体为肝细胞提供了一个类似于体内的三维生长环境,其内可见细胞间胆小管、细胞连接等结构,可促进肝细胞的生长和代谢功能.但由于聚集体中心的细胞处于不良的营养和缺氧环境,容易衰老死亡,所以必须控制形成的球形聚集体的直径(3BAL的生物反应器生物反应器是整个BAL的核心部分.目前研究及应用的生物反应器主要有以下几种.　　3.1中空纤维型生物反应器是目前应用最多的一类反应器.中空纤维管分为内腔和外腔,目前一般将肝细胞黏附生长于外腔,内腔用来通血浆或氧气.可根据不同的细胞选择合适分子截留量的生物膜.该反应器最大的优点是巨大的表面积与体积比,便于代谢物的转运,且保持最小的死腔.但由于肝细胞在反应器中分布不均,也易造成细胞活力的下降.　　3.2平板单层生物反应器该反应器是将肝细胞直接种植于平板上,他的优点是细胞分布均匀,微环境一致,但表面积与体积之比下降.Shitoetal[17]　　设计了一种带有内膜氧合器的平板单层生物反应器,研究结果表明:带有氧合器的反应器中肝细胞活性更稳定,功能更强.　　3.3灌注床/支架生物反应器该生物反应器是将肝细胞种植在灌注床或支架上,该反应器使血浆与细胞直接接触,增加了物质的转运,三维支架也促进了肝细胞三维结构的形成,同时也容易扩大细胞容量,其缺点是灌注不均一,易堵塞.　　3.4包被悬浮生物反应器该生物反应器是将肝细胞用一种半透膜材料包裹,制成多孔微囊,然后进行灌注培养.其优点是所有细胞有相同的微环境,有大量细胞培养的空间,减少免疫反应的发生.缺点是细胞稳定性差,物质交换能力受限[18-19]　　.　　4BAL的临床应用4.1HepatAssist2000肝脏支持系统是一个体外利用猪肝细胞作为基础的BAL系统,由Cedars-Sinai医疗中心发明,ArbiosInc.,MA制造.这一装置含有4部分组成:含有7×107猪肝细胞的纤维空心反应器,2个木炭过滤网,1个膜冲氧器和1个泵.生物反应器中生物反应膜能阻止整个肝细胞通过,但可以让水溶性和蛋白结合的毒物以及-->大分子质量的蛋白质自由通过. 这些物质在肝细胞之间通过内部毛细管相互交换,而血浆则是在空心管的内部流动.一开始,患者的血液在血浆置换装置中被分成血浆和细胞成分,两个活性炭过滤装置可以清除血液中的有毒物质,其原理如同血液透析系统.在解毒作用后,血浆通过含有肝细胞的空心纤维管,进一步去除血氨、乳酸盐、胆汁酸,生成分泌白蛋白和葡萄糖,而净化血浆.净化血浆与细胞部分混合,重新回输给患者.氧气发生器和加热器,位于活性炭过滤和肝细胞反应器之间,保持血浆和肝细胞处于体温状态下.HepatAssist2000肝脏支持系统是体外细胞基础肝脏支持系统中研究最多的一个.这一系统在体内和体外经过一系列严格临床评估,在改善患者神经系统方面是肯定的[20]　　.　　1997年,该系统通过Ⅰ、Ⅱ期试验并被证实了他的安全性,是终末期肝病患者通向肝移植手术的桥梁.随后,该系统进行了为期4年的随机对照试验,通过来自美国和欧洲的20个临床医疗中心的171例患者的使用,证实其能够提高爆发性肝衰竭患者的生存率.但是,该系统尚在进行Ⅲ期临床试验,其临床应用前景尚不容乐观[20-21]　　.　　4.2ELAD体外肝脏支持系统体外肝辅助装置(extracorporealliverassistdevice,ELAD)是由Baylar设计,Vital治疗公司(SanDiego,CA,USA)研制开发.其在概念上与辅助肝脏相似,但ELAD运用HepC3A肝细胞,而不是猪肝细胞,包括四个中空纤维透析生物反应器.使用之前,在每个反应器里放入少量的肝细胞,经过3L/h).这个过滤设计有一个显著的优点,就是他可以连续工作10d而不间断.超过滤只允许直径1μm的物质通过,从而保证没有HepG2细胞再回输到患者体内.　　两个临床试验中心24例患者通过该系统进行治疗,通过监测平均动脉压,心脏指数等来评价其安全性.