检验科微生物室作业指导书模板

XXX医院检验科微生物室作业指导书生效日期：XXXX年XX月XX日276 目录第一章组织和管理微生物检验实验室设置及管理程序……………………………………………………1微生物检验实验室人员配置及培训程序………………………………………………2微生物检验实验室工作人员职责设置程序……………………………………………3微生物检验实验室记录管理程序………………………………………………………5微生物检验实验室保密程序……………………………………………………………7微生物检验实验室投诉与抱怨处理程序……………………………………………8第二章质量管理微生物检验实验室质量管理程序………………………………………………………10微生物检验实验室室间质量评价管理程序……………………………………………12微生物检验实验室室内质量控制管理程序……………………………………………13微生物检验实验室仪器设备管理程序…………………………………………………19微生物检验实验室试剂管理程序………………………………………………………22微生物检验实验室质量改进程序………………………………………………………24第三章安全管理微生物检验实验室安全管理程序………………………………………………………25微生物检验实验室二级生物安全管理程序……………………………………………27微生物检验实验室疑似高致病性微生物标本管理程序………………………………30微生物检验实验室应急管理程序………………………………………………………31微生物检验实验室菌种管理程序………………………………………………………32微生物检验实验室危险化学品使用管理程序…………………………………………33微生物检验实验室废弃物处理程序……………………………………………………35微生物检验实验室消毒灭菌管理程序…………………………………………………36微生物检验实验室职业暴露处理程序…………………………………………………37微生物检验实验室人员流动管理程序…………………………………………………38第四章检验前操作程序微生物检验实验室检验项目申请程序…………………………………………………39276 微生物检验实验室标本检验标签程序…………………………………………………40微生物检验实验室采样前病人识别程序………………………………………………41微生物检验实验室标本采集运送程序…………………………………………………42微生物检验实验室标本接受标识程序…………………………………………………43微生物检验实验室标本拒收操作程序…………………………………………………44微生物检验实验室标本检验前储存程序………………………………………………46微生物检验实验室标本检验信息输入程序……………………………………………47第五章检验中操作程序第一节微生物检验仪器标准操作规程微生物检验实验室CO2培养箱标准操作规程………………………………………48微生物检验实验室生物安全柜标准操作规程………………………………………50微生物检验实验室普通冰箱标准操作规程……………………………………………52微生物检验实验室低温冰箱标准操作规程……………………………………………53微生物检验实验室普通离心机标准操作规程…………………………………………55微生物检验实验室电热恒温水浴箱标准操作规程……………………………………57微生物检验实验室压力蒸汽灭菌效果检测标准操作规程……………………………58PREVI全自动革兰染色仪标准操作规程……………………………………………60Bact/Alert3D型自动血培养分析仪准操作规程……………………………………62Autobact全自动微生物分离培养仪标准操作规程……………………………………66VITEK2COMPACT全自动鉴定药敏分析仪标准操作规程……………………67DNP电热恒温培养箱标准操作规程………………………………………………75OLYMPUS显微镜标准操作规程………………………………………………………77电热灼烧器标准操作规程………………………………………………………………78旋涡混合器标准操作规程………………………………………………………………79移液器标准操作规程……………………………………………………………………80VITEK比浊仪标准操作规程…………………………………………………………82紫外线消毒车标准操作规程……………………………………………………………85MI-01恒温金属浴标准操作规程………………………………………………………87MB-80微生物快速动态检测系统标准操作规程……………………………………89第二节常用培养基及试剂配制标准操作规程276 营养琼脂配制标准操作规程……………………………………………………………90血琼脂培养基配制标准操作规程………………………………………………………91巧克力培养基配制标准操作规程………………………………………………………92M-H培养基配制标准操作规程…………………………………………………………93营养肉汤配制标准操作规程……………………………………………………………94碱性蛋白胨水配制标准操作规程………………………………………………………95沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基配制标准操作规程……………………………………96第三节生化和血清学试验标准操作规程微生物检验实验室触酶试验标准操作规程……………………………………………97微生物检验实验室氧化酶试验标准操作规程…………………………………………98微生物检验实验室凝固酶试验标准操作规程…………………………………………99微生物检验实验室DNA酶试验标准操作规程………………………………………100微生物检验实验室CAMP试验标准操作规程………………………………………101微生物检验实验室Optochin试验标准操作规程……………………………………102微生物检验实验室七叶苷试验标准操作规程…………………………………………103微生物检验实验室卫星试验标准操作规程……………………………………………104微生物检验实验室糖（醇、苷）类发酵试验标准操作规程…………………………105微生物检验实验室三糖铁试验标准操作规程…………………………………………106微生物检验实验室葡萄糖o/f试验标准操作规程……………………………………108微生物检验实验室甲基红试验标准操作规程…………………………………………109微生物检验实验室VP试验标准操作规程……………………………………………110微生物检验实验室吲哚试验标准操作规程……………………………………………111微生物检验实验室硝酸盐还原试验标准操作规程……………………………………112微生物检验实验室脲酶试验标准操作规程……………………………………………113微生物检验实验室赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程…………………………………114微生物检验实验室鸟氨酸脱羧酶试验标准操作规程…………………………………115微生物检验实验室精氨酸脱羧酶试验标准操作规程…………………………………116微生物检验实验室苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程………………………………117微生物检验实验室枸橼酸盐利用标准操作规程………………………………………118微生物检验实验室丙二酸盐利用试验标准操作规程…………………………………119276 微生物检验实验室硫化氢试验标准操作规程…………………………………………120微生物检验实验室ONPG试验标准操作规程……………………………………… 121微生物检验实验室沙门菌血清学检测标准操作规程…………………………………122微生物检验实验室志贺菌血清学检测标准操作规程…………………………………123致病性大肠埃希菌血清学检测标准操作规程…………………………………………124微生物检验实验室霍乱弧菌血清学检测标准操作规程………………………………125微生物检验实验室血清牙管形成试验标准操作规程…………………………………126微生物检验实验室解脲脲原体试验标准操作规程……………………………………127微生物检验实验室G试验标准操作规程………………………………………………128微生物检验实验室GM试验标准操作规程……………………………………………130微生物检验实验室隐球菌抗原检测试验标准操作规程………………………………132微生物检验实验室T-SPOT.TB试验标准操作规程……………………………………134第四节临床微生物检验基本技术标准操作规程微生物检验实验室标本处理标准操作规程……………………………………………137微生物检验实验室标本接种标准操作规程……………………………………………138微生物检验实验室细菌鉴定操作规程…………………………………………………139微生物检验实验室不染色标本检查法标准操作规程………………………………140微生物检验实验室革兰染色标准操作规程……………………………………………141微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程……………………………………………142微生物检验实验室墨汁染色标准操作规程……………………………………………144微生物检验实验室药物敏感试验标准操作规程………………………………………145第五节临床标本的细菌学检验标准操作规程脑脊液标本细菌学检验标准操作规程…………………………………………………147穿刺液标本细菌学检验标准操作规程…………………………………………………149生殖道标本细菌学检验标准操作规程…………………………………………………151粪便标本细菌学检验标准操作规程……………………………………………………153脓液伤口标本细菌学检验标准操作规程………………………………………………156中心静脉导管标本细菌学检验标准操作规程…………………………………………158微生物检验实验室真菌标本检验标准操作规程………………………………………159276 微生物检验实验室血液及骨髓标本细菌学检验准操作规程…………………………162第六节临床微生物检验标准操作规程微生物检验实验室不动杆菌属检验标准操作规程……………………………………165微生物检验实验室色杆菌属检验标准操作规程………………………………………167微生物检验实验金黄杆菌属检验标准操作规程………………………………………169微生物检验实验室莫拉菌属检验标准操作规程………………………………………171微生物检验实验室嗜血杆菌属检验标准操作规程……………………………………173微生物检验实验室布鲁菌属检验标准操作规程………………………………………175微生物检验实验室军团菌属检验标准操作规程………………………………………177微生物检验实验室弯曲菌属检验标准操作规程………………………………………179微生物检验实验室葡萄球菌属检验标准操作规程……………………………………181微生物检验实验室微球菌属检验标准操作规程………………………………………184微生物检验实验室分支杆菌属检验标准操作规程……………………………………186微生物检验实验室诺卡菌属标准操作规程……………………………………………189微生物检验实验室埃希菌标准操作规程………………………………………………191微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程…………………………………193微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程……………………………………………195微生物检验实验室志贺菌属标准操作规程……………………………………………197微生物检验实验室克雷伯菌属标准操作规程…………………………………………199微生物检验实验室肠杆菌标准操作规程………………………………………………201微生物检验实验室沙雷菌属标准操作规程……………………………………………203微生物检验实验室变形杆菌属标准操作规程…………………………………………205微生物检验实验室摩根菌属标准操作规程……………………………………………207微生物检验实验室枸橼酸杆菌属标准操作规程………………………………………209微生物检验实验室耶尔森菌属标准操作规程…………………………………………211微生物检验实验室霍乱弧菌属标准操作规程…………………………………………213微生物检验实验室链球菌属标准操作规程……………………………………………215微生物检验实验室肠球菌属标准操作规程……………………………………………218微生物检验实验室奈瑟菌属标准操作规程……………………………………………221微生物检验实验室李斯特菌属标准操作规程…………………………………………223276 微生物检验实验室副溶血霍乱弧菌标准操作规程……………………………………225微生物检验实验室产碱杆菌属检验标准操作规程……………………………………227微生物检验实验室假单胞菌属检验标准操作规程……………………………………229微生物检验实验室邻单胞菌属检验标准操作规程……………………………………231微生物检验实验室气单胞菌属检验标准操作规程……………………………………233第七节抗菌药物敏感试验标准操作规程肠杆菌科纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程……………………………………235假单胞菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程……………………………………238不动杆菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程…………………………………240嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程…………………………242洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程…………………………244葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程…………………………………246肠球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程……………………………………249链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程……………………………………251超广谱β-内酰胺酶测定标准操作规程………………………………………………253深部真菌药物敏感试验标准操作规程…………………………………………………256第八节医院感染监测标准操作规程物体表面采样及监测标准操作规程……………………………………………………258医疗器械微生物监测标准操作规程……………………………………………………259空气采样检测标准操作规程……………………………………………………………260医务人员手采样标准操作规程…………………………………………………………262压力蒸气锅灭菌效果监测标准操作规程………………………………………………263第六章检验后操作程序微生物检验实验结果报告程序…………………………………………………………265微生物检验实验室危急值报告程序……………………………………………………266微生物检验实验室传染病报告程序……………………………………………………267微生物检验实验室资料、数据保持和备份程序………………………………………268微生物检验实验室更该报告程序………………………………………………………269微生物检验实验室检验后标本管理程序………………………………………………270微生物检验实验室菌种保存程序………………………………………………………271276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物实验室设置及管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0101版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范为生物实验室的设置及管理程序，保证检验结果的准确性和可靠性。2.适用范围适用于临床微生物实验室的设置和日常管理等。3.职责实验室负责人参与本实验室设置和管理。4.程序4.1实验室设置4.1.1临床微生物室设标本接种、细菌鉴定和药敏、培养基配制等岗位。4.1.2微生物实验室分为污染区、半污染区和清洁区。污染区为已被病原微生物污染的区域，如标本收发室、病原微生物检测实验室等；半污染区为被病原微生物污染的区域如缓冲间、工作服放置室、走廊等；清洁区为未被病原微生物污染的区域，包括办公区、会议室、休息室等。4.2实验室管理4.2.1严格遵守微生物实验室的生物安全制度，参见《二级生物安全防护程序》。4.2.2非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员应经实验室负责人同意并登记后才能进入实验室；禁止穿着工作服进入清洁区。4.2.3实验完毕后做好清洁消毒工作。4.2.4污染的处理参见《二级生物安全防护程序》。4.2.5实验室质量管理参见《质量管理程序》、《室间质量控制管理程序》、《室内质量控制管理程序》等相关文件。4.2.6实验室生物安全管理参见《实验室安全管理程序》、《二级生物安全防护程序》等相关文件。4.2.7实验室人力资源管理参见《实验室人员的配备及培训程序》、《工作人员职责设置程序》。版。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书实验室人员配置及培训程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0102版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范实验室人员配置及培训程序。2．适用范围本程序适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。3．职责实验室负责人应负责本科室工作人员培训及管理工作。1.程序4.1人员要求4.1.1实验室应由一人或多人负责管理，其负责人应具有大学本科以上学历或中级以上职称，五年以上本专业工作经历。4.1.2本实验室检验人员应具有医学检验专业或相关专业学历。4.1.3实验室工作人员应参加卫生部或地方临床检验中心举办的微生物检验技术培训，并取得资格证。4.1.4对于新进入本室的工作人员，在上级检验人员指导下进行试验工作，应在最短时间内取得资格证。4.2人员配置4.2.1实验室应配置高级、中级和初级工作人员。4.2.2各级检验人员履行相应的工作职责。实验室负责人负责实验室全部管理解决、技术指导、解决与临床沟通及技术疑难问题。检验人员负责实验室日常工作，参与部分实验室管理工作。4.3人员培训及考核实验室应有每年对各级工作人员进行质量保证／质量管理培训、客户服务培训、安全培训、继续教育培训计划。按实验室的规定应至少每3个月对人员进行胜任该岗位的考核，并提供记录。4.4人员管理实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关资料复印件。技术档案分文本档案和电子档案。文本档案每年更新1次，电子档案随时更新。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书工作人员职责设置程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0103版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范工作人员职责设置程序。2．适用范围适用于实验室工作人员管理及考核。3．职责微生物实验室负责人和所有检验人员执行本程序。4．程序4.1微生物实验室负责人职责4.1.1在检验科主任领导下负责微生物实验室日常业务和管理工作。4.1.2在检验科主人授权下，制定实验室质量方针、目标和文件，并写入质量手册。4.1.3负责微生物实验室专业专业、学术、咨询、组织、管理及教育等。4.1.4组织本实验室工作人员完成各项常规任务，定期检查、总结实验室工作。4.1.5负责对本室专职实验工作人员培训及考核工作。4.2高级职称人员职责4.2.1参与微生物实验室质量方针和目标的制定，编写技术管理文件。4.2.2熟悉、追踪本学科国内外最新学学术发展动态，引进先进的技术和方法。4.2.3组织承担本学科科研项目，解决本室工作中的技术难题。4.2.4承担部分临床检测工作、教学和科研工作。组织制定医疗、科研的实验方案和编写实验指导书。4.2.5通过学术报告、专题讲座等形式培养本专业的相关技术人员。4.2.6参与临床会诊、咨询等工作。4.3中级职称人员职责4.3.1掌握微生物室有关的专业知识和技术，负责本微生物实验室实验技术工作，提供技术咨询。4.3.2在上级技术人员的指导下，制定本专业的技术操作规范和仪器设备的操作规程。做好仪器设备的保养和一般故障的维修工作，并有记录。4.3.3全面参加临床微生物工作，协助并参与科研工作。4.3.4承担初级技术人员和实验技工的培训提高和业务考核工作，指导带教进修生和实习生。4.4初级职称人员职责276 4.4.1在上级检验人员指导下，全面参加临床微生物检验工作，协助并参与科研工作。4.4.2与上级检验人员一起做好仪器设备的保养和一般故障的维修工作。4.4.3带教进修生和实习生。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书记录管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0104版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范记录管理程序，保证微生物实验室记录完整。2．适用范围病人和标本信息、实验操作记录、实验检测结果、原始检测申请单和检测报告单、仪器使用记录等。实验记录包括电子记录和文本记录。3．职责检测人员对实验记录负责，实验室负责人家督落实。4．程序4.1人实验室应建立并实施对质量及技术记录进行识别、收集、索引、查询、存放、维护及安全处置的程序。4.2所有记录应易于阅读，便于检索。记录可存储于任何适当的媒介，但应符合国家、区域或地方法规的要求。应提供适宜的存放环境，以防损坏、变质、丢失或未经授权之查询。4.3实验室应制定政策，规定与质量管理体系和检测结果相关的各种记录的保留时间。保存期限应根据检验的性质或每个记录的特点而定。记录包括但不限于：4.3.1检验申请表（包括用做检验申请表的病人表格或病例）。4.3.2检验结果和报告。4.3.3仪器打印结果。4.3.4检验操作规程。4.3.5实验室工作记录簿／记录表。4.3.6接收记录。4.3.7质量控制记录。4.3.8.投诉及采取措施。4.3.9内部及外部审核记录。4.3.10外部质量评价／实验室间比对记录。4.3.11质量改进记录。4.3.12仪器维护记录，包括内部及外部校准记录。276 4.3.13供应品德批次文件、证书、包括插页。4.3.14偶发事件／意外事故记录及所采取措施。4.3.15人员培训及能力记录。4.4超过保存期限的实验记录，由微生物实验室负责人交科里统一保存。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书实验室保密程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0105版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的保证实验室保密程序，保护病人的隐私，确保实验室工作的有序开展。2．适用范围病人资料、原始数据、检验结果。3．职责每个实验室工作人员均有保密的责任。4．程序4.1实验室所有原始资料包括病人的原始化验单、实验原始记录及汇总表应各自归档，保存至少2年。所有病人资料非经许可，一般人员不可查询；特殊情况是必须在科主任或本室负责人同意的情况下方可查询。4.2当临床科室要求电话报告结果时，应先确认对方身份，核对其查询病人姓名、病区床号等情况后，在本室负责人授权的情况下方可报告结果，并明确告知对方，实验的最终结果以检测报告单为准。4.3实验室应收集检验项目所必需的相关信息，不应收集无关的个人信息，病人有权知道收集的信息和目的。门诊病人的检验报告，凭回执单和收费明细单取检验报告。住院病人的检验报告提供给申请检验的医师。4.4当病人同意或者法律要求时方可报告给相应的其他方。实验室检验结果可用于如流行病学或其他统计分析，但不能有病人个人信息。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008(应春妹蒋晓飞周庭银蒋燕群葛平)编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书投诉及抱怨处理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0106版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范投诉与抱怨的处理程序，提高工作质量。2.适用范围来自于病人或家属，临床医护人员和实验室工作人员针对检测结果质量、服务质量和（或）实验室管理等问题的投诉或抱怨。3.职责微生物实验室负责人和所有检验人员执行本程序。4.程序4.1抱怨的接受：执行者在接受抱怨时应热情、友好、礼貌、严肃和认真，应记录抱怨者姓名、地址、联系方式、抱怨内容（首先应注意稳定抱怨者情绪）。4.2抱怨的处理4.2.1病人对服务态度抱怨的处理方式4.2.1.1接到抱怨后，及时记录抱怨，并向科室负责人汇报。4.2.1.2对病人提出的合理要求技师进行处理。4.2.1.3调查事情原因，根据调查结果对相关责任人进行处罚。4.2.1.4记录处理结果。4.2.2病人对实验结果准确性的抱怨的处理方式4.2.2.1向病人展示原始实验数据。4.2.2.2向病人解释相关实验程序和可能临床情况，帮助病人解除疑惑。4.2.2.3如确有实验结果不符合有效性要求或出现错误，则应及时纠正错误，重新实验以得到准确结果，并保留原错误报告单，存档备查。同时由实验室负责人向病人致歉以争取得到其谅解，按有关条例对责任人进行相应处罚，并记录。4.2.3医生对检测结果和临床诊断的符合率抱怨的处理方式4.2.3.1针对医生的抱怨进行全程调查，查找存在影响结果的因素，并形成书面报告。4.2.3.2根据调查发现的问题进行针对性解决。4.2.3.3建立与医生交流的机制。4.3处理的原则276 4.3.1能及时处理的抱怨应给予及时解决，记录处理结果。4.3.2不能及时处理的抱怨应与抱怨者约定反馈时间，尽可能将问题向实验室主任汇报，寻求妥善的处理方法，尽快答复抱怨者。4.3.3抱怨的处理以抱怨者的满意为目的，但必须以尊重科学、尊重事实为原则，在不违背科学原则、医疗行为为规范的基础上，争取抱怨者对大限度的理解。4.4抱怨处理的善后4.4.1执行者对抱怨做好记录并保存。4.4.2对抱怨的审核遵照科内部审核安排执行4.4.3如抱怨涉及对实验室操作程序是否符合实验室管理办法，实验室负责人应召集实验室工作人员讨论，如实验室的操作程序确实不符合有关规定，应重新修订操作规程，并报科主任批准后执行。4.4.4实验室工作人员在向实验室负责人抱怨得不到满意解决时，有权向科主任提出抱怨。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则(ISO15189:2007).2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书质量管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0201版本：20140601生效日期：20140615共2页1、目的规范质量管理程序，保证检验的质量。2、适用范围适用于微生物实验室的各个检验项目。3、职责3.1微生物实验室负责人负责制定微生物检验质量管理程序，并监督质量管理程序的实施。3.2检验人员执行质量管理程序。4、程序4.1质量管理内容包括人员、操作规程、申请单、报告和记录、标本、仪器、培养基、试剂、检测方法、质量控制等。4.2人员包括学历、职称等要求，员工的培训和工作能力评估。4.3操作规程4.3.1制定检测申请、标本采集开始到发出检测结果报告为止的全过程的操作规程和管理程序。4.3.2培训员工熟悉和掌握操作规程的管理程序。4.4申请单申请单应包括：病人信息、申请医生姓名和工号、申请科室、申请项目、标本种类、标本采集和接收时间，必要时应标明临床诊断、采集部位、抗菌药物的应用情况、预期微生物的种类等。参见《微生物检测项目申请程序》。4.5记录和报告4.5.1记录检验全过程必要的信息，如标本接收、细菌鉴定流程表、检验结果审核等。参见《记录管理程序》。4.5.2结果报告应包括检验结果、结果解释等。参见《结果报告程序》。4.6对标本质量进行评估。参见《标本接收、标识程序》、《样本拒收程序》。4.7仪器质量管理4.7.1仪器在安装时及常规使用中应满足检验所需的质量标准，并具有达标的证明文件。4.7.2每种仪器具有唯一性标识。4.7.3要求保留每种仪器影响检验性能的相关记录。4.7.4要求制定仪器的标准操作规程。经培训考核通过并经实验室授权的工作人员方可操作仪器。操作者应可以方便取阅仪器标准操作规程及仪器维护信息。4.7.5按制造商的要求监测并记录仪器的运行情况，定期进行校准。4.7.6要求制定定期维护、保养得计划，维持仪器的安全工作状态。4.7.7276 一旦发现仪器故障，应停止使用，清楚标记后妥善存放至其被修复。在仪器投入使用、修理或退役之前对其去污染。4.7.8如果仪器脱离实验室未被直接控制，或已被修理、维护过，该仪器在实验室重新使用之前，应经校准、验证或检测表明其达到规定的可接受标准后方可使用。详情参见《仪器管理程序》。4.8试剂的质量管理4.8.1严格监测自配培养基的质量并做好记录。4.8.2商品化培养基应严格验收，并保存质控合格证明文件。4.8.3所有试剂（包括染液和抗血清）应有标签，用阴、阳对照质控，合理保存，在有效期内使用并做好记录。参见《试剂管理程序》。4.9样本的质量控制，参见《标本采集、运送程序》。4.10检验过程的质量控制4.10.1细菌的分离和鉴定根据检验目的选择培养基，选择病原菌进行鉴定。4.10.2药物敏感试验根据分离菌种的生物学特性和感染部位，选择恰当的药物进行药物敏感试验（参见《室内质量控制管理程序》）。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CN-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008（周庭银蒋晓飞蒋燕群）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书室间质量控制管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0202版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范室间质量控制管理程序，确保检验质量。2．适用范围国家或省、市临检中心组织的微生物室间质控。3．职责微生物检验人员均须熟知并遵守本程序。1.程序4.1微生物室所开设的检测项目应参加CNAS认可的能力验证（PT）及实验室间比对计划。缺乏CNAS认可的PT及实验室间比对计划的项目，应至少每6个月进行一次性能评估，方法包括：与参考实验室或其他实验室分割标本检测;与本实验室建立的方法分割标本检测；分析纯物质、地方数据库或临床证实资料；其他适宜的和规定的方法。4.2质控标本的接收和验收收到质控物后由相关人员登记、签字，根据质控标本的有关说明对质控物的数量、批号、包装进行验收并将质控标本按要求保存。4.3室间质控样本必须按实验室常规工作进行，由进行常规工作的检验人员测试，必须使用实验室的常规检测方法和试剂，不得特殊对待。检测结果须在截止日期前上报。4.4室间质控的检测结果和反馈结果均记录于室间质控记录表，根据反馈结果分析室间质控的状态，如有不合格结果应先向负责人和主任报告，然后查找原因，撰写错误评估报告，制定纠正措施并培训员工，避免常规工作和质控再次发生同样错误。4.5结果上报截止日期之前严禁与其他实验室交流室间质控的检测结果。4.6结果上报截止日期之前严禁将质控标本送至其他单位代做。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008(周庭银蒋晓飞蒋燕群)编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书室内质量控制管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0203版本：20140601生效日期：20140615共6页1．目的。规范微生物实验室管理程序，确保临床报告的质量。2．适用范围微生物实验室的所有检验项目。3．职责实验室检验人员均须熟知并遵守本程序。4．程序4.1分析前质量管理4.1.1检验申请单临床医生应按照《微生物检测项目申请程序》申请临床微生物检测。口头申请追加样本检验项目，必须在样本有效期内申请，并补正式的检验申请单。4.1.2生成微生物检验标本标签护士应在核对医嘱、病人信息和检验申请信息后，按照《微生物标本检验标签程序》生成申请单核微生物检验项目标签，并将微生物检验项目标签正确张贴于标本容器上。4.1.3样本的采集手册实验室应制定样本采集手册，指导正确采集和处理样本。4.1.4样本采集和运输样本采集人员应按照《采集前病人识别程序》确认病人，按照《标本采集、运送程序》采集样本，并在规定的时间和温度范围内，使用指定的运输培养基，安全运送到微生物室。4.1.5样本的接收样本接收人员应严格按照《标本接收、标识程序》、《标本拒收程序》对样本接收或拒收，并记录。4.1.6微生物检验标本信息输入微生物实验室接种岗位检验人员严格按照《微生物标本检验信息输入程序》录入、核对病人信息和标本信息等资料。4.1.7样本储存微生物实验室接种岗位检验人员按照《微生物标本检验前储存程序》正确储存未能及时处理的标本。已经检验的样本应在保证其性质稳定的条件下，将样本以适当的方式保留到规定的时间内，以便能在出具结果报告后可以复查，或做补充检验。4.2分析中质量管理4.2.1试剂的质量控制4.2.1.1。4.2.2所有试剂用于检测标本前，必须做质控以评估质量并记录质控结果，只有质控合格才可使用。下列试剂每进一批新批号或货号要求用阴性、阳性标准菌株或质控菌株评估其质量（表2-1）。触酶、氧化酶、凝固酶、ß-内酰胺酶、Optochin、X、V和XV纸片；细菌鉴定系统使用的每一种鉴定卡及相关试剂；276 表2-1常用试验试剂质量控制试剂阳性对照阴性对照监测频率氧化酶铜绿假单胞菌ATCC27853大肠埃希菌ATCC25922每次新配制时及使用中每个工作日触酶金黄色葡萄球菌ATCC25923A群链球菌ATCC19615每次新配制时及使用中每个工作日靛基质大肠埃希菌ATCC25922肺炎克雷伯菌ATCC138831%蛋白胨水及靛基质试剂：每次新配制时及使用中每个月1次……直接用于检测病人标本有内标准的抗原试验如：金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验（每天或每次试验做质控）；抗血清（至少每半年用阴、阳性质控菌株做质控）；革兰染色（每周一次用阴、阳性质控片做质控）；抗酸染色（每次使用要求用阴、阳性质控片做质控）；自制试剂（每配制一批新试剂做质控）。4.2.1.2平行试验新批号试剂使用前须用老试剂或参考材料平行试验。4.2.1.3无厂商特别说明时，不同批号的试剂不可混用。4.2.1.4缺陷或失效试剂只能用于培训员工业务能力，否则报废处理。培训试剂应明显标记“仅培训使用”，并与检验试剂分开放置。4.2.2培养基的质量控制4.2.2.1购买的有质量保证标准的培养基实验室应保存制造商所遵循的质量保证标准，以及每批号产品完成无菌试验、生长试验、生化试验及质量控制性能的合格证明等文件；无质量保证标准的培养基，每批号和（或）每次购买的产品应检测相应的性能，包括生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生长试验（适用时）等。每个批号和（或）每次购买时，应进行外观检查并记录。4.2.2.2自制培养基每批号产品应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生化反应（适用时）等。4.2.2.3外观检查合格培养基的标准：完整、琼脂附于平板底部，血平板应不透明、没有溶血情况，平板颜色好、湿润，无干裂、无污染、无浑浊或沉淀、无冻伤、无过热现象，琼脂厚度至少3mm。如发现与上述情况不符的培养基，应不予使用。4.2.2.4无菌试验抽检培养基数量：100块以内，随机抽检5%；100块以上可随机取10块平板皿或10支试管培养基进行无菌试验。35℃培养24小时后观察是否有细菌生长，无细菌生长为合格。4.2.2.5生长试验及生化反应试验质控菌株（表2-2,2-3）35℃培养24小时，用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位的细菌悬液。无菌生理盐水1∶100稀释，每块平板接种10μl（浓度相当于10³~104CFU/平板）。培养24~48小时。符合生长、生化试验质控标准者方可使用。失控者必须记录失控情况并有相应的纠正措施。276 表2-2生化试验用培养基的质控培养基质控菌株鉴定标准克氏双糖培养基大肠埃希菌ATCC25922+/+奇异变形杆菌ATCC49005－/+，H2S+福氏志贺菌质控菌株－/+铜绿假单胞菌ATCC27853－/－1%蛋白胨水（靛基质用）大肠埃希菌ATCC25922+肺炎克雷伯菌ATCC13883－鸟氨酸阴沟肠杆菌ATCC45301+肺炎克雷伯菌ATCC13883－尿道定位显色培养基大肠埃希菌ATCC25922紫红色肺炎克雷伯菌ATCC13883蓝色科玛嘉念珠菌显色平板光滑念珠菌ATCC90030紫色、光滑白念珠菌ATCC90028绿色热带念珠菌ATCC981083蓝灰色克柔念珠菌质控菌株粉红色，表面毛糙……表2-3培养基的生长试验质控培养基质控菌株鉴定标准巧克力平板流感嗜血杆菌ATCC49247生长情况好血平板金黄色葡萄球菌ATCC25923中度到大量生长A群链球菌ATCC19615生长，β溶血肺炎链球菌ATCC49619生长，α溶血大肠埃希菌ATCC25922生长中国蓝培养基大肠埃希菌ATCC25922生长，蓝色菌落奇异变形杆菌ATCC49005部分抑制鼠伤寒沙门菌ATCC14028无色菌落粪肠球菌ATCC29212不生长SS培养基大肠埃希菌ATCC25922部分或全部抑制福氏志贺菌质控菌株生长，无色菌落鼠伤寒沙门菌ATCC14028生长，有黑色中心……276 4.2.3自动化仪器试剂质控4.2.3.1鉴定卡的质控每新进一批鉴定卡做一次质控，每一新生产批号鉴定卡需用相应质控菌株做质控以检测生化反应的可靠性。材料和试剂批号必须记录并保存。4.2.3.2药敏卡的质控分为日质控、周质控和新进药敏卡质控。新用户在熟悉操作前，建议先进行日质控，直至结果满意可转为周质控。日质控：按质控菌株表要求，每种药敏卡每日用相应质控菌株进行质控，连续检测20日并记录结果。将某一种质控菌及相应的抗生素作为一个组合，连续检测20日得出20个结果，只要每个组合的20个结果中，失控不超过2个，则可转为周质控。周质控：每周用相应质控菌株进行质控并记录结果。如抗生素种类改变，必须重新做日质控直至结果满意再转为周质控。新进药敏卡质控：每一新生产批号药敏卡需用相应质控菌株做质控，以检测MIC结果的可靠性。材料和试剂批号必须记录并保存。鉴定卡和药敏卡质控菌株应根据仪器品牌种类而定，表2-4以Vitek2Compact为例介绍常用反应卡使用的质控菌株。表2-4Vitek2Compact常用反应卡使用质控菌株反应卡种类质控菌株GNI阴沟肠杆菌ATCC700323产酸克雷伯菌ATCC700324GPI金黄色葡萄球菌ATCC25923铅黄肠球菌ATCC700327YST葡萄牙念珠菌ATCC34449头状地菌ATCC28576NH流感嗜血杆菌ATCC9007乳糖奈瑟菌ATCC23970ANC普通拟杆菌ATCC8482产气荚膜梭菌ATCC13124AST-GNXX大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单胞菌ATCC27853AST-NXXX大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单胞菌ATCC27853AST-GPXX肺炎链球菌ATCC49619AST-PXXX粪肠球菌ATCC29212金黄色葡萄球菌ATCC292134.2.3.3检测仪器要进行维护、功能评估及温度监测。参见《仪器管理程序》。4.2.4抗菌药物敏感试验纸片参见《药物敏感性试验标准操作程序》。4.2.5染液质量控制见表2-5。表2-5染液质量控制染液阳性对照阴性对照监测频率革兰染色金黄色葡萄球菌ATCC25923大肠埃希菌ATCC25922开启新瓶及使用中每周1次抗酸染色分支杆菌（临检中心提供）大肠埃希菌ATCC25922开启新瓶及每次使用时4.2.6标本处理、涂片及接种（微生物标本接种岗位检验人员完成）4.2.6.1276 严格按照《呼吸系统标本细菌学检验标准操作规程》预处理呼吸道标本，涂片革兰染色以判定痰标本是否合格，正确选择培养基接种。4.2.6.2按照《血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程》将血培养瓶放入全自动血培养分析系统进行培养。如仪器报阳性，应立即取瓶，涂片革兰染色，同时接种血平板。如果涂片阳性，应按照《危急值报告程序》将染色结果以初步报告形式电话通知临床医生，并记录《危急值报告登记表》上。4.2.6.3按照《脑脊液标本细菌学检验标准操作规程》处理脑脊液标本，涂片革兰染色，正确选择培养基接种。如果涂片阳性，应按照《危急值报告程序》将染色结果以初步报告形式电话通知临床医生，并记录《危急值报告登记表》上。4.2.6.4按照《尿液标本细菌学检验标准操作规程》定量培养(菌落计数)。4.2.6.5按照《生殖道标本细菌学检验标准操作规程》正确选择培养基，处理、接种生殖道标本。阴道炎病人标本必须进行革兰染色；孕妇需进行B群链球菌的筛查。4.2.6.6根据医生的要求，按照《粪便标本细菌学检验标准操作规程》正确选择培养基、处理、接种粪便标本。无症状携带者，常规使用增菌培养基或选择培养基；黏性较低的培养标本，宜进行直接显微镜检查。有抗菌药物治疗史的严重腹泻病人（6个月婴儿除外），粪便常规培养无异常发现时，可检测艰难梭菌毒素。4.2.6.7按照《脓及伤口标本细菌学检验标准操作规程》处理、接种伤口标本。深部伤口感染应至少包括标本采集、需氧菌及厌氧菌的培养及鉴定。最好进行直接涂片革兰染色检查并报告结果。如果涂片阳性，将染色结果以初步形式电话通知临床医生。4.2.6.8按照《厌氧菌属检验标准操作规程》处理、接种结核分枝杆菌细菌学检查标本。标本应置密闭的防渗漏容器内；某些标本（如尿液、痰液）抗酸染色及培养前，应以密闭的螺旋盖试管置密封的离心机离心浓缩，以最大限度减少气溶胶危害。抗酸涂片标本应进行分枝杆菌荧光染色，应及时报告涂片染色结果。分支杆菌培养最好接种2种培养基（包括液体、固体），置35~37℃孵箱培养。4.2.6.10按照《深部真菌检验标准操作规程》处理、接种真菌学检查标本。4.2.6.11核对检验单与接种平板信息，确保无误后并记录，按照检验要求将接种好的平板放置相应条件孵育箱培养。4.2.7菌落观察及鉴定（细菌鉴定岗位检验人员完成）细菌鉴定岗位检验人员取出充分孵育的平板按照各种标本标准操作程序，观察培养基上菌落形态，根据需要进行革兰染色及初步生化试验以判别细菌类型。根据初步检测结果，制订进一步鉴定及药敏试验方案。涂片染色、手工或仪器鉴定，要求按照《质量控制管理程序》进行质控，并记录在《室内质控记录表》上，确保试验质量。4.2.8药敏试验（药敏试验岗位检验人员完成）药敏试验岗位检验人员根据细菌鉴定或初步鉴定结果审核药敏试验方案，按照纸片琼脂扩散法、深部真菌药敏试验标准操作规程、稀释法等标准操作规程进行药敏试验。要求按照质量控制管理程序进行质控，并记录在《药敏试验质控记录表》上。要求用头孢西丁纸片检测苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌，VRE、PISP和PRSP需用MIC法确认。结果4.2.9严格遵守《二级生物安全管理程序》进行微生物标本的检测。4.3分析后质量控制。276 4.3.1药敏岗位检验人员综合细菌鉴定和药敏结果形成检验报告并签名，微生物实验室负责人或指定人员按照相关抗菌药物敏感试验标准操作规程核对药敏结果，尤其注意异常和少见结果，例如VRE、PRSP等。。4.3.2报告病人结果之前，应确认质控在可接受范围。4.3.3经双人双核后的报告单交报告发放人员分发到各病房或门诊病人，注意签收并记录。缺乏审核者的报告结果，应由微生物实验室负责人或指定人员在24小时内进行评估。4.3.4血培养阳性、脑脊液涂片阳性的初步报告经核实后，按《危急值报告程序》报告。4.3.5发现传染性病原菌应严格按照《传染病报告程序》做好传报。4.3.6完成分析后的微生物标本，检验人员应按照《检验后标本保存程序》安全妥善管理标本及平板，要求有明确标识以备复检。3~5日后，由废弃物处理岗位人员按照《废弃物处理程序》处理。4.3.7遇到来自临床或病人对检验结果的抱怨，应按照《投诉与抱怨处理程序》解决。4.3.8发现检验流程、文本等错误，应按照《质量改进程序》处理。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL20：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书仪器管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0204版本：20140601生效日期：20140615共3页1．目的规范微生物实验室仪器的管理、使用和维护保养程序，保证仪器的正常安全使用。2．适用范围微生物实验室的所有仪器。3．职责3.1检验科主任负责审批微生物实验室仪器的采购申请，医院设备科负责采购。3.2微生物实验室负责人负责仪器配置、评估、申请、验收、维修、报废等管理工作。3.3仪器负责人负责建立仪器档案、编写仪器SOP。3.4微生物实验室检验人员负责仪器的使用、质量控制和保养工作。4．程序4.1仪器的配置、评估、申购及验收4.1.1配置实验室应根据工作需求配置所需的全部仪器。4.1.2评估选择仪器时应评估该仪器性能是否满足本实验室的要求。应以技术操作可靠性、工作特异性为原则选择高质量、高安全性的仪器。4.1.3申购实验室负责人填写仪器申购表，经科主任审核，上报医院设备科购买。4.1.4验收仪器采购到货后，由厂家工程师负责安装，要求仪器安装完成后能够达到规定的性能标准，并且符合相关试验要求。经设备科工作人员确认，填报仪器安装单，由微生物实验室负责人签字后方可使用。4.2仪器档案微生物实验室所有仪器应建立档案，包括以下内容。4.2.1仪器名称、唯一标识。4.2.2生产商、型号、系列号。4.2.3接收日期及接收人员签字。4.2.4接收时的状态（例如：新品，使用过，修复过）。4.2.5启用日期及当前存放位置。4.2.6制造商说明书及其存放处。4.2.7重要仪器制造商的联系人姓名和电话。4.2.8证实仪器可以使用的仪器性能记录。性能记录应包括所有校准和（或）验证报告（或证明）的复件，内容包括日期、时间、结果、调整、可接受标准以及下次校准和（或）验证的日期。4.2.9已执行及计划进行的维护。4.2.10记录校准的相关参数，及时更新备份。276 4.2.11仪器的损坏、故障、改动或维修。4.2.12预计更换日期（可能时）。4.2.13日常使用保养记录及质控记录等。4.3仪器的标识4.3.1微生物仪器均应有唯一标识，并张贴在仪器醒目处。4.3.2标识内容包括名称标识、功能状态标识、运行状态颜色标识。4.3.2.1名称标识包括仪器名称、型号、序列号、仪器统一编号（仪器统一编号采用“组室名英文缩写-仪器号”形式，如：“MIC-01”表示微生物室1号仪器）；生产厂商、代理商名称；提供的检测项目；使用组室的名称；启用日期；负责人等。4.3.2.2功能状态标识包括仪器工作条件，运行状态，校准有效期（标明仪器已经过校准或验证状态，性能处于正常，并标明有效期及再次校准验证日期），耗材订购联系电话等。4.3.2.3运行状态颜色标识采用绿色、红色标识。绿色标识：表示仪器处于正常状态。红色标识：表示仪器处于停用状态(仪器停用可能由于某些原因引起，如校准不合格、处于维修或损坏状态、未经过方法学验证尚未启用)。4.4仪器的使用4.4.1微生物实验室仪器应安全、有序、整洁地放置。任何人不得随意搬移、拆卸。4.4.2各类仪器应指定仪器负责人，负责编写仪器的使用、校正质量控制、维护保养计划和操作规程，严格执行并有相应的记录。4.4.3操作手册应放置在方便取用的位置，供工作人员参考。4.4.4仪器的使用授权只有经授权的工作人员才可操作仪器。4.4.5仪器的操作管理实验室工作人员须经厂商培训考核，经实验室负责人签字认可后方能操作仪器，操作前须确认仪器运行状态正常、环境条件良好、质控通过并做好记录。操作时应严格按照仪器标准操作规程操作。一般工作人员不得随意更改仪器设置或参数，必要时应设置权限。操作完成后应做维护保养。4.5仪器的校正4.5.1实验室仪器应有定期校正计划，只有经过定期检查、校正的仪器才具操作可靠性。可通过检测质控数据、PT试验等确定仪器操作的稳定性及校准状态的可信度。4.5.2小型计量仪器（如移液器和游标卡尺等），必须定期送计量所进行准确度和重复性校正。4.5.3较大型仪器（如天平、离心机、高压锅等）必须定期由计量所人员校正检定，并出具检定报告。4.5.4大型仪器(如细菌鉴定仪、血培养仪等)由仪器工程师定期校正，并出具仪器校正报告。至少每年一次。4.5.5科室应有已知精密度的标准温度计（NIST认证或生产商保证达到NIST标准），每年对所有温度计进行校正。276 4.5.6校正后验证主要仪器维护好后应验证仪器的可操作性，并用质控来验证仪器性能。4.5.7校正合格的仪器有仪器负责人贴上状态标识，以标明仪器的校正或验证状态以及下次校正或验证的日期。4.6仪器的维护保养4.6.1生产商应定期履行仪器保养计划。4.6.2所有重要仪器应有紧急报警装置，并配置不间断电源以防在断电或外力冲击时发出警报。4.6.3任何一个有潜在接触电装置的仪器应有合适的接地证明。4.6.4实验室发生故障的仪器应停止使用，立即加贴红色停用标识。4.6.5实验室应有相应的备用仪器，用来替代故障仪器。4.6.6实验室应采用合理措施在修理或报废之前对其进行去污染处理。4.7仪器的报废管理因使用寿命、损坏、故障导致仪器不能满足检测需要时，该仪器即行报废。由实验室负责人填写报废申请，科主任审核，设备科批准后办理相关报废手续。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008(阮斐怡田月如蒋晓飞)编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书试剂管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0205版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范微生物实验室试剂的管理程序，保证试验质量。2．适用范围微生物实验室的所有试剂。3．职责3.1检验科主任负责审批微生物实验室试剂的申请。3.2微生物实验室组长负责对试剂评估、申购、验收、出库等管理工作。3.3检测人员负责试剂试验相关SOP的编写。3.4检测人员负责试剂的使用、质量控制工作。4．程序4.1试剂4.1.1试剂的评估、申购、验收用于检测标本的试剂必须坚持高质量、高安全性的标准，由实验室组长每两周根据工作需要进行审购，科室主任审核后交院领导审批，批试剂到货后统一先由采购办人员和检验科专职人员验收，验收后再由检验科库管人员二次验收入库。验收内容包括：试剂的数量、外观、有效期及运送条件。记录验收结果，并在试剂外包装上标明接收时间及接收人员签名，保存质量保证书。有损坏或降解的试剂应拒收。4.1.2试剂档案订购试剂应建立试剂档案，以监控试剂供应状况，保证实验顺利进行。试剂档案内容包括：试剂名称、批号、数量、生产商、接收日期、失效日期、储存条件、试剂说明书、相关质控文件及接收人员签字等。4.1.3试剂标识所有试剂须有标识，并张贴于试剂醒目处。标识内容包括：试剂名称、量、浓度或滴度、储存条件、配置日期、失效日期（如果开瓶改变试剂有效期，必须重新登记）。4.1.4试剂储存所有试剂应按产商要求储存以防损坏、降解、污染。低温保存的试剂须放置冰箱或冷库内。冰箱和冷库应每天记录温度以监控存放条件是否符合要求。注意安全存放，危险品应专门放置，由专人负责，并有明显危险标识。4.1.5试剂使用使用前所有试剂必须由组长或指定人员出库并做好登记，工作人员在使用试剂前应确认：试剂处于有效期内，质控合格、标识明确、储存条件正确、存放合理。出现与上述情况不符时，应立即通知组长，并暂停使用。取用试剂应按有效期先后取用，标明开瓶日期、有效期，开瓶人签名。当试剂存放量近警戒线时，应及时通知负责人订购下一批试剂。4.1.6试剂质量控制参见《室内质量控制管理程序》。4.2培养基276 4.2.1成品培养基4.2.1.1由实验室组长根据实际工作需要进行审购。4.2.1.2要求生产商提供培养基质控资料，包括培养基名称、成分、有效期、保存条件及无菌试验、生长试验、生化试验的合格证明等，质控资料至少保留2年。4.2.1.3验收时应注意培养基是否有标识（包括培养基名称、批号、生产日期、失效日期），包装是否完整，培养基是否破损、污染，外观是否良好（良好培养基应该是表面平滑，水分、颜色、厚度适宜，无污染）等。不符合要求时应拒收。4.2.1.4验收后应记录培养基名称、、厂家、数量、批号、生产日期、失效日期、培养基内外包装是否完整及验收人员签名。4.2.2自制培养基4.2.2.1应严格遵守SOP配制，由勤杂人员高压灭菌。高压灭菌时须贴指示带监测灭菌效果。4.2.3培养基保存4.2.3.1常规2~8℃保存4.2.3.2不常用的培养基应用塑料袋包好储存，避免脱水致某些指示剂或抑制剂浓度相对增加，而使病原菌不能生长或生长不良。4.2.4培养基质量控制参见《室内质量控制管理程序》。4.3试剂警戒线微生物实验室应设置试剂警戒线，以防出现试剂短缺而导致试验无法完成。4.3.1设置警戒线应当考虑到：试剂供货周期的长短；试剂有效期长短；质控试验需要的时间（要保证新进试剂一旦失控时，实验室仍有足够试剂保证试验的正常进行）。4.3.2每月月底清点试剂，清除过期试剂，预购下月需要使用的试剂。药敏纸片：常见葡萄球菌药敏纸片定为剩×支纸片时预定下一批；常见肠杆菌科药敏纸片定为剩×支纸片时预定下一批……鉴定卡：GNI+：定为剩×盒时预定下一批；GPI：定为剩×盒时预定下一批;GNS:定为剩×盒时预定下一批；GPS：定为剩×盒时预定下一批……血培养瓶：定为剩×箱时预定下一批。培养基：每周准备好下一周培养基的用量，保证实验正常进行。……参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington:ASMPress,2007(阮斐怡田月如蒋晓飞)编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书质量改进程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0206版本：20140601生效日期：20140615共1页1、目的规范质量改进程序，不断提高微生物检验工作的质量。2、适用范围适用于与微生物检验质量有关的全部程序。3、职责微生物实验室负责人对发现的质量问题及时进行分析、改进。4、程序4.1实验室应制定质量监测指标如分别以血培养的污染率、分枝杆菌培养污染率、检测报告时间等作为质量监测指标，每季度统计分析，以监测微生物检验的工作质量。4.2上述监测指标、室内质控出现问题，临床和病人提出异议，各级管理部门的审查及督导、室间质评的反馈等提示工作质量缺陷时，按下列程序分析问题的来源。4.2.1文书错误包括手工抄写、电脑输入错误等。4.2.2环境错误包括温度、湿度错误等。4.2.3标本错误包括标本质量、运送和储存，标本信息等。4.2.4试剂错误包括取错试剂、试剂信息错误、是否为有效试剂、试剂的质控是否合格等。4.2.5仪器错误包括仪器的运行状态、监定卡和药敏卡质控是否合格等。4.2.6操作错误是否存在人为错误。4.3分析、解决问题4.3.1分析错误来源，如文书错误、标本信息错误、试剂错误等。4.3.2对以上错误找出解决办法，制定纠正措施。标本错误、文书错误，应着重加强核对；试剂错误应杜绝使用过期试剂、不合格试剂等。4.3.3问题解决后，应书写分析报告，向科主任汇报，并将相关资料存档。4.4.4培训员工，杜绝问题再次发生。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008(蒋晓飞周庭银蒋燕群)编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书实验室安全管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0301版本：20140601生效日期：20140615共2页1、目的规范实验室安全管理程序，保证人员和环境安全。2、适用范围临床微生物室实验室所有工作人员及其他进入本室的人员和访客。3、职责科主任为安全责任人，全面负责实验室安全管理工作。微生物实验室负责人负责制定微生物检验安全管理程序，并监督安全管理程序的实施。4、程序4.1微生物实验室负责人全面负责实验室安全法规、制度等，并监督、检查。微生物实验室安全管理员协助微生物实验室负责人工作。4.2所有实验室人员都了解实验室安全法规、制度等。实验室内应备有可供取阅的安全手册。4.3应为所有实验室人员提供适宜的医学评估、监测和治疗，进行定期的健康检查，并应妥善保存相应的医学记录，纳入人员档案。4.4实验室安全设计应保证对技术工作区域中微生物、化学、放射和物理危害的防护水平控制与二级生物安全风险程度相适应，并为关联的办公区域和临近的公共空间提供安全的工作环境，以降低周围环境的风险。通向出口的走廊和通道应无障碍，应设置紧急喷淋，洗眼、洗手池（非接触式水龙头）。除此之外还应考虑以下因素：照明、温度|、通风、噪声、工效学因素、门标及其他因素。4.5实验室分为污染区、半污染区和清洁区。