环境微生物实验指导书2010.5.25(修改)

环境微生物学实验指导龙建友崔明超夏建荣编广州大学环境科学与工程学院二零壹零年四月-35- 实验室守则为了维持环境工程微生物实验室的工作秩序，保证环境工程微生物学实验的教学质量，特制定本守则。1.进入环境生物学实验室的学生必须严格遵守实验室的各项规章制度。2.认真预习《环境微生物学实验指导》，明确每次实验的目的、要求、原理和方法，做到心中有数。3.仔细观摩实验指导老师的讲解和示范，了解仪器设备的基本技能，掌握实验操作的基本要领，严格按照规程操作。4.珍惜每次实验机会，重视各项试验技能，认真观察实验现象，如实做好实验记录。5.需集中处理的物品，应注明组别、名称及处理方法，放在教师指定的地方。6.实验结束后，做好仪器设备、试剂药品等整理工作，经教师验收后，将仪器设备放回原处。值日学生做好实验室的清洁卫生工作。7.提倡科学严谨的实验作风。仔细整理实验结果，认真完成实验报告，并将报告按时交给指导老师披阅。8.爱护国家财产。如因违规操作而损坏仪器设备，须按学校有关规定赔偿。9.保持实验室安静，维护实验室整洁。-35- 目录实验一光学显微镜的使用实验二培养基的制备与灭菌实验三空气微生物的检测实验四水中细菌总数的测定实验五土壤微生物的计数法实验六微生物的染色实验七水中总大肠菌群的测定实验八环境样品蛋白质含量的测定实验九重金属污染物对光合作用强度影响的测定实验十叶绿素a的测定实验十一聚合酶链反应-35- 实验1通光学显微镜的使用普通光学显微镜简称光学显微镜（lightmicroscope），以平均波长为550nm的可见光作为光源，能分辨的两点距离为0.22。多数细菌的个体大于0.25µm，因此可在光学显微镜下观察。由于许多细菌的大小与光学显微镜的分辨率处于同一个数量级，为了看清细菌的形态与结构，经常使用油镜来提高显微镜的分辨率。在光学显微镜的使用中，油镜的使用是一项十分重要的操作技术。一、目的要求1．了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。2．学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。3．在油镜下观察细菌的几种基本形态。4．采用悬滴法在高倍镜下观察细菌运动。二、基本原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。1．机械系统机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。（1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。（2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3~5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；装有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。-35- （6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。2．光学系统光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故又称它为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之央光阑上粘上一小段细发可用作指针，指示视野标本的位置。在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数。可按需选用。（2）物镜：它的功能是民标本放大，产生物像。物镜可分为低倍镜（4×或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40×~60×）和油镜（100×）。一般油镜上刻有“OI”（oilimmersion）或HI（homogeneousimmersion）字样，有的刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numericalaperture，简称NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数。以油镜为例，100/1.25表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜（简称低倍物镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反应，便于看清标本。（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。（二）普通光学显微镜的性能。1．数值孔径数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。式中1-1中，n为物镜与标本之间介质的折射率，α为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角。物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔越大，物镜的性能越好。因为镜口角α总是小于180º，所以的最大值不可能超过1。又因为空气的折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05~0.95。根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率。使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2~1.4。2．分辨率分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点点的最小距离（D）表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。-35- 式1-2中，λ为光波波长。比较式1-1和式1-2可知，D可表示为：根据式1-3，在物镜数值孔径不变的条件下，D值的大小与光波波长成正比。要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：①采用短波光源。普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为400~700nm。缩短照明光源的波长可以降低D值，提高物镜分辨率。②加大物镜数值孔径。提高镜口角α或提高介质折射率n，都能提高物镜分辨率。若用可光作为光源（平均波长为550nm），并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本，能分辩出的两点距离约为0.22µm。3．放大率普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大。