曲霉微生物转化黄山药的研究

曲霉微生物转化黄山药的研究‘摘要:报道以单一菌株纯培养的固态发酵方式,选用黑曲霉(YM33182)和微紫青霉(YM3213)分别对黄山药中药材进行微生物转化研究.采用硅胶色谱和凝胶色谱技术,从菌株YM33182转化产物中分离得到4个单体化合物,通过波谱数据分析,分别鉴定为p一胡萝卜贰(daucosterol)(I),薯裁皂昔元次皂昔元B(ProsaPogeninB)(n),薯茨皂昔(Dioscin)(m),纤细薯菠昔(Grac皿n)(W).而从菌株YM32139转化产物中分离到一个主要的化合物,鉴定为薯孩皂昔元(diosgenin).TLC及HPLC分析,pr0SapogeninB在菌株YM33182转化产物中的质量分数高达10.77%;而diosgenin在菌株YM32139转化产物中的质量分数为20.85%.关键词:黄山药;曲霉;微生物转化;化合物黄山药(D如coreapanthoica)是我国特有的薯菠科、薯菠属植物.其根状茎的主要有效成分为是薯裁皂昔,具有治疗心肌缺血、抗血小板凝聚、降血脂等作用〔’,2〕.微生物转化是利用微生物生长代谢过程中产生的酶对特定底物进行结构修饰的化学反应〔3〕.微生物转化技术具有反应条件温和,程序简单,产品纯度高,不污染环境等特点,展示出广阔的应用前景[’].采用生物转化的方式处理中草药,将其用于复杂天然药物的筛选和研制,并与高效快速的药物筛选手段结合,是发掘天然高效活性先导化合物的重要途径困.本文利用单一菌株的固态发酵方式,直接对中药材黄山药进行微生物转化研究,为探究黄山药有效成分的结构新颖性和多样性,发掘新型药物先导化合物,寻找防治人类疾病天然药物成分开辟又一条途径.1材料与方法1.1菌种黑曲霉A,e嗜illusni岁r(编号YM33182),分离自云南大围山土壤.微紫青霉Penieilliumjanthinellum(编号YM32139),分离自云南罗平多依河杉树林土壤.2株菌均保藏于云南大学微生物研究所.1.2黄山药薯茨科植物黄山药(Dioscoreapan-thaica)的根茎干粉(〕0.216mm),云南产中药材.1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基,马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基,固体转化培养基(m(黄山药干粉):m(鲜豆渣):m(水)=1:1:0.2). 1.4仪器日本EYELA旋转蒸发仪,德国Wa-ters高效液相色谱仪,BrukerAVDRX50()型核磁共振仪(TMS为内标).1.5药品和试剂薄层色谱及层析色谱柱用硅胶G(均为青岛海洋化工厂生产).乙睛(色谱纯),水(超纯水),甲醇,乙醇(95%),氯仿,丙酮(均为国产化学纯).1.6微生物转化以固态发酵方式,将活化好的菌种斜面接人三角瓶中(50mLPDB培养基/250mL三角瓶),摇瓶培养48h(28士2℃,200r/min),即得一级种子.按5%一7%的接种量,取一级种子转接人500mL三角瓶内装100mLPDB培养基中,摇床培养3一4d(200“min,28土2℃),扩大为收稿日期:2007一05一20作者简介:张传会(1981一),女,硕士生,主要从事真菌资源及应用微生物学研究.通讯作者:陈有为,E一mail:ywchen@y皿.edu.cn.第Sl期张传会等:曲霉微生物转化黄山药的研究二级种子.再将二级种子按7土1%接种量计接人固体转化培养基中,于28士2℃发酵12d后,即得转化产物.1.7转化产物的提取和化合物的分离纯化对转化产物采用70%乙醇浸提3次,收集合并的浸提液,过滤,滤液经真空旋转浓缩仪浓缩后,加人90%乙醇,室温下放置过夜,过滤弃沉淀物,取滤液于55℃下真空浓缩得浓缩物.以同样上述方法采用95%乙醇纯化浓缩物2次,挥弃乙醇溶剂,置60℃下干燥后,即为转化产物乙醇提取物.分别取不同菌株的转化产物乙醇提取物经硅胶柱层析分离,以氯仿、氯仿一丙酮、氯仿一甲醇梯度洗脱,凝胶柱层析纯化,获得化合物I一V.1.8转化产物乙醇提取物的分析1.8.1TLC分析展开剂:v(氯仿):v(石油醚)二4:l;显色剂:乙醇一硫酸显色剂.3组对照:黄山药乙醇提取物(CK一1),薯茨皂昔元(CK-2),微紫青霉PDA发酵物(CK一3);转化产物和对照样品均为乙醇溶解,毛细管点样.1.8.2HPLC分析色谱条件:色谱柱选用Sym-metryC18柱(5拜m,4.6mmx250mm);流动相:乙睛一水(98:2);流速:1mL/min;检测波长:203nm;柱温:常温;进样量:ro拌L.分析样品制备:精确称取转化产物乙醇提取物及各对照样品一定量,分别置10mL容量瓶中,甲醇定容后HPLC仪器分析.2结果与分析 2.1化合物I一V的结构鉴定化合物I:白色粉末,mp283一286℃(dec),易溶于毗吮,可溶于氯仿.’HNMR(500MHz,DMSO一d6)肠.3543(IH,s,H一6),5.0716(IH,s,H一g一l),3.9831(IH,s,H一3),1.4291(ZH,m,H一11),0.8541(IH,m,H一9);’3cNMR见表1.