污染区：已被病原微生物污染的区域；半污染区：可能被病原微生物污染的区域如更衣室、缓冲间等；清洁区：没有被病原微生物污染的区域，如办公室、会议室等。4.6检验科工作人员凭IC门禁卡进出检验科。严格控制外来人员的进入，非本科人员未经许可不得随意进出检验科。允许进入者，需接受检验工作人员的指引，注意安全并避免生物污染，并登记记录。详见«二级生物安全防护的程序»4.7职业暴露的管理参见«职业暴露处理管理程序»4.8在实验室内所有与病原微生物有关的操作均须执行漏电保护器4.9实验室应该只保存满足日常使用量的化学品。大量的化学品应贮存在专门指定的房间或建筑物内。化学品应按字母顺序存放。易燃、易爆、强腐蚀性物品、剧毒物品有危险品保管员专人专柜保管。保管人负责做好领用记录并指导使用人员进行正确使用，做好安全措施，危险性化学品的使用遵照«276 危险性化学品使用管理程序»4.10实验室应确保有潜在危险的生物标本、菌(毒)种的运输符合国家法律法规，防止在运输中泄漏、被盗、被抢、丢失等事故发生，确保万无一失。4.11实验室安全负责人与消防保卫部门之间保持紧密联系。对实验室成员进行火灾发生时的应急行动和如何使用消防器材等方面进行培训。须备有烟雾和热量自动探测及报警系统。定期测试报警系统已确保其功能正常，并使使用人员熟知其运行。4.12实验室的所有电器设备和线路均符合国家电气安全标准和规范。对所有电器设备都必须定期进行检查和测试，包括接地系统。在实验室电路中要配置断路器和漏电保护器。断路器不能保护人，只是用来保护线路不发生电流超负荷从而避免火灾。漏电保护器用于保护人员避免触电。实验室的所有电器均应接地，最好采用三相插头。4.13当发生意外事故时，从工作区撤离和紧急事件的处理参见«实验室应急管理程序»参考文献[1]WHO.实验室生物安全手册.第三版.2004[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL36：2007医学实验室安全认可准则（ISO151900:2003）.2007276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书二级生物安管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0302版本：20140601生效日期：20140615共3页1．目的规范二级生物安全实验室的所有操作行为，确保严员工和环境的安全。2．适用范围适用于实验室人员生物安全的规范化操作；适用于实习生、进修生和新进实验人员的培训。3．职责生物安全管理小组：编写操作程序，监督操作程序的执行。实验人员：严格执行操作程序，指导实习生、进修生和新进实验人员的学习。4、程序4.1实验室工作区设计4.1.1实验门应带门禁并可自动关闭，门上应有可视窗。实验室应通风，如使用窗户自然通风，应有放虫纱窗，防止节肢动物和动物进入。每个实验室应设有洗手池，宜设在靠近出口处。必须设有洗眼设施，必要时设置紧急喷淋装置。4.1.2实验室的墙壁、天花板和地面应平整、宜清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀。地面应防滑，不得铺设地毯。实验室台面应防水。耐腐蚀、耐热。实验室中的橱柜和实验台应耐固。橱柜、实验台彼此之间应保持一定距离，以便清洁。4.1.3在实验室门口应该设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。应有足够的储贮空间摆放物品以方便使用。在实验室工作区域外还应当有长期使用的储贮空间。4.1.4在实验室的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。4.1.5应在实验室内配备生物安全柜。4.1.6有可靠的电力供应、适宜的工作照明和应急照明。必要时重要设备如培养箱、冰箱等应设备用电源。4.1.7实验室出口应有在黑暗中明确辨认的标识。4.2进入规定图3-14.2.1在处理危险度2级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志（图3-1）4.2.2只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。4.2.3实验室的门应保持关闭。4.2.4儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。4.2.5与实验室工作无关的物品不得带入实验室。276 4.2.6实验室人员须严格按照清洁区—半污染区—污染区进入，污染区—半污染区—清洁区退出，不可逆向而行。4.3人员防护4.3.1在实验室室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。4.3.2在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。4.3.3在处理完感染性材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。4.3.4为防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，适当时戴安全眼罩、面罩（面具）或其他防护设备。4.3.5严禁穿着实验室防护服离开实验室（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息室和卫生间）。4.3.6不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。4.3.7禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。4.3.8禁止在实验室工作区域贮存食品和饮料。4.3.9在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。4.4微生物安全操作技术规范4.4.1应使用移液辅助器，严禁用口吸取；所有移液管应戴棉塞，以减少移液器具的污染；不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体；感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合；不能将液体从移液管内用力吹出。严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。4.4.2为了避免感染性物质从移液管滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物材处理。4.4.3所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。微生物操作中释放的较大粒子和液滴（直径>5um）会迅速沉降到工作台面和操作者的手上。实验室人员在操作时应戴一次性手套，并避免触摸口、眼及面部。4.4.4应限制使用皮下针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物液体，皮下针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。4.4.5出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告。4.4.6必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。4.4.7污染的液体在排放到生活污水道以前必须清除污染（采用化学或物理方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。276 4.4.8需要带出实验室的手写文件必须保证实验室内没有受到污染。4.4.9标本容器可以玻璃的，但最好使用塑料制品。标本容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确地粘帖标签以便于识别。标本的要求或说明书不能卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。4.4.10为了避免意外泄漏或溢出应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有标本的容器保持直立，二级容器可以是讲述或塑料制品，应该可以耐高压灭菌或耐化学消毒剂的作用。密封口最好有一个垫圈，要定期清除污染。4.4.11接收和打开标本的人员应当了解对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用标准防护方法的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。标本的内层容器要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。4.4.12为了避免接种物洒落，微生物接种环的直径为2-3mm并完全封闭，柄的长度应<6cm，以减少抖动。4.4.13使用封闭式微型电加热器消毒接种环，能够避免在本生等的明火上加热引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要在消毒的一次性接种环。4.4.14干燥痰液标本时要注意避免生成气溶胶。4.4.15准备高压灭菌和（或）将被处理的废弃标本和培养物应当放置在防漏的容器内（实验室废弃物袋）。在丢弃到废弃物盛器中以前，顶部要固定好（如采用高压灭菌胶带）。4.4.16在没一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。4.5生物安全柜的使用生物安全柜的操作见«生物安全柜标准操作规程»参考文献[1]WHO.实验室生物安全手册.第三版.2004[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL36：2007医学实验室安全认可准则（ISO151900:2003）.2007276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书疑似高致病性微生物标本管理程序文件编号:XXX-JY-GL-WSW-0303版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范疑似高致病性微生物标本的处理程序，确保人员、环境的安全。2．范围微生物实验室疑似高致病性微生物标本和细菌。3．职责微生物实验室所有检验人员负责执行本程序。4．程序4.1高致病性病原微生物是指危害程度第一类和第二类的微生物。危害程度第一类病原微生物是能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人、或动物与人、或人与动物、或动物与动物之间传播的病原体。4.2危害程度第二类病原微生物是能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。4.3微生物室须根据«人间传染的病原微生物名录»对本实验室可能接收和从事的微生物检测标本进行危害评估，危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的、基因修饰的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。4.4对评估中可能存在疑似高致病性微生物标本来源制定清单，如可能包含炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌等的样本，主要通过与临床沟通、流行病学调查鉴定样本来源。并培训员工，使实验室样本接收人员具备识别疑似高致病性微生物标本的能力。4.5遇疑似高致病性微生物标本或细菌时，立即用指定的材料封装并装入到特定的硬质、密闭、防泄露的容器中，并向上级汇报。实验室不得自行处理。4.6由微生物实验室负责人和科主任联系CDC，用符合生物安全要求的专用容器有双人专车送至CDC。参考文献[1]中华人民共和国卫生部.人间传染的病原微生物名录.2006[2]中华人民共和国国务院令第424号.病原微生物实验室管理条例.2004276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书实验室应急管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0304版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范实验室应急程序,确保实验室安全.2．适用范围微生物实验室.3．职责微生物实验室全体工作人员执行本程序.4．程序4.1报告4.1.1检验人员在工作中发现实验室有生物安全隐患、紧急意外事件、事故、火灾等，应立即向有关人员报告。4.1.2检验人员在工作中发现实验室人员出现相应致病性微生物感染症状时，应立即就地隔离治疗，上报有关部门。4.2实验室须配备应急设备，如急救箱、合适的灭火器、消毒设备、个人防护设备、划分危险区域界限的器材和警告标志等，4.3实验室内应张贴实验室负责人，生物安全责任人，消防队，医务科值班，水、气和电维修部门等的电话号码及地址。4.4处理措施及应急程序4.4.1值班人员发现停电停水时应尽快通知医院有关部门，在未恢复供水前，实验人员须用酒精擦手液消毒双手。4.4.2当发生潜在危害化学物质的吸入时，应立即报告安全责任人和实验室负责人，按«二级生物安全防护的程序»退出实验室进行观察，必要时接受医学监护观察。4.4.3当发生试管等容器破损及感染性物质的溢出时，立即用浸消毒剂的软包或纸巾覆盖，玻璃碎片应有镊子清理。4.4.4个人防护失败（手套或口罩破裂、脱落）时马上停止实验，皮肤表面用75%酒精消毒并彻底清洗后，更换备用手套或口罩。4.4.5当遭遇火灾、水灾、地震等自然灾害时应停止实验，切忌惊慌失措，按«二级生物安全防护的程序»有序撤离现场。参考文献[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB19489-2004实验室生物安全通用要求.2004[2]WHO.生物安全手册.第三版.2004276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书菌种管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0305版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范菌种管理程序,确保微生物检验结果可溯源性.2．范围微生物实验室保存的标准菌株和来自临床标本的菌株。3．职责微生物实验室检验人员正确保管、使用菌株，并确保生物安全。4．程序4.1计划4.1.设立《菌种管理登记表》其内容包括：名称、来源、存入/取出数量、使用日期、保管人、剩余量、库存量。4.2根据菌种的特性选择适应的保存方式。保藏要用小剂量密封瓶，做好标记后放入-80℃冰箱内，采用双人双锁管理。4.3根据菌种情况，定期检测菌种品质，发现菌种变异或退化时应及时报告，并查明原因。4.4菌种的发放需要双保管人员同时在场的情况下才能进行。每次使用标准菌株都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。剩余最小库存量时必须进行繁殖。购买4.5购买的标准菌株复苏使用时，应批量保存在菌种管中，-20℃以下保存。4.6新的标准菌株复苏后，传代最多不得超过3次，如超过3次将不再作为标准菌株使用。4.7标准菌株保存管一经解冻后，不得再次冻存。4.8菌种必须装在密闭的专用容器内高压灭菌销毁，并做好销毁记录。参考文献[1]中华人民共和国国务院令第424号.病原微生物实验室管理条例.2004[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL36:2007医学实验室安全认可准则(ISO15190:2003).2007276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书危险性化学品使用管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0306版本：20140601生效日期：20140615共2页1、目的规范危险性化学品使用管理程序,减少危险性化学试剂对实验室人员及工作人员的危害.2、适用范围微生物实验室内使用的危险性化学试剂。3、职责微生物实验室所有人员和后勤保障组的工作人员负责执行此程序。4、程序4.1危险性化学品的分类4.1.1危险性化学品的分类生物安全负责人和实验室工作人员根据危险性货物运输规则或化学试剂本身所具有的危害和危险程度,对危险性化学试剂进行定义和分类.4.1.2实验人员以下列方式暴露于危险性化学品下的予以分类和确认(表3-1)表3-1暴露于危险性化学品的方式和反应暴露方式引起的反应吸入化学试剂可能引起刺激性、致敏性、变态反应、呼吸道疾病或癌症接触皮肤接触时可能引起化学烧伤、眼结膜炎火全身性中毒食入危险性化学试剂可能经过嘴吸或污染的食物和饮料而意外食入透过受损皮肤危险性化学试剂可能经皮肤切口、擦伤创面或针扎进入体内4.2化学品的储存4.2.1对于所确认的危险性化学品，实验室应该只保存满足日常使用的量即可。4.2.2大量的化学品应储存在专门指定的房间或建筑物内，储存室地面应该是混泥土结构，门口处有门槛以防溢出。4.2.3易燃品应单独储存在远离其他储存物品的房间或建筑物中。储存室的电灯开关要安装在建筑物的外面，电灯应安装枣隔离罩内，以避免电源接头处产生的电火花点燃易燃、易爆的挥发性气体。4.2.4化学品不应按字母顺序存放，避免不能共存的化学品摆放位置过近。4.2.5所有大容积的试剂瓶以及装有强酸和强碱的试剂瓶应该放在地板上的试剂托盘中。4.3危险性化学品的使用4.3.1危险性化学品的保管实行双人双锁制，使用需经实验室负责人批准方可领用。276 4.3.2使用前仔细了解化学品的危险性信息、潜在的健康影响、急救程序、防火措施以及意外释放防火措施。4.3.3按照相关标准在每个储存容器上标明每个产品的危害性质和风险性，还应在“|使用中”材料容器上清楚标明。4.3.4根据不同的化学危险品，采用不同的人身防护装备，重点防护眼睛、皮肤、呼吸道和其他暴露部位。4.4.5严格按照安全操作规程工作，使用后应及时封闭瓶口，并放回原位。4.3.6对实验室内使用的每种化学制品的废弃和安全处置都应事先制定书面程序，并最终按照程序执行。4.44.4.1将化学品溢出处理的示意图张贴在实验室中显著的位置，并应配备以下物品;化学品溢出处理工具；防护服，包括耐用橡胶手套、橡胶靴、防毒面具等：铲子和簸箕；用于夹取碎玻璃的镊子；拖把、擦拭用的不和纸；用于中和酸及腐蚀性化学品的碳酸钠或碳酸氢钠；沙子（用于覆盖碱性溢出物）；不可燃的清洁剂。4.4.2发生大量化学品溢出时，应采取下列措施：通知生物安全负责人和实验室负责人，疏散现场的多余人员；如果溢出物时易燃性的，熄灭所有明火，关闭可能产生电火花的电器；避免吸入溢出物品所产生的挥发性气体；确认实验室内安全后，有安全负责人指导清理溢出物。参考文献[1]中华人民共和国国务院令第344号，化学危险物品安全管理条例，2002[2]医学实验室-安全要求ISO15190:2003（E）[3]中华人民共和国国务院令第424号.病原微生物实验室管理条例.2004276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书废弃物处理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0307版本：20140601生效日期：20140615共1页第1页1.目的规范废弃物处理程序，减少医疗废弃物对人员及环境的危害。2．范围实验室内使用废弃物。3．职责实验室所有工作人员执行此程序。4．程序4.1医疗废弃物有感染性废物、损伤性废弃物和化学废弃物组成，必须分开收集。4.2生活垃圾和医疗废物应分类收集，生活垃圾应放置在黑色塑料袋中，医疗废物应放置在黄色塑料袋中，黄色塑料袋应有生物危害警示标志（图3-2），盛装的医疗废物不应超过总容量的3/4。感染性废物和化学性废物应分开存放，并贴上警示标志，做好标签；损伤性废物应放入利器盒，盒外应贴上警示标志，做好标签。所有标签内容包括日期、科室名称、医疗废物类别、特别说明。4.3医疗废弃物盛放容器应封口，防止泄露。含微生物的废弃物如血平板等先高压灭菌处理后有清洁人员按固定路线运送到医院集中暂存场所，运送前应检查包装物的标志、标签、封口是否符合要求，不符要求不得运送；如果包装物或容器外表被污染，应增加一层包装；清洁人员在运送过程中应防止医疗废弃物泄露、流失、和扩散，并防止医疗废物接触身体。4.4运送医疗垃圾废物应使用防渗漏、防扩散、无锐利边角、易于装卸和清洁的容器，每次运送后应清洁运送的容器。医疗废物在暂存点存放时间不的超过2日。4.5医疗废物运送处理中心统一焚烧处理参考文献[1]中华人民共和国国务院令第380号，医疗废物管理条例，2003[2]医学实验室-安全要求ISO15190:2003（E）[3]中华人民共和国国务院令第424号.病原微生物实验室管理条例.2004[4]中华人民共和国国务院令第36号.医疗卫生机构医疗废物管理办法.2003276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书消毒灭菌管理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0308版本：20140601生效日期：20140615共1页第1页1.目的规范消毒灭菌程序,保证实验室内环境安全。2.范围适用于微生物实验室内环境日常消毒的操作。2.职责实验室负责人及检验人员、消毒人员执行本程序。3.程序在微生物实验室内必须保证在实验期间每天进行消毒，在操作过程中根据不同的病原微生物实验选择相应的有效消毒液或消毒方法。4.1实验室常用消毒方法3%H2O2溶液：主要用于实验室环境空间喷洒消毒；1000mg/l含氯消毒液：用于实验室环境空间消毒，地面、台面以及一般设备的消毒，实验人员身体表面和双手消毒。门缝喷洒消毒，酒精铺巾上的喷洒。4.1.1紫外线灯或移动紫外线车照射消毒。4.1.2高压蒸汽灭菌，本实验室使用121摄氏度，30分钟对微生物标本进行灭菌。4.2每天工作结束后用1000mg/l含氯消毒液对实验台面、地面进行消毒，实验人员按六步洗手法洗手或用免洗手消毒液进行手卫生消毒。4.3实验室仪器设备、生物安全柜使用后台面及玻璃窗的表面等用除含氯消毒液之外的消毒液擦拭消毒，开启紫外线照射30分钟以上。4.4实验室微生物样本使用高压蒸汽灭菌器121摄氏度，30分钟，对微生物标本进行灭菌后按《废弃物处理程序》处理。参考文献[1]中华人民共和国卫生部.各种污染对象常用消毒方法(试行).2003[2]中华人民共和国国务院令第424号.病原微生物实验室管理条例.2004276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书职业暴露处理程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0309版本：20140601生效日期：20140615共1页第1页1、目的规范职业暴露处理程序。2、适用范围适用于由医疗锐器、危险化学品、传染性物质造成的损伤。3、职责实验室全体人员执行本程序。4、程序4.1医疗锐器（如注射器针头、缝针、各种穿刺针、手术刀、剪刀等）造成的皮肤损伤。4.1.1伤口紧急处理　立即从近心端向远心端将伤口周围血液挤出，用流水冲洗２～３分钟。用７５％酒精或０.５％安尔碘消毒伤口；２４小时内留取基础血样（３ml，普管）备查。4.1.2报告　发生锐器伤后，立即报告部门负责人。根据损伤程度决定是否应组织专家，共同评估锐器伤情况并指导处理。4.1.3锐器伤危险度评估　如果病人情况确定，则分类处理。病人为ＨＢsＡg（＋），如当事人（职业暴露者）ＨＢsＡg（＋）或Ａnti－HBs（＋）或Ａnti－HBc（＋），不需注射乙肝疫苗或乙肝免疫球蛋白；如当事人ＨＢsＡg（—）或Ａnti－HBs（—），从未注射乙肝疫苗，应在２４小时内注射乙肝免疫球蛋白并注射乙肝疫苗３次（锐器伤当时、一个月后、６个月后），当时及３个月、６个月检测肝功能及乙肝病毒血清学指标。当事人Ａnti－HBs（＋）<５０mIU/ml，需24小时内注射乙肝免疫球蛋白200~400单位，当时及3个月、6个月检测肝功能及乙肝病毒血清学指标。病人为HCV抗体（+），当事人当时及3个月后抽血查HCV抗体和肝功能。病人为HIV抗体（+），当事人经过评估达到规定的危险度，可在医师指导下及时服用预防用药并医学观察1年：刺伤后1个月、2个月、3个月、6个月查HIV抗体。病人为梅毒血清学（+），当事人在当时及第4周做梅毒血清学检查，同时在医师指导下进行预防性用药。病人无血源性传染病，当事人不需要进行任何处理，仅密切观察。4.2传染性物质造成的损伤实验室安全负责人应确保所有相关人员知道，所有病人的血液、体液和被血液、体液污染的物品均视为具有传染性的病原物质，工作人员（眼、嘴、其他黏膜）接触这些物质时，必须采取防护措施，严格按照《二级生物安全防护的程序》执行。参考文献【1】中华人民共和国卫生部.医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则.2004【2】中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2004年版）.2004【3】肖平.医院职业暴露与防护.北京：人民卫生出版社，2004,25~38276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室人员流动程序文件编号：XXX-JY-GL-WSW-0310版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的严格规定实验室工作人员流动走向，防止污染发生。2.适用范围微生物检验实验室的工作人员。3.职责临床基因扩增检验检验室的工作人员应严格遵守流动程序，防止污染发生。4.操作程序4.1实验室工作人员应严格按单一方向流动，即按“试剂配制室”→“核酸提取室”→“基因扩增检测室”的方向单一流动。严格禁止反向进入各实验区。4.2进入工作区时，按规定更换鞋套和工作服，并签名登记。4.3非本室工作人员严禁入内。4.4各实验区的工作用品和清洁用具、均为专用，不得混用。参考文献[1]《临床基因扩增检验检验实验室工作规范》(卫医发[2002]10号)[2]全国临床基因扩增检验检验实验室技术人员培训班《培训教材》276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物学检验项目申请程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0401版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范临床医师微生物学检验项目申请程序。2．适用范围微生物学实验室所有检验项目。3．职责申请临床微生物学检验项目的医生应遵守本程序。1.程序4.1临床医师根据病人病情需要和检验项目的敏感性、特异性正确选择检验项目。临床申请检测项目可参照医院微生物学标本采集指南选择。4.2必要时需与病人签订“知情同意书”，如进行尚未完全明确检验项目意义的科研检查项目时，需与病人签订“知情同意书”。4.3登陆临床医生检验申请系统申请微生物学检验项目。4.4输入病人一般信息及申请的检验项目要求的信息。4.5条码和手工申请单要求含有病人信息、检测要求及开单医师姓名。必需内容：病人姓名、性别、住院号、病室科别、床号、标本种类、标本来源、检测项目、采用及送检日期时间等。4.6特殊情况下医师需要口头申请检验，可记录口头申请的检验要求、必要的病人信息、申请医师及记录人员的姓名或工号。条件许可时，及时补齐所有微生物学检验申请相关信息。4.7包含微生物学检验申请单的医嘱交当班护士，进入标本采集程序。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物学标本检验标签程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0402版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范微生物学标本检验标签程序。2．适用范围所有微生物学检验标本。3．职责临床各科室采集标本工作人员应遵守本程序。4．程序4.1当班护士将医生所开医嘱输入各临床科室病人管理系统，核对病人信息和检验申请信息后，生成微生物学检验项目标签和申请单（包括电脑和手工微生物学检验申请单）。4.2微生物学检验标本申请单内容应包括：病人姓名、性别、住院号、床位、诊断、标本种类、采样部位、采样方式、检验项目及检验单据号等。4.3打印微生物学检验项目标签及检验项目清单。4.4经双人核对检验项目清单、标本容器及医嘱后，将标签正确地贴在标本容器上，不可贴在标本容器盖上，不可覆盖容器自带的条形码。4.5如有需要，标本容器上应贴上生物危害标志。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007（阮斐怡田月如蒋晓飞）276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书采样前病人识别程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0403版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范采集标本前确认病人程序。2．适用范围所有申请微生物学检测项目的病人。3．职责临床各科室采集标本工作人员应遵守本程序。4．程序4.1样本采集前，采样人员必须核对病人信息、标本容器和微生物学检验申请项目。4.2病人清醒时，让病人说出自己的姓名，并根据病人标识核对检验申请单上或条形码上病人姓名、性别、病员号、病室可别、床号、检测项目等病人信息。4.3如果病人登记身份与实际信息不匹配，则与病人信息登记处联系，采集前解决不匹配问题。4.4如果病人不能提供信息，则从病人家属处获取信息。4.5如果病人缺少身份标识，通知相关工作人员对病人做进一步确认后再采集标本。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007（阮斐怡田月如蒋晓飞）276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书标本采集、运送程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0404版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范标本采集程序，保证实验室检测前标本质量。2．适用范围微生物学实验室受理的标本。3．职责3.1医护人员和检验人员负责指导病人如何正确留取标本。3.2门诊抽血人员和病房护理人员负责临床标本的采集，特殊标本由临床医师采集。3.3标本运输人员负责定时到临床各科室收集标本和运输标本；急诊检验标本和值班采集的标本由临床科室相关人员直接送微生物学室。4．程序4.1采集标本前，采样人员根据检验申请单检验项目的要求，确认采样计划并进行适当的准备工作。包括核对医嘱，打印条形码，选择合适的标本容器，粘贴条形码及指导病人做好采样前的准备工作等。4.2认真核对病人、标本容器和检验申请是否一致，严防差错。4.3选择正确的解剖部位，采用适当的技术和设备来采集标本。各4.4收集足够量的标本，量少可能导致假阴性的结果。4.5在每份标本上表明病人的姓名、标本来源、采集部位、采集目的和时间、采集者姓名。4.6将标本放置于合适的密封容器中。4.7采集样品所用材料需按照废弃物处理程序安全处置（参见《废弃物处理程序》）。4.8标本运输人员按微生物学实验室与各临床科室制定的标本收集时间表到各病房收集标本。4.9标本运输人员收集标本时，必须核对标本个数是否与送检清单相符，并用硬质、密闭防泄漏的二级容器将标本安全送抵微生物学室（各种标本运输注意事项参见表4-1~4-5“微生物标本采集指南”）。4.10标本送达微生物学室，标本运输人员必须与微生物学室标本接受人员对标本进行核收登记并签名。4.12标本采集和运输中的生物安全防护参见《二级生物安全防护程序》。4.13采集人员必须经过培训合格后方可进行采样。病人自行采集的标本，必须受专业人员的指导。4.14所有标本必须记录采用时间并立即送检，一般不得超过2小时。4.18标本采集后无论运送距离的远近都应按要求进行标本的包装和标识。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的应用说明.2007276 [2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书标本接收、标识程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0405版本：20140601生效日期：20140615共1页1、目的规范微生物学标本接收及标本唯一检验标识程序，保证实验室不误检、漏检。2、适用范围微生物学实验室所有标本。3、职责微生物学实验室接种岗位检验人员应遵守本程序。4、标准操作程序4.1各种微生物学标本送至接收室后，接收人员与标本运送人员共同核对标本清单及标本信息，并在清单上签上标本运输、接收人员的姓名及接收日期和时间。4.2根据微生物学检测项目或标本类别编写检验号。4.3微生物学标本检验号为英文+阿拉伯数字组合流水号。英文字母代表不同检测项目或标本类别，阿拉伯数字以“年月标本号”的方式编。例如：S0902.1，表示：S为（痰标本）一般培养，09表示年，02表示月，1表示标本流水号。4.4同一病人标本在标本容器、检验申请单、申请单附页、仪器编码及正式报告上的检验号应完全统一。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书标本拒收程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0406版本：20140601生效日期：20140615共2页1、目的规范标本拒收程序。2、适用范围微生物学实验室所有标本。3．职责微生物学实验室检验人员应遵守本程序。4．程序4.1微生物学实验室检验人员应根据各类标本的送检要求评估标本的合格性，具体参见《标本采集、运送程序》。4.2检验人员必须严格执行标本的接收、拒收制度和标准，拒收所有可能导致错误结果的标本。4.3表4-7列举了常见微生物学标本拒收原因及处理方式。表4-7常见微生物标本拒收原因及处理方式拒绝原因处理方式无标签非损伤方法获得的标本（例如：痰、粪便等标本），重新送检损伤方法获得的标本（例如血、脑脊液或组织等），与取样医师协商后，再处理标本。并在申请单上注明问题所在，记录所采取的措施送检延迟（超过规定时间）提示送检者拒收原因，并要求重新送检。病人申请单上注明“标本送检延迟”容器不合适或标本泄露通知送检者，并要求重新送检。病人申请单上注明问题所在及所采取的措施标本运送条件不合适（例如厌氧条件送检的标本与送检者联系阐明检测要求，指出不符合之处并要求重新送检却用需氧条件送检）同一天内同一检测条件的重复标本（血除外）通知送检者，指出重复标本。在申请单上注明问题所在标本污染重新采样标本量不够 重新采样4.4276 在《不合格标本处理记录表》登记相关信息，至少包括：标本唯一标识、病人唯一标识、标本采集人姓名、标本采集时间、不合格原因及性状描述、识别者签名及时间。5．生物安全防护参见《二级生物防护程序》和《疑似高致病性微生物标本处理程序》。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007（阮斐怡田月如蒋晓飞）276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物标本检验前储存程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0407版本：20140601生效日期：20140615共1页1、目的规范微生物标本处理前的储存程序，保证未能立即送检或未能及时处理的微生物标本质量。2、适用范围微生物实验室所有标本。3、职责微生物实验室接种岗位检验人员应遵守本程序。4、程序4.1微生物实验室接收到标本后须及时接种，不能及时接种的标本，可按表4-9所列条件暂时储存。表4-9微生物学标本暂时储存的条件标本类型储存条件尿标本、痰标本、粪便标本4℃血、骨髓标本常温无菌体液标本常温鼻咽部标本常温脓、伤口标本常温生殖道标本常温眼、耳部标本，褥疮标本常温留置针、心脏起搏器标本常温4.2细菌培养标本储存时间不应超过24小时。4.3志贺菌（应立即处理）、淋球菌、脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌（对低温敏感）对环境温度敏感，因此脑脊液、生殖系统、眼或内耳标本不能冷藏。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008276 [3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物学标本检验信息输入程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0408版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范微生物学标本检验信息输入的程序，及时发现标本采集、处理和接收过程中的不符合项，保证标本符合检验项目的要求，同时留存记录方便后续检验及查询。2.适用范围微生物学实验室所有标本。3.职责微生物学实验室接种岗位检验人员应遵守本程序。4.程序4.1有条形码的微生物学检验标本编好检验号后，在LIS系统相应编号位置直接用条形码扫描器将检验信息录入LIS系统，并记录收到标本的日期和时间、标本接收者的签名。核对、保存信息后，打印实验室检验附页。4.2有需要改动信息者打开病人信息修改窗口修改信息。核对、保存修改的信息后，打印检验附页。4.3手工开单的微生物学检验标本编好检验号后，手工输入检验单的检验相关信息，包括病人姓名、性别、年龄、住院号、病区床号、标本种类来源、采集日期时间、接收日期时间及检测项目等。核对、保存信息后，打印实验室检验附页。4.4信息录入时发现标本的病人信息、标本信息及标本采集运输不符合时，及时与相关人员联系，消除差错。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]PatrickR.Murray.ManualofClinicalMicrobiology.8thed.Washington：ＡＳＭ　Ｐress，2007276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书CO2培养箱标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0501版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的确保CO2培养箱工作稳定，正常运转。2.授权操作人经培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.原理（略）4.适用范围微生物室CO2培养箱。5.操作程序5.1二氧化碳培养箱开启程序5.1.1打开培养箱外门及玻璃门，向水盘中注汝蒸馏水，关门。5.1.2将温度控制器旋纽调至37C。5.1.3插上电源，打开电源开关。5.1.4仪器将自动执行常规检测功能。5.1.540秒后，常规检测完毕，控制面板上的显示窗内均显示箱内实际值。5.1.6启动AUTOSTART，参见“5.3AUTO-START的启动”。5.1.7此时仪器温度显示35.0±0.1℃，CO2显示5.0±0.1%CO2。5.1.8如果温度或CO2显示偏差较大，可通过[▲]和[▼]键进行调整。5.1.9当测定温度和CO2达到使用要求，即可使用。5.2培养箱的紫外线消毒5.2.1确保启动紫外线消毒功能前，仪器内无培养物。5.2.2打开电气安装抽屉面板上的紫外线灯保护开关，将CO2设定为0。5.2.3按钥匙键+[▲]或钥匙键+[▼]调节数字为222（紫外线灯开关）。5.2.4按钥匙键+[▲]设定为（1），即打开紫外线灯，按[i]键确认。紫外线灯亮，仪器前面板CO2显示窗将显示[---]。5.2.5约30分钟后，消毒结束，内腔紫外线灯熄灭，显示面板显示实际数值，打开玻璃门，使腔内臭氧散出，关闭电气安装抽屉面板上的紫外线灯保护开关。5.3AUTO-START的启动276 5.3.1启动AUTO-START前，先将温度调至37℃，CO2调至0。5.3.2打开培养箱们约1分钟放出空气体，在培养箱内放2升水，确定仪器内无培养物后关门。5.3.3同时按下[▲]和[▼]键约10秒，直至CO2显示0.0,GAS指示灯熄灭，AUTO-START灯亮，放开两键。5.3.4仪器将自动启动AUTO-START功能。5.3.5建议AUTO-START状态时不要开门，等待18～24小时。6.质量控制（不需要）7.维护及保养7.1每日由专人负责观察和记录培养箱温度、CO2浓度及CO2钢瓶压力。7.2每周做1次紫外线消毒，参见“5.2AUTO-START的启动”。8.校正8.1例行校正包括温度和CO2浓度，至少每年1次。8.2故障校正质控失控或仪器监测指标失控、仪器移位后及仪器因故障进行维修后需要校正。8.3校正后验收仪器校正后，微生物负责人对各项指标进行核实，指标达到要求方可。9.应急处理9.1外接电源、电压必须匹配，并要求有良好的接地。9.2出现影响检验质量的故障，应立即转移内容物，放入备用CO2培养箱。10.注意事项10.1培养箱外壳必须有效接地，以保证使用安全。10.2培养箱应放置在具有良好通风条件的室内，在其周围不可放置易燃易爆物品。10.3箱内物品放置切勿过挤。10.4箱内外应经常保持清洁。参考文献[1]CO2培养箱配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室生物安全柜标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0502版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范生物安全柜操作规程，确保生物安全柜正常使用、洁净、无污染。2.授权操作人经培训并通过考核的微生物检验实验室工作人员。3.原理高效粒子过滤器（HEPA）可有效过滤并滞留99.99%的≥0.3um的颗粒。层流气体沿着一个方向以一固定的速度流动为层流。安全柜内由上向下的层流，能捕捉安全柜工作区域内产生的全部浮尘，并将它们引导到HEPA过滤器。定向气流从安全柜前面的栅格定向引入安全柜的气流，对生物安全柜的性能也起着关键的作用。空气导流板可阻止安全柜内的浮尘从工作区域跑到外部环境中去。4.适用范围可能产生气溶胶标本的处理；所有需要基因扩增的标本。5.操作程序5.1将安全柜门抬起至正常工作位置，注意不得高于安全柜左边的警戒线（SASFLEVEL）.5.2打开安全柜电源开关及内置风机，仪器报警自检，约需3秒。5.3检查、记录压力指示读数。5.4无任何阻碍状态下，让安全柜至少工作15分钟。5.5在正式操作前将实验用品放入安全柜，不得过载，不得挡住前后风口。5.6安全柜内所有的实验材料须离玻璃门至少4cm。5.7放入实验材料后，让安全柜开启2～3分钟后再开始工作。5.8操作期间，避免工作时人员进出室内或在操作者背后走动，以减少气流干扰。5.9操作过程中，如有物质溢出或液体溅出，应对所有被污染的物体消毒，并用75%酒精消毒安全柜内表面。5.10工作结束后，须让安全柜在无任何阻碍状态下继续至少工作5分钟，以清除工作区域内浮尘污染。5.11关闭生物安全柜玻璃门，打开紫外线灯消毒≥30分钟。5.12消毒结束后，把System按钮置于“OFF”档，关闭紫外灯。6、维护保养276 6.1每日维护使用前观察并记录生物安全柜内的压力表，压力表正常工作范围为0.7～1.3英尺水柱，如≥1.3英尺水柱，参见“9.1压力异常”。工作结束后，用75%酒精消毒安全柜内部和工作台表面。工作结束后，紫外线照射生物安全柜内≥30分钟。6.2每月维护拆卸并抬起工作区域底板，用75%酒精擦拭底板下空间。6.3其他每3个月检测并记录紫外线的消毒效果。7、校正7.1例行校正厂方工作人员至少每年维护1次，校正指标见表5-1。表5-1校正指标　测试项目测试方法正常值烟雾试验垂直气流速度断面平均值热球式风速针55FPM进风速度热球式风速针105FPM工作面中线上0.15M烟雾发生器观察窗内0.025M、上沿0.15M烟雾发生器观察窗外沿0.04M烟雾发生器工作口边沿烟雾发生器安全内锁装置及UV灯测试手动内博电源插座测试万用表　7.2故障校正7.2.1仪器检测指标失控时，需要矫正。7.2.2仪器移位后，需要矫正。7.2.3仪器因故障进行维修后，需要矫正。8、应急处理8.1压力异常安全柜压力表正常工作范围为0.7～1.3英尺水柱（1ftH20=2988.98Pa），如果≥1.3英尺水柱，表示滤膜有问题，应通知厂方技术人员更换滤膜。更换滤膜或者清洗滤膜应记录在仪器设备维护保养记录表中。8.2故障处理出现故障，电话联系工程师，按照工程师意见进行处理并通知实验室负责人。9、注意事项9.1生物安全柜需要放在远离门窗的位置，以防门窗部位的不稳定气流影响安全柜内气流流动路径。9.2生物安全柜不可用作物品储藏。9.3注意纸张、棉签等可能造成生物安全柜过滤器的堵塞。9.4生物安全柜使用前后需要用适当的消毒剂对柜内工作区域进行擦拭。9.5不可堆放过多的物品于操作台上，易导致柜内后部进风不畅。9.6安全柜内禁止使用易燃、易爆及腐蚀性气体。9.7更换、维护安全柜内机件（过滤器、风机等）的工作需要由厂家专业人员完成。参考文献[1]生物安全柜配套使用说明书[2]申子瑜，李金明.正确认识临床实验室认可与提高检验质量之间的关系.中华检验医学杂志，2007，30（2）：136276 [3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室普通冰箱标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0503版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范普通冰箱使用的操作规程,保证检验质量。2.授权操作人经培训并通过考核的临床基因扩增检验学实验室工作人员。3.使用范围临床基因扩增检验学实验室普通冰箱。4.工作环境相对湿度:10%-85%;运行温度:32℃以下。5．操作程序5.1冰箱按说明书要求放好后，插上电源。5.2冷藏室温度开关设置于4℃，冷冻室温度开关设置于-20℃。5.32小时后用温度计确认温度。5.4冷藏室正常温度范围为2～8℃，冷冻室正常温度范围为-15～-20℃。5.5系统进入正常运行状态后即可正常使用。6．维护保养6.1每日保养每日观察冰箱温度并记录6.2每月保养保持冰箱出水口通畅，月底清洁冰箱。清洁时切断电源。擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂清洁。7．校正7.1例行校正温度校正至少每年1次。7.2故障校正检测指标失控、维修后校正。、7.3校正后验收校正后，临床基因扩增检验学实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。8.应急处理8.1出现不能自行解决故障，应即时联系厂商维修处理，并告知临床基因扩增检验学实验室负责人。8.2出现影响检验质量的故障，应立即转移冰箱内容物，放入备用冰箱。9.注意事项9.1冰箱应放置于水平地面并留有一定散热空间。9.2外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。276 参考文献[1]普通冰箱配套使用说明书编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室低温冰箱标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0504版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范-25度低温冰箱的使用规程，确保冰箱内温度恒定，运转正常。2.授权操作人经培训并通过考核的临床基因扩增检验学实验室工作人员。3.使用范围临床基因扩增检验学实验室-25度低温冰箱。4.工作环境相对湿度:10%-85%;运行温度:32℃以下。5操作程序5.1冰箱启用。5.1.1按要求放置冰箱，插上电源，调试。5.1.2等半小时后有明显降温感觉，表示冷柜工作正常。5.2温度的调节面板上显示冰箱内温度。5.2.1快速按下并释放“SET”键，显示“SET”。5.2.2按“SET”键，显示设定温度。5.2.3按“︽”或“︾”键增加或降低数字，调节至需要的温度。5.2.4按“SET”键，确认。5.2.5按“FNC”键返回，面板上显示箱内温度。5.3报警限制设定为保证箱内储存物的质量，电子温控器具有报警功能。当箱内温度高于报警上线或低于报警下线时，蜂鸣器会报警，同时显示屏上的报警指示灯会闪烁，按任意键报警消除（但显示屏上的报警指示灯继续闪烁）。当箱内温度恢复到正常范围时，报警消失。报警限值设定的标准操作如下。5.3.1按“SET”键至少5秒以上，显示“CP”。5.3.2按“︽”键，显示“AL”。5.3.3按“SET”键，显示“AFD”。5.3.4按“︽”键，显示“HAL”。5.3.5按“SET”键，显示设定的报警上限值。5.3.6按“︽”或“︾”增加或降低数字，调节至需要的温度。276 5.3.7按“SET”键确认，显示“HAL”；按“︽”键，显示“LAL”。5.3.8按“SET”键，显示设定的报警下限值。5.3.9按“︽”或“︾”增加或降低数字，调节至需要的温度。5.3.10按“SET”键确认，显示“LAL”。5.3.11按2次“FNC”返回，面板上显示箱内温度。6．维护保养6.1每日保养每日观察冰箱温度并记录6.2每月保养每月擦拭冰箱表面，必要时可用中性洗涤剂清洁。7.校正7.1例行校正温度校正至少每年1次。7.2故障校正检测指标失控、维修后校正。、7.3校正后验收校正后，临床基因扩增检验学实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。8.应急处理8.1出现不能自行解决故障，应即时联系厂商维修处理，并告知临床基因扩增检验学实验室负责人。8.2出现影响检验质量的故障，应立即停止使用，并转移冰箱内容物，放入备用冰箱。9．注意事项9.1冰箱应放置于水平地面并留有一定散热空间。9.2外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。参考文献[1]普通冰箱配套使用说明书276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室普通离心机标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0505版本：20140601生效日期：20140615共2页276 1.目的规范普通离心机操作规程,保证检验质量。2.授权操作日经培训通过考核的微生物实验室工作人员。3.适用范围临床基因扩增检验学实验室普通离心机。4.工作环境相对湿度：15%～85%；运行温度：15-30℃。5.操作程序5.1开机准备5.1.1插上电源5.1.2打开离心机电源开关（在离心机右后方）。5.1.3按[OPEN]键，按手动安全门扣，打开机盖。5.1.4装入离心套管。5.2程序设定5.2.1时间设定按按“time”键1次，时间“分钟”开始闪烁。按[▲]键和[▼]键设定分钟。按按“time”键1次，时间“秒”开始闪烁。按[▲]键和[▼]键设定秒。5.2.2转速设定按“RCF”键，选择离心力，或按“RPM”键，选择离心速度。按[▲]键和[▼]键设定速度。5.2.3程序储存共可储存0-10个离心程序。上述时间和转速确定后，按“ATORE”键。5.3离心5.3.1按“OPEN”键，按手动安全门扣，打开机盖。5.3.2选择所需要的程序，按“RECALL”键，按“PROG”键多次，选择所需要的程序号码，按“RECALL”键确定。如显示的程序已是需要的程序，直接进入下一步。5.3.3标本平衡后，放入离心机。5.3.4关上离心机盖，按“START”键开始离心（等达到离心速度时，时间显示开始倒计时）。5.3.5离心结束，发出“嘟…”声，按“OPEN”键，按手动安全门扣，打开机盖。取出标本。6.维护保养7.1每日保养每日观察离心机运转情况并记录。使用完毕后，进行清洁保养。276 7.2每月保养每月用消毒液清洁离心机。7.校正7.1例行校正离心速度的校正至少每年1次。7.2故障校正故障进行维修后，需要校正。7.3校正后验收校正后，临床基因扩增检验学实验室负责人对各项指标进行核实，达标后方可。8.应急处理8.1样本在离心机内破碎时的处理8.1.1听到离心机有标本破碎的声音，应立即停机。8.1.2不可立即打开离心机盖子，30分钟后才可打开。8.1.3工作人员应戴手套、口罩，尽可能在生物安全柜内用镊子将破碎的玻璃移除，用2000mg/L有效氯消毒液擦拭，再用清水清洁离心机。8.2出现故障由使用者及时通知仪器工程师并告知临床基因扩增检验学实验室负责人。8.3实验室内离心机互为备用。9.注意事项外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。参考文献[1]普通离心机配套说明书编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室电热恒温水浴箱标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0506版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1.目的规范电热恒温水浴箱的操作规程，确保正确使用电热恒温水浴箱。2.授权操作人经培训并通过考核的检验科微生物检验实验室工作人员。3.适用范围微生物检验实验室电热恒温水浴箱。4.工作环境相对湿度:10%-85%;运行温度:15-30度。5.操作程序5.1浴箱内注入清洁温水至总高度的1/3-1/2处。5.2接通水浴箱电源，打开开关，调节温度控制旋钮至设定温度。5.3当水槽内温度达到设定温度时，加热中断。再通电，90分钟内温度可保持稳定。5.4水浴箱工作温度波动范围应控制在设定温度±1℃以内。5.5水浴箱使用完毕，关闭开关，切断电源。6．维护保养6.1使用水浴箱时，记录温度。6.2使用完毕，应用清洁干布擦净水浴箱外壳，忌用腐蚀性溶液擦拭。7．校正7.1例行校正温度的校正至少每年1次。7.2故障校正维修后需要校正。7.3校正后验收校正后，微生物检验实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。8．应急处理出现不能解决的故障，应及时联系维修人员并通知微生物检验实验室负责人。9．注意事项9.1水浴箱外壳必须有效触地。9.2未加水之前，切勿打开电源，以防电热管烧坏。参考文献[1]电热恒温水浴箱配套说明书[2]全国临床检验操作规程编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室压力蒸汽锅灭菌效果检测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0507版本：20140601生效日期：20140615共2页276 1.目的规范压力蒸汽锅灭菌效果检测标准操作规程，确保检验质量。2.授权操作人经培训并通过考核的微生物检验实验室工作人员。3.适用范围微生物检验实验室压力蒸汽锅。4.工作环境相对湿度:10%-85%;运行温度:15-30度。5.操作程序5.1化学监测法5.1.1化学指示卡监测方法需每包监测。将既能指示蒸汽温度，又能指示温度持续时间的化学指示管放入每一待灭菌的物品包中央，经一个灭菌周期后，取出指示管，根据其颜色及形状的改变判断是否达到灭菌条件。5.1.2化学指示胶带监测法需每包监测。将化学指示胶带黏贴于每一待灭菌物品包外，经一个灭菌周期后，观察其颜色的改变，以指示是否经过灭菌处理。5.1.3B-D试验对与预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌，每日进行一次B-D试验。将测试纸水平放于灭菌柜内灭菌架的底层靠近排气口处，柜内除测试包外无其他任何物品。5.2生物监测法5.2.1将两个菌片分别放入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位。5.2.2灭菌柜室内，排气口上方放置一个标准试验包5.2.3经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，经560C±10C培养7日，观察培养基颜色变化。5.2.4检测时设阴性对照和阳性对照。5.3结果判定5.3.1化学监测法所放置的指示管、胶带的形状或颜色均变至规定的条件，判为灭菌合格；若其一未达到规定的条件，则灭菌过程不合格。B-D试验：经1320C，3-5分钟后，取出一次性B-D包观察颜色变化。均匀一致变色，说明冷空气排除效果良好，灭菌器可以使用，反之，则有冷气残留，测试不合格。新安装的设备和大修后设备应该进行B-D试验标准包测试，测试应该重复3次。5.3.2生物监测法每个指示菌片接种的培养基都不变色，判定为灭菌合格；指示菌片之一接种的培养基，由紫色变为黄色时，则灭菌过程不合格。6.质量控制276 每次高压灭菌时都用标准菌株检测灭菌效果，并做记录。7.维护保养7.1使用高压灭菌时，观察工作状态，并记录。7.2使用后，擦洗外壳，并关闭锅盖，放出剩余水。8.校正8.1例行校正温度的校正至少每年1次。8.2故障校正维修后需要校正。8.3校正后验收校正后，微生物检验实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。9.应急处理出现不能解决的故障，应及时联系维修人员并通知微生物检验实验室负责人。10.注意事项10.1化学监测监测所用化学指示物须经卫生部批准，并在有效期内使用。10.2生物监测生物指示物监测应1月1次。参考文献[1]中华人民共和国医政司（叶应妩，王毓三，申子瑜）全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006：927-931[2]金华彰，马彦冰.2000版标准质量管理体系德建立与文件编制北京：中国计量出版社，2002：177-202[3]申子瑜，李金明.