所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。因此，显微镜的放大率（V）是物镜放大倍数（V1）和目镜放大倍数（V2）的乘积，即：V=V1×V2（1-4）如果物镜放大40倍，目镜放大10倍，则显微镜的放大率是400倍。常见物镜（油镜）的最高放大倍数为100倍，目镜的最高放大倍数为15倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。4．焦深一般将焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。三、实验器材1．菌种：培养12~18h的枯草杆菌（Bacillussubtilis）斜面培养物3~4支。2．标本片：细菌三种基本形态的染色标本，特殊形态细菌染色标本（示范镜）。3．仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或1：1的乙醚酒精溶液），擦镜纸。4．其他用品：盖玻片，凹玻片，吸水纸，酒精灯，接种环，牙签，凡士林。四、实验程序（一）显微镜（油镜）操作1．领取并检查显微镜：按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移，轻轻放置在实验台上。检查各部件是否齐全，镜头是否清洁。若发现有问题应及时报告老师。2．调节光源：良好的照明明保证显微镜使用效果的重要条件。将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；若自然光线较弱，则可用凹面反光镜）。然而，调节聚光器的位置（酌予升降），直至视野内得到均匀适宜的亮度。3．低倍镜观察：使用低倍观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央，用压片夹固定-35- ，并将标本部位移到正中，转动粗调螺旋，使镜头与标本的距离降到10mm左右。然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋，继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察。4．中、高倍镜观察：依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。如果油镜上升至离开油面还未看清物像，则需重新调节。可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，以免击碎玻片，损坏镜头。6．调换标本：观察新标本片时，必须重新从第3步开始操作。7．用后复原：观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲或1：1的乙醚酒精溶液（香柏油可溶于二甲苯及1：1的乙醚酒精溶液），擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯（或1：1的乙醚酒精溶液），最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。降低镜筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放收指定的显微镜柜内。（二）细菌形态观察1．结合显微镜（油镜）的使用，观察三个细菌染色片（球菌、杆菌、和螺旋菌。2．看示范镜，观察双球菌和四联球菌，并绘图。（三）细菌运动性观察有些细菌具有鞭毛，能在水中自由运动。细菌运动常用水浸片法和悬滴法观察。1．水浸片法用接种环取培养12~18h的枯草杆菌菌液一环，置于干净的载玻片中央，盖上盖玻片（图1-16，注意不使产生气泡），用低倍镜找出目标后，再换用中倍至高倍镜观察。2．悬滴法取一洁净的盖玻片，用牙签挑取少量凡士林，涂于盖玻片四有；再按无菌操作要求，用接种环从斜面底部取培养12~18h的枯草杆菌菌液一环，置盖玻片中央（菌液呈水珠状）；接着取凹玻片一块，将凹窝向下覆盖在带有菌液的盖玻片上；翻转凹玻片，使液滴悬于盖玻片表面。悬滴片制成后，先用低倍镜找到水滴，再换高倍镜观察，可以看到活跃的细菌运动。五、注意事项1．不要擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏设备。2．拭擦镜面请用擦镜纸，不要用手指或粗布，以保持镜面的光洁度。3．观察标本时，请依次用低倍、中倍、高倍镜，最后再用油镜。在使用高倍镜和油镜时，请不要转动粗调螺旋降低镜筒，以免物镜与载玻片碰撞而压碎玻片或损伤镜头。4．观察标本时，请两眼睁工，一方面养成两眼轮换观察的习惯，以减轻眼睛疲劳，另一方面养成左眼观察、右眼注视绘衅的习惯，以提高效率。5．取显微镜时，请用右手紧握镜臂，左手托住镜座，切不可单手拎镜臂，更不可倾斜拎镜臂。6．沾有有机物的镜片会滋生霉菌，请在每次使用后，用擦镜纸擦净所有的目镜和物镜，并将显微镜存放在阴凉干燥处。-35- 实验2培养基的制备与灭菌一、目的要求学习和掌握营养琼脂培养基、查氏培养基和高氏一号培养基的配制方法。二、基本原理营养琼脂培养基是一种广泛用于细菌的培养基，主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它们主要提供细菌生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等。查氏培养基是一种广泛用于霉菌的培养基，在配制过程中，不经pH调节而呈自然状态。高氏一号培养基是一种用于放线菌的合成培养基，以可溶性淀粉作为碳源和能源，硝酸钾作为氮源，磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁作为无机盐。三、实验器材1．药品和试剂：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，马铃薯，蔗糖，可溶性淀粉，K2HPO4，KNO3，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，1mol/LHCl和1mol/LNaOH等。2．仪器：天平，电炉，pH计。3．玻离器皿：移液管，烧杯，量筒，锥形瓶，培养皿，玻璃漏斗，玻棒，带有棉塞的无菌试管，带铝盖的试管等。4．其他物品：刻度搪瓷杯，药匙，称量纸，pH精密试纸，记号笔，纱布，线绳，牛皮纸，报纸，标签等。四、实验程序（一）营养琼脂培养基的配制营养琼脂培养基的配方见下表，配制步骤如下。1．材料用量的计算根据配方以及所需配制培养基的数量，称取或量取所需的材料，在本实验中，先将配方中的各种材料配成浓缩液：10%牛肉膏、10%蛋白胨、10%氯化钠。如果需要配制300mL培养基，则吸取10%牛肉膏15mL，10%蛋白胨30mL，10%氯化钠15mL，称取琼脂6g。表1营养琼脂琼脂培养成分组分含量（每1000mL培养基）灭菌条件牛肉浸膏蛋白胨氯化钠琼脂自来水pH5g10g5g20g1000mL7.2~7.41.21kg/cm220min2．配制将吸取的材料加入有刻度的搪瓷烧杯，用自来水补足300mL，并记下刻度。