理化性质及光谱数据与文献「6」报道一致,该化合物为份胡萝卜贰(Daucos-terol).化合物n:白色针状结晶,mp230一231℃(deC),易溶于毗咙,可溶于甲醇.’HNMR(500MH:,DMSO一d6)脸.4477(ZH,t,H一2),2.6920(3H,d,H一4),3.8837(IH,d,H一3),4.7110(ZH,s,H一r一2),5.3137(IH,s,H一6),5.9116(IH,s,H一:一1);’3eNMR见表1.光谱数据与文献「7-9j报道一致,该化合物为薯菠皂贰元一a一L鼠李糖(1‘4)一日一D葡萄糖贰(pros即ogeninB).化合物111:白色粉末,mp275一277℃(dee),易溶于毗吮,可溶于甲醇.’HNMR(500MHz,DMSO一d6)般.7135(3H,t,H一4),2.7815(ZH,d,H一2),3.4866(3H,t,H一26),6.3910(IH,s,H一g一l),5.8487(IH,s,H一g一l);”CNMR见表1.理化性质及光谱数据与文献「7一9〕报道一致,该化合物为薯技皂贰元〔一。一L鼠李糖(1~2)〕一。一L鼠李糖(l~4)一日一D葡萄糖贰(Diosein).化合物W:白色粉末,mp290一293℃(dee),易溶于毗吮,可溶于甲醇.’HNMR(500MHz,DMSO一d6)己6.38(IH,s,H一g一l),5.3330(IH,s,H一6),5.1146(IH,s,H一g一1),4.9231(IH,s,H一r一l),3.5742(ZH,d,H一3);’3CNMR见表1.理化性质及光谱数据与文献「8,10」报道一致,该化合物为薯预皂贰元〔一。一L鼠李糖(1~2)〕一日一D葡萄糖(l一3)一p一D葡萄糖贰(Gracillin).化合物V:白色针状结晶,mp204一207℃;易溶于氯仿,可溶于甲醇、丙酮,难溶于水.‘HNMR(50()MHz,Me0D一d6)a3.5192(IH,d,H一3),5.3524(IH,d,H一6),1.6384(IH,d,H一8),0.9383(IH,d,H一9),4.3873(IH,d,H一16),1.8506(IH,d,H一20),1.6100(IH,d,H一25),3.3526,3.3744(ZH,d,H一26),0.7847,0.7899,0.7964(3h,d,H一27).’3CNMR(500MHz,nMSO一d6):637.05(CI),32.03(CZ),72.13(C3),42.68(C4),141.22(es),121.81(C6),32.46(C7),31.86(CS),50.50(Cg),37.64(Clo),21.28(Cll),40.20(C12),40.68(C13),56.94(C14),32.24(C15),81.24 (C16),62.54(C17),16.67(Cls),19.80(C19),42.03(CZ。),14.89(CZ;),109.70(C22),31.80(C23),29.21(e、),30.07(e25),67.25(C26),17.51(CZ:).理化性质及光谱数据与文献【10〕报道一致,该化合物为薯菠皂昔元(diosgenin).2.2TI刀和H甲LC分析结果2.2.1TLC分析结果TLC结果表明,黄山药乙醇提取物及转化菌株代谢产物中未观察到薯菠皂昔元成分,说明转化产物中的薯菠皂昔元组分是由微生物转化黄山药而形成的(如图1所示).434云南大学学报(自然科学版)第29卷表1化合物I一W的13CNM[R化学位移《inDh侣0一d6,AVDRx500)Tab.l‘3CNMRehemicalshiftsofeom即undsl一lV(inDMso一苗,AvDRxsoo)一、孟U2/3/4/5/、‘U2/3/4/5/6/AglyeoneC一lC一2C一3C一4C一5C一6C一7C一8C一9C一10C一11C一12C一13C一14C一15C一16C一17C一18C一19C一20C一21C一22C一23C一24C一25C一26C一27 C一28C一2939.5331.9680.6141.39142.99123.9134.1232.2952.4238.9723.3241.88月4.5358.8926.5430.5558.3214.0121.4438.4121.0536.2828.5248.1231.2921.2621.9825.4614.1839.4234.1880.6141.67143.25124.1134.5634.0152.6539.8123.4942.2442.83 59.0234.6383.6765.2518.7321.7744.3417.40111.6432.5731.6332.6769.2419.6938.3933.2079.0539.87141.87122.6533.0932.5951.2338.0320.2740.7641.3557.5532.7381.9963.8117.1920.2742.8715.86110.1331.0430.1531.4767.7618.1739.5132.1080.68 40.75142.84121.8334.3533.7452.3339.1723.1241.9042.4958.6934.2383.1264.9418.3321.4044.0017.00111.2533.8631.2932.6168.8919.30SugarGk一1104.6277.3480.4273.3980.2264.91105.0877.9179.0980.6979.5163.90103.81 79.7577.7678.8278.7563.81Gle一1/6/Rha一lRha一l/104.83101.1975.