正确认识临床实验室认可与提高检验质量之间的关系.中华检验医学杂志，2007，30（2）：136编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书PREVI全自动革兰染色仪标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0508版本：20140601生效日期：20140615共2页276 1.目的规范PREVI全自动革兰染色仪的操作规程，保证检验质量。2.授权操作人经培训并通过考核的检验科微生物检验实验室工作人员。3.工作原理染液中的结晶紫可以迅速透过微生物细胞，并将其染成蓝黑色，聚乙烯吡咯烷酮稳定的碘试剂穿透微生物细胞并与结晶紫形成复合物，脱色时由于细胞壁成分的不同，只有革兰阴性细菌的碘结晶紫复合物会被清除，革兰阳性细菌不会被脱色，复染后革兰阳性菌依然是蓝黑色，革兰阴性菌被复染液染成粉红色。染色后，全自动革兰染色仪会干燥载玻片。4.工作环境相对湿度:20%-80%;运行温度:15-30度；电源电压：100～240V，50/60HZ5.操作程序5.1开启仪器：按下位于仪器后部左下角的开机按钮。5.2仪器屏幕显示“presscleantoreprime”,放入空染片转盘，点击“clean”，仪器将灌注试剂于管路中。5.3把玻片放入玻片架：标本正面位于顺时针面，标签朝外，对称放置，如果标本小于6张，按编号由小到大排列，放玻片架于仪器中，盖上盖子。5.4通过数字按钮输入染片数量：2,4,6；如6张以上仪器视为满载，无需输入染片数量。5.5点击“RUN”，仪器开始运行染片。5.6染片结束后，取出玻片架，取出玻片镜检。5.7染片结束后，用布擦干仪器滚筒，放回玻片架，盖上盖子。5.8下班关机前，按“CLEAN”按钮运行喷嘴清晰程序，当屏幕显示“presscleantoreprime”,关机。6．质量控制6.1每次更换染液进行一次质控菌株ATCC25922和ATCC29523的染色效果观察。6.2每周进行一次常规质控，即用质控菌株ATCC25922和ATCC29523的染色,观察结果。7．仪器保养7.1日保养：管路染料再灌注，清洗管路、腔体以及盖子。7.2周保养：喷嘴体积测试，清洁腔体、盖子，冲洗废液管，倒空废液桶。7.3月保养：喷嘴保养，清洗B管路，喷嘴体积测试。8．注意事项8.1仪器运行前，检查所有染液是否足够，确保蒸馏水、无水酒精量足够。8.2每日下班前要进行管路清洗，关机后要用酒精冲洗腔体和喷嘴，再用蒸馏水冲洗并擦干。276 参考文献[1]PREVI全自动革兰染色仪配套使用说明书[2]全国临床检验操作规编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书Bact/Alert3D型自动血培养分析仪器操作文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0509版本：20140601生效日期：20140615共3页276 1．目的规范Bact/Alert3D120型自动血培养分析仪操作规程，保证检验质量。2．授权操作人经培训考核通过的工作人员可操作仪器。3．检测原理BacT/ALERT3D系统中所使用的每一培瓶內底部都含有颜色感应器，其中有半滲透性硅胶膜隔离了培养基及颜色感应器，只有CO2可透过硅胶膜。当血液培养瓶內有微生物生长时，释出的CO2滲透至感应器经水饱和后，产生氢离子(H+)改变感应器酸碱度值，使感应器颜色产生变化，从灰色变为黄色，由颜色变化计算有无微生物生長。其反应如下：CO2+H2O®H2CO3®H++HCO3–BacT/ALERT3D120孵育箱內,每一测试槽底部都有一组激光器及反射光感应器，反射光感应器隨瓶底颜色感应器颜色改变，产生不同的反射值。光度信息经扩大、传送至电脑后，系统会自动连续分析及记录，然后判断阳性或阴性。系统随之以图象及声音报警。电脑有下列三种阳性生长计算图表4．工作环境相对湿度：10~85%；运行温度：10-30℃；电源电压：220/240V，50/60Hz.5．操作程序5.1培养瓶种类：SA标准成人需养培养瓶、SN、标准成人厌养培养瓶、FA成人需氧中和抗生素培养瓶、FN成人厌氧中和抗生素培养瓶、PF小儿需氧培养瓶、MP非血液标本结核培养瓶、MB血液标本结核培养瓶、MAC抗生素补充试剂盒（MP瓶用）和抗生素补充试剂盒复溶液。5.2开机5.2.1打开仪器的UPS电源，孵育组件和其他链接组件开关。5.2.2系统开启启动并最终进入开始监视屏幕，待温度达到要求后即可使用。5.3关机5.3.1遇到下列情况需关闭或重启组合箱或控制箱：电源断开、移位、修理无应答的操作控制箱或键盘。5.3.2操作程序取出控制箱或组合箱键盘按键盘左上边的Esc键，然后输入YES命令，几十秒钟之后程序自动退出到MS-DOS状态（即C:>状态），然后关闭仪器电源，关闭UPS电源。（不可非法关机）。5.4培养瓶的装载5.4.1点击放瓶键，出现装瓶界面。可见每个抽屉底部显示出当前有效单元数，同时含有有效单元的孵育箱指示灯会亮绿灯。276 5.4.2使用条码扫描器将培养瓶上的条码输入进去，依次输入培养瓶ID号，医院ID号、病人信息。5.4.3打开孵育箱，将培养瓶放入到有亮绿灯的孵育单元，单元指示灯闪烁确认培养瓶已被加载。5.4.4重复步骤5.4.2、5.4.3加载其他培育瓶。加载完毕，关闭孵育箱，点击确认图标完成此操作。5.5更改最长检测时间5.5.1输入条码后，装瓶界面左侧的最大测试时间设置纽变兰，可按要求更改时间。5.5.2如瓶已经装入孵育箱，则进入瓶的详细细节屏幕，在屏幕左侧最大测试时间设置纽更改最大测试时间，点击即可保存更改。5.6卸瓶5.6.1卸载匿名瓶轻触卸哉匿名瓶按纽。匿名瓶所在的单元指示灯亮（阴性瓶为绿光，阳性瓶为红光）。卸下匿名瓶，只是灯闪烁表示瓶已卸下。随后按5.4步骤重新装载培养瓶。依次其余卸下匿名瓶。关闭孵育箱，点击确认图标完成操作。5.6.2卸阳性/阴性瓶当有阳性标本出现时，仪器会发出报警提示，屏幕相背景相应变成黄色，同时阳性瓶键会亮起，点击取阳性瓶键，仪器相应的抽屉指示灯的绿灯会亮起，打开抽屉，其抽屉内相应有阳性瓶位置的指示灯会亮起，可依次取出，然后关闭抽屉，完成此操作。当有阴性标本出现时，阴性标本键会亮起，点击取阴性瓶键，仪器相应的抽屉指示灯的绿灯会亮起，打开抽屉，其抽屉内相应有阴性瓶位置的指示灯会亮起，可依次取出，然后关闭抽屉，完成此操作。阳性标本处理5.7.1用75%酒精消毒瓶口，颠倒混匀培育瓶数次。5.7.2用无菌注射器针头插入瓶口，抽取培养液接种于血平板、巧克力平板，35℃、CO2培养18~24小时。5.7.3同时抽取少量培养液涂布于玻片上作革兰氏染色镜检，结果作为危急值报告临床，并纪录。5.7.4如果临床要求立即做药敏试验，则从阳性瓶中抽取一些培养液直接做药敏试验，此结果仅供参考，待培养出细菌后再做药敏试验并出具最终报告。6.质量控制±6.1瓶孔质控仪器每天自检。6.2温度质控每次开门时需查看温度计与仪器监视器显示的温度（应在35.5±2℃）,两者误差<0.5℃6.3血培养瓶的质量6.3.1外观检查检查外观是否完整，有否破损，有否污染等。6.3.2无菌试验每新进一批号或货号应做无菌试验。随机抽一只培养瓶，直接放入仪器培养，结果应是无细菌生长。276 7.维护保养7.1日保养查看仪器监视温度与仪器内部温度计温度。清洁仪器及电脑外表面。7.2月保养清洁瓶孔，清洁检查区块。7.3年保养由厂家进行一次全面保养。8.校正8.1例行校正瓶孔、温度的校正，至少每年一次。8.2故障校正质控失控、监测指标失控时、移位、维修后需校正。8.3校正后，微生物实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。9.应急处理9.1出现不能自行解决故障，应及时联系工程师维修处理，并告知微生物实验室负责人。9.2温度失控的处理温度降低可能是操作时门开启时间过长，关闭半小时以上，再观察。10.注意事项10.1关门时应确认关紧。10.2装载、卸瓶时应尽量快，避免开启时间长。参考文献[1]Bact/Alert3D120型自动血培养分析仪配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:20082008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书Autobact全自动微生物分离培养仪标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0510版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范Autobact全自动微生物分离培养仪标准操作规程，保证检验质量。2．授权操作人经培训考核通过的工作人员可操作仪器。3．检测原理Autobact全自动微生物分离培养仪是配套专用微生物分离培养装置使用的自动化设备。用专用微生物分离培养装置一起使用的自动化设备。用专用样本采集管采样后插入分离培养装置的特定位置（仪器样本盘中），仪器自行阅读识别条形码，自动进行样本前处理。仪器施压装置将样本采集管底部压破，采集管中的样本经过特定通道流到培养板底端的样本池中，位于样本池中的接种环蘸区样本，仪器机械手握住接种器前端的驱动手柄，使接种环按照设定的划线方式自动进行划线接种，同时仪器通过事先设定好的程序自动提供相应的温度环境以及气体浓度，培养周期末取出培养装置中培养板观察细菌生长情况，挑取可疑菌落以做进一步的检测。4．工作环境相对湿度：85%；运行温度：5-40℃；电源电压：220/240V，50±Hz.5.操作程序5.1培养装置种类四面分离培养装置（适用于痰液样本、部分拭子样本等）、两面分离培养装置（适用于粪便、尿液、拭子、体液样本等），根据需要选择相应编号的培养装置。5.2开机5.2.1检查外部电源供电，开启ups电源开关。5.2.2检查Autobact仪器电源、数据线、电脑连接线，确保处于良好状态。5.2.3开启Autobact各个模块的电源开关（模块左侧绿灯会变亮，开启电脑显示器及电脑主机，运行Autobact程序，经过软件初始化后进入主操作界面。5.2.4打开氮气气源开关及二氧化碳气源开关（普通模块除外），二氧化碳气源输入调整为0.3Mpa以下，一般0.1Mpa即可。5.3关机5.3.1确认各模块运行状态处于“已经停止”状态。5.3.2在电脑主操作界面上按键盘【ctrl】+[F4],退出操作界面。5.3.3关闭电脑，关掉Autobact各模块电源。5.4添加/取出培养装置5.4.1若仪器正处在“运行”状态下，则务必先停止运行样本，按左下角【停止】键，待仪器运行指示灯熄灭，仪器处于待机状态。打开Autobact模块的舱门，放入或取出培养装置。5.4.2关上Autobact模块舱门，然后按左下角【开始】键后模块开始运行。5.5样本的处理方法5.5.1尿液标本培养操作276 首先在微生物安全柜中打开你哦熬夜采集管盖子，将送检尿液样本倒入采集管中（尿液标本的量应在表示线内），盖上采集盖子，拔去采集管底部无菌保护罩，将采集管置于尿液培养装置的特定位置。将此尿液培养装置放置于仪器的样本盘，关闭模块舱门，点击【运行】。5.5.2拭子标本培养操作首先在生物安全柜中打开拭子采集管盖，将送检拭子样本的拭子头倒入采集管中（采集管中含有增菌液），盖上采集管盖子，拔去采集管底无菌保护罩，将采集置于拭子培养装置的特定位置。将拭子培养装置置于仪器样本盘，关闭舱门，点击【运行】。5.5.3粪便标本培养操作首先在生物安全柜中打开粪便采集管盖，用专用样本采集勺采集1-2勺样本，放入采集管中（采集管中含有增菌液），盖上采集管盖子，拔去采集管底无菌保护罩，将采集置于粪便培养装置的特定位置。将粪便培养装置置于仪器样本盘，关闭舱门，点击【运行】。5.5.4痰液标本培养操作首先在生物安全柜中打开痰液标本采集管盖，将痰液样本（2-4ml）倒入采集管中，同时加入消化液4ml，盖上采集管盖子，拔去采集管底无菌保护罩，将采集置于痰液培养装置的特定位置。将痰液培养装置置于仪器样本盘，关闭舱门，点击【运行】。5.6分离培养结果的观察及处理分离培养末期，点击电脑左下角【停止】键，仪器运行指示灯熄灭，打开Autobact模块舱门，取出培养装置，从中取出培养板，观察培养板上细菌生长情况，挑去细菌菌落，进行细菌鉴定与药敏试验，发送报告。6质量控制7维护保养7.1日保养情节保养仪器及联机电脑外表7.2月保养清洁样本盘7.3年保养由厂家进行一次全面保养与维护。8校正9应急处理9.1未连接检查仪器电源好连接线9.2新标本找不到接种器驱动手柄检查培养装置是否放置到位，样本盘内是否有异物。9.3无样本信息检查条码是否清晰9.4划线错误检查培养装置接种杆位置是否正确9.5出现不能自行解决的故障，应及时联系经销商或工程师维修处理，并告知微生物实验室负责人，样本培养改用其他方法。10.注意事项10.1放置培养装置时条形码面朝外10.2确保培养装置放置到位。参考文献[1]Autobact全自动微生物分离培养仪配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:20082008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书VITEK2COMPACT全自动鉴定药敏分析标准操作规程文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0511版本：20140601生效日期：20140615共8页1.目的规范VITEK2COMPACT全自动鉴定药敏分析仪的操作规程，确保微生物鉴定药敏分析的准确性。2.授权操作人经培训并通过考核的检验科微生物检验实验室工作人员。3.工作原理细菌理化性质不同，分解底物导致PH改变而产生不同颜色。经光电比色法测定来判断反应结果，不同种类的鉴定卡上有不同数量和类别的生化反应，采用连续检测法，每隔一段时间仪器会自动判读结果，最后结合仪器内部微生物数据库得出鉴定及药敏结果。4.工作环境相对湿度:20%-80%无凝集水;室温:15-30度，避免日光直射。5.操作程序5.1卡片选择5.1.1鉴定卡GN革兰阴性杆菌鉴定卡GP革兰阳性菌鉴定卡NH奈瑟菌嗜血杆菌鉴定卡YST酵母菌鉴定卡ANC厌氧菌鉴定卡5.1.2药敏卡AST-GN革兰阴性菌药敏卡AST-GP革兰阳性菌药敏卡AST-YST真菌药敏卡5.2菌悬液配置及稀释5.2.1悬浮液：0.45%NaCL液，PH4.5-7.25.2.2.菌悬液浓度：鉴定卡GN0.5-0.63麦氏单位GP0.5-0.63麦氏单位NH2.7-3.3麦氏单位YST1.8-2.2麦氏单位ANC2.7-3.3麦氏单位药敏卡AST-GN3.0ml盐水+145µl0.5–0.63麦氏单位菌悬液AST-GP3.0ml盐水+280µl0.5–0.63麦氏单位菌悬液276 AST-YST3.0ml盐水+280µl1.8–2.2麦氏单位菌悬液5.2.3药敏卡稀释方法-按上述浓度手工进行稀释VITEK2COMPACT上机前的细菌培养要求(表一)菌种接种物的浊度卡片培养要求革兰阴性杆菌0.5-0.63McFGNAST-GN培养基TSAB/CBA/MAC，35-37℃，需氧，无CO2，培养18-24小时革兰阳性菌0.5-0.63McFGPAST-GP使用TSAB/CBA上的菌落。35-37℃需氧培养18-24小时，链球菌:5-10%CO2葡萄球菌:无CO2酵母菌1.8-2.2McFYSTAST-YST使用SDA/TSAB/CHBA/CBA/TSA/CPSID3，35-37℃需氧培养18-72小时,无CO2奈瑟菌嗜血杆菌弯曲菌其他苛养菌2.7-3.3McFNH弯曲菌：TSAB,35-37℃微需氧培养18-24小时其他苛养菌：CHOC,CHOCPVX5-10%CO2,35-37℃需氧培养18-24小时厌氧菌棒状杆菌2.7-3.3McFANC棒状杆菌：使用CBA/CAN/TSAB/TSAHB上的菌落,35-37℃CO2,或非CO2,培养18-24小时厌氧菌：使用CBA/CDC/BRU/CHBA/TSAB/TSAHB上的菌落,35-37℃厌氧培养18-72小时注：TSA：胰酶大豆琼脂TSAB：胰酶大豆琼脂+5%羊血CBA：哥伦比亚羊血琼脂CHBA：哥伦比亚马血琼脂MAC：麦康凯琼脂CPSID3：尿标本产色鉴定平板SDA：沙保弱葡萄糖琼脂CAN:哥伦比亚CAN琼脂+5%羊血CDC:CDC厌氧琼脂+5%羊血276 BRU:Brucella布氏琼脂+5%羊血，血红素，维生素K5.3操作流程5.3.118-24小时分纯细菌（新鲜菌）；5.3.2根据细菌选卡片（参照表一）；5.3.3使用前将卡片和盐水瓶从冰箱取出，放室温15-20分钟，充分复温；5.3.4在载卡架上放一次性塑料试管（注意：必须使用厂家配套提供的塑料管），每管中加入3ml0.45%NaCl溶液；5.3.5用比浊仪校正管（Ref93059）校正比浊仪，测定的数值应在规定范围内；5.3.6按表一建议配制菌悬液，并用比浊仪测定菌液浓度；如同时做药敏试验时，应按二（2）建议进行稀释并混匀；5.3.7将卡片按顺序放在载卡架上，输样管插入到菌液管中。药敏卡应放在配对鉴定卡的后面；5.3.8进入VITEK2COMPACT应用软件主界面。扫描载卡架条码（或直接选取卡架号）。扫描试卡条码，将鉴定试卡与药敏试卡链接，并输入标本信息。如图所示：1)进入主菜单，如左图：2）点击，进入试卡编辑菜单，出现下图窗口3)点击，，出现以下窗口载卡架信息：可以用条码扫描器输入也可自下拉菜单选择4）扫描试卡5）选中属于同一菌株的所有实验卡，点击按钮，出现如下窗口276 输入实验号和菌株编号点击点击保存5.3.9将载卡架放入仪器的填充仓，按“充入”，70秒左右填充完毕。填充完毕后，仪器的蓝色指示灯闪亮。将载卡架取出并放入装载仓。仪器自动扫描条码，审核所有输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡。操作完成后，仪器口的蓝色箭头闪亮提示。如图：1）2）3）4）5.3.10在仪器运行过程中，可以进行病人信息的输入，点击，出现以下窗口：按栏目提示，编辑好病人信息并保存。5.3.11仪器每隔15分钟自动阅读孵育仓内所有卡片，并将数据传入英文工作电脑，电脑分析所有数据并给予结果，确认无误结果可传至中文电脑，由操作者认可并发放临床报告；5.3.12已完成的卡片由仪器自动卸载入废卡箱。6．结果处理6.1浏览结果276 从主菜单敲击图标，出现以下窗口，点击屏幕左列的相应编号，可见：ID结果AST结果下图为“结果处理流程图”未完成结果需补充信息需浏览需审核确认完成需菌株信息实验室操作者确认分离株信息上级操作者确认分离株信息并点击“review”并点击“approve”AES提示信息；在药敏结果右上方显示，见右图标示：点击专家系统按钮，可见如下图，可利用下拉箭头浏览不同类别抗生素的耐药机制：276 6.2鉴定结果6.2.1鉴定卡的结果：一般仅给出单一结果，无需进行补充试验，电脑主机VITEK2COMPACT程序浏览结果时，可给出结果的可信度评估。单一良好结果可直接传输到数据库（设置选择为EnablingLong-TermDataStorage）和中文软件中并长期储存；6.2.2如果给出两个及两个以上结果，仪器会做出提示或要求进行补充试验，请按注释进行补充试验，选择正确的鉴定结果，并将结果传输；6.2.3不能鉴定或无法确定的结果，请查找原始分离平板，确认所分离细菌是否为纯培养，必要时重新分离并重新进行鉴定试验。6.3药敏结果6.3.1如果同时进行鉴定和药敏试验，细菌鉴定结果会自动加到药敏卡上；否则需手工添加细菌名称到药敏卡信息中；6.3.2如果有专家系统评语出现，则应按操作规程对药敏结果作适当的修改并确认最终结果；6.3.3如果有浏览信息出现，应按程序处理浏览信息并确认最终结果；6.3.4上述步骤处理完毕，结果会自动传输到LSN数据库中。7.质量控制7.1在“ManageQCresults”菜单,点击图标7.2输入或扫描卡片批号7.3进行批号维护：输入接收的数量及日期等276 7.4按照一般上卡程序上卡，扫描试卡后，在对试卡进行维护时，选择为质控卡；7.5试验结束后点击图标查看质控结果；7.6如需删除某QC结果，选择需删除的结果，点垃圾筒图标。8.维护保养8.1清洁废卡槽打开废卡收集器舱口，取出废卡收集器将所有卡片倒入废物处理槽，10％漂白液清洗垃圾槽，放回舱内。8.2清洁填充仓打开舱门，用10％漂白液清洁舱门8.3清洁光学读头(在无测试卡的前提下)打开孵育器，拔出读数头，用擦镜纸清洁8.4清洁孵育转盘Carousel试卡架分为四个部分。清洗前，应确认卡架内已没有待处理的试卡。8.4.1进入卡架清洗程序：MainMenu>Utilities>Maintenance>Cleaning>CarouselCleaning;8.4.2点击continue，仪器显示”Removetheincubactoraccesscovernow”；8.4.3仪器显示“PreparingforsectionRemoval”；8.4.4按仪器提示，依次序卸出四个试卡架，并将孵育架进入盖盖回。消毒清洁并干燥孵育架(10％漂白液清洗并浸泡5分钟，勿高温,T<85°C)后，重新放回读数孵育箱内。8.4.5再次启动孵育架清洗程序MainMenu>Utilities>Maintenance>Cleaning>CarouselCleaning，此时仪器显示Preparingforsectionreplacement；8.4.6按程序提示依次装回所有卡架，盖好孵育架进入盖；276 8.5清洁载卡架cassettes：8.5.1取下条形码；8.5.2剩余船体用10％漂白液清洗并浸泡5分钟，风干；8.5.3装回条形码。9．注意事项9.1菌悬液配制过程中，一定要将细菌菌落研磨细致，否则卡片在洗液过程中可能会堵孔；9.2正常运行或者空闲状态下不能打开装载仓的仓门。参考文献[1]VITEK2Compact全自动鉴定药敏分析仪配套使用说明书[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书DNP电热恒温培养箱文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0512版本：20160415生效日期：20160415共2页1．目的规范DNP电热恒温培养箱操作，以保证DNP电热恒温箱的正确使用。2．.授权操作人经过培训并并通过考核的微生物室检验人员。3．原理（略）。4.适用范围DNP电热恒温培养箱。5.操作程序5.1接通电源，将仪器电源开关拨到“1”位，此时电源指示灯亮，控温仪显示培养箱内当时温度。5.2温度设定当所需温度与设定温度相同时不需设定，反之则需重新设定。5.2.1按控温仪的功能键[SET]进入温度设定状态，此时“SV”设定闪现。5.2.2按移位键[←]，并配合加键[↑]或减键[↓]设定培养箱温度至所需温度。5.2.3按功能键[SET]确认设定，温度设定结束。5.3上限跟踪报警设定5.3.1按功能键[SET]5秒，仪表进入上限跟踪报警设定状态“AL1”。5.3.2按移位键[←]，并配合加键[↑]或减键[↓]操作，设定报警温度应与所设温度相符。5.3.3按功能键[SET]确认，跟踪报警设定结束。5.4温度显示值修正5.4.1按功能键[SET]5秒，仪表进入参数设定循环状态“AL1”，继续按功能键[SET]，使PV显示“SC”修正。5.4.2按移位键[←]，并配合加键[↑]或减键[↓]操作，设定显示温度与实际温度相一致。5.4.3按功能键[SET]确认，温度显示值修正设定结束。5.5设定结束后，各项参数长期保存。此时培养箱进入升温状态加热指示灯亮，当箱内温度接近设定温度时，加热指示灯反复多次闪烁，控制进入恒温状态。5.6依次打开外门、内门，将所需培养的物品放入培养箱，然后依次关好内外门，开始进行培养。6.质量控制（不需要）7.维护保养7.1每日保养每日记录温箱温度。7.2每月保养每月月底进行清洁保养一次，箱内外应保持清洁。8.应急处理8.1出现故障由使用者及时联系工程师进行维修处理，并告知微生物实验室负责人。8.2出现影响检验质量的故障，应立即转移内容物，放入备用培养箱。9.校正9.1例行校正温度校正，至少每年一次。9.2故障校正仪器监测指标失控、仪器移位、维修后，需要校正。276 10.注意事项10.1外界电源、电压必须匹配，并要求有良好的接地。10.2设备应放置在具有良好通风条件的室内，周围不得放置易燃易爆物品。10.3箱内物品放置切勿过挤。10.4箱内外应经常保持清洁。参考文献[1]DNP电热恒温培养箱配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAABBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书OLYMPUS显微镜文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0513版本：20160415生效日期：20160415共2页1.目的规范尼康显微镜使用操作规程，保证显微镜的正常使用。2.授权操作人经培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.适用范围微生物实验室尼康显微镜4.工作环境相对湿度：85%；运行温度：25±10℃。5.操作程序5.1将开关由“O”拨至“I”，旋转亮度调节钮调节亮度。5.2瞳距调节调节目镜筒的展幅，使左右眼的视场重叠合一。5.3将标本放在载物台上。拨开弹片，将标本固定住。5.4旋转物镜转换器，选择所需放大倍率的物镜移入光路。转动粗调，当标本接近物镜后旋转微调对焦。5.5油镜观察时，在标本上加1滴油，慢转物镜转换器，将油镜移入光路。如果浸油中含有气泡，应除去。5.6油镜观察完毕，应用去油剂清洁干净，旋转物镜转换器使镜头离开视野后放低载物台。5.7关闭开关，切断电源。待足够冷却，用防尘罩将显微镜罩住。6.质量控制（不需要）7.维护保养7.1每日保养使用完毕，用去油剂清洁镜头。7.2每月保养每月对聚光镜进行清洁保养。松开聚光镜安全钮，取出聚光镜，用湿布轻轻擦拭。顽固性污垢可用中性洗涤剂擦拭。8.校正8.1例行校正至少每年一次。8.2故障校正维修后，需要校正。9.应急处理9.1出现不能自行解决的故障应及时联系工程师维修处理，并告知微生物实验室负责人。9.2出现影响检验质量的故障，应立即停止使用该显微镜，转由其他显微镜代替。10.注意事项10.1搬运显微镜时，应抓住显微镜后上部并托住前下端。10.2显微镜喷漆部件、塑料部件不能用有机溶剂如酒精、乙醚等清洁。参考文献[1]尼康显微镜配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAABBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书电热灼烧器文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0514版本：20160415生效日期：20160415共1页1.目的规范电热灼烧器操作规程，确保电热灼烧器正确使用。2.授权使用人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.适用范围微生物实验室的电热灼烧器。4.工作环境相对湿度：10%-85%；运行温度：15-30℃。5.操作程序5.1接通电源。把电源开关置于“ON”档。5.2等待10分钟，是灼热器内部都变得通红。5.3灼烧接种环时，须保持加热5-7秒。6.质量控制（不需要）7.维护保养每月保养每月擦拭电热灼烧器外表面8.校正（不需要）9.应急处理出现不能解决的故障，应及时联系维修人员并通知微生物实验室负责人。10.注意事项10.1灼烧时，避免液体加热飞溅。10.2灼烧器工作时，内部温度很高，操作时应注意安全。参考文献[1]电热着灼烧器配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAABBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书旋涡混合器文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0515版本：20160415生效日期：20160415共1页1.目的规范旋涡混合器操作规程，确保正确使用旋涡混合器。2.授权操作人经培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.适用范围微生物实验室旋涡混合器4.工作环境相对湿度：10%-85%；运行温度：15-30℃。5.操作程序5.1接通旋涡混合器的电源。5.2打开旋涡混合器上方的绿色开关，混合器即开始工作。5.3把装有欲混匀物品的容器放于混合器的海绵上。5.4稍微用力按压混匀物，用力越大，混匀强度越大。5.5混匀完毕，关闭开关，切断电源。6.质量控制（不需要）7.维护保养每次使用完毕，切断电源，清洁表面。8.校正（不需要）9.应急处理出现不能自行解决的故障，应及时联系维修人员并告知微生物实验室负责人。10.注意事项10.1容器开始混匀时应逐渐加力，以免一开始就高强度混匀，液体容易溅出。10.2如液体溅出，应立即停止使用。取出海绵，用消毒液浸泡清洗，待海绵脱水干燥后，方可重新使用。混合器外表及台面均要用消毒液擦拭干净。10.3不要长时间开启旋涡混合器。参考文献[1]旋涡混合器配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAABBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书移液器文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0516版本：20160415生效日期：20160415共2页1.目的规范移液器的操作规程，确保正确使用移液器。2.授权操作人经培训并通过考核的检验科微生物实验室工作人员。3.适用范围微生物实验室移液器。4.工作环境相对湿度：10%-85%；运行温度：15-30℃。5.操作程序5.1设定容量值根据量程选择相应的移液器，可调式移液器只能在允许容量范围内调节。5.2吸液5.3选择量程合适的吸头安装在移液器枪头上。稍加扭转压紧吸头使之与枪头间无空气间隙5.4把吸液按钮压至第一停点，吸头浸入液样中，缓慢、平缓地松开按钮，吸取液样，等1秒，然后将吸头提离液面，用吸水纸抹去吸头外面可能附着的液滴，勿触及吸头口。5.5释放液体5.6吸头贴到容器内壁并保持10°-40°倾斜。5.7平稳地把按压钮压到第一停点，等1秒后把按钮压到第二停点以排出剩余液体。5.7.1压住按钮，同时提起加样器。5.7.2松开按钮。5.7.3按吸头弹射器除去吸头（吸取不同液体时需更换吸头）6.质量控制（不需要）7.维护保养定期用湿布清洁移液器外部，不可用乙醚、酒精等有机溶剂擦洗。8.校正8.1例行校正每半年一次。8.2故障校正容积失准时、维修后需要校正。8.3校正后验收校正后，微生物实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。9.应急处理9.1发现漏气或计量不准，其原因和解决方法如下。9.1.1吸头松动时，用手拧紧。9.1.2吸头破裂时，检查吸头，更换新的吸头。9.2发现吸液时有气泡，先将液体排回原容器，再检查原因。276 1.1出现不能解决的故障，应及时联系维修人员并通知微生物室负责人。2.注意事项2.1吸头浸入液体深度要合适，吸液过程中应尽量保持吸头浸入液体的深度不变。2.2吸头内有液体时不可将移液器平放或倒转，以防液体污染移液器。参考文献[1]仪器配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书VITEK比浊仪文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0517版本：20140601生效日期：20140615共3页1.目的规范VITEK比浊仪的操作规程，保证检验质量。2.授权操作人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.适用范围微生物实验室VITEK比浊仪。4.工作环境相对湿度：10%-80%；运行温度：15-30℃。5.原理（略）6.操作程序6.1电池安装6.1.1取下电池仓盖，极性显示于电池仓中。6.1.2根据指示将随同本仪器所提供的四节电池置于电池仓中，重新盖上盖子。注释：当更换电池时，必须根据电池仓中的图形符号遵守正确的极性。6.1.3选择一个干净的试管，并目测确定其无划痕。6.1.4试管中加入无菌盐水并放入试管插架中。6.1.5按下电源键以打开仪器。注释：当打开仪器时，如果持续按下电源键1秒或更长时间，则屏幕上的所有字段都将打开。当释放电源键时，固件版本将显示2秒钟，然后返回测量屏幕。6.1.6仪器屏幕将闪烁数字0.按下归零/滚动键。仪器将显示一系列短线，随后是0.00.6.1.7现在，仪器准备就绪可以使用了。6.2设置时间6.2.1按下菜单键，然后按下归零/滚动键，直到屏幕以00:00格式显示时间。6.2.2按下读数/回车。待编辑的数位将会闪烁。6.2.3使用归零/滚动键更改输入，然后按下读数/回车接受并前进到下一数位。时间以24小时制输入。6.2.4设置最后一位数字后，按下菜单键退出模式。6.3更改试管类型设置6.3.1按下菜单键。SEL和一个三角形将一直闪烁，指示当前设置。6.3.2按下读数/回车键移动三角形。276 6.3.3当三角形指向将要使用的设置时，按下菜单键。6.4调出存储的测量6.4.1按下菜单键，然后按下归零/滚动键，直到屏幕显示┏［┕。6.4.2在RCL（调出）模式中，按下读数/回车可调出存储的测量，从最近一次所进行的测量开始。本仪器存储了测量编号01（最近一次）至10（最早一次）、测量值以及进行测量的时间。归零/滚动键允许按编号选择某个测量。读数/回车键可在所有存储的数据点之间滚动浏览。6.4.3要退出RCL（调出）模式，请按下菜单键。6.5每当使用一种新型的试管（例如一家新的制造商或部件编号）时，应当执行该步骤以确保固有的准确度。6.5.1选择一个干净的试管，并目测确定其无划痕。6.5.2用无菌盐水填充试管。6.5.3在仪器关闭时，将填充盐水的试管插入仪器中。6.5.4按下电源键以打开仪器。6.5.5确保选择了正确的试管设置（塑料或玻璃）。6.5.6按下归零/滚动键，缓慢地旋转试管。在读数显示之前确保旋转了一整圈。仪器将显示一系列短线，随后显示0.00.6.6制备菌悬液6.6.1请用实验室SOP文件规定方法制备菌悬液：6.6.2按下电源键以打开仪器。6.6.3将混合好的菌悬液试管放入仪器中，缓慢旋转试管。在读数显示之前，确保旋转了一整圈。仪器将显示一系列短线，随后显示一个读数。6.6.4检查所试细菌显示的McFarland值是否处于可接受的范围内。7.质量控制（略）8.维护保养每日使用时，须记录仪器使用情况，使用完毕，须清洁仪器。9.校正9.1例行校正浊度仪的校正，至少每年1次。9.2故障校正维修后需校正。9.3校正后验收校正后，微生物实验室负责人对各项指标核实，达标后方可。10.应急处理出现不能自行解决故障，应及时联系经销商或工程师维修处理，并告知微生物实验室负责人。276 参考文献[1]VITEK比浊仪配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书紫外线消毒车文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0518版本：20160415生效日期：20160415共1页1、目的：规范紫外线消毒车的操作规程，保证检验质量2、授权操作人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3、适用范围紫外线消毒车（以下简称消毒车）适用于医疗卫生部门空气消毒用。4、主要技术参数4.1输入功率：132VA4.2电源电压：AC220V50HZ4.3定时范围：0－60分钟4.4灯臂调节角度：0－150度4.5紫外灯管辐射强度30W:107Uw/cm24.6灯管：双端无臭氧紫外线杀菌灯（ZW30S19W）2支4.7紫外线波长：253.7nm4.8熔断器型号：φ5×20F2AL250V4.9分类：I类，连续运行设备，不能在由易燃易爆麻醉气体和空气的混合或氧化亚氮的混合气情况下使用的设备。5、使用方法：5.1使用安装本产品前，请仔细阅读本说明书。5.2打开保护门。5.3用手托住灯臂往上往上抬至需要位置。5.4插上电源、打开开关。5.5根据需要设定消毒时间。5.6使用完毕将按钮摁到底，同时另一手托住灯臂慢慢将灯管放进灯箱内并关上保护门。5.7切断电源，并拔下电源插头。6、维护保养，防止液体的危险：产品应请专业维修人员定期检查，保养，检查运行是否异常情况，发现异常情况应仔细查找原因，排除故障后方可使用。本设备用于自行调换的元件有：a紫外线灯管（ZW30S19W）b、仪器外接熔断器（φ5×20F2AL250V）7、质量控制（略）8、注意：调换元器件时，必须拔去电源插头！8.1熔断器更换：拧出熔断器盖，更换新的熔芯后，再拧入熔断器盒盖即可。8.2灯管的更换：若灯管损坏可以自行更换，首先将坏的灯管旋转90°，然后拧出灯管，换上新灯管，再旋转90°即可。参考文献[1]紫外线消毒车配套说明书编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书MI-01智能恒温金属浴文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0519版本：20160415生效日期：20160415共3页1、目的：规范MI-01智能恒温金属浴的操作规程，保证检验质量。2、授权操作人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员3、适用范围微生物实验室MI-01智能恒温金属浴。4、正常工作条件：使用环境温度：5℃-30℃相对湿度：≤70％使用电源：AC220V±22V50HZ±1HZ150V5、操作步骤：5.1、温度时间设5.1.1执行预设程序a)打开电源开关，显示屏出现如图画面仪器进入初始化，并伴随“滴”的声音。Ｓｙｓｔｅｍ-Ｔｅｓｔｉｎｇ．．．．．．b）约4秒后，显示主界面，光标停留在“1”处位置闪烁，此时按“↑”或“↓”可选择工作方式，工作方式“1”为预设程序，即满足固定用户的试验需要，直接按start开始即可；工作方式“2”为自设程序，用户可以根据需要来设定工作时间。１：Ａｕｔｏ　Ｐｒｏｇｒａｍ２：Ｓｅｔ　　Ｐｒｏｇｒａｍc)当选择方式“1”按下start后，开始执行加热显示界面，此时仪器开始加热。Ｔ１：７０Ｃ　　　　Ｔ２：２５ＣＰｌｅａｓｅ　ｗａｉｔd)大约十分钟后，仪器升温到70℃，此时蜂鸣器报警提示，按下start后，开始恒温。Ｔ１：７０Ｃ　　　　Ｔ２：２５ＣＰｒｅｓｓ　Ｓｔａｒｔ5.1.2执行自设程序276 a)按下start，即时温度（PV值）显示的数值25.0为模块的当前温度，设置温度（SV值）显示的数值37.0为初始化设置的目标温度。ＰＶ：２５.０Ｃ　　　　　０１：００ＳＶ：３７.０Ｃ　　　　　*　*　００b)按一次set健立即放开，此时**的位置显示T1,表示进入设置的第一阶段，同时光标在小时时间处闪烁，如图所示，若将温度设置为70.0℃，控制时间设置为一个半小时，操作如下：闪烁的数值表示可以修改，此时按“↑”或“↓”可使该为的数值增加或减少。接着按“←”或“→”将光标右移或者左移到需要改动的位置。即按右移键两次，移至分位，在按增加键三次，调整为数字3，再按右移键两次，移至目标温度位，同上依次调整，即调整到01：30和70.0.如图所示。ＰＶ：２５.０Ｃ　　　　　０１：３０ＳＶ：７０.０Ｃ　　　　　Ｔ１　００c)再按一次set键立即放开，此时T1的位置显示为T2，表示进入设置的第二阶段，同时光标在小时时间处闪烁，如图所示。第二阶段的设置与第一阶段的设置方法相同。系统默认第二阶段温控时间为0，用户根据需要自行设置第二阶段的温控时间和目标温度。ＰＶ：２５.０Ｃ　　　　　００：００ＳＶ：７０.０Ｃ　　　　　Ｔ２　００5.2、运行、暂停功能ＰＶ：２５.０Ｃ　　　　　０１：３０ＳＶ：７０.０Ｃ　　　　　**　　００a)按下start键立即放开，程序按当前设定值运行，先运行第一阶段，屏幕出现一个“*”当即时温度（PV）到达设置温度（SV）后，蜂鸣器“滴”的一声，温控是时间开始倒计时显示。当第1节温控完成后，程序自动进入第2节温控方式，屏幕出现两个“**”如图所示b)当第2节温控方式运行结束后，蜂鸣器报警提示，仪器停止一切温控动作，并在屏幕上显示“PROGRAMEND”和“GOODBYE!”字符。如图所示ＰＲＯＧＲＡＭ　ＥＮＤＧＯＯＤ　ＢＹＥ！c)在运行过程中，按stop276 键立即放开，程序运行暂停，界面返回主菜单界面，所有状态初始化，只有再次按start键，来选择工作方式，程序才能重新运行。6、故障分析与处理故障分析与处理方法序号故障现象原因分析处理方法1打开电源开关后显示屏不亮电源未接通检查电源并接通熔断器烧毁更换熔断器（250v3AΦ5×20）2温度显示与实际温度严重不符传感器损坏或模块接触不好与供应商或厂家联系3模块既不加热也不制冷温度传感器损坏与供应商或厂家联系TE制冷片损坏与供应商或厂家联系4按键不起作用薄膜开关损坏与供应商或厂家联系7质量控制（略）8、注意事项：在对仪器表面进行清洗时，必须切断电源。仪器表面严禁用腐蚀性清洗剂清洗。参考文献[1]MI-01智能恒温金属浴配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书MB-80微生物快速动态检测系统文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0520版本：20160415生效日期：20160415共1页1.目的规范MB-80微生物快速动态检测系统的操作规程，保证结果准确性。2.授权操作人经培训的微生物实验室检验人员。3.原理MB-80微生物快速动态检测系统通过对真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的相应因子后形成凝固蛋白过程的动态检测，对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量分析，为临床深部真菌感染疾病及治疗预后效果提供快速诊断的依据。4.工作环境相对湿度：20%-80%；温度控制：30±0.3℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。5.操作程序5.1打开主机及电脑电源开关，启动MB-80微生物快速动态检测系统软件，录入病人信息、样本种类及检测项目等信息。5.2打开加热仪，待其温度达到70℃。5.3体液前处理过程的制备（以血液为例）用含有少许无菌抗凝剂（肝素钠）的无热源玻璃注射器或一次性真空采血管采取静脉血2ml，放入无热源离心管中，用灭菌铝箔封闭管口以防污染，进行3000r/min离心1分钟，分离得富血小板血浆，取出后放入冰水浴中。若暂时不用，可在-30℃冰箱保存1个月。5.4待测样品制备取上述富血小板血浆0.1ml，加入0.9ml样品处理液中，混匀后70℃保温10分钟，取出后立刻放入冰水浴中，即为待测血浆样品。5.5检测方法取待测血浆0.2ml直接加入酶反应主剂中，溶解后使用微量加样器转移至10*75mm标准玻璃反应管中（不要产生气泡），插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行检测，反应结束后自动计算出待测血浆中（1-3）-β-D葡聚糖浓度。6.参考值（参考范围）正常人血浆中（1-3）-β-D葡聚糖浓度<10pg/ml；10-100pg/ml之间为病变观察期，应连续检测；>100pg/ml，为深部真菌感染症状，需对症治疗。参考文献[1]MB-80微生物快速动态检测系统配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书营养琼脂配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0521版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范营养琼脂培养基配制的操作规程。2．原理培养基含有氮源、碳源和微量无机盐，适宜细菌生长繁殖。3．用途供细菌培养、菌株纯化及传种使用。4．配方营养琼脂干粉28g、蒸馏水1000ml5.操作步骤将28g营养琼脂干粉溶于1000ml蒸馏水中，混匀至完全溶解，分装，经121℃灭菌15分钟，冷藏备用。6.储存条件2～8℃冰箱7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1质控频度每次新配制时做质控8.2质控方法及结果见表5-17。表5-17配制营养琼脂培养基质量控制方法及结果试验方法结果无菌试验<100块抽检5%，>100块随机取10块，35℃培养24～49h无细菌生长生长试验金黄色葡萄球菌ATCC25923，35℃培养24～49h菌落浅黄色铜绿假单胞菌ATCC2785335℃培养24～48h菌落无色或浅绿色直径>2.7mm平行试验平行试验做质控时取新旧批号的培养基同时做9．注意事项倾倒时温度不易过高，否则冷凝水过多易污染；若温度过低，琼脂易凝固。参考文献[1]谢正旸主编。现代微生物培养基和试剂手册。福州：福建科学技术出版社，1994[2]王钦升，周正明，高屹主编。实用医学培养基手册。北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书血琼脂培养基配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0522版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范血琼脂培养基配制标准操作规程，保证培养基质量。2．原理羊血或兔血等是细菌生长繁殖的良好营养物质。在45～50℃的基础培养基中加入血液可以完好保存血液中某些不耐热的生长因子，同时血细胞不被破坏。若将NaCl浓度提高到0.85%，可使血平皿在35℃培养18～24小时后色泽仍然新鲜。3．用途供一般病原菌的分离培养、溶血性鉴别及保存菌种用。4．配方特殊蛋白胨23g、淀粉1g，氯化钠5g、琼脂10g、无菌脱纤维羊血（或兔血）5%～10%，pH7.1～7.5。5.操作步骤将上述成分混合，溶于1000ml蒸馏水中，加热溶化，校正pH，121℃高压灭菌15分钟。冷却至50℃加入无菌血液，充分摇匀后倾注平板，待凝固后冷藏备用。血琼脂层厚4mm。6.储存条件2～8℃冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1质控频度每次新配制时做质控8.2质控方法及结果见表5-18.表5-18配制血琼脂培养基质量控制方法及结果试验方法结果无菌试验生长试验平行试验<100块抽检5%，>100块随机取10块，35℃培养，观察有无细菌生长化脓性链球菌ATCC19615，35℃，培养18～24小时肺炎链球菌ATCC6305，35℃，培养18～24小时金黄色葡萄球菌ATCC25923，35℃，培养18～24小时大肠埃希菌ATCC25922，35℃，培养18～24小时做质控时，取新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长良好，β溶血生长良好，a溶血生长良好，β溶血生长良好，9.注意事项倾注时温度不易过高，否则血细胞易被破坏而溶血；若温度过低，琼脂易凝固。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书巧克力培养基配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0523版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范巧克力培养基配制标准操作规程，保证培养基质量。2．原理流感嗜血杆菌生长依耐血液中的X及V因子，当培养基加热至80～90℃时，可使血液中的红细胞破裂释放出X及V因子，以利用嗜血杆菌的生长培养。3．用途主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增值培养。4．配方牛肉浸出液1000ml、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂5g、无菌脱纤维羊血100ml，pH7.2～7.4。5.操作步骤将前4项成分混合，加热溶化，校正pH，121℃高压灭菌15分钟，冷却至80～85℃，以无菌技术加入羊血，摇匀后置80～85℃水浴中，维持15分钟，使之成巧克力色取出，倾注平板，待凝固后冷藏备用。6.储存条件2～8℃冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1质控频度每次新配制时做质控8.2质控方法及结果见表5-19.表5-18配制巧克力琼脂培养基质量控制方法及结果试验方法结果无菌试验生长试验平行试验<100块抽检5%，>100块随机取10块，35℃，CO2培养24～48小时流感嗜血杆菌ATCC10211，35℃，CO2培养18～24小时奈瑟氏菌ATCC43069，35℃，CO2培养18～24小时做质控时，取新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长生长9.注意事项水浴温度不宜过高，时间不宜过长，否则X和V因子消耗殆尽；水浴温度也不宜过低，时间也不宜过短，否则X和V因子不能充分释放出来，应控制在80～85℃。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书M-H培养基配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0524版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范M-H培养基配制标准操作规程，保证培养基质量。2．原理M-H培养基用Mueller-Hinton琼脂（水解酪蛋白琼脂）配制，淀粉为保护性胶体，能对抗细菌中的毒性物质，水解酪蛋白含多种氨基酸，牛肉浸膏能提供细菌氮源的主要营养物质。药敏试验中，为保证结果重复性及抑菌环的大小、清晰，因此培养基不含对抗生素及磺胺药物的拮抗剂。3．用途用于普通细菌的抗菌药物敏感试验。4．配方成品OXOIDM-H干粉38g、蒸馏水1000ml，pH7.1～7.5。5.操作步骤将上述成分混合，校正pH。121℃高压灭菌15分钟。冷至50℃左右，无菌定量吸取25ml于直径9cm的无菌平板内，凝固后冷藏备用。琼脂层厚4mm.6.储存条件2～8℃冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1质控频度每次新配制时做质控8.2质控方法及结果见表5-20.表5-18配制M-H培养基质量控制方法及结果试验方法结果无菌试验质量检测平行试验<100块抽检5%，>100块随机取10块，35℃，CO2培养24小时在M-H培养基上涂布粪肠球菌ATCC29212，用甲氧苄啶∕磺胺甲噁纸片进行药敏试验，35℃培养24小时做质控时，取新旧批号的培养基同时做无细菌生长出现一个边缘清楚的抑菌圈，直径应≧20mm9.注意事项9.1倾注琼脂量为25ml，平板深度4mm。若太薄，易产生假敏感。若太厚，平皿中的抗生素往下扩散而使抑菌环变狭窄，产生假耐药性。9.2pH会影响某些抗生素的活性。实验时不可将平板培养在CO2培养箱中，否则会在琼脂的潮湿表面产生碳酸而降低pH值，将影响各种抗生素的扩散速度、抑菌环大小。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书营养肉汤配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0525版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范营养肉汤配制标准操作规程，保证培养基质量。2．原理含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，如蛋白胨、牛肉浸膏、食盐、水等，所以可供微生物生长繁殖之用。3．用途用于标本及各类细菌增菌。4．配方蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉浸液1000ml，pH7.2～7.4。5.操作步骤将上述成分混合，校正pH，分装试管，每支3～5ml，经121℃高压灭菌15分钟，冷藏备用。6.储存条件2～8℃冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1质控频度每次新配制时做质控8.2质控方法及结果见表5-22.表5-21配制营养肉汤质量控制方法及结果试验方法结果无菌试验生长试验平行试验<100块抽检5%，>100块随机取10块，35℃培养18～24小时，观察有无细菌生长（若有细菌生长，则营养肉汤变浑浊）大肠埃希菌ATCC25922，需氧，35℃，18～24小时金黄色葡萄球菌ATCC25923，需氧，35℃，18～24小时35℃培养做质控时，取新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长生长9.注意事项调整pH时，加碱后，必须加热，使pH值得以稳定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书碱性蛋白胨水配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0526版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范碱性蛋白胨水配制标准操作规程，保证培养基质量。2．原理在pH8.0～9.0环境中，霍乱弧菌能较好地生长繁殖，而其他大部分细菌在此环境中生长受抑制，因此霍乱弧菌在次培养基上生长占优势，为进一步分离培养提供有利条件。3．用途主要用于霍乱弧菌增菌培养用。4．配方蛋白胨10g、氯化钠20g、蒸馏水1000ml，pH8.4～8.8。5.操作步骤将上述成分混合加热溶解，调整pH至8.4～8.8，煮沸，稍冷后，分装试管，每支8ml，121℃高压灭菌15分钟，冷藏备用。6.储存条件2～8℃冰箱。7.有效期实验室自行规定，确保培养基质量。8.质量控制8.1质控频度每次新配制时做质控8.2质控方法及结果见表5-23.表5-23配制碱性蛋白胨水质量控制方法及结果试验方法结果无菌试验生长试验平行试验<100支抽检5%，>100支随机取10块，35℃培养18～24小时，观察有无细菌生长（若有细菌生长，则营养肉汤变浑浊）非O1群弧菌（质控菌株），35℃孵育6h大肠埃希菌ATCC25922，35℃孵育6h副溶血弧菌（质控菌株），35℃孵育6h做质控时，取新旧批号的培养基同时做无细菌生长生长良好生长抑制生长良好9.注意事项蒸馏水配制时，由于蒸馏水pH偏低，故pH要重新测定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基配制标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0527版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基配制标准操作规程，保证培养基质量。2．原理绝大多数真菌在此培养基中能利用葡萄糖及蛋白胨分别作为碳源和氮源进行生长繁殖。培养基形成的pH5.6环境也适合于真菌的生长。3．用途真菌分离的常规培养基，适用于各种标本的初代分离，对酵母、霉菌都适用。4．配方葡萄糖40g,蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。5.操作步骤先取700ml蒸馏水将琼脂加热溶解，300ml蒸馏水溶解葡萄糖和蛋白胨，两者混合均匀后分装试管，加塞后121℃高压灭菌10分钟。置斜面冷却。贴标签及标注制备日期和有效期。如制备平皿培养基，可在高压灭菌后倾注无菌平皿。可添加氯霉素200mg（适用于含细菌的标本，如痰、粪、尿、脓及皮屑等）、放线菌酮500mg（适用于甲屑标本，可抑制污染真菌，促进皮肤藓菌生长），均可在高压消毒前加入。6.结果判断培养物出现气泡者为阳性。7.注意事项严格控制高压灭菌的温度与时间，以防因温度过高或时间过长导致葡萄糖焦化、培养基颜色变深。。8.有效期限试管：3个月；平皿：2周。9.质控培养基色泽为黄色半透明。每批培养基制备后应抽检5%（>100支，抽检10支）分别置37℃及25℃48小时，观察有无细菌、真菌的生长。分别接种酵母及真菌的标准菌株，观察能否正常生长。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书触酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0528版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范触酶试验标准操作规程。2．原理具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。3．试剂3%过氧化氢溶液。4．质控金黄色葡萄球菌ATCC25923阳性，肺炎链球菌ATCC49619阴性。5.操作步骤取3%过氧化氢溶液0.5ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1～3ml滴加入盐水菌落悬液中。6.结果判断培养物出现气泡者为阳性。7.注意事项7.1细菌要求新鲜。7.2不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性。7.3需用已知阳性菌和阴性菌作对照。8.临床意义在革兰阳性球菌中，链球菌触酶试验阴性，葡萄球菌及微球菌均阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书氧化酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0529版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范氧化酶试验标准操作规程。2．原理氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素酶呼吸系统的酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的琨类化合物。3．试剂盐酸二甲基对苯二胺（或四甲基对苯二胺）0.1g加蒸馏水10ml，置棕色瓶内可用一周。冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。4．