在电炉上加热溶解，并用玻棒搅匀。3．调节pH按照要求，将pH调节至7.4。从电炉上取下搪瓷杯，用玻棒蘸取少量培养液至pH试纸上，与比色卡对照得出pH值。根据偏差大小，分别滴入浓度1mol/LHCl或NaOH溶液进行调节，并不断用pH试纸检测pH值，直至达到预期的pH值。4．加入琼脂在液体培养基中加入称好的琼脂6g，加热至沸腾，期间不断用玻璃搅拌，以防糊底，直至琼脂完全熔化。最后补足蒸发损失的水分。5．分装培养基培养基的分装应当趁热在漏斗架上完成。在带有棉塞的无菌试管中，每支分装5mL，共10支，用于制作斜需。带有铝盖的试管各装10mL，共20支，用于制作平板。6．包扎成捆以10支为一捆，用防水纸包扎成捆，挂上标签，灭菌备用。-35- （二）查氏培养基的配制查氏培养基培养基的配方见表2，如需配制1000mL培养基，操作步骤如下。表2查氏培养基成分组分含量（每1000mL）灭菌条件硝酸钠　蔗糖（或葡萄糖）　磷酸氢二钾　自来水琼脂pH3g30g1g1000mL20g自然1.21kg/cm220min（三）高氏一号培养基的配制高氏一号培养基的配方见表3，如需配制1000mL培养基，操作步骤如下：表3高氏一号培养基配方组分含量（每1000mL培养基）灭菌条件可溶性淀粉KNO3K2HPO4MgSO4·7H2ONaClFeSO4·7H2O琼脂自来水pH20.0g1.0g0.5g0.5g0.5g0.01g20g1000mL7.2~7.41.21kg/cm220min1．计算称量吸取1%KNO330mL；1%K2HPO415mL；1%MgSO4·7H2O15mL；1%NaCl15mL；1%FeSO4·7H2O0.3mL，置电炉上加热。2．淀粉预处理用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉6g，从300mL水中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待前一只搪瓷杯内的培养液沸腾后，将淀粉糊洗入培养液中，搅匀。3．调节pH从电炉上取下搪瓷杯，按照配制细菌培养基的方法，用NaOH或HCl将pH调节至7.4.4．加入琼脂加入琼脂6g，在加热的同时，不断用玻棒搅拌，要求将底部的淀粉糊搅起来，以防糊底。加热至琼脂完全熔化。5．分装培养基趁热分装培养基，取10支无菌棉塞试管，各分装5mL，另取20支铝盖无菌试管，各分装10mL。后续步骤同细菌培养基的配制。五、注意事项1．由于配制培养基所需的材料较多，称取材料后，最好根据配方核对一遍，以免搞错。2．在配制培养基的过程中，各材料按照配方所列次序添加。所用容器的大小应为培养配制量的两倍，以便操作。3．熔化琼脂时，要控制火力，并不断搅拌，以免琼脂烧焦和外溢。4．用于分装培养基的容器应当洁净并经灭菌。分装培养基的动作要快，以防培养基凝固。如果分装量难以控制，可用装好等体积自来水的同规格试管作为参照。切勿让培养基沾污试管口，以免招致杂菌污染。-35- 实验3空气微生物检测一、目的要求l．学习空气中微生物数测定的方法。2．了解一定环境空气中微生物的分布情况，学习并掌握检定空气微生物基本方法。二、器材l．培养基   营养琼脂培养基、高氏合成一号培养基、查氏培养基、无菌水。2.仪器或其他用具   灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。空气中微生物的数量及种类常因污染源及污染程度不同而异。空气污染物多以气溶胶形式存在，微生物气溶胶也可以污染食品或水源。人类很多疾病从空气直接传染，经空气传播的病原菌主要有结核杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎球菌、感冒病毒、麻疹病毒等。因此，空气中微生物污染情况的检验，目前在许多行业中倍受重视，一般以细菌和真菌作为检测目标。空气中细菌的检验方法较多，在此介绍一种常见而简单的方法。沉降法将盛有培养基的平板放在空气中暴露一定时间，经培养后计算出其上所生长的菌落数。此法简单，使用普遍，由于只有一定大小的颗粒在一定时间才能降到培养基上，因此，所测得微生物数量欠准确，检验结果比实际存在数量少，并且也无法测定空气量，所以，仅能粗略计算空气污染程度及了解被测区微生物的种类。具体步骤如下：1、将已制备好的营养琼脂、查氏培养基和高氏合成一号培养基三种平板置于检测地点，打开平板盖在空气中暴露5-10min；2、盖上培养皿盖，置于37℃培养24-48h，根据平板上所生长的菌落数计算出1m3或者1L空气中的细菌总数；3、计算，奥梅梁斯基认为：在面积为100cm3平板琼脂培养基表面上，5min降落的细菌数经37℃培养24h所生长的菌落数和10L空气中所含的细菌数相当。根据奥氏公式计算X=N×100×100∏r2在公示中，X表示每1m3空气的细菌个数，N表示5min降落在平板上，经37℃培养24h后所生长的菌落数，r表示平板的半径，记录空气中微生物的种类和相对数量，并将结果填入下表中。菌落结果细菌霉菌放线菌室内5min10min室外15min10min-35- 实验4水中细菌总数的测定一、目的要求l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2．了解水质状况与细菌数量在饮水中的重要性。二、基本原理本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、器材l．培养基   营养琼脂培养基，无菌水。2.仪器或其他用具   灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤l．水样的采取(1)自来水   先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样。(2)池水、河水或湖水   应取距水面l0～15cm的深层水样，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2．细菌总数测定(1)自来水(2)池水、河水或湖水等①稀释水样   将水样稀释为10-1、10-2与10-3浓度。三个稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3 、10-4-35- 三个连续稀释度。3．菌落计数方法(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。(2)首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。记录不同稀释度平板中细菌得数量情况，填入下表中。　稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）　　　1　　　　　　2　　　　　　3　　　　　　4　　　　　　5　　　　　　6　　　　　　7　　　　　　五、思考题1、从自来水细菌总数结果来看，是否合乎饮用标准？2、你所测得得水源水污秽程度如何？3、国家对自来水得细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计条件(培养温度、培养时间)来测定水样总数呢？