结果24例患者神经系统症状与对照组相比明显改善.在其Ⅰ、Ⅱ期临床试验中,12个医疗中心的44位患者的治疗,证实了ELAD系统的安全性.临床数据显示与对照组相比,ELAD治疗组患者生存率明显提高,大多患者能安全过度至肝移植.近来,Enosauleauetal开发,是利用螺旋形、三维、非编织聚酯纤维、高密度猪肝细胞与氧合器结合构成的生物人工肝,可聚集培养猪肝细胞10×109个以上[26]　　.采用高密度的肝细胞形成更符合生理大小的聚合物.AMC-BAL与其他生物反应器在结构上的最大不同在于没有中空纤维生物半透膜,而是一种氧发生器和肝细胞培养聚酯罐合二为一的一体化生物反应器,从而避免了生物半透膜微孔因污物阻塞, 而不能发挥物质交换的作用的缺点.AMC-BAL生物反应器完全模拟正常肝脏的结构,每个肝细胞都能获得良好的灌流,保证了最佳的物质交换效率.vandeKerknoveetal报道,这一装置在20世纪90年代后期经过了许多动物实验,完成了Ⅰ期试验.在意大利开始的Ⅰ期临床实验中,对7例昏迷程度Ⅲ或Ⅳ期的肝衰竭患者进行8-35h的治疗,所有患者的神经系统功能改善,而且胆红素和血氨的浓度有所改善.其中6例患者成功的过渡到原位肝移植,另1例接受两次治疗后肝功能恢复,不需要肝移植,未发现不良反应[27].2004年,vandeKerkhoveetal[18]　　再次报道1例通过采用AMC-BLA治疗,顺利过渡到肝移植的病例.　　4.5混合型LSS-MELS系统(hybridliversupportsystem,LSSmodularextracorporealliversupportsystem,MELS)由德国柏林Charitevirchow教授研发,其生物反应器设计独特,由交织的中空纤维膜组成,产生三维架构,肝细胞团分布其上,可改善细胞的供氧和物质交换.生物反应器内有3组中空纤维管,2组由亲水的纤维管构成,血浆流经此中空纤维管,与管腔外的肝细胞接触-->;另一组由疏水的纤维管构成,是用来产生氧气和去除二氧化碳的,用于生物反应器内的气体交换.生物反应器可装填500-600g的肝细胞.三个中空纤维管形成了一个三维毛细管网,具有高效率的营养物质和酶作用底物的交换[28].　　2002年,Mundtetal报道该系统采用猪肝细胞与非实质细胞共培养而进行实验的,生物反应器存放180-550g新鲜分离共同孵化的猪肝细胞,直到用于临床.7例患者全部过渡到移植手术,在随后的两年随访中生存率达到100%.通过计算血氨的摄取和尿素的释放显示5/7个反应器中血氨是净摄入,6/7个反应器中尿素是持续释放,提示了肝功能的正常化.　　随后的Ⅰ期临床试验中证明了其安全性,没有一个患者有不良反应,3-4年的随访中,没有发现PERV的感染病例[29-30　.　　LSS和MELS还是唯一利用废弃人体供肝分离人肝细胞的系统.2003年Gerlachetal报道从废弃的人类肝脏移植中分离肝细胞和非实质细胞作为MELS的细胞.细胞在培养基中孵化数周,通过监测培养基的代谢活性,尿素合成,氨的解毒,半乳糖和葡糖醇摄取的数量来显示其稳定的表现.这一研究表明从废弃人体供肝分离的人肝细胞可以从损伤中恢复过来,若保存于反应器中共同孵化,可使这些细胞发展成为临床可用的BAL细胞[31].但该系统还没有通过Ⅲ期临床试验,来进一步证明他的有效性. 　　4.6RFB反应器(radialflom厚的聚酯纤维膜,反应器中可加入200-230g新鲜分离的肝细胞,加温氧合的血浆从纤维管的外周向中间通过,汇聚到收集腔中,离开生物反应器之后与血液重组回输给患者.　　2002年,Morisanietal报道采用意大利RFB治疗7个多种病因引起的急性肝衰竭患者Ⅰ期临床试验.其中6例患者度过危险期,顺利进入肝移植阶段.一个患者因多器官功能衰竭死亡.　　