质控铜绿假单胞菌ATCC27853阳性，大肠埃希菌ATCC25922阴性。5.操作步骤取洁净的滤纸一小块，蘸取菌苔少许，加1滴10g∕L盐酸二甲基对苯二胺溶液于菌落上，观察颜色变化。6.结果判断立即呈粉红色并迅速转为紫红色者为阳性。。7.注意事项7.1试剂在空气中易氧化，故应经常更换新试剂，或配制时试剂内加入0.1%维生素C以减少自身氧化。7.2不宜采用含葡萄糖培养基上的菌落（葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性）。7.3实验时应避开含铁的培养基等含铁物质，因本试验过程中，遇铁时会出现假阳性。8.临床意义8.1用于奈瑟氏菌、非发酵菌等细菌的鉴定。8.2所有的革兰阴性菌均应进行氧化酶试验，如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化酶阳性的嗜水气单胞菌错误地鉴定为大肠埃希菌或沙雷菌。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书凝固酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0530版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范凝固酶试验标准操作规程。2．原理金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集，可用玻片测出。另一种是菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶，能使凝固酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固。3．试剂新鲜人或兔血浆，生理盐水。4．质控金黄色葡萄球菌ATCC25923阳性，表皮葡萄球菌ATCC57625阴性。5.操作步骤5.1玻片法取兔或混合人血浆和盐水各一滴分别置清洁载玻片上，挑取待检菌菌落分别与血浆及盐水混合。如血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象为阳性。5.2试管法取试管2支，分别加入0.5ml的血浆（经生理盐水1：4稀释），挑取菌落数个加入测定管中充分研磨混匀，用已知阳性菌株加入对照管，37℃水浴3～4小时。血浆凝固为阳性。6.结果判断玻片法：如血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象为阳性。试管法：血浆凝固为阳性。7.注意事项若被检细菌为陈旧的肉汤培养物（>18～24小时）或生长不良、凝固酶活性低的菌株往往出现假阴性。8.临床意义金黄色葡萄球菌凝固酶试验为阳性，而表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌凝固酶试验为阴性，故此试验对鉴别葡萄球菌有重要价值。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书DNA酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0531版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范DNA酶试验标准操作规程。2．原理某些细菌可产生细胞外DNA酶。DNA酶可水解DNA长链，形成数个单核甘酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸则可溶于酸，当在菌落平板上加入酸后，若在菌落周围出现透明环，表示该菌具有DNA酶。3．试剂3.1DNA琼脂成分DNA（脱氧核苷酸）2.0g胰蛋白胨15gD大豆胨5.0g氯化钠5.0g琼脂20g蒸馏水1000mlpH7.2～7.43.2制备将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH，分装三角烧瓶，经115℃灭菌15分钟。倾注于灭菌平皿，冷藏备用。4．质控粘质沙雷菌ATCC14041阳性，大肠埃希菌ATCC25922阴性。5.操作步骤将待检菌点状接种于DNA琼脂平板上，35℃培养18～24小时，在细菌生长物上加一层1mol/L盐酸（使菌落浸没）。6.结果判断菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。7.注意事项培养基表面凝固水需烘干，以免细菌呈蔓延状生长。也可在营养琼脂的基础上增加0.2%DNA。8.临床意义肠杆菌科中的沙雷菌和变形杆菌可产生DNA酶，革兰阳性球菌中只有经黄色葡萄球菌产生DNA酶，因此可用于鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书CAMP试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0532版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范CAMP试验标准操作规程。2．原理B群链球菌具有“CAMP”因子，能促进葡萄球菌β溶血素的活性，使两种细菌在划线处呈现箭头形透明溶血区。3．试剂血琼脂平板，金黄色葡萄球菌ATCC25923.4．质控无乳链球菌ATCC13813阳性，化脓链球菌ATCC19615阴性。5.操作步骤先用产溶血素的金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上划一横线，再取待检的链球菌与前一划线作垂直划线接种，两者相距0.5～1cm。置35℃孵育18～24小时，观察结果。6.结果判断在两种细菌划线的交界处，出现箭头形透明溶血区为阳性。7.注意事项被检菌与金黄色葡萄球菌划线之间留出0.5～1cm距离，不得相接。8.临床意义主要用于鉴定B群链球菌（阳性），其他链球菌本试验阴性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书Optochin试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0533版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范Optochin试验标准操作规程。2．原理Optochin(ethylhydrocupreine,乙基氢化去甲奎宁的商品名)可干扰肺炎链球菌叶酸的生物合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对其敏感，而其他链球菌对其耐药。3．试剂血琼脂平板，Optochin纸片（含药5ug）.4．质控肺炎链球菌ATCC49619阳性，粪链球菌ATCC9790阴性。5.操作步骤将待检的a溶血的链球菌均匀地涂布在血琼脂平板上，贴放Optochin纸片（含药5ug），35℃孵育18～24小时，观察抑菌圈的大小。6.结果判断抑菌圈>10mm为肺炎链球菌。7.注意事项7.1做Optochin敏感试验的平板不能在CO2环境下培养，因其可使抑菌圈缩小。7.2同一血琼脂平板可同时测定几株菌株，但不要超过4株被测菌。7.3Optochin纸片可保存于冰箱中，一般可保存9个月。但如用已知敏感的肺炎链球菌检测为耐药时，纸片应弃用。8.临床意义用于肺炎链球菌与其他链球菌之间的鉴别。肺炎链球菌对Optochin敏感，而其他链球菌则耐药。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银陈险峰）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书七叶苷试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0534版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范七叶苷试验标准操作规程。2．原理粪肠球菌能分解七叶苷，其代谢产物与铁离子结合产生黑色沉淀，使培养基变黑。3．试剂3.1七叶苷琼脂成分蛋白胨5g磷酸氢二钾1g牛肉膏3g七叶苷1g枸橼酸铁0.5g蒸馏水1000mlpH7.23.1制备上述各成分混合溶解后，调pH至7.2，分装试管，高压灭菌，冷藏备用，4．质控粪肠球菌ATCC29219阳性，肺炎链球菌ATCC49619阴性。5.操作步骤将试验菌接种于七叶苷琼脂斜面上，经35℃孵育18～24小时后取出，观察结果。6.结果判断培养基变黑色，为阳性。7.注意事项7.1若接种七叶苷液体培养基，阳性者经过经35℃孵育3～6小时，培养基即可变黑。7.2其他链球菌亦能在此培养基上生长，但不变黑；肺炎链球菌不生长。8.临床意义主要用于鉴别D群链球菌与其他非D群链球菌。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书卫星试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0535版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范卫星试验标准操作规程。2．原理金黄色葡萄球菌会产生一种扩散蛋白CAMP因子（合成脱氢酶），并渗入培养基中，刺激流感嗜血杆菌生长。3．试剂血琼脂平板，金黄色葡萄球菌4．质控流感嗜血杆菌ATCC10211阳性，卡他莫拉菌ATCC49226阴性。5.操作步骤挑取可疑菌落，接种于血琼脂平板上，作浓密连续划线后，再将金黄色葡萄球菌点种其上（2～4处），于37℃培养24小时后观察结果。6.结果判断如见葡萄球菌菌落邻近处的菌落较大，而远离金黄色葡萄球菌菌落处的菌落小，即为“卫星现象”阳性。可初步鉴定为流感嗜血杆菌。7.注意事项若产生大的新月形或箭头形溶血，则为CAMP阳性，即B型链球菌，而小区溶血及不溶血为阴性反应。8.临床意义用于流感嗜血杆菌与其他细菌的鉴别。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书糖（醇、苷）类发酵试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0536版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范糖（醇、苷）类发酵试验标准操作规程。2．原理不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖的能力各不相同，产生的代谢产物也随细菌种类而异。观察细菌能分解各类单糖（葡萄糖等）、双糖（乳糖等）、多糖（淀粉等）和醇类（甘露醇）、糖苷（水杨苷等），是否产酸或产气。3．试剂3.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g溴甲酚紫指示剂10ml蒸馏水1000ml3.2制备将上述成分混合后，加热使其溶解。校正pH至7.1～7.2，用滤纸过滤；根据需要，分别加需要的糖和醇；分装于试管，每管内3ml，置高压灭菌器内，经115℃灭菌10分钟。置4℃左右冰箱备用。4．质控大肠埃希菌ATCC25922阳性（加葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖），奥斯陆莫拉菌ATCC25829阴性。5.操作步骤将纯培养的细菌接种至各种糖培养管中，置一定条件下孵育后取出，观察结果。6.结果判断若细菌能分解此种糖类产酸，则指示剂呈酸性变化；不能分解此种糖类，则培养基无变化。产气可使液体培养基中倒置的小管内出现气泡，或在半固体培养基内出现气泡或裂隙。7.注意事项糖发酵的基础培养基内必须不含有任何糖类何硝酸盐，以免出现假阳性反应。因有些细菌可使硝酸盐还原产生气体，而影响发酵糖类产气结果的观察。8.临床意义糖发酵试验是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖类。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书三糖铁试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0537版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范三糖铁试验标准操作规程。2．原理能发酵葡萄糖和乳糖的细菌产酸产气，使三糖铁的斜面和底层均呈黄色，并有气泡产生；只能发酵葡萄糖，不发酵乳糖的细菌，使斜面呈红色，而底层呈黄色；有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢,硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀；分解尿素，呈红色。3．试剂3.1三糖铁琼脂成分上层：乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g硫酸亚铁0.2g蛋白胨20g琼脂20g硫代硫酸钠0.2g氯化钠5g0.2%酚红12.5ml蒸馏水1000ml下层：牛肉膏1.8g酸性磷酸钾1.2g0.2%酚红1.8ml蛋白胨6g琼脂3g氯化钠3g尿素12g蒸馏水600ml3.2制备上层制备：成分混合后，加热溶解，校正pH至7.6，分装三角烧瓶内，115℃灭菌15分钟。下层制备：下层成分（除尿素外）混合后，加热溶解，校正pH至7.2，然后加入尿素分装每管约1.5ml，115℃灭菌15～20分钟。再取葡萄糖0.5g、0.1%酚红溶液10ml混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使其溶解，分装于试管中，每管约1.5ml，置高压灭菌器内，经115℃灭菌10分钟。取出后，待其直立凝固。下层凝固后，用无菌手续，将上层培养基成热装于下层培养基上面。凝固后将其置于37℃培养箱中，培养18～24小时，如无杂菌污染，可存于冰箱中备用。4．质控大肠埃希菌ATCC25922，三糖铁琼脂上、下层均为黄色，福氏志贺菌CMCC51573，三糖铁琼脂上层不变，下层为黄色。5.操作步骤挑取纯菌落接种于三糖铁琼脂上，35℃孵育18～24小时。276 6.结果判断出现黑色沉淀物为硫化氢阴性。7.注意事项三糖铁琼脂上下层配制时，高压灭菌时掌握好温度和时间，以免培养基中的糖被分解。8.临床意义三糖铁琼脂用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可初步鉴定细菌的种属。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书葡萄糖O∕F试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0538版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范O∕F试验标准操作规程。2.原理又称氧化∕发酵（O∕F）试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧（氧化型），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱型）。3.试剂3.1O∕F基础培养基成分葡萄糖10g溴甲酚紫（1.6%水溶液）1.0ml蛋白胨20g琼脂3g磷酸氢二钾0.2g氯化钠5g蒸馏水1000ml3.2制备上述成分除指示剂外加热溶解后校正pH至7.1，加入指示剂并分装13×100mm的试管，每管2～3ml，置高压灭菌器内，经115℃15分钟的灭菌，即为O∕F基础培养基。最终糖浓度为1%。4.质控铜绿假单胞菌ATCC27853开放管为黄色，封闭管为紫色；大肠埃希菌ATCC25922开放管、封闭管均为黄色。5.操作步骤从平板上或斜面培养基上挑取少量细菌，同时穿刺接种于2支O∕F试验管，其中1支用滴加溶化的无菌凡士林（或液体石蜡）覆盖培养基液面0.3～0.5cm高度。经37℃培养48小时后，观察结果。6.结果判断仅开放管产酸为氧化反应，两管都产酸为发酵反应，两管均不变为产碱型。7.注意事项有些细菌不能在O∕F培养基上生长，若出现此类情况，应在培养基中加入2%血清或0.1%酵母浸膏，重做O∕F试验。8.临床意义葡萄糖O∕F试验可用于葡萄球菌与微球菌的鉴别，前者为发酵型细菌，后者为氧化型细菌。更重要的是用于革兰阴性杆菌的鉴别，肠杆菌科的所有细菌为发酵型细菌，而绝大多数的非发酵菌则为氧化型或产碱型细菌。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书甲基红试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0539版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范规范甲基红试验标准操作规程。2．原理某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步代谢分解为乳酸、甲酸、乙酸，使培养基的ph下降到4.5以下，加入甲基红指示剂即显红色（甲基红变红的范围为ph4.4～6.0）；某些细菌虽能分解葡萄糖，但产糖量少，培养基的ph在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。3．试剂3.1葡萄糖蛋白胨水培养基成分多价蛋白胨7g葡萄糖5g磷酸氢二钾5g蒸馏水1000mlPH7.23.2制备将上述成分混合溶解后，分装小试管，高压120℃灭菌15分钟。3.3试剂甲基红0.1g95％乙醇300ml蒸馏水200ml4．质控大肠埃希菌ACTT25922为红色，阴沟肠杆菌ACTT13047为黄色。5.操作步骤将待检菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃孵育1～2日，加入甲基红试剂2滴，立即观察结果。6.结果判断红色者为阳性，黄色者为阴性。7.注意事项7.1培养基中的蛋白胨水可影响甲基红试验结果，在使用每批蛋白胨水之前用已知甲基红阳性菌和阴性菌做质量检测。7.2甲基红反应并不因增加葡萄糖的浓度而加快。7.3孵育时间不得少于48小时，若过早地判断结果，往往可造成假阴性。8.临床意义主要应用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书VP试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0540版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范规范VP试验标准操作规程。2．原理某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步代谢分解为乙酰甲基甲醇，后者在碱性环境下被空气中的氧氧化成为二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等所含的胍基结合，形成红色的化合物，即VP试验阳性。3．试剂3.1葡萄糖蛋白胨水培养基成分多价蛋白胨7g葡萄糖5g磷酸氢二钾5g蒸馏水1000mlPH7.23.2制备将上述成分混合溶解后，分装小试管，高压120℃灭菌15分钟。3.3试剂甲液：6％ɑ萘酚酒精溶液；乙液：40％KOH溶液4．质控大肠埃希菌ACTT25922为无红色出现，肺炎克雷伯菌ACTT13883为红色。5.操作步骤5.1将待检菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃孵育1～2日。5.2观察方法-贝氏（Barritt）法观察时按每2ml培养液加甲液1ml、乙液0.4ml混合，置35℃，15～30分钟出现红色为阳性。若无红色，应置37℃，4小时后再判定，本法较奥氏法敏感。6.结果判断呈红色者为阳性。7.注意事项7.1许多实验室工作人员有一个错误的印象，即VP试验阳性菌甲基红试验自然是阴性，或反之亦然。实际上，肠杆菌科的大多数细菌产生相反的反应（由于乙酰甲基甲醇形成碱性，导致甲基红试验阴性和VP试验阳性）。某些细菌如蜂房哈夫尼菌和奇异变形杆菌，35℃培养可产生甲基红试验和VP试验同时阳性反应，后者常延迟出现。7.2ɑ萘酚酒精溶液易失效，试剂放室温暗处可保存1个月。KOH溶液可长期保存。国内多采用贝氏法。8.临床意义本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性，反之亦然。如大肠埃希菌、沙门菌等甲基红呈阳性反应，而VP试验则为阴性；相反，如沙雷菌、阴沟杆菌等，VP试验阳性，而甲基红反应为阴性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书吲哚试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0541版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范规范吲哚试验标准操作规程。2．原理某些细菌具有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，生成吲哚，吲哚与试剂对二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。3．试剂3.1葡萄糖蛋白胨水培养基成分蛋白胨（或胰蛋白胨）10g氯化钠5.0g蒸馏水1000mlPH7.23.2制备将上述成分溶于水中，校正PH至7.2，分装试管，每管2～3ml,置120℃灭菌15分钟备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为红色，肺炎克雷伯菌ACTT13883为无色。5.操作步骤将待检菌接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃孵育1～2日，沿管壁慢慢加入柯凡可（Kovacs）试剂0.5ml，即刻观察结果。6.结果判断两液面交界处呈红色者为阳性，无红色者为阴性。7.注意事项蛋白胨中应含有丰富的色氨酸，否则不能应用。8.临床意义主要应用于鉴别肠杆菌。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书硝酸盐还原试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0542版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范规范硝酸盐还原试验标准操作规程。2．原理硝酸盐培养基中的硝酸盐可被某些细菌还原为亚硝酸盐，后者与乙酸作用生成亚硝酸。亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与ɑ奈胺结合成红色的N-ɑ奈胺偶氮苯磺酸。3．试剂3.1硝酸盐培养基成分蛋白胨10g硝酸钾（AR）2g蒸馏水1000mlPH7.43.2制备将上述成分混合后，加热溶解，调PH至7.4，分装试管，每管约4ml,置120℃灭菌15分钟备用。3.3试剂配制甲液：对氨基苯磺酸0.8g5mol／L乙酸100ml乙液：ɑ奈胺0.5g5mol／L乙酸100ml4．质控大肠埃希菌ACTT25923为阳性，鲍曼不动杆菌ACTT19606为阴性。5.操作步骤将待检菌接种至硝酸盐培养基中，35℃孵育1～2日，加入试剂甲液和乙液各2滴，即刻观察结果。若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原。可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，证明产生芳基肼，表示硝酸盐仍然存在；若仍不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮，也可在培养基内加1支小试管，若有气泡产生，表示有氮气生成，用以排除假阴性。6.结果判断呈红色者为阳性。若不呈红色，再加入少许锌粉，如仍不变为红色者为阳性，表示培养基中的硝酸盐已被细菌还原为亚硝酸盐。进而分解成氨和氮。加入锌粉后变为红色者为阴性，表示硝酸盐未被细菌还原，红色反应是由于锌粉的还原所致。7.注意事项本试验在判定结果时，必须在加入试剂之后立即判定结果，否则因颜色迅速退色而造成判定困难，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。8.临床意义本试验在细菌鉴定中广泛应用，肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，部分假单胞菌产生氮气。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书脲酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0543版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范脲酶试验标准操作规程。2．原理某些细菌具有脲酶，能分解尿素生成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。3．试剂3.1尿素氮培养基成分蛋白胨1.0g氯化钠2.0g葡萄糖1.0g磷酸二氢钾2.0g0.4％酚红溶液3.0ml琼脂18～20g20％尿素溶液100ml蒸馏水1000mlPH7.03.2制备将上述成分(除酚红、尿素外)混合于蒸馏水中，加热溶解，校正PH，加入酚红溶液，分装每瓶100ml，置120℃灭菌15分钟备用。临用时，加热溶解，冷却至55℃左右，加入无菌的尿素溶液10ml，摇匀，无菌分装于灭菌试管，每支2ml，并置成斜面备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为阴性，奇异变形杆菌ACTT49005为阳性。5.操作步骤将待检菌接种至含尿素培养基中，35℃孵育1～4日。6.结果判断红色者为阳性。7.注意事项所有尿素培养基均依靠出现碱性来证实，故对脲酶不是特异性的。某些细菌如铜绿假单胞菌利用培养基的蛋白胨可分解为多量氨基酸，使PH升高呈碱性，造成假阳性。因此必须用无尿素的相同培养基作为对照。8.临床意义主要应用于肠杆菌科中的变形杆菌属细菌的鉴别。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0544版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程。2．原理某些细菌能产生氨基酸脱羧酶，使该种氨基酸脱去羧基，生成胺（如赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺），从而使培养基变碱性，指示剂变色。3．试剂3.1基础液成分蛋白胨5g牛肉浸膏5g溴甲酚紫0.1g甲酚红0.005g吡躲醛（VB6）0.005g葡萄糖0.5g蒸馏水1000ml3.2制备基础液加热慢慢溶解，按1％浓度加入赖氨酸，调PH至6.0，呈深亮紫色。分装每支4ml，同时配对对照管（不加氨基酸），置120℃灭菌15分钟，冷却后冷藏备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为紫色，福氏志贺菌CMCC51573为黄色。5.操作步骤挑取纯菌种接种于含赖氨酸的培养基及不含氨基酸的对照培养基中，加无菌石蜡油覆盖，35℃孵育4日，每日观察结果。6.结果判断若仅发酵葡萄糖显黄色，为阴性；由黄色变为紫色，为阳性。对照管为黄色。7.注意事项7.1由于脱羧酶培养基含有蛋白胨，培养基表面的蛋白胨氧化和脱氨基作用可产生碱性反应，所以培养基应密封。隔绝空气，以消除假阳性反应。7.2不含氨基酸的空白对照管，孵育18～24小时后，仍保持黄色（发酵葡萄糖）。8.临床意义沙门菌属中除甲型沙门菌赖氨酸反应阳性，志贺菌属和枸橼酸杆菌属均为阴性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书鸟氨酸脱羧酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0545版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范鸟氨酸脱羧酶试验标准操作规程。2．原理某些细菌能产生某种氨基酸脱羧酶，使该种氨基酸脱去羧基，生成胺（如赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺），从而使培养基变碱性，指示剂变色。3．试剂参见《赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程》。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为紫色，为阳性；福氏志贺菌CMCC51573变为黄色，为阴性。5.操作步骤挑取纯菌种接种于含鸟氨酸的培养基及不含氨基酸的对照培养基中，加无菌石蜡油覆盖，35℃孵育4日，每日观察结果。6.结果判断若仅发酵葡萄糖显黄色，为阴性；由黄色变为紫色为阳性。对照管（无氨基酸）为黄色。7.注意事项参见《赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程》8.临床意义沙门菌属中，除伤寒沙门菌和鸡沙门菌外，其余鸟氨酸脱羧反应均为阳性；克雷伯菌属鸟氨酸脱羧反应均为阴性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书精氨酸双水解酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0546版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范精氨酸双水解酶试验标准操作规程。2．原理精氨酸经两次水解后，生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变色。3．试剂参见《赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程》。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为紫色，为阳性。普通变形菌CMCC49001显黄色，为阴性。5.操作步骤挑取纯菌种接种于含精氨酸的培养基及不含氨基酸的对照培养基中，加无菌石蜡油覆盖，35℃孵育1～4日，每日观察结果。6.结果判断若仅发酵葡萄糖显黄色，为阴性；由黄色变为紫色，为阳性。对照管（无氨基酸）为黄色。7.注意事项参见《赖氨酸脱羧酶试验标准操作规程》。8.临床意义主要应用于鉴别肠杆菌科及假单胞菌属。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0547版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程。2．原理某些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与三氯化铁作用形成绿色化合物。。3．试剂3.1苯丙氨酸琼脂成分DL-苯丙氨酸2g氯化钠5g酵母浸膏3g磷酸氢二钠1g琼脂12g蒸馏水1000mlPH7.33.2制备除琼脂外其他的成分加热溶解，调PH至7.3，再加入琼脂溶解后分装，每管约4ml,置120℃灭菌15分钟，置成斜面，凝固后冰箱保存，备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为黄色，阴性；普通变形杆菌CMCC49001为绿色，阳性。5.操作步骤将待检菌接种至苯丙氨酸琼脂斜面，35℃孵育18～24小时，在生长的菌苔上滴加三氯化铁试剂，即刻观察结果。6.结果判断斜面呈绿色者为阳性。7.注意事项7.1注意接种菌量要多，否则出现假阴性反应。7.2苯丙氨酸脱氨酶试验需在加入三氯化铁试剂后，立即观察，因为绿色易很快褪去，不管阳性或阴性结果，都必须在5分钟内作出判断。8.临床意义本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性，肠杆菌科其他细菌则为阴性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书枸盐酸盐利用试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0548版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范枸盐酸盐利用试验标准操作规程。2．原理在枸盐酸盐培养基中，细菌能利用的碳源只有枸盐酸盐。当某种细菌能利用枸盐酸盐时，可将其分解为碳酸钠，使培养基变碱性，PH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。3．试剂3.1枸盐酸盐培养基成分硫酸镁0.2g磷酸二氢铵1g磷酸二氢钾1g枸盐酸纳2g氯化钠5g琼脂15g2g/L溴麝香草酚蓝溶液4ml蒸馏水1000ml3.2制备加热溶解，校正PH至7.0，分装试管，每管3ml,置115℃灭菌15分钟，冰箱中备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为绿色，阴性；肺炎克雷伯菌ACTT13883为蓝色，阳性。5.操作步骤将待检菌接种至枸盐酸盐培养基斜面，35℃孵育1～7日。6.结果判断培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性。7.注意事项接种时菌量应适宜，过少可发生假阴性，接种时过量可导致假阳性。8.临床意义有助于于鉴别肠杆菌科细菌。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书丙二酸盐利用试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0549版本：20140601生效日期：20130801共1页1．目的规范丙二酸盐利用试验标准操作规程。2．原理在丙二酸盐培养基中，细菌能利用的碳源只有丙二酸盐。当某种细菌能利用丙二酸盐时，可将其分解为碳酸钠，使培养基变碱性，使指示剂由绿色变为蓝色。3．试剂3.1枸盐酸盐培养基成分硫酸胺2g酵母浸膏1g磷酸二氢钾0.4g磷酸氢二钾0.6g氯化钠2g丙二酸盐3g溴麝香草酚蓝0.025g蒸馏水1000ml3.2制备将上诉溶液混合，校正PH至7.1左右。用滤纸过滤，分装试管每管约3ml,置115℃灭菌15分钟，冰箱中备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为绿色，阴性；肺炎克雷伯菌ACTT13883为蓝色，阳性。5.操作步骤将待检菌接种至丙二酸盐培养基上，35℃孵育1～2日，观察结果。6.结果判断培养基由绿色变为蓝色为阳性。7.注意事项某些利用丙二酸盐的细菌产碱量少，造成判断困难。可将其与未接种的培养基进行对比。培养48小时后，有蓝色反应为阳性，阴性结果必须在培养48小时后才能作出判断。8.临床意义肠杆菌科中亚利桑那菌和克雷伯菌属为阳性，枸盐酸盐杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反应，其他各菌属均为阴性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书硫化氢试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0550版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范硫化氢试验标准操作规程。2．原理细菌分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）生产硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子生成黑色硫化物。3．试剂3.1醋酸铅培养基成分蛋白胨10g硫酸钠0.1g蒸馏水1000ml胱氨酸0.1g3.2制备将上述成分加热溶解，调PH至7.0～7.4，分装试管，每管液体高度为4～5cm,置120℃灭菌20分钟备用。4．质控普通变形杆菌CMCC49001阳性，为黑色；肺炎克雷伯菌ATCC13883阴性，为黄色。。5.操作步骤将培养物接种于醋酸铅培养基或克氏铁琼脂等培养基，35℃孵育1～2日，观察结果。6.结果判断呈黑色为阳性。7.注意事项如用克氏铁琼脂等培养基，则可有硫代硫酸钠、硫酸钠或亚硫酸钠还原产生硫化氢，阳性时可与二价铁生成黑色的硫化氢，阴性不产生黑色沉淀。8.临床意义肠杆菌科中沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸盐酸杆菌属和变形杆菌属细菌绝大多数硫化氢试验阳性。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书ONPG试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0551版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范ONPG试验标准操作规程。2．原理ONPG试验又称半乳糖苷酶试验。某些细菌具有半乳糖苷酶，可分解邻-硝基酚--D-半乳糖，生成黄色的邻-硝基酚。3．试剂3.1成分试剂甲：0.01mol/LPH7.0磷酸氢二钠缓冲液100ml试剂乙：蛋白胨3.0g氯化钠1.5g蒸馏水300mlPH7.03.2制备将甲、乙液分别置121℃灭菌15分钟，冷却至40～50℃，乙液加入ONPG0.6g，置56℃水浴中加热溶解，无菌过滤，将滤液与甲液合并分装试管，每管2ml，作无菌试验后备用。4．质控大肠埃希菌ACTT25922为黄色，奇异变形杆菌ACTT49005为无色。5.操作步骤将纯菌落用无菌盐水制成浓的菌悬液，加入ONPG溶液0.25ml，35℃水浴，于20分钟和3小时观察结果。6.结果判断通常在20～30分钟内显色。出现黄色为阳性反应。7.注意事项7.1ONPG溶液不稳定，培养基呈黄色即不可使用。7.2ONPG试验结果不一定与分解乳糖相一致。8.临床意义用于测定不发酵或迟缓发酵乳糖的细菌是否产生此酶，亦可用于迟发酵乳糖细菌的快测鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书沙门菌血清学检测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0552版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范沙门菌的血清学检测标准操作规程。2．原理用已知的沙门菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为沙门菌。3．试剂沙门菌诊断血清，生理盐水。4．质控伤寒沙门菌ATCC50096阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。5.操作步骤5.1首先用可疑菌与沙门菌O多价血清(A-F)进行凝集，若呈明显凝集，提示被检菌株可能属于A-F6个O群范围之内，再用H因子血清第一相（特异相）定型，最后用H因子第二相（非特异相）辅助定型。5.2若生化反应符合沙门菌，但A-F多价血清不凝集，首先考虑是否存在表面抗原（Vi抗原），因为Vi抗原能阻断O抗原与相应抗体发生凝集，加热可将其破坏。应将细菌制成菌悬液，放入沸水中加热15～30分钟，冷却后再次做凝集试验。若去除Vi抗原后仍不凝集，此时应考虑是否为A-F以外菌群，应送专业实验室进行鉴定。6.结果判断阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。自凝：试验一侧及对照一侧凝集。7.注意事项伤寒沙门菌菌体表面常有一层Vi抗原。它能阻抑菌体抗原与抗血清的凝集，从而导致假阴性结果。此时应将菌悬液于100℃中煮沸1小时，以破坏Vi抗原，然后再做试验。8.临床意义主要用于沙门菌属的鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书志贺菌血清学检测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0553版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范志贺菌的血清学检测标准操作规程。2．原理用已知的志贺菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为志贺菌。3．试剂志贺菌诊断血清，生理盐水。4．质控福氏志贺ATCC12022阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。5.操作步骤5.1首先用志贺菌属4种多价血清作玻片凝集，如凝集再进一步作血清定型（用福氏志贺菌1-6型、痢疾志贺菌1-2型、鲍氏志贺菌1-6型及宋氏志贺菌鉴定到种、型）。一般先用福氏志贺菌血清凝集，因我国以B群最为多见，若出现生化反应符合志贺菌，而与4种多价血清不凝集的菌株，应考虑为K抗原存在，将菌液加热到100℃15-30分钟后再进行凝集。5.2与各型志贺菌血清不发生凝集，菌落特征与生化反应似痢疾志贺菌，可考虑非典型痢疾血清型，应送专业实验室进行鉴定。6.结果判断阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。自凝：试验一侧及对照一侧凝集。7.注意事项志贺菌菌体表面常有一层K抗原。它能阻抑菌体抗原与抗血清的凝集，从而导致假阴性结果。此时应将菌悬液于100℃中煮沸15-30分钟，以破坏K抗原，然后再做试验。8.临床意义主要用于志贺菌属的鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书致病性大肠埃希菌血清学检测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0554版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范致病性大肠埃希菌的血清学检测标准操作规程。2．原理在确定大肠杆菌后，用已知的致病性大肠埃希菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为致病性大肠埃希菌。3．试剂致病性大肠埃希菌诊断血清，生理盐水。4．质控致病性大肠埃希菌阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。5.操作步骤5.1先以生化反应确定为大肠埃希菌，再以抗原分析定型。5.2用接种环挑取大肠埃希菌依次于数组多价OK抗血清作玻片凝集试验（其分组血清型见试剂盒说明书），若与某一单价血清呈凝集反应，可初步确定为相应血清型，再用菌液与OK抗血清确定亚型。5.3若不凝集或凝集微弱，可视为阴性。再挑取另一个菌落，如上法试验，如此检查5-10个菌落，可最终判定为阴性。6.结果判断阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。自凝：试验一侧及对照一侧凝集。7.注意事项大肠埃希菌各血清型间的抗原关系十分密切，特别是O抗原玻片凝集反应仅作为阴性标本筛选，确定试验须作定量凝集试验。8.临床意义主要用于致病性大肠埃希菌的血清学鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书霍乱弧菌血清学检测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0555版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范霍乱弧菌的血清学检测标准操作规程。2．原理用已知的霍乱弧菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为霍乱弧菌。3．试剂霍乱弧菌诊断血清，生理盐水。4．质控霍乱弧菌ATCC14035阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。5.操作步骤5.1先用接种环取1环生理盐水于玻片上，以接种针挑取少许菌落与盐水混匀，再取稀释血清1环与之混合，立即出现凝集者为阳性。5.2若有自凝现象改用生理盐水稀释的血清再做凝集。与O1群霍乱弧菌血清凝集者即可定为霍乱弧菌，然后再进一步对霍乱弧菌分型。6.结果判断阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。自凝：试验一侧及对照一侧凝集。7.注意事项试验时应同时用生理盐水作对照，以防止出现假阳性。8.临床意义主要用于霍乱弧菌的鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书血清牙管形成试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0556版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范血清牙管形成试验标准操作规程。2．原理白念珠菌在血清中能形成牙管，借此可鉴定酵母样真菌。3．试剂血清，生理盐水。4．质控白念珠菌ATCC14053阳性；光滑念珠菌ATCC710阴性。5.操作步骤用无菌试管加血清0.2-0.5ml，接种少量真菌，经充分震荡混合数分钟后，在37℃恒温箱培养。每隔1小时用接种环取1滴含菌血清，于玻片上镜检。6.结果判断白念珠菌的牙管形状是从孢子生出一个芽，其长为细胞的3-4倍，末端的宽为细胞的二分之一。7.注意事项牙管形成试验要在37℃3小时内完成，同时做阴阳性对照。8.临床意义主要用于白念珠菌的鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书解脲脲原体试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0557版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范解脲脲原体试验标准操作规程。2．原理解脲脲原体在合适其生长的培养基中分解培养基底物，使培养基的PH值上升，培养基由黄色变红。3．试剂解脲脲原体培养基。4．质控解脲脲原体ATCC27618阳性。5.操作步骤将取样后棉拭子插入培养基中充分荡洗，棉拭子在管壁上挤干水分后丢弃；液态标本取150-200ul直接加入培养基中摇匀，35℃培养18～24小时后，观察结果。6.结果判断培养基由橙色变成红色且清亮为阳性，表示有脲原体生长。培养基不变色为阴性。7.注意事项培养基接种到药敏板前腰充分摇匀。培养基变红但混浊，不能报阳性，或重做试验。8.临床意义解脲脲原体主要引起人体泌尿生殖系统的感染，如急性尿道综合症、非淋菌性尿道炎，也可引起肾盂肾炎、阴道炎和盆腔炎等。参考文献[1]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006[2]解脲脲原体培养基说明书编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书G试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0558版本：20160415生效日期：20160415共2页276 1．目的规范G试验标准操作规程。1.操作授权人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。2.用途：4．原理真菌（1，3）-β-D葡聚糖能特异性激活反应主剂中的G因子、凝固酶原等，发生凝固蛋白原转变的级联反应从而引起吸光度的变化，根据检测气吸光度的变化从而对真菌（1，3）-β-D葡聚糖浓度进行定量，试剂中添加的两性电解质甘氨酸、氨基糖苷类抗生素机表面活性剂可抑制脂多糖对B、C因子的激活，对革兰阴性脂多糖有特异性屏蔽作用。5．样本要求5.1血清的制备：用一次性无热源真空采血管采静脉血4ml，进行3000rpm/min离心10-15min分得血清2小时内检测。5.2血清保存：标本需冷藏于2-8℃下不超过24小时避免反复冻融。产品如果需要运输，则应该冷藏运输。5.3标本前处理：取上述血清0.1ml，加入0.9ml样品处理液中，混匀后70℃孵育10min，取出后立刻放入冷却槽中冷去5min，即为待测血清样品。。6．操作步骤：取待测血清0.2ml直接加入酶反应主剂中，溶解后使用微量加样器转移至9*65mm标准无热源平底试管中，然后再加入0.1ml反应主剂溶液，混匀后，插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应，反应结束后检测系统自动计算出待测血清中真菌（1，3）-β-D葡聚糖含量。注：每批试剂盒由厂家提供参考标准曲线。定标使用真菌（1，3）-β-D葡聚糖纯品，纯度>98%。7.结果判断结果解释：参考值：正常血清真菌（1，3）-β-D葡聚糖值<60pg/ml。60pg/ml以下，无深部真菌感染（隐球菌、接合菌除外）：60-100pg/ml之间，为观察期，应连续检测。100pg/ml以上，怀疑为深部真菌将感染，建议临床结症状治疗。8.注意事项8.1、只能检测（1，3）-β-D葡聚糖含量，不能区分真菌种属，不能检测接合菌和隐球菌。8.2、实验操作应在无菌无热源的环境下，避免微生物细菌污染8.3、无菌无热源的采血管（建议采用BD血清管），保证试验数据的准确。8.4、干扰因素：①应用纤维素膜进行血液透析患者；②某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖；③静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；④某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）；⑤抗肿瘤药物（香菇多糖、裂殖菌多糖）；⑥磺胺类药物；⑦蘑菇类食物。276 参考文献[1]真菌（1，3）-β-D葡聚糖检测试剂盒配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书GM试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0559版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范GM试验标准操作规程。2.操作授权人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.用途：采用酶联免疫双抗体夹心一步法（ELISA）半定量检测人血清标本中半乳甘露聚糖抗原。4．原理采用双抗体夹心ELISA方法检测血清样本中半乳甘露聚糖抗原。微板中包被半乳甘露聚糖抗体，可与样本中半乳甘露聚糖抗原和试剂中酶标抗体试剂结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），经公式计算得到I值，根据I值与cut-off值（0.5）的比较判断有无曲霉菌的感染或感染的程度。5．样本要求5.1标本类型：血清5.2标本采集和储存：见试剂说明书5.3标本处理:标本编号后离心3000r/min，10min当日不做的标本离心后及时放入2-8℃冰箱冷藏，详见试剂说明书。6．操作步骤：6.1试剂从冰箱取出平衡30分钟，恢复至室温状态方可使用,提前40分钟将水浴箱调成100℃。6.2配洗液：将R2浓缩清洗液用蒸馏水以1：20稀释，备用。6.3样本/对照质控的处理：300ul质控血清/病人样本+100ul样本处理液R7（专用无热源离心管和枪头）混合振荡后进行水浴100℃3min，然后10000g离心10min,取上清液待用。6.4从微孔板取出微板架盒微孔条R1,将不准备使用的反应条返回袋中，连同干燥剂一起，封入袋中。每孔加50ul酶结合物R6,再依次每孔加入50ul已处理质控血清/病人标本的上清液。密封膜封好，在37℃±1℃温度下孵育90±5min。6.5洗板：5次，每孔加满但不可溢出，间隔2-3S倒掉，最后一次拍干。6.6每孔快速加入200ulTMB溶液R9且避光。6.7微板室温（18-25℃）避光孵育30±5min。6.8终止反应：加入100ul终止液R10，并小心擦干微板底部。6.9读数：加入终止液30min之内，在450/620nm处读取OD值。并计算I值7.结果判断结果解释：阳性结果I值≥0.50阴性结果I值<0.50在受检标本中是否存在或缺失半乳甘露聚糖抗原,可通过每个病人样本的指数计算来断定。指数（I276 ）是样本的光密度值除以含Cut-off对照血清的小孔光密度值均值得到的。Cut-off对照光密度均值的计算Cut-off对照血清R4两个小孔的光密度总和除以2。每个受检血清指数I的计算为每个受检血清计算下面的比率：I=[样本光密度/Cut-off对照光密度均值]指数<0.50的血清解释：指数<0.50的血清被认为是半乳甘露聚糖抗原阴性注释：阴性结果表示病人的结果低于实验的可检测水平。阴性结果不排除侵袭性曲霉菌感染的诊断。如果结果是阴性的，而怀疑感染了疾病，建议重新检测。指数≥0.50的血清解释:指数≥0.50的血清学被认为是半乳甘露聚糖抗原阳性对于所有阳性病人,建议随后的检测,从同一样本中取新的一等份重新检测。注释：吸光度低于0.000，可以表示实验步骤或设备出错，应当对错误进行评估。实验结果无效并且标本需要重做。8.质量控制（有效性）：Cut-off对照液：每个cut-off对照液血清的光密度必须≥0.300且≤0.080阳性对照：阳性对照血清指数必须大于1.50I=[阳性对照光密度(R5)/Cut-off对照光密度均值]>1.50阴性对照:阴性对照血清指数必须小于0.40I=[阴性对照光密度(R3)/Cut-off对照光密度均值]<0.40不符合上述有效标准的对照液,则所有分析无效,病人标本结果不能报告.重新审阅操作步骤后,再做分析;或咨询生产商,寻求帮助.(如果重新分析,在重做分析中应使用新的同一样本)9.试剂：9.1试剂名称：PlateliaTM曲霉菌抗原检测试剂盒。9.2、试剂生产厂家：美国伯乐公司9.3、包装规格：96T/Kit4、试剂盒组成：微孔板、浓缩清洗液、阴性对照血清、cut-off质控血清、阳性对照血清、酶标结合物、样本处理液、TMB溶液、终止液、微板密封板、说明书等。10.注意事项：用于对侵袭性曲霉菌感染高危患者的筛查诊断，动态疗监测及临床用药的评估。参考文献[1]PlateliaTM曲霉菌抗原检测试剂盒配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书隐球菌抗原检测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0560版本：20160415生效日期：20160415共2页1．目的规范隐球菌抗原检测试验标准操作规程。2.操作授权人经过培训并通过考核的微生物实验室工作人员。3.用途：作为隐球菌病的辅助诊断试验，本检测系统利用简单快速乳胶凝集反应对血清和脑脊液中隐球菌的荚膜多糖抗原进行定性检测。4．原理本检测系统利用了包被在乳胶颗粒中的抗隐球菌抗体与含有隐球菌荚膜多糖抗原的样本发生凝集反应。血清中，风湿因子的存在阻碍了此抗原的检测，本实验通过链酶蛋白酶对血清样本的预处理不仅减少了非特异性干扰。而且还加强了对隐球菌荚膜多糖抗原的检测。5．样本要求A、脑脊液：1）常规操作方法收集无菌样本2）1000g离心15min以确保去除所有白细胞和微粒体3）小心吸取脑脊液溶液加入无菌容器并密封4）样本可以立即处理，冷藏，在-20℃冷藏保存。5）100℃孵育脑脊液要本5min6）备用。B、血液1）常规操作方法收集全血无菌样本。含抗凝血剂的样本无效2）1000g离心15min3）小心吸取血清溶液加入无菌容器密封4）样本可以立即处理，冷藏，在-20℃冷藏保存。5）在50ul链酶蛋白酶中加入300ul血清并用密封6）56℃孵育血清/链酶蛋白酶溶液30min7）加入一滴链酶蛋白酶抑制液终止反应9）备用。C、试剂准备按照提示剂量用蒸馏水或去离子水制备链酶蛋白酶，链酶蛋白酶应该以50ul的量进行分装。6．操作步骤：6.1在环状玻片中分别加入25ul隐球菌抗原阳性对照，阴性对照和经过热处理的脑脊液或链酶蛋白酶处理的血清样本于不同的分离环中。6.2每个环中加入25ul隐球菌乳胶276 6.3利用分离的涂药棒彻底混合环中物质6.4室温下手动旋转或者100rpm（+-25）旋转仪上5min7.结果判断阴性：无可见团块的均匀颗粒悬浮液阳性：清晰且明显的颗粒或块状8.质量控制（有效性）：乳胶对照：周期性的利用隐球菌抗原阳性对照对隐球菌敏感性进行检测。如果隐球菌乳胶试剂敏感性良好，阳性对照明显。链酶蛋白酶对照：至少每月一次对冷冻链酶蛋白酶水解活性进行检测，按照血清样本准备用300ul链酶蛋白酶对照替换血清样本进行操作。同时对经过链酶蛋白酶处理的和未经链酶蛋白酶对照通过利用上述实验操作进行检测。未经处理的链酶蛋白酶对照为阳性，经过处理的应为阴性。若后者反应为阳性，则水解活性已经降低，则需要重新制备链酶蛋白酶试液即复水、分装、冷冻和检测。9..注意事项：9.1所有试剂仅用于体外诊断9.2.对人的标本应该按照标准的生物危险品进行处理，预防危害的发生。参考文献[1]隐球菌抗原检测试剂盒配套说明书[2]中国合格评定国家认可委员会．CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会。CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书T-SPOT.TB标准操作规程文件编号XXX-JY-CZ-WSW-0561版本：20160415生效日期：20160415共3页1.目的规范T-SPOT.TB操作规程，用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。2.授权操作人经培训并通过考核的检验科微生物检验实验室工作人员。3.工作原理外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。通过洗涤去除任何未标记的抗体。可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T细胞数量。4.工作环境相对湿度:20%-80%无凝集水;室温:15-30度，避免日光直射。5.操作程序5.⒈样本采集：无菌注射器抽取足量的外周静脉血，加至含有肝素或柠檬酸钠抗凝剂的采血管中或使用肝素或柠檬酸钠抗凝的真空采血管直接进行采集。