为什么？-35- 实验5土壤微生物的计数法一、目的要求学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。二、基本原理平板菌落计数法是实验室最常用的活菌计数法。在高度稀释条件下，待测样品中的微生物被分散成单个细胞，经过适当培养，每个细胞可以在固体培养基上形成单个菌落。根据对样品进行系列稀释，使其中的微生物分散成单个细胞，否则一个菌落就不只代表一个细胞。计数时，需要取适当稀释度的菌液接种于固体平板培养基上，否则会因菌落太多而无法准确计数。一般以直径9cm平板上出现30~300个菌落为宜。采用本法测得的菌数是培养基上生长出来的菌落数量，故被称为活菌计数法。三、实验器材1．待测样品：新鲜活性污泥液。2．培养基：营养琼脂培养基，查氏培养基、高氏合成一号培养基。3．仪器：恒温培养箱，电炉，恒温水浴锅。4．其他用品：45mL无菌水（装在三角瓶中，并带有玻璃珠10粒），9mL无菌水（装在试管中），无菌培养皿，无菌移液管，无菌三角玻璃棒，酒精灯，火柴，记号笔。四、实验程序（一）制作平板培养基将融化的培养基冷却至55~60℃，右手持盛培养基的三角瓶于火焰旁，用左手将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，倒入大约15mL培养基，盖好皿盖，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，在桌面上冷凝成平板，备用。（二）制备土样稀释液用无菌移液管吸取5新鲜污泥液，放入盛有45mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，用手或在摇床上振荡10~20min，使污泥与水充分混匀并将细胞分散，即成10-1稀释液。用1mL无菌称液管吸取1mL菌悬液，加至盛9mL无菌水的试管中，混合均匀即成10-2稀释液，以此类推，可制成10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的菌悬液。（三）涂布培养稀释平板计数的操作过程如下。1．取样接种：用记号笔在平板上做好标记，分别用无菌移液管吸取0.1mL10-4、10-5、10-6污泥稀释液，加至对应的平板培养基中央，每个稀释度设三个重复。2．涂布平板：右手拿无菌三角玻棒，左手拿加好稀释液的平板，将皿盖在火焰旁打开一条缝进行涂布。涂布时，使无菌三角玻棒沿同心圆方向轻轻地向外扩展，让稀释液均匀分布至整个平板表面。3．倒置培养：在室温静止5~10min，使菌液渗入培养基。然后，将平板培养基倒置于恒温培养箱中培养48h，平板表面长出菌落。（四）计数从3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出被测样品中的含菌数。筛选适宜稀释度（即计算稀释度）的标准是：1．在每个平皿中，细菌、放线菌、酵母菌的菌落数为30~300个，霉菌的菌落数为10~100个。2．同一稀释度的各个重复之间，菌落数不能相差太大。-35- 3．从低稀释度到高稀释度，以菌落数递减10倍为基础，各稀释间的递减误差越小越好。4．菌悬液的含菌数可按下面公式进行计算：新鲜花污泥液含量（个/mL）=平均落数×稀释倍数五、注意事项1．预先制好平板，并将其放入30℃恒温培养箱，去除平板上的存留水或皿盖上的冷凝水。否则，平板上的冷凝水会影响检测结果。2．当平板上出现大片菌苔时，应弃除该皿的菌落数。（四）四大类微生物菌落形态的识别和比较微生物的个体形态是群体形态的基础，群体形态则是无数个体形态的集中反映，每一类微生物都有一定的菌落特征，大部分菌落都可以根据形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征来识别。熟悉和掌握四大类微生物（即细菌、酵毒菌、放线菌和霉菌）的形态特征，对于菌种的识别和筛选具有重要作用。四大类微生物菌落的基本特征见表12-1。表12-1细菌、酵毒菌、放线菌和霉菌菌落的形态特征及主要区别类群特征项目细菌放线菌真菌酵母菌霉菌菌落表面形态特征圆形或不规则；边缘光滑或不整齐；大小不一，表面光滑或皱褶；颜色不一，常见灰白色、乳白色；湿润黏稠与细菌比较，主要区别为表面干燥，呈细致的粉末状或茸毛状颇似细菌的菌落，一般圆形，表面光滑，但不及细菌菌落湿润、黏稠；多显乳白色与细菌比较，差异显著。与放线菌比较，表面呈绒毛状或棉絮状，如呈粉末状，则不及放线菌致密菌落在培养基上生长情况整个菌落易用接种环从培养基表面刮去菌落表面的粉末或茸毛（气生菌丝和孢子丝）可用接种环从培养表面刮去，但菌落基部（基质菌丝）不易用接种环刮去，留下圆形、密实的基部菌丝状与细菌相似与放线菌比较，整个霉菌菌落可用接种环从培养基表面刮去，不会在培养基上留下圆形、密实的基部菌丝块。菌落生长过程从菌落形成到成熟，主要变化为增大、增厚、颜色加深初期出现由密实的基质菌丝构成的菌落，随后菌落表面出现细致、绒毛或粉末状的气生菌丝和孢子丝，并呈现不同颜色与细菌相似初期出现白色或无色的绒毛状或棉絮状菌落，随后霉菌形成孢子，呈现粉末状和不同颜色可能出现的气味臭味土腥味、冰片味酒香味霉味四大类微生物在个体和菌落上的主要区别是：1．细胞形态细菌——小而分散。酵母菌——大而分散。-35- 放线菌——细丝状。霉菌——粗丝状。2．菌落形态细菌——表面湿润，小而薄。酵母菌——表面湿润，大而厚。放线菌——表面干燥，小而致密。霉菌——表面干燥，大而蓬松。-35- 实验6微生物的染色细菌的基本形态主要有球状、杆状、和螺旋状。在适宜的生长条件下，细菌细胞一般在幼龄阶段呈现物定形态。但右培养条件发生变化或培养物老龄化，菌体形态会出现异常。细菌个体微小且无色透明，对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，直接在显微镜下观察，不易看清它们的真实面目。对菌体进地染色，可以增加反差，显现细菌的一般结构和特殊结构。染色技术是微生物形态学研究的重要手段，它可分为简单染色、鉴别染色和特殊染色三种类型。一、简单染色（一）目的要求1．学习细菌涂片的基本技术。2．掌握细菌简单染色法。3．熟练掌握显微镜油镜的使用技术。（二）基本原理简单染色是采用一种染料使细菌着色的染色方法。微生物细胞含有蛋白质、核酸等两性电解质，在酸性溶液中离解出碱性基团而带正电荷，在碱性溶液中离解出酸性基团而带负电荷。细菌的等电点为。在中性（pH7）、碱性（pH＞7）或偏酸性（pH6~7）溶液中，细胞的等电点低于溶液的pH值，因此菌体一般带负电荷。因为电离后碱性染料带正电荷，可与菌体内的负电荷结合，所以在细菌学研究中大多采用碱性染料进行染色。常用的碱性染料有碱性复红、番红、结晶紫、孔雀绿、美蓝等。（三）实验器材1．菌种：芽孢细菌2．染色液：石炭酸复红染色液。3．仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或1：1的乙醚酒精溶液），擦镜纸。4．其他用品：蒸馏水，载玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，无菌牙签。