(X)73.3775.2073.6076.3975.0272.7570.3520.9219.33一102.88一75.04一73.70一74.77一71.31一19.48106.5276.9979.0773.5379.7964.47104.2074.7974.4676.1471.5820.67102.0580.5191.5271.6379.86研.47l:黄山药;2:转化产物;3:薯蔽皂昔元;4:菌株PDB发酵物图1转化产物的TLC分析Fig·1TLCoftransPOrmationouteome2.2.2HPLC分析结果HPLC分析比较了转化 前后物质的变化,以及薯孩皂昔元在菌株转化产物中百分含量,见图2.HpLC分析结果表明,pros即ogeninB保留时间为6.8min(D),与菌株YM33182转化产物(A)中2一致;通过纪录prosapogeninB的峰面积,根据外标法测定占转化产物的10.77%.Dioscin的保留时间为5.1min(C),纪录Dioscin的峰面积,根据外标法测定Dioscin占转化产物的24.3%,而第Sl期张传会等:曲霉微生物转化黄山药的研究Dioscin占黄山药提取物的24.6%.由此可见,经黑合物1相同,而黄山药提取物(B)未见相同保留时曲霉YM33182的转化作用,使黄山药原药用成分间内出现色谱峰,以外标法计算转化产物中薯祯皂组成和结构均发生了系列变化.昔元质量百分含量高达20.85%.与原药材黄山药HPLC图谱也显示,薯裁皂昔元的保留时间为(B)比较,菌株YM32139的黄山药转化产物(F)21.7min,与微紫青霉YM32139转化产物(F)中化中的化合物种类明显增加.图2菌株Y州。3182转化产物《A),黄山药(B),肠.蛇恤(c),h洲甲誉山B(D),击峋笋血(E},菌株yN日2139转化产物(F).的H卫LC图谱(1一山佣梦山,3一珑.沈加,2一P~沪脚加B)Fig.2HpLCChromatogramsoftransformationproductionsofYM33l82(A),ext二tantofD~rea尹anrhaica(B),prosa-pogeninB(C),Dioscin(D),dios朗nin(E),transfromationproductionsofYM32139(F)3讨论本文通过研究黑曲霉(YM33182)对黄山药的微生物转化,从该菌的转化产物中分离到转化前黄山药提取物中不含有的化合物11(ProsaPogeninB).推测该化合物是菌株YM33182产生的特定酶作用于原黄山药薯莎皂昔化学结构鼠李糖基团而形成.而微紫青霉(YM32139)对黄山药的转化作436云南大学学报(自然科学版)第29卷用,主要表现在该菌转化产物中形成一个原黄山药未含有的化合物工.同理可以看出,该化合物也是由菌株YM32139酶系作用,导致原黄山药中的薯菠皂昔失去糖基而发生了结构变化.由此可见,通过微生物的转化作用,可丰富中药材黄山药原有化合物组分,使之原物质化学结构发生质量的改变,为原药材的生物活性的增强以及天然新药成分资源的发掘提供了基础.参考文献:[5]徐亚军,郭华春.黄山药的研究进展〔Jl.农业基础科学,2005,21(2):9牛96.李伯刚,唐易芳,时铱.黄山药中水难溶性街体皂贰的 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ysedbyspeetrumdatewereDaueosterol(I),prosapogeninB(11),Diosein(111)andGracillin(IV).oneeompoundwasseparatedfromthetransformationproduetsofYM32139bytheabovewethod,andidentifiedasdiosgenin(V).TheeontentofprosapogeninBinthetransformationproduetsofYM33182was10.77%andtheeontentofdios罗nininthetransformationproduetsofYM32139was20.85%,bytheanalysisofTLCandHPLC.K勺wo找如:Dioscoreapan‘haica:A,e咭illussp·;mierobialtransformation;eompunds