样本采集后应尽快进行外周血单个核细胞（PBMCs）的分离，室温保存时间不应超过4小时，不得冷藏或冷冻。免疫力正常的患者，根据以下标准从静脉血样本中获得足够数量的PBMCs用于实验：·成年人或10岁以上儿童：8ml静脉血·2-9岁儿童：4ml静脉血·2岁以下儿童：2ml静脉血5.⒉外周血单个核细胞（PBMCs）的分离：注意：细胞培养液使用前需预温至37℃5.2.1将抗凝全血按1:1等比例与1640混匀，按2-3:1的比例小心将稀释血样轻缓加到Ficoll细胞分离液上(注意不能将血样与分离液混合)。5.2.2离心与洗涤：第一次离心（水平温控离心机）：离心力：1000g；时间：20分钟；温度：18℃;减速档要求调到低档（保证PBMC层清晰，提取足够的白细胞），将外周血单个核细胞从分离管中转移276 到新的无菌的15ml尖底离心管，加RPMI1640液至10ml，混匀。第二次离心（水平温控离心机）：离心力：600g；时间：7分钟；温度：18℃；加速档和减速档调高档（保证分离PBMC），离心后小心弃去上清用RPMI1640轻缓重悬细胞加RPMI1640液至10ml，混匀。第三次离心（水平温控离心机）：离心力：350g；时间：7分钟；温度：18℃；加速档和减速档调高档（保证分离PBMC），离心后小心弃去上清用500ulAIM-V轻缓重悬细胞。5.3外周血单个核细胞（PBMCs）的收集与计数：T-SPOT.TB实验要求每个检测孔含有25万个细胞。每个样本检测需要4个孔。每个检测孔都必须加入足够的细胞。错误的做法会导致结果的不正确。使用血细胞分析仪计数的简化计算公式-配置细胞稀释液所需的细胞悬液体积(ml)＝1.25/*N-*N代表细胞液的原始浓度(106/ml)。对应浓度见附表15.4孵育过夜：5.4.1培养板加试剂。从铝箔袋取出板，并平衡到室温(18-25℃)。每一个样本加四个培养孔：-N阴性孔—加50μlAIM-V培养液-A抗原孔—加50μlA抗原液(ESAT6)-B抗原孔—加50μlB抗原(CFP10)-P阳性对照孔—加50μl阳性液(PHA)5.4.2培养板加样本的标准溶液在上述四孔内分别加入100μl细胞悬液（含有250，000个细胞）。-孵育条件：37℃，5％CO2，16-20小时.孵育过夜。注：要求培养箱保持湿度。5.5斑点计数：5.5.1洗板:10倍稀释PBS缓冲液，每反应孔加200ulPBS缓冲液，洗4次，建议每次洗板后拍干。5.5.2二抗工作液的配制：取出底物工作液，室温平衡，用无菌PBS按1:200配置新鲜酶标抗体工作液（即用即配），1个样本需要1μl二抗，考虑到耗损，酌情多配。5.5.3显色与干燥：每孔加50μl新鲜的酶标抗体工作液，将酶标板在2-8℃孵育1小时无菌PBS洗涤4遍除去未结合的酶标抗体,每孔加50μl底物工作液,室温7分钟。无菌蒸馏水冲洗终止反应。37℃烘箱干燥4小时或通风处干燥培养板，分析结果。5.5.4.记数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。6．结果处理6.1结果判断：根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果:检测结果为”“有反应性”，参照以下标准：276 空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”6.2参考值（参考范围）“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞“无反应性”结果表明样本中可能不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞6.3检验结果的解释(1)通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而阳性质控对照孔斑点数超过20个。(2)空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。此类样本的结果难以判断查阅T-SPOT.TB技术手册分析原因（下栽www.oxfordimmunotec.com）。重新复查是必要的。(3)阳性质控对照孔斑点数应当超过20个或遍布整个反应孔（斑点数量太多）。当阳性质控对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”，除非抗原A或抗原B孔根据结果解释和判断标准确定为“有反应性”，此检测结果有效。(4)基于生物学和反应体系的原因，当空白对照孔斑点数为0-5个并且（抗原A或抗原B斑点数）减去（空白对照孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”，应当利用所有可利用相关的的临床信息进行判断。必要时可进行复查。(5)虽然在卡介苗和大部分环境分枝杆菌中都缺失ESAT-6和CFP10抗原，当感染M.kansasii,M.szulgai,M.marinumorM.gordonae时，T-SPOT.TB检测有可能出现“有反应性”结果。当怀疑上述细菌感染时有必要进行鉴别诊断。7.质量控制7.1每新近一批试剂做一次质控。8.维护保养8.1每日保养每日观察离心机运转情况并记录。使用完毕后，进行清洁保养。8.2每月保养每月清洁离心机。9.校正10.注意事项：10.1耗材要求无菌-操作按照无菌步骤10.21周内有输血史或做过PET-CT的患者会影响血液中淋巴细胞的分离，建议两周后再行检测。u样本室温（15-25℃）保存与运输，不得冷冻/冷藏。10.3建议样本采集后4小时内送到实验室。运输过程中防止颠簸，避免样本溶血影响结果10.4避免枪头接触到膜，以免损害培养膜。10.5要求培养箱保持湿度10.6培养板加样防止交叉污染10.7由于湿的培养板会造成斑点的不清晰，错误计算斑点的数量，故要求培养板完全干燥后，读取斑点数。参考文献[1]T-SPORT.TB配套使用说明书[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31：2007医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2007[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02:2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189:2007）.2008276 编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书标本处理标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0562版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范标本处理标准操作规程。2．范围临床微生物标本。3．职责微生物检验人员严格执行本程序。4．程序4.1血液标本、接收标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记住址、联系电话等信息。将血培养瓶置于全自动培养仪中培养。4.2痰标本4.2.1接收编号、登记后的痰标本，加入痰消化剂或无菌生理盐水处理。4.2.2用无菌棉签挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板，麦康凯平板的第一区，然后用接种环划第二、第三区······4.2.3同时做痰涂片镜检。4.3咽拭子标本涂布于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯平板第一区，然后用接种环划第二区、第三区······4.4脑脊液、胸腹水等穿刺液床边抽取体液标本1-2ml注入多功能体液培养瓶或需氧血培养瓶，即送实验室。接收标本后，立即对标本进行编号、登记，置孵育箱培养。脑脊液标本需离心涂片检查。4.5粪便或肛拭标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，取粪便脓血部位标本根据检验申请单要求选择平板，立即接种。4.6尿标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，将尿标本混匀，用10ul定量接种环立即接种血琼脂平板、麦康凯平板，分离细菌和菌落计数。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书标本接收标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0563版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范标本接种标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2．范围微生物所有标本的接种。3．职责微生物检验人员严格执行本程序。4．程序4.1分区划线法4.1.1此法多用于粪便等含菌量较多的标本。4.1.2用接种环先将标本涂布在平板第一区并作数次划线，再在二、三······区依次用接种环划线。每划一个区域，应将接种环烧灼1次，待冷却后再划下一个区域。每一个区域的划线应接触上一个区域的接种环2-3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。4.2斜注平板法4.2.1本法用于尿液等标本的细菌计数。4.2.2将灭菌生理盐水适量稀释的标本1ml，置于灭菌平皿内，注入已熔化并冷却至50℃左右的培养基15ml，混匀，待冷却后，倒置。4.3斜面接种法4.3.1此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力。4.3.2用左手握住菌种管和斜面培养管底部，右手持接种环。用右手小指于手掌、小指于无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。用接种环伸入菌种管内挑取移种之菌落。伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上蜿蜒划线。将接种环垂直插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后穿刺线推出接种环。4.4穿刺培养法4.4.1此法用于保存菌种，观察动力及某些生化反应。4.4.2以接种环挑取细菌培养物，插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种环。4.5液体培养基接种法用灭菌接种环挑取菌落或标本。在试管内壁于液面交界处研磨，使细菌混匀在液体培养基中。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书细菌鉴定操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0564版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范细菌鉴定标准操作规程。2．适用范围革兰阴性菌、革兰阳性菌等。3．职责检验人员严格执行本程序。4．程序4.1观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等，观察内容应记录在《细菌鉴定流程表》。4.2涂片，革兰染色，观察染色性及细菌形态、大小和排列，球菌、杆菌或螺形菌等，观察内容记录在《细菌鉴定流程表》。4.3初步生化反应根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等。4.4制定细菌鉴定方案4.4.1仪器鉴定方案（以VITEK2为例）革兰阴性杆菌：选择GN卡（阴性菌鉴定卡）。革兰阳性球菌：选择GP卡（阳性菌鉴定卡）。酵母菌：选择YST卡（酵母菌鉴定卡）。需氧芽孢杆菌：选择BBL卡（需氧芽孢杆菌卡）。4.4.2手工细菌鉴定法氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶苷等生化反应。氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合：触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、吲哚、甲基红、枸橼酸盐、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合。革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、葡萄糖O/F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、脲酶等。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书不染色标本检查法标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0565版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范不染色标本检查法标准操作规程。2．范围微生物不染色标本检查。3．职责微生物检验人员严格执行本程序。4．程序不然色标本检查法主要用于检查细菌的动力及运动状况。有鞭毛的细菌，在显微镜下呈现活泼的运动，4.1湿片法用接种环取细菌悬液或细菌培养液2环，置于清洁载玻片中央，轻轻覆上盖玻片，于油镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。4.2悬滴法取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各一块，将凹孔四周的平面上涂薄薄一层凡士林，取1接种环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴盖上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻轻压，使盖玻片与凹孔边缘粘紧，使凡士林密封其边缘，菌液不致挥发变干。镜下观察时，先用低倍镜，调成暗光，对准焦距后以高倍镜观察，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见其从一处移动到另一处，无动力的细菌呈现布朗运动而无位置改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野或位相显微镜观察其形态、活动。4.3毛细管法主要用于检查厌氧菌的动力。以毛细管（长60～70mm,管径0.5～1.0mm）接触培养物，让菌液吸入毛细管后，用火焰将毛细管两端熔封，将毛细管固定在载玻片上，镜检。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书革兰染色标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0566版本：20140601生效日期：20140615共1页276 1．目的规范革兰染色标准操作规程。2．原理细菌样本先经紫色草酸盐结晶复合物染色，之后用Lugol-PVP媒染剂处理以促进燃料与革兰染色阳性菌结合。经酒精-丙酮的脱色作用，革兰染色阴性菌中的结晶紫会被洗脱。番红精则是作为复染剂：革兰染色阴性的细菌呈现粉红色，而革兰染色阳性的细菌呈现紫色。。3．试剂3.1结晶紫草酸盐溶液结晶紫2%；酒精20%；草酸铵0.8%。3.2稳定Lugol-PVP复合物碘1.3%；碘化钾2%；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）10%。3.3脱色剂95%酒精50%；丙酮50%。3.4番红精溶液番红精0.25%；95%酒精10%。4．质控4.1采用大肠埃希菌ATCC25922质控菌株，每周1次，有室内质控记录。4.2采用金黄色葡萄球菌ATCC25923质控菌株，每周1次，有室内质控记录。。5.操作步骤5.1初染第一液初染剂（结晶紫）染色1分钟，水洗。5.2媒染第二液媒染液（碘液）染色1分钟，水洗。5.3脱色第三液脱色剂（95%酒精）用到无紫色脱落为止，水洗。5.4复染第四液复染剂（石碳酸复红或沙黄）染色30秒，水洗。自然干燥后镜检。6.结果判断革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。7.注意事项7.1染色的结果常受操作者技术的影响，尤其是容易过度脱色，往往阳性染成阴性。7.2在同一载玻片上，需用已知金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌作革兰阳性及阴性对照。7.3染色关键在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。7.4菌龄为18～24小时为佳。8.临床意义8.1鉴定细菌可将细菌分为阳性和阴性两大类，因而可以初步识别细菌，缩小范围，有利于进一步鉴定。8.2选择药物革兰阳性菌与阴性菌的细胞壁结构有很大差别，因而抗菌药物有差异。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书抗酸染色标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0567版本：20140601生效日期：20140615共2页276 1．目的规范抗酸染色标准操作规程。2．原理抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物状，此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫色红色；而其他脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。3．试剂3.1Kinyoun溶液。碱性品红40g乙醇（95%）200ml石碳酸80ml蒸馏水1000ml3.2Gabett溶液亚甲蓝10g无水酒精300ml硫酸200ml蒸馏水500ml4．质控每天用龟分支杆菌ATCC93326做阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照。5.操作步骤5.1初染涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约5分钟，水洗。5.2脱色第二液脱色约1分钟，轻轻摇动玻片，无红色脱色或略呈粉红色时为止，水洗。5.4复染第三液复染30秒，水洗。自然干燥后镜检。6.结果判断抗酸杆菌呈红色。7.注意事项7.1每张玻片只能涂一份标本，禁止将2份或2份以上的标本涂在同一张载玻片上。7.2为防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色。7.3在涂抹痰标本时，严禁对载玻片进行加热。7.4菌龄为18～24小时为佳。8.临床意义只针对用于结核病、麻风病等的细菌检查，初步诊断。9.安全防护措施9.1操作人员要戴口罩、手套和穿隔离衣。9.2涂片制备痰标本要高压灭菌或者在标本中加入等量0.5%“84”消毒液（含有效氯2500mg/L）后涂片。气管刷片送检的玻片，紫外线灯下照射30276 分钟进行染色镜检。或者对于进行抗酸染色的痰标本（因使用的容器原因不能高压灭菌）。9.1镜检后的玻片均浸泡在含有效氯1000mg/L的消毒液中，高压灭菌后处理。9.2所有标本、污染物丢弃之前，都需经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书墨汁染色标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0568版本：20140601生效日期：20140615276 共1页1．目的规范墨汁染色标准操作规程。2．原理墨汁染色（负染色法）：背景着色而菌体本身不着色的染色法称负染色法。此法用以观察细菌及某种真菌的荚膜等。3．试剂印度墨汁。4．质控新型隐球菌ATCC32609为阳性，白念珠菌ATCC90038为阴性。5.操作步骤脑脊液等其他标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于洁净玻片上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检。镜下背景呈黑褐色，菌体无色。6.结果判断新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细胞被染成黑色不透亮，但核形明显。7.注意事项7.1不要使用过期的印度墨汁。7.2墨汁应无污染、无颗粒等。8.临床意义主要用于新型隐球菌的鉴定。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书药物敏感性试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0569版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范药物敏感性试验标准操作规程，确保药敏结果准确。2．原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。3．试剂M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、标准比浊管或比浊仪。4．质控4.1常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。4.2质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的抑菌环。质控菌株的抑菌环在允许范围之内，说明结果可信。4.3质控的频率由于纸片法药敏试验是很稳定的，在不失控的时候，可以每周作1～2次质控菌株的测定。如果发现有失控的情况，就必须每日做1次，寻找失控的原因并予以纠正。如果连续30日失控<3次的，可以恢复每周1次。5.操作步骤5.1挑取4～5个纯培养菌落，接种于3～5mlM-H肉汤（0.5麦氏单位）中，经35℃培养6～8h。5.2用无菌生理盐水或M-H肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同。5.3用无菌棉拭蘸取校正过的菌液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个M-H平板表面，再重复两次，每次旋转平板60°，使整个平板涂布均匀，最后用棉拭涂布平板四周缘一圈。5.4涂布菌液的平板于室温中干燥3～5分钟后，用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，直径90mm的平板宜贴6张药敏纸片。5.5将贴好纸片的平板置35℃孵育18～24小时后，用卡尺量取抑菌圈直径。个别菌孵育温度，时间及条件应按照CLSI规定。6.结果判断7.根据CLSIM100最新标准将所测抑菌圈的大小，报告为敏感（S）、中介/中敏（I）或耐药（R）。8.注意事项8.1测试链球菌时应测量生长受抑制区域而不是溶血受抑制区域。8.2276 如抑菌圈内有独立生长的菌落，则提示可能有杂菌，需要重新分离鉴定和药敏试验。此菌落也可能为高频突变耐药株。8.3某些细菌的磺胺类药抑菌圈内可能有微量的细菌生长，可忽略不计，应以外圈为准。9.临床意义测定细菌对药物的敏感程度，指导临床合理选用抗菌药物。参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]王钦升，周正明，高屹主编.实用医学培养基手册.北京：人民军医出版社，1999（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书脑脊液标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0570版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范脑脊液标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围脑脊液培养。3.标本3.1标本类型脑脊液。3.2标本采集由临床医师以无菌要求做腰椎穿刺，抽取脑脊液2-3ml，盛于无菌容器中送检。脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶酶，迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌离体后也易于死亡。因此，脑脊液无论涂片或培养，必须于采集后立即送检。3.3标本拒收标准3.3.1标本标识与化验申请单不符。3.3.2标本未用无菌试管留取。3.4标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不应超过2小时，切勿放冰箱，否则影响检出率。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。5.细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。6.1涂片检查6.1.1一般细菌涂片检查外观浑浊或脓性脑脊液可直接涂片，无色、透明的脑脊液，应3000r/min离心10-15分钟后取沉淀物涂片、革兰染色、就、镜检。根据染色及形态特征，常可初步提示细菌的种类。6.1.2结核分枝杆菌涂片检查参见《分支杆菌属检验标准操作规程》6.1.3新生隐球菌涂片检查取脑脊液的沉淀物作墨汁负染色，或取脑脊液的离心沉淀物接种于沙氏培养基，置于35摄氏度培养2~5日，根据菌落特性，涂片染色镜检作出报告。必要时可作生化反应进一步鉴定。6.2分离培养276 6.2.1用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯平板，置于5%~10%CO2环境中35摄氏度培养18~24小时，观察细菌生长情况，根据菌落特点、形态与染色及生化反应鉴定细菌，并作药敏试验。6.2.2结核分枝杆菌培养参见《分支杆菌属检验标准操作规程》7.结果报告无论是涂片还是培养，一旦检测到阳性细菌应立即电话或书面通知临床医师。查见细菌，报告菌名和药敏结果。经培养48小时，仍无细菌生长者，报告“培养2日无细菌生长”。8.注意事项8.1抽取的脑脊液分置于无菌试管中，迅速送至实验室，病毒、真菌分支杆菌培养样本置于4°C保存待送。8.2流感嗜血杆菌容易在外界环境中死亡，脑膜炎奈瑟菌对寒冷和干燥均很敏感，在体外容易自溶，故不论是涂片镜检还是进行培养，均应及时送检。9.临床意义正常人的脑脊液是无菌的，检出细菌提示细菌性（急性化脓性或结核性等）脑膜炎。化脓性脑膜炎最多见脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌居第二位。3个月至5岁儿童细菌性脑膜炎的主要致病菌是流感嗜血杆菌，新生儿脑炎多由大肠埃希菌、B群溶血性链球菌和脑膜败血黄杆菌引起的，特别是早产的婴儿。结核分枝杆菌引起结核性脑膜炎。85%脑脓肿病人脑脊液培养可检出厌氧菌，有时可为厌氧菌和需氧菌混合感染。10.危急值报告直接涂片找到细菌或培养阳性均作危急值报告。若检测出脑膜炎奈瑟菌则应做传染病报告。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL32:2008医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编全.国临床检验操作规程第.三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualofClinicalMicrobilogy.9thed.Washington：ASMPress，2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书穿刺液标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0571版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范穿刺液标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围穿刺液标本培养。3.标本3.1标本类型胸水、腹水、心包液、关节液、鞘膜液等。3.2标本采集采用无菌方法采集体内可疑感染部位的液体约2ml，注入无菌试管，或抽取穿刺液1-2ml注入多功能液体培养瓶，或抽取穿刺液2-5ml注入血培养瓶，混匀，立即送检。如怀疑厌氧菌感染，应做床边接种或接种运送培养基。3.3标本拒收标准3.3.1标本标识与化验申请单不符。3.3.2标本不是无菌留取，容器不符合要求。3.4标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不超过2小时。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。5.细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。6.1涂片检查脓性标本直接涂片。浆液性标本先离心（3000r/min）15分钟，取沉淀物涂片作革兰染色，观察有无细菌，以及细菌的形态。6.2分离培养6.2.1一般细菌培养接种于接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置于5%-10%CO2环境中，35°C培养18-24小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断。6.2.2增菌-分离培养法将多功能体液培养瓶颠倒混匀使液体覆盖整个固体面，然后置35°C孵育培养箱（固体面在上，液体在下）。次日观察固体表面菌苔生长及瓶中液体是否浑浊。如发现有菌生长，立即涂片镜检、生化鉴定和药敏试验。此法可提高阳性检出率。276 6.2.3厌氧菌培养床边接种或从厌氧菌运送培养基转种后，立即置于厌氧环境中，35°C培养24-48小时；挑取可疑菌落作耐氧试验，确定为厌氧菌。6.2.4结核分枝杆菌培养：参见《分支杆菌属检验标准操作规程》。7．结果报告培养48小时无菌生长，报告“培养2日无细菌生长”。查见细菌，报告菌名和药敏结果。注意事项标本的采集一定要严格履行无菌操作技术，避免污染。加入抗凝剂的标本（如胸腹水）采集后要与抗凝剂充分混匀并及时送检。体液均需做厌氧培养，故运送过程严格厌氧环境。临床意义各个部位穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等）的细菌学检查对于确定该部位是否有细菌感染具有重要的诊断价值。正常穿刺液是无菌的，若从病人穿刺液中查见致病菌或条件致病菌则提示该部位有细菌感染。胸腔感染的病原菌以结核分枝杆菌多见，其次是金黄色葡萄菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等，腹腔感染的病原菌以肠道细菌如大肠埃希菌、溶血性链球菌、粪肠球菌，以及结核分枝杆菌多见；心包炎和关节炎以金黄色葡萄菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等多见。10．危急值报告涂片发现细菌或培养阳性均需要及时向临床报告结果。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL32:2008医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编全.国临床检验操作规程第.三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualofClinicalMicrobilogy.9thed.Washington：ASMPress，2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书生殖道标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0572版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范生殖道标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围生殖道标本培养或涂片检查。3.标本3.1标本类型生殖道标本。3.2标本采集3.2.1女性由临床医师用无菌棉拭子采集阴道、宫颈分泌物。怀疑盆腔炎厌氧菌感染时，由医师用注射器从阴道后穹窿穿刺抽取标本，立即床边接种于厌氧菌平板。3.2.2男性翻转包皮，用肥皂水清洗尿道口，清水冲洗，采集尿道口分泌物。采集前列腺液时，先冲洗尿道和膀胱，用手指从肛门内按摩前列腺，使前列腺液溢出。3.2.3梅毒螺旋体标本从外生殖器的硬下疳处蘸取渗出液，置于载玻片上，加盖玻片后立即送检。3.3标本拒收标准3.3.1化验申请单与标本不符。3.3.2标本不是用无菌容器留取。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。5.细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。涂片检查6.1.1革兰染色镜检观察阴道分泌物中有无细菌，以及细菌形态和染色性，尤其注意观察有无白细胞内外的革兰阴性双球菌（淋病奈瑟菌），以及有无覆盖大量革兰阴性菌的上皮细胞，（线索细胞，提示可能有阴道加特纳菌感染）。6.1.2梅毒螺旋体图涂片检查直接暗视野检查，观察有无纤细、发亮、前后旋转的密螺旋体，或冯泰纳染色，观察有无棕黑色的密螺旋体。276 6.2分离培养6.2.1一般细菌培养接种于血琼脂平板和麦康凯平板，置于5%-10%CO2环境中，35°C培养18-24小时。6.2.2淋病奈瑟菌培养接种于GC琼脂平板，置于5%-10%CO2环境中，35°C培养18-24小时，观察有无较小、灰白色、露滴状菌落形成，进一步生化鉴定。6.2.3阴道加特纳菌培养接种于5%羊血琼脂平板，5%-10%CO2环境中环境培养48小时，观察有无形成针尖大小（0.3-0.5）、圆形、光滑、不透明、不溶血（在人血或兔血琼脂平板上可出现β溶血）的菌落。结核分枝杆菌培养参见《分支杆菌属检验标准操作规程》。7.结果报告报告菌名和抗菌药物药敏结果试验结果。注意事项取阴道分泌物之前避免性生活、阴道冲洗和用药。临床意义正常的内生殖道是无菌的，而外生殖器（包括男性尿道口和女性阴道）有多种细菌寄生，如尿道口的常见有葡萄球菌、类白喉棒状杆菌和非结核分枝杆菌，阴道常见有乳杆菌、双歧杆菌、消化球菌等。查见病原菌提示有细菌感染，如急、慢性前列腺炎，睾丸炎、精囊炎、附睾炎、阴道炎，急慢性淋病等。常见病原菌主要有葡萄球菌、肠球菌、链球菌、淋病奈瑟菌、大肠埃希菌、变形杆菌等。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL32:2008医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编全.国临床检验操作规程第.三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualofClinicalMicrobilogy.9thed.Washington：ASMPress，2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书粪便标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0573版本：20140601生效日期：20140615共3页1.目的规范粪便标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围粪便培养。3.标本3.1标本类型粪便、直肠拭子。3.2标本采集3.2.1自然排便采集自然排便后，挑取其脓血、黏液部分2-3g，液体粪便取絮状物2-3ml，盛于灭菌容器内，或置于保存液（运送培养基）、增菌培养基中送检。3.2.2直肠拭子如不易获得粪便时，或排便困难病人及婴儿，可用直肠拭子采取，即以无菌棉拭用保存液或生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm（幼儿约2-3cm）轻轻转动取出，插入卡-布（Cary-Blair）运送培养基内或无菌容器内送检。3.2.3粪便标本应该立即送检，室温保存不超过2小时，如不能及时送检放入磷酸盐甘油（PH7.0）或转运培养基，但不能超过24小时。培养艰难梭菌的标本保存于-20°C以下。培养沙门菌和志贺菌的标本应放置磷酸盐甘油溶液中保存。保存弯曲杆菌和弧菌的标本，需加CaCl2（100mg/L）试剂。3.3标本拒收标准3.3.1粪便标本放置时间超过2小时。3.3.2送检的粪便标本混有尿液。3.3.3直肠拭子未置于运送培养基中。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。5.细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。涂片检查粪便标本因各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。因此276 粪便标本一般不作涂片检查。只有怀疑霍乱弧菌及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查（观察动力和菌群比例）。培养6.2.1沙门-志贺菌培养参见《沙门菌属检验标准操作规程》、《志贺菌属检验标准操作规程》。6.2.2致病大肠埃希菌培养参见《致病大肠埃希菌检验标准操作规程》。6.2.3霍乱弧菌培养参见《霍乱弧菌检验标准操作规程》。6.2.4副溶血弧菌培养参见《副溶血弧菌检验标准操作规程》。6.2.5小肠结肠炎耶尔森菌培养参见《小肠结肠炎耶尔森菌检验标准操作规程》。6.2.6空肠弯曲菌培养《空肠弯曲菌检验标准操作规程》。6.2.7金黄色葡萄球菌培养《金黄色葡萄球菌检验标准操作规程》。6.2.8艰难梭菌培养取水样或黏液样粪便立即接种于环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（简称CCFA）平板上，并将粪便作102-106稀释后定量接种。35°C厌氧环境下培养48小时后，选择粗糙型黄色菌落，移种于葡萄糖苞肉培养基作毒素测定；同时涂片，悬滴检查动力、革兰染色及生化鉴定。6.2.9真菌培养参见《结核分枝杆菌检验标准操作规程》。6.2.10气单胞菌和邻单胞菌的培养参见《气单胞菌检验标准操作规程》和《邻单胞菌检验标准操作规程》。6.2.11结核分枝杆菌参见《结核分枝杆菌检验标准操作规程》。7.结果报告8.注意事项查出肠道致病菌，报告其菌名和药敏结果。8.1空肠弯曲菌是微需氧菌，初次分离时需5%-10%CO2和85氮。8.2痢疾病人要采集大量脓血标本另行培养。8.3粪便标本有很多杂菌，但不能由此认为粪便标本的采集就无需注意杂菌污染，为防止污染必须注意标本的采集方法。9.临床意义正常情况下肠道中多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌、肠球菌、大肠埃希菌、肠杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌等。引起感染性腹泻的病原微生物有：（1）细菌性：产毒素型腹泻，包括霍乱孤菌、肠毒型大肠埃希菌等；侵袭型腹泻，包括志贺菌、肠致病型大肠埃希菌和肠侵袭性大肠埃希菌等；食物中毒，包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌和肉毒梭菌等；伪膜性型肠炎，包括艰难梭菌或金黄色葡萄球菌；慢性腹泻，可能由结核分枝杆菌引起。（2）真菌性：念珠菌、毛霉菌等。（3）病毒性：轮状病毒等。危急值报告培养出霍乱弧菌、伤寒沙门菌、致病性大肠埃希菌O157等及时按传染病报告，同时送CDC复核。276 参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL32:2008医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编全.国临床检验操作规程第.三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualofClinicalMicrobilogy.9thed.Washington：ASMPress，2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书脓液伤口标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0574版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范脓及伤口标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围脓液培养或涂片检查。3.标本3.1标本类型脓液。3.2标本采集3.2.1开放性脓性和脓性分泌物用无菌盐水或75%酒精擦去表面渗出物，用拭子深入溃疡处采集2支拭子，1支为涂片检查用，1支作培养用。3.2.2大面积烧伤的创面分泌物用灭菌棉拭取多部位创面的脓液或分泌物，置灭菌试管内（注明采集部位）送检。3.2.3封闭性脓肿消毒局部皮肤或粘膜表面后，用注射器抽取，将脓液注入多功能培养瓶或无菌试管内送检。疑为厌氧菌感染时，应作床边接种或置厌氧运送培养基内送检。3.3标本拒收标准3.3.1标本标识与化验申请单不符。3.3.2标本不是无菌留取。3.3.3送标本的时间在采集标本后超过2小时。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。5.细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。6.1涂片检查革兰染色镜检，报告“查见革兰×性菌，形似××菌”或报告“未查见细菌”。6.2培养6.2.1一般细菌培养标本接种于接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置于5%-10%CO2环境中，35°C培养18-24276 小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断，作出初步判断，再按各类细菌的生物学特性进行鉴定。6.2.2厌氧菌培养取脓液标本接种于厌氧血琼脂平板及其他选择平板，置于厌氧菌环境培养，根据生长情况及涂片染色结果，按厌氧菌生物学特性进行鉴定。6.2.3嗜血杆菌及奈瑟菌培养接种于巧克力琼脂平板，置5%-10%CO2环境中培养。6.2.4结核分枝杆菌培养参见《结核分枝杆菌检验标准操作规程》。6.2.5真菌培养可用沙氏培养基。7.结果报告查见致病菌，报告菌名和药敏结果。8.注意事项8.1对于某些特殊病人（如气性坏疽病人），在菌种鉴定及药敏试验结果尚未报出之前，根据涂片镜检情况，采取治疗措施。8.2厌氧菌培养取得样本后，拭子应立即置于厌氧运送管，尽可能少让样本暴露于空气中。穿刺时最好以针筒直接抽取，避免接触环境中氧气。9.临床意义从脓液及创伤标本中能检出的病原菌微生物种类很多，最常见的由葡萄球菌和链球菌引起的局部化脓性感染，包括有毛囊炎、疖、痈、甲沟炎、扁桃体炎、乳腺炎、中耳炎、外耳道疖肿、外耳道炎、细菌性结膜炎、脓疱疮、外科切口及创伤感染等。化脓性骨髓炎、化脓性关节炎的主要致病菌是金黄色葡萄菌。慢性骨髓炎和慢性化脓性关节炎病原菌中，除上述细菌外，主要为结核分枝杆菌。脓液标本中可检出铜绿假单胞菌、变形杆菌和类白喉棒状杆菌等，常为继发感染或污染所致。气性坏疽主要致病菌为产气荚膜梭菌，其次为水肿梭菌、败毒梭菌和溶组织梭菌等。坏疽常继发葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌或其他需氧菌感染。器官脓肿和机体深部组织的脓肿多为厌氧菌感染。危急值报告培养出产气荚膜梭菌及时按传染病报告。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL32:2008医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编全.国临床检验操作规程第.三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualofClinicalMicrobilogy.9thed.Washington：ASMPress，2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书中心静脉导管标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0575版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范中心静脉导管标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围中心静脉导管细菌培养。3.标本中心静脉导管标本。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。4.2VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。5.细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6.检验步骤用无菌镊子将5cm导管（近心端）在血琼脂平板和麦康凯平板上交叉滚动四次，然后弃之，在35°C，5%-10%CO2孵育箱培养18-24小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断，再按各类细菌的生物学特性进行鉴定。7.结果报告7.1若48小时无细菌生长，报告“培养2日无细菌生长”。7.2报告菌名和抗菌药物药敏试验结果。8.注意事项8.1如血琼脂平板上生长≥15个菌落，提示有潜在导管相关性感染，应进行细菌鉴定和药敏试验，同时建议抽血作血培养。8.2若为2种细菌生长，且菌落计数均≥15个菌落/平板，均应进行细菌鉴定和药敏，建议作血培养确证。9临床意义判断中心静脉导管是否有细菌生长，指导临床医师是否拔除导管还是保留导管。参考文献[1]吴爱武主编.床微生物学与检验实验指导.第三版.北京：人民卫士出版社，2007[2]中华医学重症医学专业委员会.血管内导管相关感染的预防与治疗指南（2007）.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书真菌标本检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0576版本：20140601生效日期：20140615共3页1.目的规范真菌标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围各类真菌检测的标本。3.标本采集及处理3.1标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。3.2标本采集与处理3.2.1痰液、气管穿刺抽取的痰液。3.2.2尿液早晨中段尿10ml，离心取沉淀液1ml，作真菌涂片及培养。3.2.3口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠粘膜的标本应迅速放入内装1-2ml无菌蒸馏水的试管送检。常规KOH涂片及SDA培养。3.2.4粪便无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。3.2.5脓液脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。3.2.6脑脊液采集于无菌试管3-5ml，立刻送检。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养（SDA）25°C及37°一周。3.2.7血液分别于左右两侧无菌抽血3-5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。3.2.8体液支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检(注意颗粒)及培养。3.2.9组织标本置于无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或切成1-2mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。3.2.10皮屑皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。取材前75%酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。3.2.11甲屑用细锉或牙签研磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25°C-28°C培养3周，并同时作KOH涂片。3.2.12毛发取病发15根、75%酒精消毒，3-5根作直接镜检，5-10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。3.3标本拒收标准及处理参见《标本拒收程序》4.试剂、培养基及仪器4.1接种针、电热灼烧器、显微镜、恒温培养箱、冰箱、全排式生物安全柜等。4.2常用培养基及血培养瓶放置于2-8°C冰箱，并在有效期内使用。276 4.3沙氏葡萄糖琼脂（SDA），科玛嘉念珠菌显色培养基米粉吐温琼脂，察氏琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂，七叶苷琼脂，咖啡酸琼脂，API20CAUX板条，10%KOH，正常人或羊血清。5.真菌鉴定的质控（略）6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。6.1涂片检查标本置于载玻片后加1滴10%KOH，覆上盖玻片，微加热后轻压盖玻片，驱逐气泡并压匀标本，再以滤纸条吸去周围溢液。先在低倍镜下寻找(遮去强光源)，发现真菌的菌丝或孢子后经高倍证实，报告“真菌直接镜检阳性”。6.2培养6.2.1粪、痰标本可用无菌棉签或接种针挑取带血、黏液的病理部分，接种于含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂及科玛嘉念珠菌显色培养基，置于37°C培养48小时。6.2.2支气管保护性毛刷标本悬液、肺泡灌洗液、体液及尿等液体标本，可以无菌吸管吸取离心沉淀物约0.5ml，接种于上述培养基，37°C孵育48小时后如未见菌落生长，可报告“无真菌生长”。6.2.3脑脊液取离心沉淀物约0.5ml接种于2管沙氏葡萄糖琼脂斜面，分别置25°C及37°C孵育一周。6.2.4血分别左右两侧无菌抽血3～5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。6.2.5皮屑、毛发接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面，置25°C～38°C培养2周。6.2.6甲屑以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的沙氏平皿25°C～28°C培养3周。7.结果报告所有的标本如分离出真菌，应尽可能鉴定至种，报告“ΧΧ菌生长”，尤其对于念珠菌中克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，光滑念珠菌对唑类药物也逐渐表现出不敏感倾向。8.注意事项真菌血培养每天检查完毕后需摇动培养基，37°C振荡培养可加速真菌的生长，提高检出率；不作直接镜检，因其直接镜检阳性率低。9.临床意义真菌根据感染部位不同分为浅部真菌和深部真菌两大类，前者主要累及皮肤、毛发及甲板，后者感染皮下组织及内脏器官。准确鉴定至种的水平可以为临床诊断及治疗提供重要依据，特别四部分种对抗真菌药物的敏感性存在差异。制定真菌鉴定规范的操作程序是保证结果的准确性与可靠性的基础。危急值报告血培养阳性涂片确定真菌及脑脊液墨汁涂片发现新型隐球菌后，应及时向临床报告。安全防护措施12.1操作人员在工作过程中要穿隔离衣、戴口罩和手套。12.2所有报告结果后的标本及污染物，必须经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。276 12.3若送检途中培养瓶不慎打破，应封锁现场，进行消毒处理。11.4标本运送应采用密封容器。参考文献[1]孙鹤龄主编.医学真菌鉴定初稿.北京:科学出版社,1987[2]吴绍熙主编.现代医学真菌检验手册.第二版.北京:中国协和医科大学出版社,2005[3]上海第一医院华山医院皮肤科真菌室.临床真菌检验.上海:上海第一医院出版社.1975[4]王家俊主编,临床真菌检验,上海:上海医科大学出版社,1995[5]秦启贤主编.临床真菌学.上海:上海医科大学出版社,2001[6]王端礼主编,医学真菌学—实验室检验指南，北京：人民卫生出版社，2004[7]GlennSBulmer，郑岳臣主编，汉英对照医学真菌学，上海：上海科学技术出版社，2005编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0577版本：20140601生效日期：20140615共3页1.目的规范血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。2.适用范围血液及骨髓。3.标本3.1标本类型血液及骨髓。3.2标本采集3.2.1采血时间抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。3.2.2采血频率对怀疑菌血症的成年病人，推荐同时在不同部位采集2-3套（每套包括一瓶需氧瓶，一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶），对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采血；婴幼儿病人，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。3.2.3采血量以培养基的1/10为宜，成人一次采血5-10ml，婴幼儿为1-2ml。3.2.4骨髓标本用骨髓穿刺针从髂骨采集。3.3标本拒收标准3.3.1血培养瓶破裂或有明显污染。3.3.2血培养瓶标识与化验申请单不符。3.3.3用过期的培养瓶采集标本、采血量不足等。3.3.4对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。3.3.5标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放入冰箱。冬季血培养瓶在送检过程应采取一定的保暖措施。4.试剂、仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦糠凯平板、相关生化试剂等。4.2BACT/ALERT3D或BACTEC9000全自动血培养系统、鉴定系统。成人需氧培养瓶、厌氧培养瓶、儿童培养瓶、革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GBS）、真菌鉴定卡（TBC）、药敏纸片、TTB板条等。4.3接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、co2培养箱等。4.4试剂的有效期和使用参照试剂说明书。5.细菌鉴定和药敏质控。参见《质量管理程序》6.检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要同时登记住址，联系电话等病人信息。276 6.1自动化培养将血培养瓶置全自动血培养仪中。当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射器抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医师报告，同时转种血琼脂平板，麦糠凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35°C、5%CO2培养箱培养18-24小时。从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用GPI及GNI上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K-B法药敏试验（具体操作见《药物敏感性标准操作规程》）6.2手工培养6.2.1将血培养置35°孵育箱，经18-20小时孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种一次。6.2.2盲目转种后，培养瓶继续孵育至第五日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，下列几种情况提示有细菌生长。根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片做革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂平板、麦糠凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35°C、CO2培养箱培养18-24小时。次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。6.3特殊培养6.3.1布鲁菌属通常将血液接种到双相血培养瓶内，培养环境应为5%-10%CO2，35°C，每48小时观察有无细菌生长，若无细菌生长应继续培养，阴性应培养至30日后才可发出报告。6.3.2乏氧菌该细菌生长需要硫醇复合物和维生素B6。在血培养基中需加盐酸-磷酸吡躲醛（0.001%）或L-半胱氨酸（0.05%-0.1%）或者皆有，否则乏氧菌不能生长。血培养物转种血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄菌，靠近金黄色葡萄菌有乏氧菌生长。