（四）实验程序简单染色的操作过程如下。1．涂片：取一片洁净无油污的载玻片（通常保存于盛有酒精的广口瓶内，用镊子取出载玻片，在酒精灯上引燃载玻片表面的酒精，冷却后即可使用），在中央滴一小滴蒸馏水，用无菌牙签取少许牙垢，与水滴混匀，涂成薄层（直径约为10mm）。2．干燥：让涂片自然干燥，也可将涂面朝上在酒精灯上稍稍加热，使其干燥。注意切勿离火焰太近，温度过高会破坏菌体形态（用手背接触载玻征反面，以皮肤不觉得烫为宜）。3．固定：涂片染色前必须先固定，目的是杀死细菌，使菌体粘附于载玻片上，同时增加菌体对染料的亲和力。固定时应尽量维持菌体原有形态，防止细胞膨胀或收缩。手执载玻片，涂面朝上，在酒精灯上快速通过火焰3次。待载玻征冷却后，再进行染色。4．染色：将载玻片置于平台上，在整个涂面上滴加石炭酸复红染色液，染色1min左右。5．水洗：染色时间一到，倾去染色液，用自来水细流冲洗涂片，直到流水中无染料颜色为止。6．干燥：可轻轻甩去载玻片上的水珠，使其自然干燥；也可用吸水纸吸去载玻片上的水珠。7．镜检：用低倍镜找到标本后，再用油镜观察各种牙垢细菌的形态，并绘出典型的视野图。-35- （五）注意事项1．载玻片要求清洁无油污，否则会导致菌液涂布不开或镜检时把脏东西误视为菌体。2．挑菌量宜少，涂片要薄而均匀，过厚菌体会导致细胞重叠而不便观察。3．染色时间与细菌种类、染色液种类、染色液浓度有关，应根据具体情况做适当调整。（六）问题与思考1．涂片为什么要固定？固定时应注意什么问题？2．你在简单染色过程中遇到了什么问题？试分析原因。二、革兰氏染色法（一）目的要求1．熟练掌握细菌涂片的基本技术。2．掌握细菌革兰氏染色法。3．熟练掌握显微镜油镜的使用技术，观察细菌的革兰氏反应。（二）基本原理简单染色法是采用一咱染料使细菌着色的染色方法。经简单染色后，只能观察细菌的大小、形态和细胞排列，不能鉴别细菌，也不能观察细菌的特殊结构。为此，微生物工作者创建了复合染色法。复合染色法是采用两种或两种以上染料使细菌着色的染色方法。革兰氏染色法就是一种复合染色法。它于1884年由丹麦病理学家ChristianGram创建，由于这种染色方法具有鉴别细菌的功能，因此它又是一种鉴别染色法。根据革兰氏染色反应，可把细菌区别为革兰氏阳性（G+）细菌和革兰氏阴性（G-）细菌。一般认为，革兰氏染色反应与细胞壁的结构和组成有关。在革兰氏染色中，经过结晶此初洒和碘液复染，菌体内形成深紫色的“结晶紫-碘”复合物。对于革兰氏阴性细菌，这种复合物可用酒精从细胞内浸出，而对于革兰氏阳性细菌，则不易浸出。其原因是革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，脂类含量较低，用酒粗脱色时，可引起细胞壁肽聚糖层脱水，网孔缩小以至关闭，阻止“结晶紫-碘”复合物外逸，从而保留初染的紫色；革兰氏阴性细菌细胞壁较薄，肽聚糖含量较少，脂类含量高，用酒精脱色时，可引起脂类物质溶解，细胞壁透性增大，“结晶紫-碘”复合物溶出，菌体呈现番红复染的红色。（三）实验器材1．菌种：大肠杆菌（Escherichiacoli）24小时的斜面培养物，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）12~16小时的斜面培养物。2．染色液：结晶紫，碘液，番红，95%酒精，蒸馏水。3．仪器及相关用品（1套/组）：显微镜，香柏油，二甲苯（或1：1的乙醚酒精溶液），擦镜纸。4．其他用品：载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，特种铅笔。（四）实验程序1．涂片：取一块洁净的载玻片，用特种铅笔在载玻片的左右侧，注上菌号，并在载玻片两端各滴一滴蒸馏水。将接种环在火焰上灼烧灭菌，采用无菌操作在①号菌（大肠杆菌）菌苔上挑取少许菌体（不要挑起培养基），放在载玻片一端的水滴中，涂成均匀的薄层。接种环使用后，必须立即用火焰灼烧灭菌。再用经火焰灭菌的接种环取②号菌（枯草芽孢杆菌）菌苔涂片。按照简单染色法的操作程序进行干燥固定。2．初染：将涂片置于平台上，在两个涂面上滴加结晶染色液，染色1min，然后倾去染色液，用自来水细流冲洗，至洗出液中无紫色。-35- 3．媒染：先用新配的碘液冲去涂片面上的残余水，或用吸水纸吸干涂片上的残余水，再用碘液覆盖涂面媒染1min，然后水洗。4．脱色：除去残余水后，滴加95%酒精进行脱色，至载玻片上流出的酒精液中紫色接近消失为止（约30s），并立即用自来水细流冲洗，终止酒精的作用。5．复染：滴加番红染色液，染色3~5min，水洗后用吸水纸吸干。6．镜检：用低倍镜找到标本后，再用油镜观察染色后的大肠杆菌和枯草杆菌，并绘图说明染色结果。（五）注意事项1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如果脱色过度。G+菌可被脱色而被误判为G-菌。如果脱色时间过短，G-菌也会被误判为G+菌。涂片厚薄以及脱色乙醇用量则会影响结果。要检验一个未知菌的革兰氏反应，应同时做一张已知菌和未知菌的混合涂片，以作对照。2．染色过程中，染色液应覆盖整个涂面，染色液不能过浓。水洗后轻轻甩去载玻片上的残余水珠，以免稀释染色液而影响染色效果。3．要严格控制菌龄，菌体衰老时，G+菌常呈G-反应。（六）问颧与思考1．革兰氏染色中哪一步是关键?为什么?如何控制这一步？2．不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌?3．以固定杀死的菌体与自然死亡的菌体进行革兰氏染色有何不同?三、芽孢染色法（一）目的要求1．了解细菌芽孢染色法。2．观察示范镜，识别细菌细胞中的芽孢。（二）基本原理芽孢染色法是为了观察细菌芽孢而设计的一种特殊染色法。细菌芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的渗透性差，不易着色。但是，一旦着色则较难脱色。根据芽孢和菌体对染料亲和力的差异，先用一种弱碱性染料孔雀绿，在加热的条件下使芽孢着色；再用自来水冲洗，菌体中的孔雀绿易被洗掉，而芽孢中的孔雀绿难以溶出；最后用碱性石炭酸复红复染，菌体被染成红色，芽孢则呈绿色。（三）实验器材1．菌种：苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）。2．染色液：孔雀绿染色液，石炭酸复红染色液，蒸馏水。3．仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或1：1的乙醚酒精溶液），擦镜纸，电炉。4．其他用品：载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，小试管。（四）实验程序芽孢染色的操作过程如图4-5所示。1．制备菌液：取一支小试管，加入1~2滴蒸馏水，再用接种环从斜面上挑取2~3环菌体至小试管中，充分打匀，制成浓稠的菌液。-35- 2．加染色液：取2~3滴孔雀绿染液，加入小试管，用接种环搅拌，使染色液与菌液充分混合。3．加热着色：将小试管浸于沸水浴中，加热15~20min，使菌体和芽孢着色。