患者在治疗期间是被屏蔽的,以免传播PERV,随访180天没有发现传染的迹象[33].虽然该系统在Ⅰ期试验中表现不错,但是欧洲系统的将来还是不确定.因为需要更进一步的临床试验和取消当前禁止使用猪肝细胞禁令.　　4.7混合型人工肝支持系统(hybridatrifieialliversupportsystem,HALSS)HALSS由中国的研究队伍研发,这一系统与HepatAssist2000有很多相似之处,包括1个空心纤维管反应器,1个充氧器/加热器,1个活性炭吸附操作杆.唯一区别是前者使用肝细胞悬浮液和生长因子,细胞悬浮液和营养液从中空纤维管反应器的外侧灌注,与管腔内的经过活性炭吸附治疗后血浆形成对流.　　每个生物反应器最大治疗时间达5-6h,而血浆置换则需要2-3L,还有报道3.5-4L的.　　2001年,Xueetal[34]　　采用TACE-HALSS治疗了6例急性或慢性肝功能衰竭的患者,结果很令人振奋.没有发生呼吸急促,低血压或心跳过速等事件.而且所有患者的神经系统功能都有所改善.另外,总胆红素、直接胆红素和血氨都趋向于正常,而凝血酶原时间也有所改善.该还报道了两个典型例子,患者因肝性脑病而接受HALSS治疗,效果非常好,以至于在患者8d内就出院.　　2003年,笔者应用两步胶原酶法分离猪肝细胞,构建聚砜膜中空纤维管生物反应器(biolivA3Areactor),细胞数量1×1010个,与非生物人工肝同期或非同期使用,对12例患者治疗14例次,每次支持时间为6h,治疗前后观察患者一般状况,并检测血氨、凝血酶原时间和部分肝功能指标.结果:应用生物人工肝治疗后血氨、凝血酶原时间和总胆红素均明显改善,治疗2d后血氨为106±131μmol/L,与治疗前相比较172±187μmol/L差异有显著意义(P-->明治培养技术,是最稳定的肝细胞培养技术,平板最上层的空间留做血浆或营养液灌流.　　5结论BAL的临床应用前景是令人鼓舞的, 但其广泛应用仍需努力攻克许多难题,如最佳细胞,体外细胞细胞长期稳定性和活性的提高,生物反应器重建肝脏的三维结构等.今后研究方向主要集中以下几点.　　BAL最佳的细胞还没有确定,最优化的细胞扩增,保存和共培养的问题仍然没有完全解决.近来,许多科研小组想通过基因修饰改造的方法来扩增细胞数目,增强生物反应器中肝细胞的作用,比如通过谷胺酰合成酶基因修饰,使HepG2细胞改善氨的代谢;基因转染猪肝细胞膜上IL-1R拮抗剂来稀释解毒IL-1对急性肝功能衰竭的毒副作用[39];SV40和Cre/loxp-介导的基因敲除诱导人类肝细胞永生化等.　　现有的生物反应器设计只能体现肝细胞实质细胞和细胞外基质的相互作用,而忽视了非实质细胞的重要性.共培养策略可能是一个比较有前途的开拓领域[8],特别是肝细胞和非实质细胞的共培养可以提高细胞与细胞之间的相互作用.肝脏中的肝细胞面临着氧气和营养物质的浓度梯度,而这个梯度是随着他们与门静脉的距离改变而改变的,正是由于存在这一梯度,肝细胞显示了不同的功能,为了肝细胞可以继续发挥在正常肝脏中所有的功能,未来的生物反应器可能需要重建这种微环境.所有上述BAL系统,都需要肝细胞与合成表面的接触,他们最终的功能可能会由更多的拟生态的酶作用底物例如胶原来提高.　　随着生物工程技术的不断创新,未来的生物反应器应该最大化转化营养物质和氧气,这就需要发展一种称为三维立体的制造技术,来重建肝脏三维立体构象,并能精确定位细胞的位置[40].最终,理想的BAL应该是由可完全吸收BAL植入性装置来实现永久的肝脏替代作用[41].　　总之,BAL无论是在细胞,细胞培养方式,还是在生物反应器的设计上,都取得了很大的进展.然而,活体肝脏结构和功能的复杂性远远超过了BAL,要想在体外完全替代肝脏的功能,还有很长的路要走.只有将生物工程和临床研究紧密结合,才有可能在不远的将来开发出更符合临床需要的BAL,为人类健康做贡献.　　6