6.3.3细菌L型在培养基中含有10%蔗糖或甘露醇时，才适合L型细菌生长。6.3.4心内膜炎特殊致病菌如果常规血培养72小时阴性而病人临床症状仍提示感染性心内膜炎，应提高培养基的营养或补加添加剂。有利于分离培养要求苛刻、生长缓慢的革兰阴性杆菌，如人心杆菌、侵蚀艾肯菌、金氏金氏菌、伴放线放线杆菌、军团菌等细菌，应延长培养至2-4周，然后转种特殊的培养基。6.3.5结核分枝杆菌培养参见《分支杆菌属检验标准操作规程》7.结果报告7.1阳性结果报告报告通常分为三级。7.1.1一级报告阳性报警的血培养瓶应进行涂片革兰染色，将涂片结果电话（或其他方式）通知临床，同时记录报告的日期、时间、内容以及接收报告人的姓名。血培养阳性应列为危急值。7.1.2二级报告报告直接药敏试验结果直接药敏试验，将血培养阳性标本进行革兰染色，如涂片找到细菌，根据革兰染色结果选择药敏所有培养基（Muller-Hinton培养基或5%羊血Muller-Hinton琼脂平板），取阳性肉汤标本约0.2ml，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面，根据革兰染色结果选择所用抗菌药物的纸片，如镜检见革兰阴性杆菌，选用肠杆菌科常用的抗菌药物纸片；若为革兰阳性球菌，成对排列，选择葡萄球菌常用的抗菌药物纸片。然后置于35°C，孵育6-7小时读取初步药敏结果。次日纯培养再进行菌株鉴定和药敏试验，发出最终报告。276 最终结果如与初步报告不符，应及时与临床沟通，并在书面最终报告注明变更内容。7.1.3三级报告报告细菌种属、药敏试验、结果评价和建议。7.2阴性结果报告血培养72小时未见细菌生长，应通知临床医师，以便作相应处理，但培养瓶要继续培养至第五日，方可发出阴性报告。如发现有菌生长，可补发报告。7.3对发出报告进行销号，并做好菌名或无菌及报告日期登记。7.4传染病（伤寒沙门菌）报告医务部门和（或）防保科。7.5菌种保存（伤寒沙门菌），交疾控中心复核。8.注意事项8.1抽血后无需更换针头即可注入血培养瓶中。8.2抽血前即应贴好标签，标签不能贴到条形码。8.3若不能立即送至实验室，应置于35°C温箱或室温，决不可放置于冰箱。8.4有自动血培养仪的实验室，应建立24小时值班制，可及时处理阳性报警标本。8.5如不同部位采集的两瓶血培养瓶出现一瓶阳性一瓶阴性，或者出现两瓶均为阳性，检测结果均为凝固酶阴性葡萄球菌，这两种情况都应该向临床报告和沟通。9.临床意义引起败血症的耐药性金黄色葡萄菌、某些革兰阴性杆菌及部分球菌；疖、痈、脓肿和化脓性骨髓炎继发的败血症主要由金黄色葡萄菌和β溶血性链球菌引起；尿道、胆道、胃肠道炎症和粘膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌最多见；烧伤后铜绿假单胞菌和金黄色葡萄菌多见。伤寒和副伤寒于病程第1-2周做血培养，伤寒和副伤寒菌的检出率可达80%-90%。10.危急值报告仪器报警阳性标本直接涂片、革兰染色，确定细菌种类，应立即向临床报告细菌涂片结果。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL32:2008医学实验室质量和能力认可准则在微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编全.国临床检验操作规程第.三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualofClinicalMicrobilogy.9thed.Washington：ASMPress，2007[5]徐英春，倪语星，王金良主编.血培养操作规范.上海：上海科学技术出版社，2002编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书不动杆菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0578版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述不动杆菌属包括鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌和溶血不动杆菌等7个种19个基因型。临床最常见的是鲍曼不动杆菌。2.标本类型血液、痰、脑脊液、尿液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性球杆菌，单个或成双排列，有时呈丝状或链状。3.2培养特性在麦康凯琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成粉红色菌落，48小时后菌落呈深红色，部分菌株呈粘液型菌落。洛菲不动杆菌在麦康凯琼脂平板上形成圆形、光滑的无色菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性，葡萄糖O/F为+/-，硝酸盐还原试验阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征氧化酶试验阴性，葡萄糖O/F为+/-，硝酸盐还原试验阴性。3.4.2鲍曼不动杆菌与洛菲不动杆菌的鉴别鲍曼不动杆菌葡萄糖O/F为氧化型，41℃时不生长。3.4.3鲍曼不动杆菌与大肠埃希菌和弗劳地枸橼酸杆菌的鉴别三者在麦康凯琼脂平板上的菌落形态相似，但可通过气味初步辨别。鲍曼不动杆菌无气味，大肠埃希菌有吲哚味，弗劳地枸橼酸杆菌有酸牛奶味。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》。3.5.2鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取有光泽的菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析鲍曼不动杆菌已发现了多重耐药菌株，耐亚胺培南不动杆菌在中国台湾地区达25%，在澳大利亚和中国大陆地区达20%左右，所以每个分离菌株都应进行药敏试验。若鲍曼不动杆菌对四环素敏感，则对多西环素（doxycycline）和米诺环素敏感。有些鲍曼不动杆菌对四环素中介或耐药，而对多西环素和米诺环素敏感。7.临床意义鲍曼不动杆菌分布于自然界和医院环境中，是人类皮肤、呼吸道、胃肠道、生殖道的正常菌群，也是一种条件致病菌，可引起各种感染和医院感染。在不动杆菌属中感染率最高的是鲍曼不动杆菌，可引起腹膜炎、脑膜炎、骨髓炎、关节炎、菌血症和肺炎等。276 8.鉴定流程血液、尿液、痰等麦康凯琼脂平板粉红色菌落、血琼脂平板灰白色菌落氧化酶试验阴性仪器鉴定或手工鉴定并做药敏试验不动杆菌属参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书色杆菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0579版本：20140601生效日期：20140615共2页1．概述紫色杆菌是色杆菌属内唯一的种。2．标本类型血液、痰、脑脊液、尿液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌，具有极端鞭毛和周鞭毛。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成紫黑色菌落。麦康凯琼脂平板上呈紫色菌落。在营养琼脂平板上菌落呈紫色。大约91%的菌株产生紫色色素。3.3生化反应氧化酶试验不定，发酵葡萄糖，不发酵乳糖和麦芽糖，硝酸盐还原试验和动力试验均为阳性，赖氨酸脱羧酶和七叶甘试验均为阴性。产色素的菌株通常吲哚试验阴性，不产色素的菌株吲哚试验阳性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征革兰阴性杆菌，在营养琼脂平板上菌落产生紫色色素，发酵葡萄糖。3.4.2不产色素的紫色杆菌与气单胞菌的鉴别两者易混淆，但不产色素的紫色杆菌赖氨酸脱羧酶为阴性，不分解麦芽糖和甘露醇，而气单胞菌则相反。3.4.3脑膜炎脓毒金黄杆菌与产吲哚金黄杆菌和吲哚金黄杆菌的鉴别脑膜炎脓毒金黄杆菌分解甘露醇，DNA酶试验阳性，不水解淀粉，而后两者则相反。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》。3.5.2鉴定从血平板上挑取有光泽的菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析该菌对氨基糖类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类有天然耐药性，但对利福平、红霉素、克林霉素及复方磺胺敏感。7.临床意义紫色杆菌在水域与土壤中存在，人类很少感染，感染一般是接触水和土壤引起的。可引起局部伤口感染或脓毒症导致的多器官脓肿、腹泻及泌尿道感染等疾病。276 8.鉴定流程血液、尿液、痰等麦康凯琼脂平板紫色菌落、血琼脂平板黑色菌落氧化酶试验阳性仪器鉴定或手工鉴定并做药敏试验紫色杆菌参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书金黄杆菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0580版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述金黄杆菌属包括脑膜脓毒金黄杆菌。产吲哚金黄杆菌等6个种。临床上最常见的是脑膜脓毒金黄杆菌，又称脑膜败血金黄杆菌。2.标本类型血液、痰、脑脊液、尿液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成黑色菌落。麦康凯琼脂平板上生长或生长不佳。在营养琼脂平板上不生长，形成亮黄色菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖和甘露醇，不分解蔗糖和木糖；葡萄糖O/F为氧化型；七叶甘、吲哚和明胶液化均为阳性；动力、枸橼酸盐和硝酸盐还原试验阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征菌落黄色，氧化酶试验阳性，葡萄糖O/F为氧化型，吲哚试验阳性，动力、枸橼酸盐和硝酸盐还原试验阴性。3.4.2脑膜炎脓毒金黄杆菌与阪畦肠杆菌、成团泛菌的鉴别脑膜炎脓毒金黄杆菌氧化酶试验阳性，后两者均为阴性。3.4.3脑膜炎脓毒金黄杆菌与产吲哚金黄杆菌和吲哚金黄杆菌的鉴别脑膜炎脓毒金黄杆菌分解甘露醇，DNA酶试验阳性，不水解淀粉，而后两者则相反。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》。3.5.2鉴定从血平板上挑取有光泽的菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析该菌对氨基糖类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类有天然耐药性，但对利福平、红霉素、克林霉素及复方磺胺敏感。7.临床意义脑膜炎脓毒金黄杆菌广泛存在于土壤和水中，是一种条件致病菌，也是医院感染常见菌之一，可引起术后感染和菌血症，也可致新生儿脑膜炎。276 8.鉴定流程血液、尿液、痰等血琼脂平板菌落呈黄色氧化酶试验阳性药敏试验、生化试验金黄杆菌属参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书莫拉菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0581版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述莫拉菌属有2个亚属，即莫拉亚菌属和布兰汉亚属。莫拉菌属包括奥斯陆莫拉菌、腔隙莫拉菌等7个种。2.标本类型血液、痰、脑脊液、尿液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性球杆菌，多数成对或短链排列。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成灰白色菌落。少数菌株在麦康凯琼脂平板上生长或生长不佳。3.3生化反应氧化酶试验阳性，不分解任何糖类，触酶试验阳性，动力、吲哚、甲基红、VP、明胶试验为阴性，DNA酶试验不定。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征氧化酶试验阳性，不分解任何糖类，触酶试验阳性，动力试验阴性。3.4.2莫拉菌属与不动杆菌属的鉴别前者氧化酶试验阳性，后者氧化酶试验阴性。3.4.3莫拉菌属的种间鉴别见表莫拉菌属鉴别的关键性试验（阳性%）菌名X因子V因子溶血葡萄糖蔗糖甘露糖木糖触酶硫化氢流感嗜血杆菌++-+--++-埃及嗜血杆菌++-+---+-溶血嗜血杆菌++++--+++杜克嗜血杆菌+--------副流感嗜血杆菌-+-+++-V+副溶血嗜血杆菌-+++---++惰性嗜血杆菌-+-W---V-副嗜沫嗜血杆菌-+-++VV-+嗜沫嗜血杆菌W--++---+注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11-89%菌株阳性，“W”为弱发酵反应。3.5操作步骤3.5.1涂片、革兰染色呈革兰阴性短小杆菌。3.5.2鉴定从巧克力琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。276 4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析大多数菌株对青霉素、四环素、喹喏酮和氨基糖苷类敏感。7.临床意义莫拉均属是人和动物粘膜上的正常菌群，但可引起社区和医院感染。本菌是呼吸道感染的主要致病菌，可引起外伤感染、肺炎、菌血症和其他感染。8.鉴定流程血液、尿液、痰等血琼脂平板灰白色菌落、不溶血氧化酶试验阴性仪器鉴定或手工鉴定并做药敏试验报告结果参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书嗜血杆菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0582版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述嗜血杆菌属包括流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、杜克嗜血杆菌等9个种。临床上以流感嗜血杆菌最为常见。2.标本类型血液、痰、脑脊液标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性短杆菌。3.2培养特性在巧克力琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成微小、无色透明似露滴状的菌落。在血琼脂平板上形成极小、圆形、透明的菌落，并有“卫星现象”。3.3生化反应分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖，吲哚、触酶和硝酸盐还原试验均为阳性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征革兰阴性细小杆菌，多形性，菌落为无色透明似露滴状，卫星现象阳性，生长需要X、V两种因子，普通培养基不生长。3.4.2流感嗜血杆菌的种间鉴别见表嗜血杆菌鉴别的关键性试验菌名X因子V因子溶血葡萄糖蔗糖甘露糖木糖触酶硫化氢流感嗜血杆菌++-+--++-埃及嗜血杆菌++-+---+-溶血嗜血杆菌++++--+++杜克嗜血杆菌+--------副流感嗜血杆菌-+-+++-V+副溶血嗜血杆菌-+++---++惰性嗜血杆菌-+-W---V-副嗜沫嗜血杆菌-+-++VV-+嗜沫嗜血杆菌W--++---+注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11-89%菌株阳性，“W”为弱发酵反应。3.5操作步骤3.5.1涂片、革兰染色呈革兰阴性短小杆菌。3.5.2鉴定从巧克力琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏276 参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析如果检出β-内酰胺酶阳性流感嗜血杆菌则提示对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药（耐药机制大多为TEM型β-内酰胺酶）。如果流感嗜血杆菌β-内酰胺酶阴性，而对氨苄西林耐药，则对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢他啶、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛均耐药。7.临床意义流感嗜血杆菌常寄居于正常人呼吸道（在呼吸道定植者可达到人群的50%），当机体抵抗力下降时，可引起人类呼吸道感染；也也可随血液入侵组织内部，引起脑膜炎、关节脓肿或其他部位的化脓感染。副流感嗜血杆菌寄居在人类的上呼吸道，可引起呼吸道感染，偶尔引起心内膜炎等。8.鉴定流程血液、脑脊液巧克力、血琼脂平板挑取可疑菌落涂片、吲哚试验可疑菌落有“卫星现象”药敏试验、生化试验嗜血杆菌属痰、脓液增菌参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书布鲁菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0583版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述布鲁菌属中与人有关的有马耳他布鲁菌（又称山羊布鲁菌）、流产布鲁菌（又称牛布鲁菌）、猪布鲁菌、狗布鲁菌。2.标本类型血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌或短杆菌。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃,5-10%CO2环境中培养2-3日，出现菌落。4-5日形成无色、不溶血的光滑型菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性，分解葡萄糖，不分解L-阿拉伯糖和半乳糖，触酶试验阳性，动力、硫化氢（H2S）和精氨酸双水解试验均为阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征革兰阴性细小杆菌或球杆菌饿，需特殊营养，生长缓慢，氧化酶、触酶试验阳性，动力、H2S试验阴性。3.4.2马耳他布鲁菌与流产布鲁菌的鉴别马耳他布鲁菌不分解L-阿拉伯糖，H2S试验阴性；流产布鲁菌则相反。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》。3.5.2鉴定挑取可疑菌落，血清凝集试验，生化鉴定包括H2S试验，需要CO2等。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析布鲁菌病表现多样，多为慢性感染且并发症较多，故治疗手段不一，有时临床疗效与体外抗菌试验的结果不一致，一般需联合用药物进行长期治疗。由于布鲁菌系细胞内致病菌，故需用细胞穿透力较强的药物。先推荐用口服多西环素与利福平（至少6周）。7.临床意义布鲁菌是一类人畜共患的感染性疾病的病原菌，牧区人群因接触患病的家畜或食用病畜肉、乳及乳制品而感染，临床表现为反复发热、关节痛、全身乏力，称为布鲁菌病。布鲁菌通过空气传播比接触传播更为重要。276 8.鉴定流程血液、尿液、痰等血琼脂平板挑取可疑菌落涂片氧化酶试验阳性，移种斜面培养基生化鉴定（H2S+）初步报告最终报告单因子血清凝集试验参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书军团菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0584版本：20120401生效日期：20120401共2页1.概述军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。2.标本类型痰等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。3.2培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。3.3生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。普通琼脂平板上不生长。3.4.2根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。3.5操作步骤3.5.1涂片、染色革兰阴性杆菌。3.5.2鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。军团菌对多种抗菌药物敏感，包括红霉素、利福平、氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺抗生素、复方磺胺甲恶唑、多西环素和福喹诺酮类等。276 7.临床意义军团菌是一种以肺部感染为主的全身性疾病，嗜肺军团菌是军团菌病的病原菌，可通过空气传播进入肺脏，临床表现多种多样。易于侵犯患有慢性器质性疾病、免疫功能低下的病人。也可从河水、空调的冷却水、浴室和雾化器等处分离到，为医院感染的主要致病菌之一。8.鉴定流程痰BCYEα琼脂平板3~5日有灰白色有光泽菌落荧光抗体染色，生化鉴定军团菌属涂片染色G-杆菌参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书弯曲菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0585版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述弯曲菌属是一类氧化酶阳性、有动力、微需氧、菌体弯曲的革兰阴性细菌，与人有关的包括空肠弯曲菌、空肠弯曲菌德莱亚种、唾液弯曲菌唾液亚种等21个种和亚种。2.标本类型粪便、肛拭子等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性，菌体细长，弯曲呈弧形。3.2培养特性粪便标本应选用CCDA活性炭无血液培养基(CSM)或Campy-CVA等选择培养基。在弯曲菌CCDA平板上微需氧（5%CO2）培养48小时后，可形成半透明、边缘整齐的菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性，不分解糖类，H2S（醋酸铅）、马尿酸钠、触媒和硝酸盐还原试验均为阳性，脲酶试验阴性，42℃生长，对啶萘酸敏感，对头孢噻吩耐药。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征革兰阴性弯曲菌，微需氧，氧化酶、触酶试验阳性，不分解糖类，42℃时生长。3.4.2空肠弯曲菌与胎儿弯曲菌的鉴别空肠弯曲菌马尿酸钠试验阳性，25℃时不生长；而胎儿弯曲菌则相反。3.4.3空肠弯曲菌与幽门螺杆菌的鉴别空肠弯曲菌脲酶试验阴性，42℃时生长；而幽门螺杆菌脲酶试验强阳性，42℃时不生长。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》。3.5.2鉴定从CCDA平板上挑取可疑菌落，用仪器鉴定或手工生化（触酶、H2S、马尿酸钠、奈啶酸敏感试验）进行菌落鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制见《质量管理程序》。6.检验结果解释与分析本菌感染轻症病人，一般不需治疗。体外药敏显示对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、红霉素、四环素、氯霉素、林可霉素、呋喃妥因和亚胺培南均敏感，对青霉素、万古霉素、利福平、甲氧苄啶等耐药。7.临床意义弯曲菌属可引起肠外感染和慢性持续性感染。空肠弯曲菌是引起散发性细菌性肠炎最常见的菌种之一，引起婴幼儿和成人腹泻。临床表现为水样便，每日3~20276 次，以后转为黏液脓血便。胎儿弯曲菌则主要引起肠外感染，如菌血症、关节炎、脑膜炎、肺部感染等。8.鉴定流程菌落观察：CCDA上呈微凸、半透明、边缘整齐的菌落涂片染色：G-，菌体细长，弯曲呈弧形氧化酶+脲酶幽门螺杆菌+25℃生长-胎儿弯曲菌+马尿酸钠-空肠弯曲菌大肠弯曲菌参考文献[1]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解，第二版，上海：上海科学技术出版社，2007[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编，全国临床检验操作规程，第三版，南京：东南大学出版社，2006[3]中国合格评定国家认可委员会，CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书葡萄球菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0586版本：20140601生效日期：20140615共3页1.概述葡萄球菌是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌、施氏葡萄球菌、路邓葡萄球菌等32个种，金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。2.标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。3.2培养特性：金黄色葡萄球在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的透明（β）溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色；在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌等在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。3.3生化反应：触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖、水杨苷，液化明胶，血浆凝固酶和DNA酶试验阳性。3.4鉴别要点：3.4.1本菌的特征：在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，革兰阳性球菌，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵甘露醇。3.4.2与微球菌属的鉴别：葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小；而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。3.4.3与链球菌属的鉴别：葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，触酶试验阳性；链球菌属葡萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。3.4.4凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别：见下表。表5-30凝固酶试验阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验菌名凝固酶触酶溶血硝酸盐海藻糖半乳糖苷酶金黄色葡萄球菌金黄色亚种+++++-金黄色葡萄球菌厌氧亚种+-+---中间型葡萄球菌++d+++施氏葡萄球菌聚集亚种++++-ND海豚葡萄球菌++++-NDS.Lutrae++++++猪葡萄球菌d+-++-注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“d”为11%~89%菌株阳性，“ND”为无资料。4.4.5凝固酶试验阴性葡萄球菌的鉴别：见下表。276 表5-31常见的凝固酶试验阴性葡萄球菌的生物学特性菌名吡咯烷酮芳基酰胺酶（PYR）凝固因子脲酶甘露醇蔗糖新生霉素耐药（5ug纸片）多粘菌素B耐药（300U纸片）表皮葡萄球菌--+-+-+腐生葡萄球菌+-+v++-溶血葡萄球菌+--V+--人型葡萄球菌--+-+--华纳葡萄球菌--+V+--解糖葡萄球菌--ND----孔氏葡萄球菌--V+-+-模仿葡萄球菌+-+++--头状葡萄球菌--V++--木糖葡萄球菌v-++++-耳葡萄球菌v------施氏葡萄球菌++-----路邓葡萄球菌+vV-+-V注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“d”为11%~89%菌株阳性，“ND”为无资料。3.操作步骤3.5.1涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。3.5.2触酶试验参见触酶试验试验标准操作规程。3.5.3凝固酶试验参见触酶试验试验标准操作规程。3.5.4鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应管进行细菌鉴定.。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版文件。5.质量管理参见质量管理程序。6检验结果解释与分析6.1由于葡萄球菌分布广泛，从临床标本中分离到金黄色葡萄球菌时，将其定为致病菌时应慎重。应根据凝固酶实验进一步确认。对可疑菌株的鉴定，最好利用商品化的鉴定系统根据生化图谱进行确认。表皮葡萄球菌分离自导管相关血流感染时，通常视为致病菌。溶血葡萄球菌从尿道感染病人分离得到时，尤其是细菌数量较大或优势时，通常视为致病菌。6.2甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）对多种广谱强效抗菌药物呈多重耐药。如果检测出耐甲氧西林的葡球菌菌株则报告耐所有青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和B-内酰胺类/B-内酰胺类酶抑制剂类，对氨基糖苷类和大环内酯类抗生素协同耐药。若葡萄球菌对四环素敏感，则对多西环素和米诺环素敏感。某些菌对四环素中介或耐药，而对多西环素和米诺环素敏感。临床感染葡萄球菌的病人用喹诺酮类治疗3-4日后，原来敏感的葡萄球菌易产生耐药。所以对这类的葡萄球菌需反复进行药敏试验。大环内酯类耐药葡萄球菌包括固有和诱导耐药。所以临床试验须进行“D”试验以检测克林霉素诱导性耐药，根据“D”试验结果报告克林霉素诱的耐药。7.临床意义276 葡萄球菌属在自然界分布很广，存在于空气、水、尘埃及皮肤上的葡萄球菌大多数无致病性。金黄色葡萄球菌等致病葡萄球菌，主要引起局部组织化脓性感染，如疖、痈和创伤感染等；也可引起深部组织的化脓性感染，如骨髓炎、化脓性关节炎、肺炎和深部脓肿等，以及败血症、心内膜炎等全身感染。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）的治疗：轻度感染可选用SMZ-TMP和喹诺酮类，严重全身感染选用万古霉素或其他糖肽类药物。8.鉴定流程葡萄糖O/F试验氧化型，氧化酶试验+微球菌属+凝固没试验-菌落观察：金黄色、黄色和白色，溶血或不溶血涂片染色：G+球菌，单个、成双或四联排列菌落观察：圆形、黄色和白色金黄色葡萄球菌施氏葡萄球菌聚集亚种中间葡萄球菌海豚葡萄球菌猪葡萄球菌触酶试验+参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微球菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0587版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述微球菌属包括藤黄微球菌、玫瑰色微球菌、里拉微球菌、西宫微球菌、卡氏微球菌、活跃微球菌和易变微球菌等9个菌种。藤黄微球菌是微球菌属中的代表种。2.标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阳性球菌，菌体比葡萄球菌大，单个、成双、四联排列或立体包裹状不规则团块。3.2培养特性：藤黄微球菌在血琼脂平板上菌落小于葡萄球菌，呈圆形、突起、光滑、不透明、黄色菌落；在营养琼脂上菌落呈黄色。3.3生化反应：触酶、氧化酶试验阳性，胆汁七叶苷、精氨酸双水解酶、枸橼酸盐和硝酸盐还原试验均为阴性。3.4鉴别要点3.4.1革兰阳性球菌，菌体较大，菌落呈黄色，触酶试验阳性。3.4.2微球菌属各菌种间的鉴别：见表5-323.4.3与葡萄球菌的鉴别：见表5-33表5-32微球菌属各菌种的生物学特性生化反应藤黄微球菌里拉微球菌易变微球菌玫瑰色微球菌活跃微球菌卡氏微球菌西宫微球菌不动微球菌盐生微球菌色素黄乳白黄粉红红浅橙桔黄乳白无葡萄糖O/F--++-+V-+甘油-----+--+胆汁七叶苷----++---精氨酸-------+-硝酸盐--++--V--37℃中生长++++-++++65g/L氯化钠++++-+-++枸橼酸盐--+------动力----+----注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11%~89%菌株阳性。表5-33微球菌属与葡萄球菌的鉴别方法微球菌葡萄球菌葡萄糖O/F氧化发酵氧化酶试验+-杆菌肽试验+-呋喃唑酮抑制试验-+276 注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11%~89%菌株阳性。4.操作步骤4.1涂片染色观察菌落特征，在血平板上挑取可以菌落，涂片染色镜检。4.2触酶试验阳性参见触酶试验标准操作规程4.3鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌4.4药敏一般不需要做药物敏感试验。5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析微球菌属寄生于皮肤、黏膜、口咽部，在临床标本分离培养时注意与葡萄球菌相区别。7.临床意义藤黄微球菌主要存在于泥土、水等外界环境，以及人和动物皮肤表面。一般不致病，但可为条件致病菌，引起伤口等局部组织感染。也能引起严重感染，如心内膜炎等疾病。8.鉴定流程菌落观察：圆形、黄色或白色微球菌属涂片染色：G-球菌，单个、成双或四联排列葡萄糖O/F试验氧化型，氧化酶试验+参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书分枝杆菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0588版本：20140601生效日期：20140615共3页1.概述分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。2.标本类型痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。3.鉴定3.1形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.2~0.5um）×（1~5um）。革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。3.2培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固体培养基上需要培养2~6星期方可见到菌落。菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉于管底。3.3生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。3.4.2与牛分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。3.5操作步骤3.5.1中性培养基3.5.1.1标本的处理痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.体液（包括脑脊液、腹水、胸水）：无菌体液直接接种；标本量>10ml,离心3000r/min，15分钟，取沉淀物接种；污染标本，须同痰液处理方法后再接种。组织：加1gNALC至组织上溶解组织；加5ml7H9肉汤，以剪刀或研磨器将276 组织均匀研碎；取约5ml研磨液至标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.粪便：挑取约1g粪便至已标记的50ml离心试管中，；加5ml7H9肉汤，混匀；等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.3.5.1.2固体培养基接种无菌毛细管吸取消化液后标本0.1ml,滴于中性罗-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37恒温箱内培养。每一标本同时接种2支。3.5.1.3液体培养基接种标本接种前，在BBLMGIT便培养管中先加入0.5ml营养添加剂（OADC）和0.1ml杂菌抑菌剂（PANTA）。接种0.5ml标本至BBLMGIT培养管中。若一次处理标本较多，可用营养添加剂（OADC）直接溶解杂菌抑菌剂（PANTA），在BBLMGIT培养管中0.8ml混合添加剂；然后接种0.5ml标本至BBLMGIT培养管中。3.5.2酸性培养基培养在约5ml痰液中加入等量的4%nNaOH溶液，漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟。无菌吸取消化后标本0.1ml滴于酸性罗-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37恒温箱内培养。每一标本同时接种2支。3.6结果观察3.6.1固体培养基接种后3日、7日观察，此后，每周观察一次。阳性结果涂片证实随时报告。若7日内报阳，则为快速生长菌，超过7日则为缓慢生长菌。阴性结果至8周后报告，必要时可延长。3.6.2液体培养基系统每天自动记录信号的变化而测知有无分枝杆菌生长，阳性结果经涂片证实后报告。4.检验结果解释与分析4.1固体培养基报告方式菌落生长不足斜面1/4分枝杆菌培养阳性（N个细菌）。菌落生长占整个斜面1/4分枝杆菌培养阳性（1+）。菌落生长占整个斜面1/2分枝杆菌培养阳性（2+）。菌落生长占整个斜面3/4分枝杆菌培养阳性（3+）。菌落生长铺满整个斜面分枝杆菌培养阳性（4+）。培养8周仍无菌落生长分枝杆菌培养阴性4.2液体培养基报告方式42日内系统显示养阳性，涂片染色抗酸杆菌阳性分枝杆菌液体培养阳性。42日内系统显示养阳性，涂片染色为非抗酸杆菌阳性标本污染，请重送。42日内系统显示养阴性，涂片染色为无细菌生长分枝杆菌液体培养阴性。5.药敏276 6.质量控制以结核分枝杆菌H37RV为阳性质控，大肠杆菌ATCC25922为阴性质控，每次检测均进行质量控制。7.临床意义结核分枝杆菌为结核病的病原体，不产生内、外毒素，其毒性物质为索状因子硫脂。人类对其有较高的易感性，最易受损的器官是肺，绝大多数由呼吸道入侵导致感染和发病，很少经消化道和接触感染。人类初次感染以后有较高的免疫力，可阻止入侵的细菌经淋巴-血流播散，但不能预防再感染。8.安全防护8.1所有操作均在生物安全柜中进行。8.2检验人员操作时要穿隔离衣，戴口罩和手套。8.3痰盒、试管、离心后上清液、剩余或废弃物标本等污染物装入生物危险袋中，先浸泡消毒，再放入防漏容器中经高压灭菌30分钟后，才能丢弃或清洗。8.4实验结束后以75%酒精喷洒安全柜台面；必要时对地面和墙面进行消毒，每周至少一次；清洗完毕，安全柜至少工作15分钟后关机。打开安全柜及实验室紫外灯消毒2小时。培养阳性标本的保存参见菌种保存程序。参考文献[1]ISO15189；2003医学实验室---质量和能力认可准则[2]严碧涯,端沐宏瑾主编.结核病变.北京:北京出版社,2003[3]闫国蕊，苏保亮主编.结核病学实验技术.郑州：郑州大学2001[4]中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京:中国教育文化出版社,2006[5]王金良主编.分枝杆菌病诊断规范.上海:上海科学技术出版社,2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书诺卡菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0589版本：20140601生效日期：20140615共2页1概述诺卡菌属是一群需氧的、能形成气中菌丝、有孢子的革兰阳性菌。包括9个种，其中星形诺卡菌、巴西诺卡菌、皮诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌、南非诺卡菌、新星诺卡菌等6个种与人类疾病有关。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3鉴定3.1态与染色：革兰阳性，菌体为丝状，称为菌丝或菌丝体。培养早期，菌体裂解为较多的球菌或杆菌状，分枝状菌丝较小；培养后期，可见丰富菌丝体形成。在脓液、痰和脑脊液等临床标本中，为纤细的分枝状菌丝。抗酸染色弱阳性。3.2培养特性：注意寻找标本中的颗粒接种培养，在不含抗生素的沙氏培养基（SDA）或营养琼脂培养基上，22℃或35℃均可缓慢生长，需5~7天可见菌落。菌落表面有皱褶，呈颗粒状、黄色或深橙色，表面无白色菌丝。在血琼脂平板上菌落较小、凸起，呈白色，时间延长可出现橙色。3.3生化反应：分解葡萄糖，不分解甘露醇、肌醇、酪蛋白、酪氨酸和黄嘌呤，不水解淀粉，不液化明胶。3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：革兰阳性，菌体为丝状，抗酸染色弱阳性；生长缓慢，菌落较小；分解葡萄糖，不分解酪蛋白、酪氨酸和黄嘌呤。3.4.2与分枝杆菌的鉴别：星形诺卡菌革兰染色性强，抗酸染色性弱，盐酸乙醇易脱色，菌体呈丝状；分枝杆菌抗酸性强，不易脱色，革兰染色弱。3.4.3与红球菌属的鉴别：星形诺卡菌对青霉素耐药，红球菌则敏感。3.4.4与棒状杆菌的鉴别：星形诺卡菌菌体呈丝状，而棒状杆菌属菌体一端或两端膨大呈棒状。3.4.5与分枝杆菌属和放线菌属的鉴别三者镜下形态相似，但星性诺卡菌抗酸染色弱阳性，分枝杆菌属强阳性，放线菌属为阴性。3.5操作步骤3.5.1观察菌落特征，挑取可疑菌落，涂片染色镜检。3.5.2触酶试验参见触酶试验标准操作规程3.5.3鉴定从SDA平板上挑取纯菌落，用仪器法或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。276 检验结果解释与分析6.1新鲜的诺卡菌培养物经革兰氏染色为阳性的杆菌，特别是菌龄较短，尚无菌丝体出现时，启形态类似细菌，鉴定中应注意。6.2培养早期，菌体裂解为较多的球菌或杆菌状，分枝状菌丝较少；培养后期，可见丰富菌丝体形成。6.3有些病人痰培养诺卡菌阳性，但没有诺卡菌感染的症状，星形诺卡菌可能是呼吸道的正常菌群，有些患者有空洞性结核、癌、囊性纤维化、哮喘或其他潜在疾病的病人，其呼吸道可能有诺卡菌的寄生。7.临床意义星形诺卡菌可引起原发性化脓性肺部感染，可出现类似结核的症状。肺部病灶可向其他组织器官扩散，形成皮下脓肿、多发性瘘管、脑脓肿、腹膜炎等。巴西诺卡菌可引起足放线菌病，表现为足部或腿部皮下肿胀、脓肿及多发笥瘘管等。8鉴定流程G+球杆菌血琼脂平板菌落呈黄色或深橙色菌丝（培养后期）其他细菌弱阳性抗酸染色阴性诺卡菌属、链霉菌等参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书埃希菌标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0590版本：20140601生效日期：20130801共2页1.概述埃希菌属包括大肠埃希菌、蟑螂埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌和伤口埃希菌5个菌种。大肠埃希菌是埃希菌属的代表种。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阴性杆菌，粗短，大小为（1.1~1.5um）×（2~6um），多数有周鞭毛3.2培养特性：在血琼脂平板上菌落呈圆形，直径为2~3um，稍凸，边缘整齐，灰白色，不透明，少数菌株产生β溶血环；在麦康凯琼脂平板上形成不透明、红色菌落，部分不发酵乳糖的菌落呈无色菌落，不数呈粘稠状菌菌；在伊红亚甲蓝平板上菌落呈紫黑色，并有金属光泽；在中国蓝琼脂平板上菌落呈蓝色；在XLD琼脂平板上菌落呈不透明黄色；在HE琼脂平板上菌落呈黄色；在CHROMagar大肠杆菌显色培养基上呈蓝色菌落，而在CHROMagar尿道菌定位培养基上菌落呈红色。3.3生化反应：氧化酶试验阴性，三糖铁琼脂（TSI）为A/A；发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇等多种糖类，产酸产气；IMViC++--（占94.6%），动力试验和硝酸盐还原试验阳性，尿素酶试验、丙二酸盐试验、苯丙氨酸脱羧酶试验均为阴性，大部分菌株不产硫化氢。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征TSI为A/A，发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇等多种糖类，IMViC++--。3.4.2与痢疾志贺菌的鉴别：无动力而乳糖迟发酵的菌株，易与痢疾志贺菌相混淆，可通过赖氨酸脱羧酶、醋酸盐试验等和血清分型法区分。见表5-39。表5-39大肠埃希菌和志贺菌的鉴别要点（阳性%）生化反应大肠埃希菌不活泼大肠埃希菌痢疾志贺菌赖氨酸90400醋酸盐95300粘液酸盐98930甘露醇95250乳糖95503.4.3与肺炎克雷伯菌的鉴别：少数粘液样菌落的大肠埃希菌在麦康凯琼脂平板上易与肺炎克雷伯菌菌落相混淆，大肠埃希菌粘液样菌落呈深粉红色，而肺炎克雷伯菌则呈浅粉红色，无动力，IMViC--++。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。276 4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析产生超广谱B-内酰胺酶(ESBLs)是大肠埃希菌最主要的耐药机制之一。ESBLs大部分由质粒介导，经典的为TEM型及SHV型广谱酶衍生的超广谱B-内酰胺酶，还包括PER型及CTX型酶等，中国ESBLs基因型的CTX-M型为主。如果检出产ESBLs大肠埃希菌，即使体外药敏试验对青霉素类、头孢菌素类或氨曲南敏感，也应报告对其耐药。对重症感染者首先碳青酶烯类抗生素进行治疗。7.临床意义大肠埃希菌寄居在人和动物的肠道，是肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症和继发感染，如胆囊炎、肾盂肾炎、膀胱炎、腹膜炎、败血症等疾病。8.鉴定流程血液、尿液、痰液等氧化酶-鉴定并做药敏试验埃希菌属麦康凯琼脂平板呈粉红色菌落参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书致病性大肠埃希菌标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0591版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。2.标本类型粪便标本。3.鉴定3.1形态染色与一般大肠埃希菌相同。3.2培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。3.3生化反应与普通大肠埃希菌相似。3.4鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。IMViC++--，3.5不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。3.6操作步骤3.6.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.6.2致病型大肠埃希菌的鉴定肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA探针）检测。肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。肠出血型大肠埃希菌(EHEC)早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。7.临床意义276 7.1EHEC主要引起严重的出血性肠炎，临床表现为低热、痉挛性腹痛，开始水样便，继而血样便。7.2EPEC主要引起婴儿腹泻,伴有低热、呕吐和腹泻，黏液便不带血。轻者不用抗生素治疗，严重者需用抗生素治疗。7.3ETCC引起旅游者和婴幼儿腹泻的主要病原菌，临床表现为水样腹泻、恶心、呕吐、寒战，有时发生脱水及中毒症状。轻者不用抗生素治疗，严重者需用抗生素治疗。7.4EIEC要侵入结肠粘膜上皮，引起志贺菌样腹泻（粘液脓血便），引起痢疾样腹泻，发热和肠炎，黏液血便，便中有红、白细胞。8.鉴定流程粪便或肛拭子报告检出EPECO××B××（L）型血清分型鉴定1.OK抗原:不加热活菌与分型血清作玻片凝集2.OK抗原:加热1001h的菌液与分型血清作玻片凝集山梨醇平板无色菌落挑菌落与分组OK多价血清作玻片凝集凝集不凝集移种KIA及MIU上报告未检出EPEC与某型血清凝集必要时可作定型凝集试验报告未检出EPEC不凝集符合大肠埃希菌粪、尿、残余食物参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书沙门菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0592版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述沙门菌属是一大群寄生于人和动物肠道中的形态、培养特性、生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌，其血清型别繁多、抗原复杂的肠道病原菌，分为6个亚属、2200种以上的血清型。伤寒沙门菌属亚属I，多价O抗血清D群，是临床上最为重要的沙门菌。2.标本类型粪便、血液等额标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阴性杆菌，菌体细长，大小为（0.7~1.5um）×（2~5um）。有周鞭毛，无芽胞，无荚膜。3.2培养特性：在麦康凯琼脂平板上形成无色、透明的菌落；SS琼脂平板上呈无色、透明，但大部分菌落中央呈黑色（产H2S）；在XLD琼脂平板上也产生中央黑色的菌落（产H2S）；HE琼脂平板上菌落呈蓝绿色。CHROMagar显色培养基上呈紫色菌落。半固体琼脂中均匀混浊生长，无穿刺线。3.3生化反应：氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖，不发酵乳糖；IMViC-+--或-+-+，H2S试验阳性或阴性，动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，鸟氨酸脱羧酶、尿素酶试验阴性，氰化钾（KCN）培养基不生长。3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：鉴别平板上无色透胆或半透明的菌落，TSI为K/A，H2S阳性或阴性，有动力，IMViC-+--或-+-+，尿素酶试验阴性。符合上述特性者，可通过血清凝集试验）作出诊断。3.4.2与志贺菌属的鉴别：少数伤寒沙门菌在TSI上H2S阴性，动力不明显，易与志贺菌属混淆，可用血清凝集反应相鉴别。3.5操作步骤3.5.1观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验。参见细菌鉴定标准操作构规程。3.5.2血清学鉴定参见沙门菌血清学检测标准操作规程。3.5.3鉴定从SS琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析沙门菌的鉴定依赖于传统或商品化系统生化反应和血清学两种方法。若生化反应符合沙门菌，但A-F多价血清不凝集，首先考虑是否存在表面抗原（Vi抗原），若有应将细菌制成菌悬疑，放入沸水中加热15-30276 分钟，冷却后再次做凝集试验。若去除Vi抗原后仍不凝集，应考虑是否为A-F以外的菌群，应送专业实验室进行鉴定。7.临床意义主要通过污染食品和水源经口感染，引起人类和动物的沙门菌病，主要有3种类型。（1）胃肠炎：此型最为常见，引起轻型和暴发型腹泻，伴有发热、恶心和呕吐。（2）菌血症和败血症：多发生于儿童和免疫力低下的老年人，可经血流到达组织，导致脑膜炎、心内膜炎、胆囊炎、骨髓炎等。往往出现血培养阳性而粪便阴性。（3）肠热症：表现为发热，血培养或肥达氏反应阳性。8.鉴定流程粪、尿、残余食物血液、骨髓增菌培养（血培养肉汤）分离培养（BAP、SS、EMB/MAC）菌落观察：SS上无色、透明、中央呈黑色初步鉴定：TSI,KIA/MIU,IMViC多价血清A-F分群最后鉴定生化反应鉴定沙门菌属生化反应鉴定仪器或手工鉴定生化反应鉴定参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书志贺菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0593版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述志贺菌属也是人类主要肠道病原菌之一。该菌属分为4个群（种）：A群为痢疾志贺菌，B群为福氏志贺菌，C群为鲍氏志贺菌，D群为宋内志贺菌。其中福氏志贺菌为该菌属最为常见的志贺菌。2.标本类型粪便、肛拭子标本。3.鉴定3.1形态染色革兰阴性细小杆菌，大小为1um×（2~4um）。无芽胞，无荚膜，无动力，无鞭毛，有菌毛。3.2培养特性在麦康凯琼脂平板上呈无色透明的小菌落；在SS琼脂平板上因不发酵乳糖而形成无色透明或半透明的较小菌落；在XLD琼脂平板上产生红色的菌落；在HE琼脂平板上菌落呈淡绿色。宋内志贺菌在麦康凯琼脂平板上可出现两种菌落，一种粉红色（迟发酵乳糖），另一种无色透明。3.3生化反应氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖、甘露醇，不发酵乳糖、蔗糖；甲基红、硝酸盐还原试验阳性，动力、V-P、枸橼酸盐、H2S、醋酸盐试验均阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征SS平板上无色菌落或半透明的小菌落，TSI为K/A，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，无动力，尿素酶、H2S试验阴性。符合上述特性者，可通过血清凝集试验作出诊断。如血清不凝集，应进一步鉴别。3.4.2志贺菌属各菌种的鉴别：见表5-40。表5-40志贺菌属各菌种的生物学特性（阳性%）生化试验痢疾志贺菌福氏志贺菌鲍氏志贺菌宋内志贺菌ONPG3011090鸟氨酸脱羧酶00298乳糖0112※甘露醇0959799海藻糖906585100吲哚4550250注：“2※”为迟缓发酵（48h以上）。3.5操作步骤3.5.1观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验参见三糖铁标准操作构规程。3.5.2血清学鉴定参见志贺菌血清学检测标准操作规程。276 3.5.3从SS琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析一般志贺菌不进入血液，所以只取粪便和肛拭子标本作培养。本菌大多数菌株对氯霉素、链霉素、氨苄西林耐药，多数菌株对卡那霉素、庆大霉素敏感。7.临床意义志贺菌属是肠杆菌科中引起人类感染性腹泻最常见的病原菌之一，主要引起人类细菌性痢疾，其中福氏和宋内志贺菌最为常见。菌痢主要有三种临床类型，即急性细性痢疾、慢性细菌性痢疾和携带者。典型的急性菌痢初期为水样便，数日后为脓血便，伴里急后重。8.鉴定流程粪便或肛拭增菌培养(GN肉汤)志贺菌属初步鉴定：TSI,KIA/MIU仪器或手工鉴定血清鉴定培养(SS、MAC)菌落观察：SS上无色、透明或半透明较小菌落参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书克雷伯标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0594版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述克雷伯菌属包括5个种，即肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、解鸟氨酸克雷伯菌、土生克雷伯菌和植生克雷伯菌。而肺炎克雷伯菌又分为3个亚种，即肺炎克雷伯菌肺炎亚种、肺炎克雷伯菌臭鼻亚种及肺炎克雷伯菌鼻硬结亚种。肺炎克雷伯菌肺炎亚种是本菌属最为重要的菌种。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阴性杆菌，大小为（0.3~1.5um）×（0.6~6um）。单个、成双或短链排列。痰标本直接涂片染色，菌体呈卵圆形或球杆状，单个或成双排列。荚膜染色外周可见透明、环状荚膜。3.2培养特性在血琼脂平板上形成较大、圆形、凸起、灰白色、不溶血的菌落；在麦康凯琼脂平板上形成隆起、大而粘液样、易融合的、粉红色菌落，用接种环挑取呈丝状粘连；在中国蓝琼脂平板上呈蓝色菌落；在XLD琼脂平板上呈粘液黄色菌落；在CHROMagar定位培养基上呈蓝灰色菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性，TSI为A/A；发酵葡萄糖等，产酸产气；IMViC--++，动力、H2S、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验均阴性，尿素酶、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征：琼脂平板上菌落较大、隆起、粘液样，用接种环挑取呈丝状粘连；发酵葡萄糖等多种糖；IMViC--++，动力试验阴性，尿素酶、赖氨酸脱羧酶试验阳性。