4．涂菌制片：取一块洁净的载玻片，用接种环从试管底部挑取数环菌液，在载玻上涂成薄层。5．干燥固定：将涂片在酒精灯火焰上干燥，然后将干燥的涂片通过酒精灯火焰3次，使菌体固定在载玻片上。6．菌体脱色：用自来水细流冲洗载玻片，直至流出的冲洗水不带绿色，使菌体内的染料溶出，但保持芽孢着色。7．菌体复杂：加石炭酸复红染色液，染色1min。倾去染色液，不经水洗直接用吸水纸吸干，使菌体染上红色。8．油镜观察：先用低倍镜找到标本，再用油镜观察菌体和芽孢，并绘图说明染色结果。（图4-6）。（五）注意事项1．控制好芽孢细菌的菌龄，保证染色时大部分芽孢留在芽孢囊内。2．要获得优质涂片，需要制备浓稠的菌液，同时需要适当的涂布菌量。从小试管中取菌液时，要搅匀，以防止菌体沉于管底，取菌体量太少。（六）问题与思考1．芽孢染色的原理是什么？有简单染色法能否观察到芽孢？2．在芽孢染色上为什么有时会出现大量游离芽孢？四、荚膜染色法（一）目的要求1．了解细菌荚膜染色法。2．观察示范镜，识别细菌细胞外的荚膜。（二）基本原理荚膜是包在细胞壁外的一层胶状黏液性物质。它是细菌鉴定的重要特征之一。荚膜与染料的亲和力较弱，不易着色，进行负染时，菌体和背景着色，但荚膜不着色。因此，在菌体周围荚膜呈一透明圈。由于荚膜含水量在90%以上，制片时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。（三）实验器材1．菌种：胶质芽孢杆菌（Bacillusmucilaginosus），也称钾细菌。2．染色液：1%结晶紫染色液，20%硫酸铜溶液。3．仪器及相关用品:显微镜，香柏油。二甲苯(或1:1的乙醚酒精溶液)，擦镜纸，电炉。4．其他用品：载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子。（四）实验程序1．制片：取在细菌斜面上培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂片，涂片方法同简单染色法，自然干燥，自然固定。2．染色：在自然晾干的涂面上。滴加1%结晶紫染色液染色2min。3．脱色：以20%硫酸铜溶液冲洗2次，晾干。4．镜检：背景和菌体呈深紫色，荚膜在菌体周围呈一明亮的淡紫色透明圈（图4-7）。在油镜下观察，并绘图。（五）注意事项-35- 制作涂片时应自然气干，否则会使荚膜缩水变形。（六）问题与思考荚膜染色过程中，涂片是否需要加热固定?为什么?五、鞭毛染色法（一）目的要求1．了解细菌鞭毛染色法。2．观察示范镜。识别细菌鞭毛。（二）基本原理细菌的鞭毛极细，直径约0.01~0.02µm，超出普通光学显微镜的分辨力，只有在电镜下才能观察。但采用鞭毛染色，可使鞭毛变粗，从而能在普通光学显微镜下观察其外形、着生部位和鞭毛数目。鞭毛染色的基本原理是先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛表面，使鞭毛直径加粗，再进行染色。生长鞭毛的细菌幼龄时具有较强的运动能力，衰老后鞭毛容易脱落。染色时，宜选幼龄菌。（三）实验器材1．菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。2．染色液：鞭毛染色液(A液和B液)，石炭酸复红染色液，蒸馏水。3．仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯(或1：1的乙醚酒精溶液)，擦镜纸，恒温培养箱。4．其他用品：载玻片，盖玻片，凹玻片，吸水纸，酒精灯，火柴，接种环，镊子，试管，无菌水，斜面培养基。（四）实验程序1．载玻片的准备：挑选光滑无痕迹的载玻片，置于含适量洗衣粉的水中煮沸20min，取出载玻片，用自来水充分洗净，沥干后放入95%酒精中脱水。过火去酒精，立即使用。2．菌种活化：预先移接5~6代，使菌种活化，增强细菌的活动能力。染色前的最后一代菌种最好采用新鲜的加富培养基培养。先在斜面培养基底部加入0.5~1.0mL无菌水，取一环经过活化的枯草杆菌菌苔，接种于斜面培养基底部的无菌水中，在30℃恒温培养箱中培养15~l8h，让枯草杆菌由水面向上爬行生长。3．菌液制备：用接种环轻轻挑起斜面底部水面交界处的（爬行生长）菌苔数环，小心地移人盛有1~2mL与菌种同温的无菌水中，不要搅动，让有活动能力的菌体游人水中，使菌液成轻度混浊。在30℃恒温培养箱中保温l0min，让老菌体及其他杂质沉降，使幼龄菌体在无菌水中运动松散鞭毛。4．涂菌制片：涂片之前，先用悬滴法观察细菌的运动能力，若运动能力很强，则适宜取菌涂片。用接种环在液面上挑数环菌液，置于洗净的载玻片一端，稍稍倾斜载玻片，使菌液缓慢地流向另一端，在载玻片表面形成菌液带，自然干燥，固定（不得加热干燥，固定）。5．鞭毛染色：①先用新配制的鞭毛染色液A液染色7~8min；②倾去A液，再加鞭毛染色液B液染色3~5min，水洗，自然干燥；③加石炭酸复红染色液染色2min，水洗，晾干。6．镜检：在油镜下观察鞭毛的数目及着生部位并绘图。（五）注意事项1．用于鞭毛染色的载玻片要特别洁净，否则会在涂片时影响菌液流动和鞭毛伸展。2．染色液必须每次配制，现配现用。-35- 3．鞭毛很容易脱落，在整个操作过程中需特别小心。（六）问题与思考1．用于鞭毛染色的细菌为什么要事先转接几代?2．为了提高鞭毛的染色效果，应注意什么?实验7水中总大肠菌群的测定一、实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2、了解水源水的平板菌落计数的原则。3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。二、实验原理原理：总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验.多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖,产酸产气以及具备革兰氏染色阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性本实验以广州大学城周围废水为例，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数.试验结果以最可能数(mostprobablenumber),简称MPN表示。仪器1.高压蒸气灭菌器2.恒温培养箱,冰箱3.生物显微镜,载玻片4.酒精灯,镍铬丝接种棒5.培养皿(直径100mm),试管(5×150mm),吸管(1,5,10mL),烧杯(200,500,2000mL),锥形瓶(500,1000mL),采样瓶.三、实验方法培养基及染色剂的制备：1.乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。3.品红亚硫酸钠培养基-35- （1）贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH至7.2—7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。