3.4.2本菌属各菌种间的鉴别：见表5-41。 表5-41克雷伯菌属各菌种间的鉴别生化反应肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌解鸟氨酸克雷伯菌植生克雷伯菌臭鼻克雷伯菌鼻硬结克雷伯菌土生克雷伯菌吲哚0991000000甲基红1020969810010060V-P9895959800100枸橼酸盐9895100300040尿素酶959090981000ONPG991001008000100丙二酸盐9398100395100100粘液酸盐909396100250100葡萄糖产气97979610050080乳糖98100100100300100鸟氨酸001000302041℃生长生长生长生长生长生长不生长276 3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析肺炎克雷伯菌可产生ESBLs，产酶株对青霉素类、头孢菌素类或单酰胺类耐药。如果检出产ESBLs肺炎克雷伯菌，即使体外药敏试验对青霉素类、头孢菌素类或氨曲南敏感，也应报告对其耐药。但对头霉素、部分加酶抑制剂的复合抗菌药物和碳青酶烯类抗菌药物敏感。7.临床意义肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界水和土壤中，是人类呼吸道的常居菌，在人和动物肠道内也常见，是常见的条件致病菌，可引起肺炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症等疾病。约30%的肺炎克雷伯菌可产生ESBLS，应引起重视。尿、痰、血液等氧化酶-麦康凯琼脂平板呈黏液、粉红色菌落克雷伯菌属仪器或手工鉴定8.鉴定流程参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书肠杆菌标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0595版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述肠杆菌属包括阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、阪崎肠杆菌、格高肠杆菌、中间肠杆菌、河生肠杆菌、日沟肠杆菌、生癌肠杆菌和梨形肠杆菌等14个种。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性粗短杆菌，有周身鞭毛，无芽胞，与其他肠杆菌科细菌相似。3.2培养特性在血琼脂平板上菌落呈灰白色，不溶血；在麦康凯等培养基上因发酵乳糖形成红色、较大菌落；在中国蓝琼脂平板上形成中等大小、蓝色菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性，TSI为A/A；发酵葡萄糖、乳糖、山梨醇等多种糖类，不发酵卫矛醇；IMViC--++，动力、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶和硝酸盐还原试验均阳性，H2S、赖氨酸脱羧酶试验阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征：发酵葡萄糖等多种糖类，IMViC--++，动力、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验均为阳性。3.4.2阴沟肠杆菌与成团泛菌的鉴别阴沟肠杆菌鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶试验均阳性，赖氨酶脱羧酶试验阴性；成团泛菌鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶试验均阴性，并产黄色色素。3.4.3阴沟肠杆菌与产气肠杆菌的鉴别阴沟肠杆菌精氨酸双水解酶试验阳性，赖氨酸脱羧酶试验阴性；产气肠杆菌相反。3.4.4产气肠杆菌与成团泛菌的鉴别前者鸟氨酸脱羧酶和赖氨酶脱羧酶试验阳性，而后者相反。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。检验结果解释与分析阴沟肠杆菌既存在ESBLs问题，有存在AmpC276 酶的问题，故耐药情况严重，应根据药敏试验和耐药机制检测报告选药。如果检出上述两种酶，体外试验对对青霉素类、头孢菌素类或氨曲南敏感，也应报告对其耐药；同时对头霉素、酶抑制剂也耐药。重症感染者首先碳青酶烯类抗生素治疗。产气肠杆菌与阴沟肠杆菌一样，临床上使用三代头孢菌素治疗的过程易产生耐药性，通常在治疗3-4日左右即转化为耐药菌株，因此应定期复查菌株的敏感性。临床意义阴沟肠杆菌广泛存在于水、土壤等外界环境和肠道中，也是一种条件致病菌，可引起尿道感染、肾盂肾炎、呼吸道和伤口感染，以及败血症等。鉴定流程尿、痰、血液等麦康凯琼脂平板呈粉红色菌落仪器或手工鉴定并做药敏试验肠杆菌属氧化酶-参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书沙雷菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0596版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述沙雷菌属包括粘质沙雷菌、液化沙雷菌、气味沙雷菌、普城沙雷菌、深红沙雷菌、无花果沙雷菌、嗜虫沙雷菌、居泉沙雷菌、格里蒙沙雷菌和变形沙雷菌等10种。在临床标本中以粘质沙雷菌最为常见。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阴性杆菌。3.2培养特性经35℃培养18-24小时，在血琼脂平板上菌落较大，呈红色；在麦康凯琼脂平板上菌落呈红色，部分菌株呈无色菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇水杨苷和肌醇，不发醇乳糖、卫矛醇和鼠李糖；IMViC--++，DNA酶、脂酶、明胶酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶试验均为阳性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征：大部分菌株产生红色色素，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，DNA酶、脂酶、明胶酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶试验均为阳性。3.4.2粘质沙雷菌与深红沙雷菌和普城沙雷菌的鉴别：三者均能产生两种不同的红色色素（灵菌红素和吡羧酸），但粘质沙雷菌发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖和棉子糖，鸟氨酸脱羧酶试验阳性；深红沙雷菌则相反。普城沙雷菌发酵阿拉伯糖，赖氨酸脱羧酶试验阴性，可与粘质沙雷菌相鉴别。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。检验结果解释与分析粘质沙雷菌易产生诱导酶，临床上使用三代头孢菌素治疗的过程易产生耐药性，通常在治疗3-4日左右即转化为耐药菌株，因此应定期复查菌株的敏感性。临床意义粘质沙雷菌长期以来认为对人体无害，但由于该菌具有侵袭性并对许多常见抗生素有耐药性，已成为临床感染的标本中一种重要的病原菌。可导致肺炎、泌尿道感染、败血症和外科手术感染等。此菌可导致医院感染爆发流行。276 鉴定流程尿、痰、血液等麦康凯琼脂平板呈红色或无色菌落仪器或手工鉴定并做药敏试验沙雷菌属氧化酶-参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书变形杆菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0597版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述变形杆菌包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌和潘氏变形杆菌4个种，其中普通变形杆菌和奇异变形杆菌在临床标本中较为常见。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌，大小为（0.4～0.6um）×(1～3um)，多数为单个存在，也可见成对短排列。周身鞭毛，运动活泼，无芽胞，无荚膜。3.2培养特性在血琼脂平板上可蔓延成波纹准确度薄膜，布满整个平板表面（迁徙现象）；在麦康凯琼脂平板上形成圆形、扁平、无色半透明、乳糖不发酵菌落；在XLD琼脂平板上形成不透明、黄色、中心黑色的菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖、肌醇和甘露醇；KCN生长；动力、H2S、尿素酶和苯丙氨酸脱氨酶试验均阳性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征：血琼脂平板上菌落呈迁徙生长，尿素酶、H2S、苯丙氨酸脱氨酶试验均为阳性。3.4.2变形杆菌属种间的鉴别：见表5-42。表5-42变形杆菌属各菌种的生物学特性（阳性％）菌名VPH2S吲哚脲酶鸟氨酸麦芽糖苯丙氨酸普通变形杆菌509829899098奇异变形杆菌095989509799潘氏变形杆菌0300100010099产粘变形杆菌1000010001001003.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析奇异变形杆菌可产生ESBLs276 ，如果检出上述酶，体外试验对对青霉素类、头孢菌素类或氨曲南敏感，也应报告对其耐药。7.临床意义普通变形杆菌广泛存在于泥土和污水及人、畜粪便中，为条件致病菌，当机体抵抗力下降时，可引起尿路感染、呼吸道感染、腹膜炎肠胃炎（潜伏期3-20小时，起病急骤、恶心、呕吐、腹痛、腹泻为水样便，带黏液、恶臭、无脓血，一日数次至十余次）等各种感染。8.鉴定流程尿、痰、血液等血平板上呈蔓延生长，麦康凯琼脂平板无色菌落仪器或手工鉴定并做药敏试验变形杆菌属氧化酶-参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书摩根菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0598版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述摩根菌属只有1个种，即摩根摩根菌，又为分摩根亚种和塞氏亚种2个亚种，及一个生物群。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌，有周鞭毛，运动活泼。3.2培养特性在血琼脂平板上形成中等大小、圆形、凸起、光滑、湿润、灰白色的菌落；在麦康凯琼脂平板上呈无色、半透明的菌落。3.3生化反应：氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖、海藻糖，不发酵甘露醇、乳糖、蔗糖；IMViC为++--，动力、尿素酶和苯丙氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶试验阳性，VP、枸橼酸盐、精氨酸双水解酶试验阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征血琼脂平板上无迁徙生长现象，麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，IMViC为++--，尿素酶、苯丙氨脱氨酶试验阳性。3.4.2摩根亚种与塞氏亚种之间的鉴别：见表5-43。表5-43摩根摩根菌各亚种的生物学特性（阳性％）亚种名吲哚TSIH4S赖氨酸动力海藻糖丙三醇摩根亚种952019505塞氏亚种50729291007生物I群10015100001003.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析摩根菌属的特征是枸橼酸盐和阿东醇试验阴性而鸟氨酸脱羧酶试验阳性。7.临床意义摩根摩根菌存在于人类、狗和其他哺乳动物及爬行动物的粪便中，是条件致276 病菌和继发侵袭菌。可引起呼吸道、泌尿道和伤口感染，以及败血症等，也是医源性感染的病原菌。8.鉴定流程尿、痰、血液等麦康凯琼脂平板呈无色菌落仪器或手工鉴定并做药敏试验沙雷菌属氧化酶-参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书枸橼酸杆菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0599版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述枸橼酸杆菌属包括弗劳地枸橼杆菌、异型枸橼酸杆菌、无丙二酸枸橼酸杆菌、魏氏枸橼酸杆菌、塞氏枸橼酸杆菌等11个种。临床上以弗劳地枸橼酸杆菌最为常见。2.标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。3.鉴定形态与染色：革兰阴性杆菌，有周鞭毛，能运动，无芽胞，无荚膜。3.2培养特性在血琼脂平板上形成直径2～4mm、灰白色、湿润、隆起、边缘整齐的不溶血菌落；在麦康凯琼脂平板上形成中等大小、红色、混浊的菌落；在中国蓝琼脂平板上形成中等大小、蓝色菌落。异型枸橼酸杆菌在麦康凯琼脂平板上形成较大、黄色的菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性；发酵葡萄糖和甘露醇，不发酵阿拉伯糖，甲基红、动力、ONPG和硝酸盐还原试验阳性，赖氨酶脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、V-P试验均为阴性，大多数菌株产H2S.3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征在麦康凯琼脂平板上多数呈粉红色菌落，赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验阴性，大多数菌株产H2S。3.4.2枸橼酸杆菌属各种之间的鉴别：见表5-44。表5-44枸橼酸杆菌属各种之间的生物学特性（阳性％）菌名吲哚H2S尿素酶鸟氨酸KCN丙二酸盐蔗糖卫矛醇阿东醇棉子糖蜜二糖弗劳地枸橼酸杆菌337844089118911044100异型枸橼酸杆菌990759909540409900无丙二酸枸橼酸杆菌1005859599191050法氏枸橼酸杆菌10005910093010020100100杨氏枸橼酸杆菌1565805955208501010布氏枸橼酸杆菌3360479310007330780魏氏枸橼酸杆菌0100100010010000000塞氏枸橼酸杆菌8301001000100010000100C.rodentium00100100010000000DNA基因种10067001001003300067DNA基因种111006767010003310003333276 3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析本菌易产生诱导酶，临床上使用三代头孢菌素治疗的过程易产生耐药性，通常在治疗3-4日左右即转化为耐药菌株，因此应定期复查菌株的敏感性。7.临床意义弗劳地枸橼酸杆菌是人和动物肠道的正常菌群，也是条件致病菌，能引起腹泻和肠道外感染如脑膜炎、败血症等疾病。8.鉴定流程尿、痰、血液等麦康凯琼脂平板呈粉红色菌落仪器或手工鉴定并做药敏试验枸橼酸菌属氧化酶-参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书耶尔森菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05100版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述鼠疫耶尔森菌是属于耶尔森菌属，现归入肠杆菌科，原系动物感染性疾病的病原菌，人通过接触感染动物或污染食物而患病。2.标本类型血液等。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性，直杆状或球杆菌。3.2培养特性血琼脂平板上形成较小、不溶血的菌落；在麦康凯琼脂平板上形成无色小菌落。3.3生化反应氧化酶试验阴性；发酵葡萄糖，不发酵蔗糖、乳糖；大部分菌株还原硝酸盐；动力、脲酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验阴性；TSI为K/A。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征革兰阴性，直杆状或球杆菌，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，动力试验阴性。3.4.2与假结核耶尔森菌的鉴别鼠疫耶尔森菌脲酶试验阴性，25℃时无动力；假结核耶尔森菌则相反。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。3.5.2从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析鼠疫耶尔森菌感染与多种齿动物有关，可通过跳蚤在陆地动物间传播。小规模的流行称为地方兽病，当爆发流行时，大量的同类动物致病。生活和工作在疫区的人可能被感染的跳蚤叮咬，或在剥离死兽皮时感染，发生腹股沟淋巴结肿大和皮肤鼠疫。吸入来自感染动物或死亡动物的病原体可引起肺炎、咽炎或结膜炎。另外，此病可经呼吸道飞沫传播致病。7.临床意义7.1鼠疫耶尔森菌是烈性传染病鼠疫的病原菌。健康人与齿类感染动物或感染人群接触，或通过跳蚤叮咬而感染。主要引起腺鼠疫、肺鼠疫和败血性鼠疫三种临床类型的感染。抗菌药物的选择;首选链霉素，其次为庆大霉素、氯霉素、氨苄西林、磺胺类及三代头孢菌素等。7.2危急值报告276 7.3检出鼠疫耶尔森菌，应立即向有关部门报告，并将菌种送到专业实验室进行鉴定。8.鉴定流程血液等麦康凯琼脂平板呈无色较小菌落，血平板不溶血小菌落仪器或手工鉴定并做药敏试验鼠疫耶尔森菌氧化酶-参考文献[1]中华人民共和国国务院令第344号，化学危险物品安全管理条例，2002[2]医学实验室-安全要求ISO15190:2003（E）[3]中华人民共和国国务院令第424号.病原微生物实验室管理条例.2004编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书霍乱弧菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05101版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述霍乱弧菌可分为古典生物型和El-tor生物型；根据菌体抗原（即O抗原）可分为155个血清群，其中O1血清群和O139血清群能引起霍乱的发病和流行，是霍乱的病原体。2.标本类型粪便等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性，菌体弯曲呈弧形或逗点状。3.2培养特性在TCBS琼脂平板上，可形成黄色的菌落；在双氢链霉素洗衣粉琼脂平板上形成心呈灰褐色的菌落；在血琼脂一板上形成较大的菌落，ElTor生物型可形成β溶血。3.3生化反应氧化酶试验阳性；发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、不发酵乳糖和阿拉伯糖；动力、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、霍乱红、硝酸盐还原和粘丝试验均阳性，精氨酸双水解酶试验阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征：运动活泼呈穿梭样运动，OX阳性，大多发酵甘露醇、精氨酸、鸟氨酸脱羧酶阳性，嗜盐性+，0/129敏感。3.4.2与氧单胞菌属、邻单胞菌属的鉴别见表5-46.表34弧菌属与类似菌属的鉴别要点试验弧菌属气单胞菌属邻单胞菌属0/129(150ug/片)SRS肌醇-++氨苄西林（10ug/片)SRR黏丝试验+--精氨酸双水解酶-++赖氨酸脱羧酶+++注：“+”为90％以上阳性，“-”为90％以上阴性，“+-”为大多数阳性。3.4.3确诊O1血清群霍乱弧菌必须具备的条件①涂片为革兰阴性，弧菌或杆菌。②TCBS等选择性培养基上典型的菌落。③动力试验阳性，符合生化特性。④O1血清诊断血清凝集试验阳性。3.5操作步骤3.5.1在pH9.0的碱性蛋白胨水增菌6-8小时后转种TCBS琼脂平板。3.5.2玻片凝集试验从TCBS琼脂平板上或双氢链霉素洗衣粉琼脂平板上挑取可疑菌落，与霍乱弧菌多价血清作玻片凝集试验，以生理盐水做阴性对照，诊断血清发生凝集、生理盐水不发生凝集者为阳性。做初步鉴定试验后，将高度怀疑菌送疾病预防控制中心（CDC）做最后鉴定。276 4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析初次分离时采用pH9.0的碱性蛋白胨水增菌，孵育6-8小时，液体呈均匀混浊，表面形成菌膜。根据O1血清群其O抗原的ABC因子，又可进一步将其分为小川（AB）、稻叶(AC)和彦岛(ABC)等3个血清型；还可根据其产毒素基因的有无和对人的侵袭力，划分为流行株和非流行株。流行株才是霍乱真正的病原菌。部分菌株不被O1群霍乱弧菌多价血清所凝集，称之为非O1群霍乱弧菌，也称不凝集弧菌或不凝集霍乱弧菌。7.临床意义霍乱弧菌是暴发流行性烈性肠道传染病霍乱的病原菌，该菌能产生霍乱肠毒素，作用于小肠粘膜，引起肠液大量分泌，表现为严重腹泻（米泔样便）、呕吐、脱水和酸中毒，病死率很高。粪便增菌培养（碱性胨水）玻片凝集阳性，生理盐水对照阴性初步报告TCBS或其他选择平板送CDC确诊快速诊断8.鉴定流程参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书链球菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05102版本：20140601生效日期：20140615共3页1.概述链球菌是一群触酶试验阴性、呈链状排列的革兰阳性球菌。该菌属种类繁多，目前临床上仍延用Lancefield血清学方法进行分群（A、B、C、D、F、G群），或根据溶血现象（β溶血、α溶血或草绿色溶血、γ溶血或不溶血）进行分类。2.标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阳性球菌，固体培养基上单个或成双排列，较少呈链状排列；肉汤培养基中呈长链排列；从脓液、尿液和痰液等标本直接涂片镜检，呈单个、成双或短链排列。3.2培养特性：在血琼脂平板上菌落可出现三种溶血反应：a溶血周围有灰绿色的狭窄溶血环；B溶血周围有明显较大的完全透明环；。溶血（不溶血）无异常变化。周围有灰绿色的狭窄溶血环；肺炎链球菌菌落中央呈脐窝状、表面光滑、灰色、扁平，周围有草绿色溶血环。3.3生化反应：触酶试验阴性，对各种碳水化合物的分解因菌种而异，链球菌不被胆汁溶解。肺炎链球菌分解菊糖，胆汁溶菌试验阳性，Optochin试验敏（抑菌环>14mm）。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征：革兰阳性球菌，单个、成双或链状排列，菌落较小、可出现：a溶血、B溶血或不溶血，触酶试验阴性。3.4.2根据溶血及关键性试验，对链球菌进行推测性鉴定分群：A群链球菌（化脓性链球菌）：β溶血，杆菌肽敏感。B群链球菌（无乳链球菌）：β溶血，CAMP试验阳性，马尿酸钠试验阳性。C群链球菌（似马链球菌、兽疫链球菌和马链球菌等）：CAMP试验、马尿酸钠、65g/L氯化钠耐盐试验均为阴性，杆菌肽耐药（抑菌试验阴性）。D群非肠球菌（马肠链球菌、牛链球菌、变形链球菌等）：胆汁七叶苷试验阳性，65g/L氯化钠耐盐试验为阴性。D群肠球菌（粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌和坚忍肠球菌等）：胆汁七叶苷、65g/L氯化钠耐盐试验阳性，45℃生长。现归属于肠球菌属。C、F及G群链球菌的鉴定常需用血清学方法。非B溶血链球菌的鉴别见表5-34276 表5-34非B溶血链球菌的鉴定菌名Optochin试验胆汁溶菌试验胆汁七叶苷试验肺炎链球菌++-牛链球菌--+其他草绿色链球菌群---3.5操作步骤3.5.1涂片染色观察菌落特征，在血平板上挑取可以菌落，涂片染色镜检。3.5.2触酶试验阳性参见触酶试验标准操作规程3.5.3鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析6.1草绿色链球菌是人体正常菌群的一部分，通常不致病，只有但草绿色链球菌出现在血液中等无菌体液中时，鉴定才有意义。6.2如果检测出链球菌对青霉素敏感，同时该菌被认为对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、阿莫西林、头孢克洛、头孢唑林、头孢地尼、头孢曲松、头孢吡肟、头孢布坦、头孢唑肟、头孢噻肟等头孢类敏感，则不必进行上述抗生素的药敏试验。如果检出肺炎链球菌苯唑西林抑菌圈≤19mm，应检测青霉素、头孢噻肟和头孢曲松的MIC浓度，可能发生青霉素耐药或中介现象。如果检出菌对红霉素敏感或耐药，则提示该菌对克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素敏感或耐药。近年来青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）及多重耐药（MDRSP）菌株的增加，给临床治疗带来一定的困难。7.临床意义A群链球菌（化脓性链球菌）临床上常引起痈、蜂窝织炎、急性咽炎、丹毒、脓疱疮、猩红热、医源性伤口感染和产后感染等。此外，A群链球菌感染后也可发生急性风湿热和急性肾小球肾炎等严重变态反应性并发症。无乳链球菌正常寄居于妇女阴道和人体肠道，带菌率可达30%左右，此菌可引起新生儿感染。肺炎链球菌存在正常人群的口腔、鼻咽部、属正常菌群，可引起大叶性肺炎或支气管炎。草绿色链球菌是人体正常菌群的一部分，通常不致病，只有但草绿色链球菌出现在血液中等无菌体液中时，鉴定才有意义。8.鉴定流程276 触酶试验-菌落观察：灰暗色、扁平、干燥，溶血或不溶血涂片染色：G+球菌，单个、成双或短链排列β溶血α溶血γ溶血其他链球菌+CAMP-+Optochin试验-+胆汁溶菌试验-无乳链球菌肺炎链球菌杆菌肽敏感PYR阳性血清学分型牛链球菌及其他化脓链球菌参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书肠球菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05103版本：20140601生效日期：20140615共3页1.概述肠球菌属于1984年从链球菌属划出，单独成为一个菌属，包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌、蒙氏肠球菌、海氏肠球菌、鹑鸡肠球菌和病臭肠球菌等18个种和1个变异株。临床上常见的菌株为粪肠球菌。2.标本类型血液、尿液、痰、穿刺液、脓液等标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阳性球菌，单个、成双或短链状排列。3.2培养特性在血琼脂平板上形成较小、灰白色，有a溶血或β溶血环的菌落。在麦康凯琼脂平板上形成较小、干燥、粉红色菌落。3.3生化反应触酶试验阴性，分解甘露醇、山梨醇、胆汁七叶苷试验阳性、在含6.5%氯化钠的肉汤中生长，多数菌株PYR试验阳性，对杆菌肽耐药。3.4鉴别要点3.4.1本菌特征革兰阳性球菌，触酶试验阴性，在65g/L氯化钠中生长，胆汁、七叶苷试验阳性，45℃中生长。3.4.2与屎肠球菌的鉴别：粪肠球菌不分解阿拉伯糖，而屎肠球菌能分解阿拉伯糖3.4.3与链球菌属和乳球菌属的鉴别：见表5-353.4.4粪肠球菌与其他各主要菌种间的鉴别：见表5-36操作步骤3.5.1触酶试验阳性参见触酶试验标准操作规程3.5.2鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析在β-内酰胺酶阴性球菌肠球菌中，氨苄西林药敏试验结果可预测阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦等敏感性。青霉素药敏试验可预测氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦等药敏结果。粪肠球菌中氨苄西林药敏结果可以预测亚胺培南的药敏结果。对于血培养和脑脊液中分离到的肠球菌，需做β-内酰胺酶检测，β-276 内酰胺酶阳性，则对青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素均耐药。为耐万古霉素肠球菌做氯霉素、红霉素、四环素和利福平药敏试验，根据结果进行治疗。氨基糖苷类高水平耐药株HLRA可用庆大霉素120ug/片和链霉素300ug/片筛选，无抑菌环为耐药，抑菌环≥10mm为非HLAR，对于抑菌环在7～9mm之间的菌株需用稀释法确认。对于肠球菌属，头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选高水平耐药性）、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性（敏感），但在临床上耐药，所以不能报告肠球菌对这些药物敏感。表5-35属常见菌种的生物学特性菌种甘露山梨山梨精氨阿拉棉子蔗核动色丙酮醇醇糖酸伯糖糖糖糖力素酸盐组1鸟肠球菌+++-+-++--+假鸟肠球菌+++--+++--+棉子糖肠球菌+++-++++--+病臭肠球菌+++---++--+组2粪肠球菌++-+--++--+屎肠球菌+--++-++---卡氏黄色肠球菌+--+++++++-蒙氏肠球菌+--+++++-+-铅黄肠球菌+--++++-++-鹑肠球菌+--++++++--组4坚韧肠球菌---+---ND---海氏肠球菌---+-++ND---不称肠球菌---+-++ND--+粪肠球菌变异株---+---ND--+硫磺色肠球菌-----+++-+-表5-肠球菌属、链球菌属和乳球菌属细菌的生物学特性试验肠球菌属链球菌属乳球菌属胆汁七叶苷+-+65g/L氯化钠中生长+-VPYR+-+45℃生长+--注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11%~89%菌株阳性。7.临床意义粪肠球主要引起感染，最常见为尿道感染，其中大部分与尿道器械操作、导尿等有关；其次为腹部和盆腔等部位的创伤和外科术后感染。近年来，肠球菌属氨苄青霉素耐药株和庆大霉素高耐药株逐渐增多，耐万古霉素的肠球道菌国外也有较多报道，已使肠球菌所致重症感染的治疗成为临床棘手问题。276 8.鉴定流程菌落观察：较小、灰白色、a溶血或β溶血触酶试验-+棉子糖-+精氨酸-+阿拉伯糖-+蔗糖-涂片染色：G+球菌，单个、成双或短链排列+丙酮酸-+甘露醇-孤立肠球菌棉子糖肠球菌鸟肠球菌异味肠球菌+丙酮酸-粪变种+阿拉伯糖-屎肠球菌+动力-+色素-曼特肠球菌坚韧肠球菌肠道肠球菌铅黄肠球菌+动力-母鸡肠球菌参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书奈瑟菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05104版本：20140601生效日期：20140615共2页菌名葡萄糖麦芽糖乳糖蔗糖硝酸盐还原DNA酶淋病奈瑟菌+-----脑膜炎奈瑟菌++----卡他莫拉菌----++1.概述奈瑟菌属是一群触酶、氧化酶试验均阳性的革兰阴性球菌，包括脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、解乳糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、粘液奈瑟菌等11个种，临床上以脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌最为重要。2.标本类型血液、脑脊液、分泌物、痰、穿刺液、脓液标本。3.鉴定3.1形态与染色革兰阴性双球菌，肾形或咖啡豆状，，常成双排列，凹面相对。3.2培养特性初次分离时需在5%~10%二氧化碳环境中生长。在血琼脂平板上形成灰色、光滑、湿润、有光泽、透明或半透明、边缘整齐、不溶血的菌落，直径1~2mm；在巧克力琼脂平板上，形成圆形、凸起、湿润、有光泽、灰蓝色的似露滴状菌落。3.3生化反应：氧化酶、触酶试验阳性；分解葡萄糖和麦芽糖，不分解蔗糖、甘露醇及乳糖；尿素酶、吲哚及硝酸盐还原试验均为阴性。3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：革兰阴性双球菌，氧化酶和触酶试验阳性，分解葡萄糖、硝酸盐还原试验阴性。3.4.2奈瑟菌与相似菌的鉴别；见表5-37。表5-37奈瑟菌与相似菌鉴别的关键性试验注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11%~89%菌株阳性。3.4..3淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌的鉴别淋病奈瑟菌分解葡萄糖，硝酸盐还原试验阴性，而卡他莫拉菌则相反。两者虽可根据标本来源加以区分，但并非绝对，因为通过性行为，卡他莫拉菌也可引起尿道炎，而淋病奈瑟菌也能引起咽炎，应引起注意。涂片不典型，作淋病奈瑟菌培养，同时作普通培养，有细菌生长可排除淋病奈瑟菌。3.5操作步骤3.5.1涂片染色观察菌落特征，在血平板上挑取可以菌落，涂片染色镜检。3.5.2氧化酶试验参见《触酶试验标准操作规程》3.5.3鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。276 4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析脑膜炎奈瑟菌对青霉素、磺胺类、链霉素和金霉素敏感。产酶株引起感染应考虑用头孢曲松或头孢噻肟替代。检出B-内酰胺类酶阳性的淋病奈瑟菌则提示青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药。7.临床意义脑膜炎奈瑟菌存在于携带者和脑膜炎患者的鼻咽部，通过飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰。感染者为幼儿和青少年，感染后多数患者呈携带状态或隐性感染。少数出现上呼吸道感染症状，仅极少数发展成败血症，进而累及脑膜、脊髓膜，形成化脓性脑脊髓炎。8.鉴定流程菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明涂片染色：G-双球菌，肾形或咖啡豆状脑膜炎奈瑟菌+麦芽糖-淋病奈瑟菌氧化酶和触酶试验阳性参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书李斯特菌属标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05105版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述李斯特菌属包括产单核细胞李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌等菌种，其中产单核细胞李斯特菌对人和动物致病。2.标本类型血液、脑脊液、尿液、痰、穿刺液、脓液标本。3.鉴定3.1形态与染色：革兰阳性小杆菌，大小为（0.4~0.5um）×(1~2um),直或微弯，常呈V字形成对排列，偶尔可见双球状；无芽胞，无荚膜，在22~25℃形成周鞭毛，有动力，37℃时鞭毛很少或无。3.2培养特性：在血琼脂平板上形成较小、圆形、光滑而有狭窄β溶血环的菌落；在液体培养基中呈均匀浑浊生长；在半固体培养基中，动力自穿刺线向四周蔓延生长，呈倒伞状。3.3生化反应：触酶试验阳性；分解葡萄糖、鼠李糖、水杨苷，不分解蔗糖、木糖、甘露醇；吲哚、尿素酶和硝酸盐还原试验阴性，甲基红、VP和CAMP试验阳性。3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：革兰阳性短杆菌，菌落较小，有狭窄的β溶血环；25℃时有动力，37℃时无动力；触酶试验阳性，分解葡萄糖、水杨苷，不分解甘露醇。3.4.2与肠球菌的鉴别本菌具有耐盐、耐碱、耐胆汁等特点，易误为粪肠球菌，两者可用触酶试验加以鉴别。3.4.3与无乳链球菌的鉴别本菌也可能因培养条件不同而呈链状，37℃培养往往无动力，CAMP试验阳性，常误为B群链球菌；链球菌触酶试验阴性可与之鉴别。3.5操作步骤3.5.1涂片染色观察菌落特征，在血平板上挑取可以菌落，涂片染色镜检。3.5.2触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》3.5.3鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析本菌容易被认为是污染的杂菌（类白喉杆菌）而丢弃。幼龄培养呈革兰阳性，48h后多转为革兰阴性。因此当遇到25℃培养有动力的杆菌，而按照革兰阴性杆菌鉴定不符时，应考虑到李斯特菌的可能。276 7.临床意义产单核细胞李斯特菌在自然界分布很广，土壤、水、人和动物粪便中均可存在，常伴随EB病毒引起传染性单核细胞增多症，也可引起脑膜炎、败血症等。近年来在发达国家常因污染奶制品引起食物中毒。8.鉴别流程其他李斯特菌产单核细胞李斯特菌+CAMP试验-触酶+，25℃动力+有动力，37℃时无动力；触酶试验阳性，有动力，37℃时无动力；触酶试验阳性，涂片染色：G+小杆菌，直或微弯，呈V字形成对排列菌落观察：较小、圆形、光滑而有狭窄β溶血环参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书副溶血霍乱弧菌标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05106版本：20140601生效日期：20140615共2页1.概述副溶血弧菌属于弧菌属，是一种嗜盐性弧菌。2.标本类型粪便标本。3.鉴定与药敏试验流程3.1形态与染色革兰阴性，菌体弯曲呈弧形或逗点状。3.2培养特性在TCBS琼脂平板上，可形成绿色的菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性；发酵葡萄糖、麦芽糖、不发酵乳糖和蔗糖；吲哚、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原均阳性，在不含氯化纳和含10%氯化纳胨水中不生长。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征在TCBS琼脂平板上，可形成绿色的菌落，在不含氯化纳和含7%氯化纳胨水中生长；葡萄糖O/F发酵型，不发酵蔗糖；动力、氧化酶、赖氨酸脱羧酶试验阳性。3.4.2与溶藻弧菌的鉴别副溶血弧菌在TCBS琼脂平板上，不发酵蔗糖呈绿色的菌落，VP试验阴性；溶藻弧菌在TCBS琼脂平板上，发酵蔗糖呈黄色的菌落，VP试验阳性。3.4.3与河弧菌副溶血弧菌在TCBS琼脂平板上，不发酵蔗糖呈绿色的菌落，赖氨酸脱羧酶试验阳性；河弧菌在TCBS琼脂平板上，发酵蔗糖呈黄色的菌落，赖氨酸脱羧酶试验阴性。3.5操作步骤3.5.1在pH9.0的碱性蛋白胨水增菌6-8小时后转种TCBS琼脂平板。3.5.2氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程3.5.3从TCBS琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。4.药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSIM100-S20最新版本文件。5.质量控制参见质量管理程序。6.检验结果解释与分析生长最适氯化纳浓度为3.5%，在无盐培养基中不能生长。最适PH值为7.7-8.0，在普通培养基上增加氯化纳的浓度，以利于细菌生长。7.临床意义副溶血弧菌常在近海海水、海产品及盐渍食品中，可引起胃肠炎。病人可出现恶心、呕吐、腹部痉挛、低热和寒颤，腹泻为水样便。偶尔血便，2-3日潜伏期，偶尔有个别死亡的病例，也可引起伤口、眼睛和耳朵感染。276 8.鉴定流程粪便增菌培养（碱性胨水）仪器鉴定或手工生化鉴定并做药敏副溶血弧菌氧化酶试验阳性TCBS或其他选择平板参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书产碱杆菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05107版本：20140601生效日期：20140615共2页1．概述产碱杆菌属的代表菌种为粪产碱杆菌。2．标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。3．鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌，单个或成双排列。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成灰白色菌落。在麦康凯琼脂平板上呈无色透明菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性，不分解任何糖类，葡萄糖O/F为产碱型，动力和枸橼酸盐试验阳性，明胶、脲酶、吲哚、葡萄糖酸盐和硝酸盐还原试验均阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征菌落有水果味，氧化酶和动力试验阳性，葡萄糖O/F为产碱型。3.4.2与产碱单胞菌的鉴别两者的形态和生化反应很相似，极易混淆，可采用鞭毛染色加以鉴别。粪产碱杆菌周身鞭毛，产碱假单胞菌是一端鞭毛。3.4.3与木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种的鉴别粪产碱杆菌不分解木糖，木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种能分解木糖。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》3.5.2鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4．质控参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5．质量控制见《质量管理程序》6．检验结果解释与分析粪产碱杆菌对氨苄西林、氨曲南、庆大霉素耐药，木糖氧化无色杆菌氧化亚种通常对氨基糖苷类、氨苄西林、氯霉素、氟喹诺酮类耐药。7．临床意义粪产碱杆菌广泛分布于自然界、水和土壤中，也存在于人和动物的肠道中，并污染人体皮肤和医疗器材，是医院感染的病原菌之一。该菌可引起各种机会感染，包括心内膜炎，外伤感染和菌血症等。8．鉴定流程276 仪器鉴定或手工生化鉴定并做药敏试验氧化酶试验阳性麦康凯平板呈无色菌落、血琼脂平板呈灰白色菌菌落血液、尿液、、痰等产碱杆菌属参考文献1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书假单胞菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05108版本：20140601生效日期：20140615共2页1．概述假单胞菌属包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌等。铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌种。2．标本类型血液、尿液、痰、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。3．鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成蓝绿色、透明溶血环的菌落，有生姜味。在麦康凯琼脂平板上，可形成5种不同的菌落。①典型型：菌落不规则，边缘呈伞状伸展；②大肠菌样型：菌落圆形凸起，无色透明，似大肠埃希菌菌落；③粗糙型：菌落呈钮扣状，表面粗糙，或菌落中央隆起边缘扁平；④黏液型：菌落光滑，隆起，呈粘液状，嵌入培养基中，不易挑起，似肺炎克雷伯菌，但是无色；⑤侏儒型：生长缓慢，培养18小时尚不见菌落，24小时后才有细小菌落。3.3生化特性氧化酶试验阳性；分解葡萄糖，不分解乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖；动力、枸橼酸盐、精氨酸双水解酶和硝酸盐还原试验均为阳性；吲哚、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验阴性。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征蓝绿色或荧光色菌落、有生姜味，动力和氧化酶试验阳性，在4℃时不生长而在42℃时可以生长。3.4.2与荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的鉴别三者均可产生荧光色素，但铜绿假假单胞42℃时生长，后两者则不能生长。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》3.5.2鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4．质控参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5．质量控制见《质量管理程序》6．检验结果解释与分析感染铜绿假单胞菌的病人，经抗生素治疗3-4日后，易产生耐药性。因此对铜绿假单胞菌要经常做抗生素药敏试验。7．临床意义276 铜绿假单胞菌广泛分布于水、空气、土壤以及正常人体皮肤、呼吸道与肠道黏膜中，为条件致病菌。当手术、化疗、放疗、激素治疗等原因使人体抵抗力下降时容易引起感染。可引起烧伤创面感染、肺部感染、泌尿道感染、中耳炎、脑膜炎、菌血症等。8．鉴定流程血液、尿液、痰等挑取麦康凯或血琼脂平板可疑菌落菌菌落氧化酶试验阳性仪器鉴定或手工生化鉴定并做药敏试验假单胞菌属参考文献1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验试验室作业指导书邻单胞菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05109版本：20140601生效日期：20140615共2页1．概述邻单胞菌属属于弧菌科，只有1个种，即类志贺邻单胞菌。2．标本类型粪便、痰等标本。3．鉴定3.1形态与染色革兰阴性短小杆菌。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，呈灰色菌落。在麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性；发酵葡萄糖、麦芽糖、肌醇，不发酵甘露醇、蔗糖；动力、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验均为阳性；对O/129敏感。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征氧化酶、动力、肌醇、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶试验均阳性，对O/129敏感，其中肌醇阳性是该菌的主要特点。3.4.2邻单胞菌属与弧菌属的鉴别类志贺邻单胞菌肌醇试验阳性，弧菌属细菌则为阴性。3.4.3邻单胞菌属与肠杆菌科细菌的鉴别类志贺邻单胞菌氧化酶试验阳性，而肠杆菌科细菌则为阴性。3.4.4邻单胞菌属与氧化酶试验阳性的非发酵菌的鉴别类志贺邻单胞菌葡萄糖O/F试验呈发酵型，而氧化酶试验阳性的非发酵菌葡萄糖O/F试验呈氧化型或产碱性。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》3.5.2鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4．质控参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5．质量控制见《质量管理程序》6．检验结果解释与分析大多数菌株产生β-内酰胺酶，对青霉素耐药，许多菌株对氨基糖苷类（除奈替米星）和四环素耐药。7．临床意义类志贺邻单胞菌引起肠道内感染，一般表现为腹泻，与进食生水和海产品有关，好发于温暖的季节。肠道外感染主要引起菌血症，可伴有脑膜炎，也偶可从胆汁、伤口、关节液和淋巴结中分离到。8．鉴定流程276 仪器鉴定或手工生化鉴定并做药敏试验氧化酶试验阳性麦康凯平板呈无色菌落、血琼脂平板呈灰色菌落菌菌落粪便、痰等邻单胞菌参考文献1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验室实验室作业指导书气单胞菌属检验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05110版本：20140601生效日期：20140615共2页1．概述气单胞菌属包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌等，临床上嗜水气单胞菌最为常见。2．标本类型血液、痰、粪便等标本。3．鉴定3.1形态与染色革兰阴性杆菌。3.2培养特性在血琼脂平板上35℃培养18~24小时，呈灰白色或淡灰色菌落，有狭窄的β溶血环。在麦康凯琼脂上呈无色、半透明菌落。3.3生化反应氧化酶试验阳性；发酵葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖，产酸产气，不发酵乳糖；TSI为K/A；七叶苷、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验均阳性；O/129耐药。3.4鉴别要点3.4.1本菌属特征氧化酶试验阳性，发酵葡萄糖、L-阿拉伯糖等多种糖类，硝酸盐还原试验阳性，鸟氨酸脱羧酶试验阴性，O/129耐药。3.4.2气单胞菌属种间鉴别见表5-42表5-42气单胞菌属鉴别的关键性试验菌种VP赖氨酸精氨酸鸟氨酸蔗糖甘露醇头孢噻吩豚鼠气单胞菌--+-++R嗜水+++-++R简氏+++--+R舒VV+---S尺骨-++-V+R维罗纳气单胞菌温和变种+++-++S维罗纳气单胞菌维罗纳变种++-+++S注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11%~89%菌株阳性，“S”为敏感，“R”为耐药。3.5操作步骤3.5.1氧化酶试验参见《氧化酶试验标准操作规程》3.5.2鉴定从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。4．质控参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。5．质量控制见《质量管理程序》6．检验结果解释与分析276 大多数气单胞菌产生β-内酰胺酶，对青霉素、氨苄西林、羧苄西林、替卡西林耐药，但对广谱的头孢菌素、氨基糖苷类、氯霉素、四环素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和喹诺酮类药物敏感。7．临床意义气单胞菌为水中常居菌，可引起人类肠内感染和肠外感染，为引起夏季腹泻的常见病原菌。肠内感染主要表现为腹泻（水样便，严重出现痢疾样脓血便），肠外感染主要为菌血症、伤口感染、心内膜炎、脑膜炎等疾病。8．鉴定流程仪器鉴定或手工生化鉴定并做药敏试验氧化酶试验阳性麦康凯平板菌落呈无色、半透明菌菌落粪便、痰等气单胞菌属参考文献1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23；2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南.2008[2]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006[4]MurrayPR.ManualO/FClinicalMircrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007[5]ISO15189:2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007（周庭银）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书肠杆菌科纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05111版本：20140601生效日期：20140615共3页1．目的规范肠杆菌科细菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于肠杆菌科细菌。3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。3.1现行版本的CLSIM02和M100对肠杆菌科细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2细菌耐药监控网每年发布的监控要求。3.3本单位上一年度假单胞菌属细菌耐药监控数据。4．质控用大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。质控频率参见《药物敏感性试验标准操作规程》。5．材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺，标准比浊管或比浊仪。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-45.表5-45肠杆菌科细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感中介耐药氨苄西林（10µg）≥1714~16≤13参见结果解释哌拉西林（100µg）≥2118~20≤17氨苄西林/舒巴坦（10/10µg）≥1512~14≤11哌拉西林/他唑巴坦（100/10µg）≥2118~20≤17276 头孢唑林（30µg）≥1815~17≤14头孢克洛（30µg）≥1815~17≤14头孢呋辛（30µg）≥1815~17≤14头孢噻肟（30µg）≥2315~22≤14参见结果解释头孢他啶（30µg）≥1815~17≤14参见结果解释头孢吡肟（30µg）≥1815~17≤14头孢他啶/克拉维酸（30/10µg）参见结果解释头孢噻肟/克拉维酸（30/10µg）参见结果解释亚胺培南（10µg）≥1614~15≤13参见结果解释美罗培南（10µg）≥1614~15≤13参见结果解释阿米卡星（30µg）≥1715~16≤14参见结果解释庆大霉素（10µg）≥1513~14≤12参见结果解释环丙沙星（5µg）≥2116~20≤15参见结果解释左氧氟沙星（5µg）≥1714~16≤13参见结果解释复方新诺明（1.25/23.75µg）≥1611~15≤10参见结果解释呋喃妥因（300µg）≥1715~16≤14头孢哌酮/舒巴坦（75/75µg）≥2116~20≤158．注意事项8.1抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。变形杆菌属细菌可蔓延生长到某些抗菌药物的抑菌圈中，在量取抑菌圈直径时可忽略抑菌圈中薄的蔓延生长区域。测量复方磺胺药敏纸片的抑菌圈时，可忽略微弱的生长区域，而从细菌明显生长处量取抑菌圈直径。8.2沙门菌属和志贺菌属的细菌对一代、二代头孢菌素及头霉素体外试验敏感，但临床治疗无效，因此不应报告敏感。8.3肠杆菌属，枸橼酸杆菌属和沙雷菌属的细菌在使用三代头孢菌素治疗的过程中会产生耐药性，因此原本敏感的菌株可能会在使用抗菌药物治疗3~4日时产生耐药性，因此重复进行药物敏感试验是必要的。9．结果分析9.1276 分离自粪便标本的志贺菌属和沙门菌属的细菌仅需进行氨苄西林、一种氟喹诺酮类药物及复方新诺明的药物敏感试验，如从肠道外标本中分离到这些菌株，还需增加氯霉素和1种三代头孢菌素的药物敏感试验。9.2对于脑脊液中分离到的肠杆菌科细菌，必须进行头孢他啶和头孢噻肟的药物敏感试验，以代替头孢噻肟和头孢唑林的药物敏感试验。9.3对于沙门菌属和志贺菌属的细菌而言，氨基糖苷类抗菌药物可能在体外表现有抗菌活性，但在临床上无抗感染作用，所以这些细菌不能报告对氨基糖苷类抗菌药物敏感。9.4肠道外沙门菌感染的病人所分离的沙门菌属细菌如对萘啶酸耐药，而对氟喹诺酮类敏感，在临床使用氟喹诺酮类时可能会治疗失败或对抗感染治疗反应迟缓。因此对肠道外感染的沙门菌属细菌需要其对萘啶酸的耐药性。如在临床上分离到这种细菌，应通知临床医师避免使用氟喹诺酮类药物。9.5有关产ESBL大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌的筛选和确证试验参见CLSI-M100-S19中的附件A。9.6有关碳青霉稀酶肠杆菌科细菌的筛选和确证试验参见CLSIM100-S19中的附件G。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书假单胞菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05112版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范假单胞菌属细菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于是假单胞菌属细菌。3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。3.1现行版本的CLSIM02和M100对假单胞属细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2细菌耐药监控网每年发布的监控要求。3.3本单位上一年度假单胞菌属细菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）和铜绿假单胞菌ATCC27853进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。质控频率参见《药物敏感性试验标准操作规程》。5．试验材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺、标准比浊管或比浊仪。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-46.表5-46假单胞菌属细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感中介耐药哌拉西林（100µg）≥18≤17参见结果解释哌拉西林/他唑巴坦（100/10µg）≥18≤17头孢他啶（30µg）≥1815~17≤14头孢哌酮（75µg）≥2116~20≤15头孢吡肟（30µg）≥1815~17≤15276 亚胺培南（10µg）≥1814~15≤15美罗培南（10µg）≥1814~15≤15氨曲南（30µg）≥1816~21≤15阿米卡星（30µg）≥1815~16≤15参见结果解释庆大霉素（10µg）≥1813~14≤15参见结果解释环丙沙星（5µg）≥1816~20≤15参见结果解释多粘菌素（300U）≥18≤15头孢哌酮/舒巴坦（75/75µg）≥1816~20≤158．注意事项8.1抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。8.2分离自囊性纤维化病人的铜绿假单胞菌的纸片扩散法药敏试验结果可靠，但药敏平板一定要孵育24小时方可报告。8.3铜绿假单胞菌在抗感染治疗期间对药物会产生耐药性，因此初分离到的敏感菌在抗感染治疗3~4日后应重复进行药物敏感试验。9．结果解释对青霉素类药物，敏感的试验结果提示在临床治疗铜绿假单胞菌严重感染时应使用高剂量的治疗方案。单剂治疗可能会失败，这时应考虑联合使用其他菌株对其敏感的抗感染药物，如氟喹诺酮类或氨基糖苷类。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书不动杆菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05113版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范不动杆菌属细菌纸片扩散法药物敏感试验操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于不动杆菌属细菌。3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。3.1现行版本的CLSLM02和M100对假单胞属细菌纸片扩散药物敏感试验的要求。3.2细菌耐药监控网每年发布的监控要求。3.3本单位上一年度不动杆菌属细菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（用于β内酰胺/β内酰胺抑制剂合剂）和铜绿假单胞菌ATCC27853进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。质控频率参见《药物敏感性试验标准操作规程》。5．试验材料和仪器M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、测量尺、标准比浊管或比浊仪。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-47.表5-47不动杆菌属细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感（S）中介（I）耐药（R）哌拉西林（100µg）≥2118~20≤17哌拉西林/他唑巴坦（100/10µg）≥2118~20≤17头孢他啶（30µg）≥1815~17≤14头孢噻肟（30µg）≥2315~22≤14头孢吡肟（30µg）≥1815~17≤14亚胺培南（10µg）≥1614~15≤13美罗培南（10µg）≥1614~15≤13阿米卡星（30µg）≥1715~16≤14庆大霉素（10µg）≥1513~14≤13环丙沙星（5µg）≥2116~20≤15头孢哌酮/钠舒巴坦（75/75µg）≥2116~20≤15276 8．注意事项抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略微弱的生长区域，而从细菌明显生长处量取抑菌圈直径。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05114版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于是嗜麦芽窄食单胞菌。3．选药原则3.1现行版本的CLSIM02和M100对假单胞属细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。3.3本单位上一年度嗜麦芽窄食单胞菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）和铜绿假单胞菌ATCC27853进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。5．试验材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-48.表5-48嗜麦芽窄食单胞菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感中介耐药米诺环素（30µg）≥1915~18≤14左氧氟沙星（5µg）≥1914~16≤13复方新诺明（1.25/23.75µg）≥1911~15≤10头孢哌酮/舒巴坦（75/75µg）≥1916~20≤15276 8．注意事项抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。测量复方磺胺药敏纸片的抑菌圈时，可忽略微弱的生长区域，而从细菌明显生长处量取抑菌圈直径。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05115版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于是洋葱伯克霍尔德菌。3．选药原则3.1现行版本的CLSIM02和M100对假单胞属细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。3.3本单位上一年度洋葱伯克霍尔德菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）和铜绿假单胞菌ATCC27853进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。5．试验材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-49.表5-49洋葱伯克霍尔德菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感中介耐药头孢他啶（30µg）≥2118~20≤17美罗培南（10µg）≥2016~19≤15米诺环素（30µg）≥1915~18≤14复方新诺明（1.25/23.75µg）≥1611~15≤10头孢哌酮/舒巴坦（75/75µg）≥2116~20≤15276 8．注意事项抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。测量复方磺胺药敏纸片的抑菌圈时，可忽略微弱的生长区域，而从细菌明显生长处量取抑菌圈直径。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006（倪语星韩立中）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05116版本：20140601生效日期：20140615共3页1．目的规范葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于葡萄球菌属的细菌。3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。3.1现行版本的CLSIM02和M100对葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。3.3本单位上一年度葡萄球菌属细菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。5．材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺。6．操作步骤根据CLSIM2-A10和M100-S19制定本操作步骤。6.1菌液制备从孵育了18~24小时的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用无菌生理盐水制成悬液作为接种物，将浊度调整至0.5麦氏标准。应在接种物制备后15分钟内接种M-H琼脂平板。用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。6.2接种好的平板可敞开盖子在室温下干燥3~5分钟（不要超过15分钟），然后用纸片分配器将纸片放入琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。各纸片中心相距应大于24mm，通常150mm平板至多放置12个纸片，90~100mm平板至多放置6个纸片。由于某些药物在纸片放入琼脂平板后几乎立即扩散，所以一旦纸片放入后就不能再移动，若要重新放置，可用一个新的纸片放在平板的另一个位置。6.3应在纸片贴好后15分钟内将平板倒置放入35℃孵箱，若超过15分钟将使纸片中的抗菌药物提早扩散。非苛养菌的药敏解释性标准是建立在这些菌株在空气中孵育的基础上，一些药物（如氨基糖苷类、大环内酯类和四环素）的抑菌圈直径受CO2的影响有较大的改变，所以本菌属细菌不能孵育在CO2孵箱。276 7．判断标准见表5-50.表5-50葡萄球菌属细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感中介耐药青霉素（10U）≥29≤28参见结果解释9.1、9.3氨苄西林/舒巴坦（10/10µg）≥1512~14≤11参见结果解释9.3头孢唑林（30µg）≥1815~17≤14参见结果解释9.3头孢西丁（30µg）≥22≤21金黄色葡萄球菌和邓葡萄球菌，参见结果解释9.2、9.3≥25≤24路邓葡萄球菌以外的凝固酶阴性的葡萄球菌，参见结果解释9.2、9.3红霉素（15µg）≥2314~22≤13克林霉素（2µg）≥2115~20≤14参见结果解释9.4替考拉宁（30µg）≥1411~13≤10参见结果解释9.5庆大霉素（10µg）≥1513~14≤12左氧氟沙星（5µg）≥1914~18≤15复方新诺明（1.25/23.75µg）≥1611~15≤10利福平（5µg）≥2017~19≤16参见结果解释9.6利奈唑胺（30µg）≥21参见结果解释9.78．注意事项8.1抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。但利奈唑胺和苯唑西林纸片应使用透射光源进行观测。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。测量复方磺胺药敏纸片的抑菌圈时，可忽略微弱的生长区域，而从细菌明显抑制处量取抑菌圈直径。如在苯唑西林、利奈唑胺抑菌圈内任何可辨别的菌落生长，则报告该菌株对相应抗菌药耐药。8.2在直接从血平板上挑取菌落配制细菌悬液时需注意，来自血琼脂培养基的菌落可能带有足够的甲氧苄啶或磺胺拮抗物，因此细菌可在甲氧苄啶/磺胺甲噁唑抑菌圈内部沿着敏感菌株的周围产生模糊生长。8.3MRS检测的要点提示：用30µg头孢西丁纸片检测MRS；用直接菌落悬液（DCS）接种法（而不是生长法）;在33~35℃（不超过35℃）、空气中孵育，金黄色葡萄球菌18小时，凝固酶阴性葡萄球菌24小时；用反射光仔细查看抑菌圈，如有任何小菌落或薄膜出现均报告耐药；如果怀疑可能为MRSA,需用OXA-Nacl筛选试验确认，培养基中必须加Nacl（2%W/V）；MRS必须报告对所有头孢类和其他β-内酰胺类抗菌药物均耐药，并提示可能对氨基糖苷类、大环内酯类、克林霉素276 和四环素等抗菌药物多重耐药；携带mecA基因，或产生PBP2a的葡萄球菌菌株，必须报告为MRS.9．结果分析9.1对于青霉素抑菌圈直径≥29mm的菌株，需要检测该菌株是否产诱导性β-内酰胺酶，非产酶菌株才可报告为敏感，见产色素头孢菌素试验标准操作规程。9.2头孢西丁纸片代替苯唑西林纸片用于试验，根据头孢西丁的试验结果报告苯唑西林的敏感、中介或耐药。9.3青霉素敏感的菌株对所有青霉素类、β-内酰胺类/β-内酰胺抑制剂合剂、头孢菌素、碳青霉稀类敏感；青霉素耐药且苯唑西林敏感的菌株对于青霉素酶不稳定的青霉素耐药，但对青霉素酶稳定的青霉素类、β-内酰胺类/β-内酰胺抑制剂合剂、相关的头孢菌素、碳青霉稀类仍然敏感；对苯唑西林耐药的菌株应报告对所有的β-内酰胺类耐药。9.4红霉素耐药，克林霉素敏感的菌株应检测菌株对克林霉素的诱导耐药性，对克林霉素的诱导耐药性可通过“D”试验进行确认，即将红霉素和克林霉素纸片间隔15~26mm，35℃孵育16~18小时观察结果，如克林霉素抑菌圈在朝向红霉素纸片的方向出现“D”型变化，该菌株为对克林霉素诱导耐药的菌株，该菌株对克林霉素的药敏结果应修正为耐药。9.5葡萄球菌属对糖肽类抗菌药的敏感试验要点提示：纸片扩散试验不能区分对万古霉素敏感菌株（MIC0.5~2µg/ml）与敏感性下降的菌株（MIC4~8µg/ml）；须仔细检查MRSA对万古霉素的MIC；可用与肠球菌同样的万古霉素琼脂做筛选试验，在35℃孵育24小时，并同时用阴性质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213作对照，用VanC型VRE做阳性对照。阳性结果需用MIC试验确认对VAN的MIC；如出现对万古霉素敏感性下降的菌株（MIC≥4µg/ml），应该重复鉴定和药敏试验，并保留菌种，送参考实验室确认；如果实验室用自动分析仪做万古霉素的敏感试验，必须加做CLSI推荐的BHI-万古霉素（6µg/ml）琼脂筛选试验，或用CLSI参考方法或E试验测定MIC；替考拉宁纸片扩散试验折点对于将替考拉宁敏感菌株从替考拉宁耐药或中介的菌株中鉴别出来的能力尚待进一步的评估。9.6利福平不能单独用于抗感染治疗。9.7利奈唑胺纸片的抑菌圈应用透视光量取，如出现利奈唑胺不敏感的菌株，应用MIC法进行确认。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书肠球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05117版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范肠球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于肠球菌属的细菌。3．选药原则3.1现行版本的CLSIM02和M100对肠球菌属细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。3.3本单位上一年度肠球菌属细菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用金黄色葡萄球菌ATCC25923进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。5．材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺、标准比浊管或比浊仪。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-51.表5-51肠球菌属细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感（S）中介(I)耐药(R)氨苄西林（10µg）≥17≤16参见结果解释9.1、9.2万古霉素（30µg）≥1715~16≤14参见结果解释9.3替考拉宁（30µg）≥1411~13≤10庆大霉素（120µg）≥106参见结果解释9.4、9.5左氧氟沙星（5µg）≥1714~16≤13呋喃妥因（300µg）≥1715~16≤14利奈唑胺（30µg）≥2321~22≤20磷霉素（200µg）≥2113~15≤12氯霉素（30µg）≥1813~17≤128．注意事项276 8.1抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。药敏平板应置于无反光的黑色背景下，用反射光源肉眼观测。但万古霉素的抑菌圈应该用透视光源量取。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。如在抑菌圈内任何可辨别的菌落生长，则报告该菌株对万古霉素耐药。8.2对肠球菌属细菌而言，头孢菌素、氨基糖苷类（高浓度除外）、克林霉素和复方新诺明体外药敏试验结果可能敏感，但临床治疗无效，因此不应报告为敏感。9．结果解释9.1氨苄西林的药物敏感试验结果可代表细菌对氨苄西林和阿莫西林的敏感性。在非产酶的肠球菌中，氨苄西林敏感提示菌株对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦敏感。9.2纸片扩散法和稀释法均无法准确判断菌株是否由于产β-内酰胺酶而引起对氨苄西林和青霉素的耐药性，因此对于从血液和脑脊液分离的菌株需要用头孢噻吩进行检测菌株是否产β-内酰胺酶，见产色素头孢菌素试验标准操作规程。9.3在进行肠球菌的万古霉素药物敏感试验时，药敏平板孵育要足24小时，须用透视光源量取抑菌圈直径，对于万古霉素中介的肠球菌应用MIC进行检测，有关耐万古霉素肠球菌的检测参见《万古霉素肠球菌筛选试验标准操作规程》。9.4氨苄西林、青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗菌药需要先进行菌株对高浓度氨基糖苷类的药物敏感试验（庆大霉素和链霉素），其他氨基糖苷类抗菌药的效果并不比这两种更好，因此无需检测。9.5敏感提示可以与细胞壁活性的抗菌药（如氨苄西林、青霉素和万古霉素等）抗菌药联合使用，7~9mm为不确定，应进行琼脂稀释法或肉汤稀释法进行确认，耐药表明不能与细胞壁活性抗菌联合使用。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006（倪语星韩立中）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05118版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范链球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于链球菌属的细菌。3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。3.1现行版本的CLSIM02和M100对链球菌属纸片扩散法药物敏感试验的要求。3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。3.3本单位上一年度链球菌属细菌耐药监控数据。4．质控纸片药敏试验应使用肺炎链球菌ATCC49619进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。5．材料和仪器加5%羊血的MHA培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、测量尺、标准比浊管或比浊仪。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-52.表5-52葡萄球菌属细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感（S）中介（I）耐药（R）青霉素（10U）≥24参见结果解释9.1头孢曲松（30µg）≥24红霉素（15µg）≥2116~20≤15参见结果解释9.29.3克林霉素（2µg）≥1916~18≤15参见结果解释9.29.3万古霉素（30µg）≥17左氧氟沙星（5µg）≥1714~16≤138．注意事项276 抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。量取时应打开药敏平板盖子，用反射光源，用肉眼观测，从上侧测量抑菌圈直径。测量区域应为肉眼观察无明显可见菌落生长的区域，忽略只有用放大镜才能观察到的位于抑菌圈外缘的细菌菌落。9．结果解释9.1对青霉素敏感的链球菌菌株可以认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢克洛、头孢唑林、头孢迪尼、头孢吡肟、头孢罗齐、头孢噻肟、头孢布坦（仅对A群链球菌）、头孢曲松、头孢呋新、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢噻吩、头孢吡硫、厄他培南、亚胺培南、洛拉卡比、美罗培南等抗菌药敏感，无需对这些抗菌药进行药物敏感试验。9.2青霉素和氨苄西林被推荐用于B群链球的围产期预防用药。头孢唑啉被推荐用于非严重青霉素过敏的妇女的治疗，严重过敏的病人应使用红霉素或克林霉素。B群链球对氨苄西林、青霉素和头孢唑啉敏感，但可能会对克林霉素和（或）红霉素耐药。如果从对青霉素严重过敏的怀孕妇女分离到B群链球菌，必须进行克林霉素和红霉素的药物敏感试验并报告结果。9.3红霉素耐药，克林霉素敏感的菌株应检测菌株对克林霉素的诱导耐药性，对克林霉素的诱导耐药性可通过“D”试验进行确认，即将红霉素和克林霉素纸片间隔15~26mm，35℃孵育16~18小时观察结果，如克林霉素抑菌圈在朝向红霉素纸片的方向出现“D”型变化，该菌株为对克林霉素诱导耐药的菌株，该菌株对克林霉素的药敏结果应修正为耐药。参考文献[1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006（倪语星韩立中）编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书超广谱β-内酰胺酶测定标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-051119版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）筛选和确证试验。2．适用范围本操作规程适用于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌。3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据现行版本的CLSIM02和M100选择ESBLs筛选和确证试验所需的药敏纸片。4．质控纸片药敏试验应使用大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。肺炎克雷伯菌ATCC700603可接受的抑菌圈范围为：头孢泊肟（10µg）抑菌环9~16mm头孢他啶（30µg）抑菌环10~18mm氨曲南（30µg）抑菌环9~17mm头孢噻肟（30µg）抑菌环17~25mm头孢曲松（30µg）抑菌环16~24mm5．材料和仪器M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、测量尺。6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。7．判断标准见表5-53.表5-53纸片法检测克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌超广谱β-内酰胺酶方法初步筛选试验表型确证试验培养基Mueller-Hinton琼脂Mueller-Hinton琼脂抗微生物药物纸片浓度肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌：头孢泊肟10μg或头孢他啶30μg或氨曲南30μg或头孢噻肟30μg或头孢曲松30μg奇异变形杆菌：头孢泊肟10μg或头孢他啶30μg或头孢噻30μg头孢他啶30μg，头孢他啶/克拉维酸30/10μg和头孢噻肟30μg，头孢噻肟/克拉维酸30/10μg确认试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸的复合制剂276 使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的敏感性接种按标准纸片扩散法的规定进行按标准纸片扩散法的规定进行孵育条件35℃空气35℃空气孵育时间16~18h16~18h判读结果肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌：头孢泊肟抑菌圈直径≤17mm头孢他啶抑菌圈直径≤22mm氨曲南抑菌圈直径≤27mm头孢噻肟抑菌圈直径≤27mm头孢曲松抑菌圈直径≤25mm奇异变形杆菌：头孢泊肟抑菌圈直径≤22mm头孢他啶抑菌圈直径≤22mm头孢噻肟抑菌圈直径≤27mm上述抑菌环直径提示菌株可能产生ESBLs2个药物中有任何一个，在加克拉维酸后，抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比，增大值≥5mm时，判定为产ESBLs（例如，头孢他啶的抑菌环=16mm；头孢他啶/克拉维酸的抑菌环=21mm）质控意见当执行ESBL筛选试验时，肺炎克雷伯菌ATCC700603被用于质量评估（如训练，能力或试验评价），肺炎克雷伯菌ATCC700603或大肠埃希菌ATCC25922用于常规QC（如每周或每日）大肠埃希菌ATCC25922（应在敏感范围）肺炎克雷伯菌ATCC700603头孢泊肟抑菌环9~16mm头孢他啶抑菌环10~18mm氨曲南抑菌环9~17mm头孢噻肟抑菌环17~25mm头孢曲松抑菌环16~24mm当执行ESBL确认试验时，肺炎克雷伯菌ATCC700603和大肠埃希菌ATCC25922用于常规QC（每周或每日）大肠埃希菌ATCC25922：所测试药物联合克拉维酸后的抑菌环直径与单药抑菌环相比，增大≤2mm肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶/克拉维酸抑菌环直径增大≥5mm头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径增大≥3mm8．注意事项只有确定分离到的奇异变形杆菌与临床感染性疾病有关，才需要进行ESBLs的筛选和确证试验。9．结果解释见表5-54.参考文献276 [1]CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSupplement.CLSIdocumentM100-S19.Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,2009[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书深部真菌药物敏感试验标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05120版本：20140601生效日期：20140615共2页1．目的规范深部真菌药物敏感试验操作规程，确保药敏结果的准确。2．适用范围本操作规程适用于念珠菌属和新型隐球菌。3．选药原则根据CLSIM27-A2的建议选择以下受试药物，5-氟胞嘧啶（5-FC）、两性霉素B（AMB）、氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）、伏立康唑（VRC）。4．质控见表5-55.表5-55深部真菌药敏试验质控结果QC1:近平滑念珠菌ATCC22019QC2:克柔念珠菌ATCC62585-FCSAMBMIC≤0.5mg/LFCAMIC=1~4mg/LITRMIC≤0.125~0.25mg/LVRCMIC≤0.06~0.125mg/L5-FCI/RAMBMIC≤0.5~2mg/LFCAMIC=8~32mg/LITRMIC≤0.125~0.5mg/LVRCMIC=0.125~0.5mg/L5．试验材料和仪器ATBFUNGUS3，无菌生理盐水，ATB电子移液器。ATBF2培养基。6．操作步骤6.1打开一个0.85%氯化钠培养基安？（或API培养悬液），采集不超过4日的菌落，制备成浊度相当于2McFarland的悬浮液。用Farland试剂盒的标准浊度管比较，或使用ATB比浊仪DENSIMAT，此菌悬液必须在准备后立即使用。6.2使用一移液管转移20µl此悬浮液到一ATBF2培养基的安？中。6.3用ATB电子移液管混匀ATBF2培养基，避免产生气泡，使用ATB电子移液管在每个杯状凹中加入135µl的ATBF2培养基，盖好试条盖子。6.4把试条放入一个密封容器或是一个装有吸潮纸是的GENbox型广口容器里，在有氧条件下35℃（+2℃）的环境中，念珠菌属要培养24小时（+2小时），新型隐球菌要培养48小时（+6小时）。6.5通过ATB仪器自动判读结果。7．判断标准见表5-56，5-57.276 表5-56念珠菌分界点（单位：mg/L）药物SIR5-FC≤418~20≥32AMBNDNDNDFCA≤816~32≥64ITR≤0.1250.25~0.5≥1VRC≤12≥4表5-57新型隐球的菌分界点（单位：mg/L）药物SIR5-FC≤48~16≥32AMBNDNDNDFCA≤48≥16ITRNDNDNDVRCNDNDND8．注意事项8.1在自动读取数据前，应擦拭试条的中间部分，去除可能存在的小滴液体，以便仪器辨认试条代码。8.2一个或两个生长对照杯状凹中的生长缺失时，测试无效，必须重复进行。8.3在培养后，带有脱水的杯状凹的试条可能给予错误结果，必须重复测试。8.4对于两性霉素B(AMB)，在自动判读时，建议肉眼检查在杯状凹外围是否有个别菌落或生长。8.5不同的操作环节之间间隔时间过长（从接种液的配制到试条的培养）可能会影响结果。8.6只能使用纯培养物，混合的或是污染的培养物可能会影响结果。8.7由于希木龙念珠菌（Candidahaemulonii）的生长不稳定干扰MIC的判断，故不能使用ATBFUNGUS3条对其做检测。8.8在检测白念珠菌，都伯林念珠菌和热带念珠菌时，氟康唑，伊曲康唑和伏立康唑可出现拖尾现象，导致MIC偏高，尤其在使用仪器判断结果的时候。针对这三个药建议肉眼判读其MIC值，特别是当伏立康唑结果耐药时（因为对伏立康唑耐药的非常少见）。9．结果解释9.1由于克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，试验结果应被系统地解释为耐药（R）。9.2对于两性霉素B，MIC≥2mg/L，建议判断为耐药，（新型隐球菌通常的MIC为0.5和1mg/L。）9.3针对光滑念珠菌的检测，建议将其对氟康唑和（或）伊曲康唑敏感的结果改为中介（I），因为该菌对这两个药存在固有的敏感性低的现象。参考文献[1]ReferenceMethodforBorthDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofYeasts.NCCLSM27-A2,2002[2]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第三版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书物体表面采样及监测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05121版本：20140601生效日期：20140615共1页1．目的规范物体表面采样及监测标准操作规程。2．适用范围2.1医院感染监控重点科室，每月常规监测。2.2发生医院感染暴发流行。3．职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。4．程序4.1用5cm×5cm的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，要求采样面积≥100cm，连续采样4个。4.2用浸有含有相应中的剂（见表5-58）无菌洗脱液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转棉拭子。4.3剪去手接触部位后，将棉拭子投入10ml含有相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。4.4门把手等不规则物体表面用棉拭子直接涂擦采样。4.5计算方式5.结果判断5.1Ⅰ、Ⅱ类区域细菌总数≤5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。5.2Ⅲ类区域细菌总数≤10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。5.3Ⅳ类区域细菌总数≤15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。5.4母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的物体表面不得检出沙门菌为消毒合格参考文献[1]中华人民共和国卫生部.消毒技术规范（2002版）。2002[2]杨华明，易滨。现代医院消毒学。北京：人民军医出版社，2002编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书医疗器械微生物监测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05122版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范医疗器械微生物监测标准操作规程。2.使用范围灭菌处理后，存放在有效期内的医疗器械。3.职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。4.程序4.1制备洗脱液与培养基无菌性试验并制备阳性对照管菌液。4.2取缝合针、针头、刀片等小件医疗器械5件直接浸入需-厌氧培养管（共6管，其中1管作阳性对照）和真菌培养基（共4管）。4.3手术钳、镊子等大件医疗器械取2件用蘸有无菌洗脱液的棉拭子反复涂抹采样，将棉拭子投入5ml无菌洗脱液中，将采样液混匀，接种于需-厌氧培养管（共6管，其中1管作阳性对照）和真菌培养基（共4管）。5.结果判断5.1阳性对照在24小时内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长。5.2需-厌氧菌及真菌培养管内均为澄清或虽显浑浊但证明并非有菌生长，判为灭菌合格。5.3需-厌氧菌及真菌培养管中任何1管显示浑浊并证实有菌生长，应重新取样，分别同法重复次，除阳性对照外，其他各管不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。6.注意事项6.1送检时间不得超过6小时，若样品保存于0-4°C,则不得超过24小时。6.2被采样本表面积＜100cm2取全部表面；被采样本表面积>100cm2取100cm2。6.3若消毒因子为化学消毒剂，采样液中应加入相应的中和剂。6.4采样和培养时要在洁净度为100级单向流空气区域内进行，应严格遵守无菌操作，避免微生物污染。6.5对单向流空气区域及工作台面，必须进行洁净度验证。参考文献[1]中华人民共和国卫生部.消毒技术规范（2002版）。2002[2]钱培芬，倪语星。医院感染监控与管理。北京：军事医学科学出版社，2002编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书空气采样标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05123版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的正确进行空气微生物检测。2.适用范围2.1医院感染监控重点科室，每月常规监测。2.2发生医院感染暴发流行时。3.职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。4.程序（平板暴露法）4.1采样时间在消毒处理后、操作前进行采样。4.2布点方法室内面积≤30m2，设内、中、外对角线3点，内、外点布点位距墙壁1m处；室内面积>30m2，设4角及中央5点，4角的布点部位距墙壁1m处。4.3采样方法将普通营养琼脂平板（直径位9cm）放在室内各采样点处，采样高度距地面1.5m采样时将平板打开，扣放于平板旁，暴露5分钟，盖好立即送检。4.4计算公式细菌总数（CFU/cm3）=50000N/(A×T)注：A为平板面积（cm2）；T为平板暴露时间（min）；N为平均菌落数（CFU）4.5结果判定4.5.1Ⅰ类区域细菌总数≤10CFU/cm3（或0.2CFU/平板），未检出金黄色葡萄菌、溶血性链球菌为消毒合格。4.5.2Ⅱ类区域细菌总数≤200CFU/cm3（或4CFU/平板），未检出金黄色葡萄菌、溶血性链球菌为消毒合格。4.5.3Ⅲ类区域细菌总数≤500CFU/cm3（或10CFU/平板），未检出金黄色葡萄菌、溶血性链球菌为消毒合格。Ⅰ类环境包括层流洁净手术室和层流洁净病房。Ⅱ类环境包括普通手术室、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室洁净区、烧伤病房、重症监护室。Ⅲ类环境包括儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁区、急诊室、换药室、化验室、各类普通病室和房间。4.6注意事项4.6.1采样前，关好门、窗，在无人走动的情况下，静止10分钟进行采样。276 4.6.2平皿应新鲜透亮，当天领取使用。4.6.3如为空气采样机，按操作说明进行。参考文献[1]中华人民共和国卫生部.消毒技术规范（2002版）。2002[2]钱培芬，倪语星。医院感染监控与管理。北京：军事医学科学出版社，2002编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书医务人员手采样标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05124版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范医务人员手采样标准操作规程。2.适用范围手卫生监测3.职责医院感染管理专职人员或兼职人员应遵守本程序。4.程序4.1被检人洗手消毒后，五指并拢。4.2将棉拭子浸泡在含有相应中和剂的无菌洗脱液中。4.3用棉拭子从双手指屈面从指根到指端往返涂擦2次（一只手涂擦面积约30cm2），并随之转动采样棉拭子。4.4剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入10ml含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。4.5将采样管在混匀器上振荡20妙或用力振打80次。4.6用无菌吸管吸取1ml待检样品接种于灭菌平皿。4.7每一样本接种在2个平皿，再加入已溶化的45°C-48°C的营养琼脂15ml-18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固。4.8将平皿置于36±1°C温箱培养48小时，计数菌落数。4.9计数方法细菌总数（CFU/cm2）=(平板上菌落数×稀释倍数)÷采样面积（cm2）4.10结果判定4.10.1Ⅰ、Ⅱ类区域工作人员细菌总数≤5CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为消毒合格。4.10.2Ⅲ类区域工作人员细菌总数≤10CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄菌、大肠埃希菌和为消毒合格。4.10.3Ⅳ类区域工作人员细菌总数≤15CFU/cm2，并未检出金黄色葡萄菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为消毒合格。4.40.4母婴室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的工作人员手上，不得检出沙门菌、大肠埃希菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄菌为消毒合格。4.11注意事项被检人洗手消毒后切勿擦干。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:2007医学实验室质量和能力认可准则[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL31:20082008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008[3]中华人民共和国卫生部.消毒技术规范（2002版）。2002[4]钱培芬，倪语星。医院感染监控与管理。北京：军事医学科学出版社，2002编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书压力蒸汽锅灭菌效果监测标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-05125版本：20140601生效日期：20140615共2页1.目的规范压力蒸汽锅灭菌效果监测标准操作规程。2.适用范围2.1每次使用压力蒸汽锅灭菌时。2.2新安装的压力蒸汽锅和大修后的压力蒸汽锅。3.职责医院感染管理专职人员或压力蒸汽锅操作人员应遵守本程序。4.程序4.1化学法监测4.1.1化学指示卡（管）监测方法需每包监测。将既能指示蒸汽温度，又能指示温度持续时间的化学指示管（卡）放入每一待灭菌的物品包中央，经一个灭菌周期后，取出指示管（卡），根据其颜色及性状的改变判断是否达到灭菌条件。4.1.2化学指示胶带监测法需每包监测。将化学指示胶带粘贴于每一待灭菌物品包外，经一个灭菌周期后，观察其颜色的改变，以指示是否经过灭菌处理。4.1.3B-D试验对预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌，每日一次B-D试验。将B-D测试纸包水平放于灭菌柜内灭菌架（车）的底层靠近排气口处，柜内除测试包外无任何物品。4.2生物监测法4.2.1将两个菌片分别装入小纸袋内（也可使用自含式生物指示物），置于标准试验包中心部位。4.2.2灭菌柜室内，排气口上方放置一个标准试验包（由三件平纹长袖手术衣，4块小手术衣，2块中手术巾，1块大毛巾，30块10cm×10cm8层纱布敷料包裹成25cm×30cm×30cm大小）。4.2.3经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气储存盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，经56°C±1°C培养7日（自含式生物指示物按说明书执行），观察培养基颜色变化。4.2.4检测时设阴性对照和阳性对照4.3结果判定4.3.1化学监测法所放置的指示管（卡）、胶带的性状或颜色均变至规定的条件，判为灭菌合格；若其中之一未达到规定的条件，则灭菌过程不合格。B-D试验；经过132°C，3-5分钟后，取出一次性B-D包观察变化。均匀一致变色，说明冷空气排除效果较好，灭菌器可以使用，反之，则灭菌器有冷空气残留，测试不合格。新安装的和大修后的设备应进行B-D试验标准包测试，试验应该重复3次。276 4.3.2生物检测法每个指示菌片接种的培养基都不变色，判定为灭菌合格；指示菌片之一接种的培养基，由紫色变为黄色时，则灭菌过程不合格。4.4注意事项4.4.1化学监测检测所有的化学指示物需经卫生部批准，并在有效期内使用。4.4.2生物监测生物指示物监测应每1月1次。指示菌株：为耐热的嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC7953或SSIK31株）。监测所有菌片需经卫生部认可，并在有效期内使用。参考文献[1]中华人民共和国卫生部.消毒技术规范（2002版）。2002[2]钱培芬，倪语星。医院感染监控与管理。北京：军事医学科学出版社，2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书结果报告程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0601版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范结果报告程序，确保结果报告的准确性。2.适用范围微生物检验报告单。3.职责报告审核。4.程序4.1微生物实验室各岗位检验人员完成报告，由负责人或指定人员审核。4.2只有当质控结果符合要求时，才可发出临床报告，否则应重新测定。4.3细菌鉴定应报告到种，不能鉴定的细菌应尽可能鉴定到属。药敏感试验应严格遵循CLSI标准，报告敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。4.4分泌物、尿液、引流液等标本培养48小时未见可疑菌落，则报告“培养两日无菌生长”。4.5脑脊液、穿刺液等标本培养48—72h未见可疑菌落，则报告“培养2或3日无细菌生长”。4.6痰液或咽拭子标本培养至48h为检出致病菌，则报告“正常菌群生长”。4.7粪便或肛门拭子等肠道标本培养至48h未见可疑菌落，则根据申请项目报告“无**菌生长”，如“无沙门菌、志贺菌生长”。4.8拭子、分泌物、尿液、引流液等真菌标本培养每日观察培养基，结果连续观察7日未见可疑菌落，则报告“未培养出酵母样真菌”。4.9分枝杆菌检验标本培养每周观察1—2次培养基斜面，结果连续观察8周未发现可疑菌落生长，报告“未培养出分枝杆菌”。4.10定性结果为“阴性”或“阳性”报告；定量或半定量项目，阳性结果应报告最高稀释度，阴性报告应报最低稀释度。4.11报告内容应包括姓名、性别、年龄、送检项目、标本类型、样本号、结果、标本接受日期、报告日期、操作者和审核者的签名等。4.12报告单应及时发出。门诊病人报告单由本人领取，病区报告单由专人送至各病区，并签收。4.13电话报告结果时，应先确认对方身份，核对病人姓名、病区床号、检测项目等情况，方可报告，并告知对方检测结果以最终报告为准。4.14当病人要求需邮寄报告时，应由病人本人或家属填写地址及邮政编码等。4.15实验室工作人员应为病人的检测结果保密，不得提供给非相关人员。4.16检测结果的报告应准确、客观和及时，禁止虚假报告。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室危急值报告程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0602版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范危急值报告程序，及时报告结果。2.适用范围HBVDNA、CTDNA阳性。3.职责微生物检验检验检验室的工作人员应当及时报告危急值结果。4.操作程序4.1结果阳性时，首先对检测过程进行仔细检查，排除污染。4.2核实后将结果报告临床并记录在《危急值报告记录表》，报告时间具体到时、分。并做好相应记录，如报告结果、报告者工号、病区接电话者工号等。4.3做好相应记录，如报告结果、报告者姓名、病区接电话者姓名等。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室传染病报告程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0603版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范传染病报告程序，为传染病暴发、流行提供及时和准确的信息。2.适用范围甲类和乙类法定传染病。3.职责微生物检验检验检验室的工作人员为责任报告人。4.操作程序4.1如检测出可疑的甲类或乙类法定传染病病原体时，首先由微生物检验检验实负责人或指定人员复核。并联系临床医师，了解临床病情，了解病人资料及联系方式。4.2复核无误后，通过网络上报或填写传染病报告表，在规定时限内上报，并登记在《传染病报告记录表》存档。4.3按照疾病预防控制中心的要求，有些传染病如HIV、霍乱、鼠疫等须立即向科主任和医务处汇报，需由CDC复核并作出最终报告。4.4严禁漏报、迟报、谎报疫情。4.5未经许可，不得随意扩大或泄露报告信息。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室资料、数据保存和备份程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0604版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范资料、数据的保存和备份程序，确保检验结果的溯源。2.适用范围实验室内所有的文档及记录，包括检验原始记录、原始数据、检验结果、室间室内质控资料等。3.职责检验人员负责记录和保存；微生物检验实验室负责人检查督促。4.程序4.1实验室内所有文档及记录，包括检验原始记录、原始数据、检验结果、室间室内质控资料等应集中保存，以备查询（保存2年）。4.2实验室内所有的文档和记录不能涂改。4.3电子资料（原始数据及检验结果）应设置密码保护，设立权限管理。由实验室专人负责备份，由网络管理人员统一存档保存。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室更改报告程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0605版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范更改报告程序。2.适用范围微生物检验实验室的检验结果报告。3.职责微生物检验检验检验室的工作人员更改，实验室负责人审核。4.程序4.1当发现已发出的检验报告有误需要更改时，首先查找错误原因，及时和临床医师沟通。应将原报告收回、注销，重新发出一份新的检验报告。新报告的编号与原报告一致，经原检验者、原审核者审核后方可报告。4.2并在原始申请单或LIS系统的备注后方报告。4.3总结分析错误根源，制定相应措施并记录备案，培训和教育员工，杜绝错误再次发生。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书微生物检验实验室检验后标本管理程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0606版本：20140601生效日期：20140615共1页1.目的规范检验后标本的保存程序，保存标本以备查。2.适用范围微生物检验实验室的所有类型标本。3.职责微生物检验实验室的工作人员保存标本。4.程序4.1实验室检测完成后的标本应密封保存在-700C以下冰箱内，要有明确标识，并记录在《标本管理记录表》上，保存期为2年，以备复查。4.2保存期过后的标本和培养物高压灭菌后按感染性废物处理，并记录在《标本管理记录表》上。参见《废弃物处理程序》。参考文献[1]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189：2007）.2008编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276 XXX医院检验科微生物检验实验室作业指导书菌种保存程序文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0607版本：20140601生效日期：20140615共3页1．目的规范菌种保存程序。2．范围微生物实验室保存的标准菌种和来自临床的标本菌株。3．职责微生物实验室检验人员正确执行本程序。4．程序4.1需氧菌保存法4.1.1一般保存法见表6-1表6-1常见菌种培养基保存期限菌种培养时间培养基保存温度保存时间流感嗜血杆菌18-24脱纤维羊血或脱脂牛奶-206个月葡萄球菌、链球菌18-24血琼脂斜面（高层加液体石蜡）4—81—3年肠杆菌科18-24Soxbean酪蛋白琼脂（高层加液体石蜡）4—81年肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌等18-24牛肉汤（6份肉汤+4份甘油或10%胰大豆肉汤或10%-15%甘油）-206个月苛养菌18-245%小牛血清肉汤-206个月分枝杆菌18-24罗氏培养基（加液体石蜡）4—83个月幽门螺杆菌18-24心脑浸液或布氏肉汤加入甘油-706年注：保存郡主均需培养18~24h。4.1.2冷冻干燥法将待保存菌培养18~24小时后，挑取菌落加入一定量的牛肉汤或心脑浸出液加入20%的蔗糖，混匀，分装于安瓿中，置-70℃低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置低温冰箱保存。大多数菌株可保存10年以上，甚至更长。4.1.3超冰冻法保存菌株初代培养18~24小时的菌落、菌苔，加入0.5~1.0ml无菌脱纤维羊血安瓿中，封口，置液氮或-40℃冰箱中保存。4.2厌氧菌保存法4.2.1短期保存方法4.2.1.1疱肉培养基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成疱肉培养管，接种待保存菌株，然后覆盖276 1~2cm的石蜡，再将培养管垂直放置片刻，待石蜡凝固置35℃培养（无芽胞厌氧菌培养72小时，普通梭菌培养24小时，产气荚膜梭菌和多枝梭菌培养2周左右），最后置室温或-20℃保存。发酵糖类的厌氧菌每个月转钟1次，不发酵糖类的厌氧菌3~6个月转钟1次。4.2.1.2半固体培养基保存法在上述液体培养基中加入.0.2%~0.5%琼脂，制成半固体培养基，接种时用毛细管将待保存的厌氧菌的菌液加入半固体培养管底，表面加入1~2cm厚度的液体石蜡，密封管口，培养48小时，置室温或-20℃保存。4.2.1.3甘油乳剂培养基保存法在厌氧液体培养基（含胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸液、L-半胱氨酸和维生素K等）中加入少量牛肉渣分装于长试管中，接种待保存菌株，置35℃培养48~72小时，取出后加入无菌甘油（按1:1比例），盖紧盖子后用石蜡封口，置4℃或-20℃保存。此法适用于保存脆弱拟杆菌、产黑色素普雷沃菌和具核梭杆菌。4.2.2长期保存法4.2.2.1低温冷冻保存法（厌氧菌在低温条件下新陈代谢处于抑制状态，不繁殖也不死亡）培养基包括脱纤维羊血、兔血或马血，20%脱脂牛乳，7.5%葡萄糖的马血清。将待保存菌株（培养24~48小时）加入上述培养基中，封好瓶口，置-70℃液氮或-70℃低温冰箱中保存。菌种不同造成保存时间差异，最长可保存10年，最短可保存2年以上。4.2.2.2冷冻真空干燥法冷冻真空干燥法的培养基（保存剂）有两种，一种是用10%~20%脱脂牛奶加入0.1%的谷氨酸钠和0.03%的L-半胱氨酸，煮沸15分钟消毒，冷却备用。另一种是用10%蔗糖与马血清的混合液，过滤灭菌，并置厌氧环境中预还原，分装备用。将培养48小时左右（处于生长静止期）的厌氧菌落或菌苔刮下，加入一定量的上述培养基，混匀分装于安瓿中，置-20℃低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置4℃环境下长期保存。4.3结核分枝杆菌保存法4.3.1短期保存方法（悬浮液低温保存法）结核分枝杆菌充分悬浮于经高压灭菌的20%丙三醇-生理盐水中，保藏在-20℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保存1年以上。4.3.2长期保存方法（悬浮液超低保存法）10mg结核分枝杆菌充分悬浮于冻存溶液（6g胰蛋白胨溶于100ml20%丙三醇水溶液）中，保藏温度-70℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保存5年以上。4.4真菌菌种保存法4.4.1冰冻保存法冰冻保存有助于抑制真菌，尤其是抑制皮肤癣菌发生多形性变化，即变异（当其培养物变成白色蓬松绒毛状时，真菌就失去所有特征性的颜色及形态学特征，甚至会停止产生各种孢子，由此会导致菌种鉴定困难）。真菌接种在沙氏培养基上培养8~10276 日或直至见到菌落将近要全面覆盖培养基时，将试管置于-20℃冰箱中保存。4.4.2石蜡油保存法真菌接种于沙氏琼脂上，25℃培养，酵母菌2~4日，产孢子的丝状真菌需形成成熟的孢子，不产孢子的真菌生长成健壮的菌丝为止。覆盖2cm的无菌石蜡（矿物）油（石蜡油的灭菌一般在1小时以上，然后将自然冷却的石蜡油加入含真菌的试管中，使液面高于斜面顶部1cm左右）。使用此方法，许多真菌可在室温下存活数年。在恢复培养时，先从石蜡油下面挑取一小块（2~3mm3）菌落，沿试管壁边挑取边挤压过多的石蜡油（因石蜡油过多会抑制真菌生长），然后接种于沙氏琼脂斜面上，培养数日并观察生长情况。4.4.3水保存法将真菌接种于培养基的斜面上，待培养成熟后，将无菌蒸馏水直接注入试管中，冲洗下孢子和菌丝，简便易行，经济，效果好。在恢复培养时，取混悬液接种于SDA培养基中即可。大多数真菌均可用这种方法保存数年（最长12年）。参考文献[1]周庭银编著.《临床微生物学诊断与图解》.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2]中华人民共和国国务院令第424号。病原微生物实验室生物安全管理条例。2004编写人：AAA、BBB操作人：本室操作人员批准人：276