（2）平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再退至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。4.伊红美蓝培养基（1）贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。再加入2g磷酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值至7.2—7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。（2）平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。5.革兰氏染色剂（1）结晶紫染色液：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取4—8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。（2）助染剂：将1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至300mL。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。（3）脱色剂：95%乙醇。（4）复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸馏水。测定步骤1.生活饮用水-35- （1）初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。（2）平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。①伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。②品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。（3）取有上述特征的群落进行革兰氏染色①用已培养18—24h的培养物涂片，涂层要薄。②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去。③滴加助染剂，1min后用水洗去。④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20—30s），用水洗去。⑤滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。4.复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1—3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查后附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。2.水源水（1）于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL1： 10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。（2）平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。（3）根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表2“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即为1L水样中的总大肠菌群数。-35- 例如，某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种1：10的水样1mL的5管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100mL水样中的总大肠菌群数为49个，故1L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：10、1：100、1：1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值。接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份)根据上述方法及步骤检查所给水样中大肠菌群细菌得数量。思考题（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？（2）你所测的水源水的污秽程度如何？-35- 实验8环境样品蛋白质含量的测定衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求：   掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理：   凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。   （1）2NH2(CH2)2COOH+13H2S04---(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O   （2）(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4   （3）2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O  （4）(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器：1、硫酸钾2、硫酸铜   3、硫酸4、2％硼酸溶液5、40％氢氧化钠溶液6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成．   7、0.OINHCL标准溶液或0．01N硫酸标准溶液．8、凯氏微量定氮仪一套。-35- 9、定氮瓶100m1或50ml一只。10、三角瓶150ml3只。11、量筒50ml、lOml、lOOml。12、吸量管10ml只。13、酸式滴定管1支。14、容量瓶100毫升1只。15、小漏斗1只。 四、操作方法：1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。2、 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。3、 想接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。 （V1-V2）×N×0.014X=------------------------------ +F×100            M×（10/100）                                                     　计算：-35- 　 　X：样品中蛋白质的含量，g；V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m：样品的质量（体积），g（ml）；F：氮换算为蛋白质的系数。 注：(1)样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。(2)样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。(3)消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。(4)在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。(5)如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。(6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。(8)氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。(9)吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。(10)以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。(11)向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++-35- 实验9重金属污染物对光合作用强度影响的测定原理：用打孔器将植物叶片切成小圆片，再用真空渗入法将叶圆片细胞间隙充满水，可使叶圆片沉于水中。在水中的叶圆片进行光合作用时吸收水中的CO2而放出氧气。由于氧在水中的溶解度很小，大部分以气体状态重新充满细胞间隙。在光合作用旺盛时，由气孔和圆片边缘排出的氧气泡还会附着在叶圆片表面。其结果会使下沉的叶圆片比重减轻而重新上浮。根据上浮所需时间的长短，即能推测光合作用的强弱。仪器与用具：直径约1CM的打孔器1支；注射器1个；100Ml三角瓶4个；小烧杯1个；温度计1支；冰块。具体步骤：1、试植物上，选取生长健全、年龄近似、厚薄均匀的成长叶片数片，用直径约1CM的打孔器打下小圆片50片左右，放入注射器中，加水使叶子浸没。在排出空气后，用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气。轻放活塞，水液即进入组织。如此反复抽拉几次，叶片即可变成半透明状而下沉，把下沉叶子连水倒入小烧杯中，放于黑暗处。2、准备三角瓶4个，编号后，在各瓶中均加入新制冷开水40Ml，再向2号、3号、4号瓶中加入相当于麦粒大小的碳酸氢钠粉末于水中充分溶解，在2号瓶上用较厚白纸遮光，3号瓶用冰水降温至10℃左右，1号、2号、4号瓶则用温水浴保持20～25℃的温度。每瓶各放入下沉叶片10片，放在日光或较强灯光下进行光合作用。3、各瓶内叶片上浮所需平均时间，或一定时间内上浮叶片数，记入表内。4、号瓶为对照，比较CO2(1号瓶与4号瓶比)、温度(3号瓶与4号瓶比)、光照(2号瓶与4号瓶比)对植物的光合作用有何影响并加以解释。表9－1各叶片上浮所需时间处理各叶片上浮所需时间(Min)1234567891030Min内各处理上浮叶片数1低CO2，2弱光，3低温，4对照【注意事项】1每种处理的三角瓶中必须放入下沉叶片(小圆片)10片。2对各瓶内叶片上浮时间和片数，必须及时加以记载。-35- 实验10叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即:A=aCL式中：a为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式:A663=82.04Ca+9.27Cb(1)A645=16.75Ca+45.60Cb(2)式（1）、(2)中的A663和A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时吸光度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以㎎/L为单位。解方程（1）、(2)，得：Ca=12.72A663-2.59A645(3)Cb=22.88A645-4.67A663(4)将Ca与Cb相加即得叶绿素总量CT:CT=Ca+Cb=20.29A645+8.05A663（5）-35- 另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、b总量：CT=(6)在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：Ca=12.21A663-2.81A646(7)Cb=20.13A646-5.03A663(8)Cx.c=（9）式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx.c为类胡萝卜素的总浓度；A663、A646和A470分别为叶绿素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的吸光度。由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式:Ca=13.95A665-6.88A649(10)Cb=24.96A649-7.32A665(11)Cx.c=(12)二、材料、仪器设备及试剂（一）材料新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备分光光度计，电子顶载天平（感量0.01g）,研钵，棕色容量瓶，小漏斗，定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管。（三）试剂(1)95%乙醇（或80%丙酮）。(2)石英砂。(3)碳酸钙粉。三、实验步骤(1)取新鲜植物叶片(或其他绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(或去掉中脉),混匀。(2)称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95%的乙醇(或80%丙酮)，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3～5min。(3)取滤纸一张，至漏斗中，用乙醇润湿，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。-35- (4)用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。(5)把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。四、实验结果计算与分析按公式(10)、(11)、(12)(如用80%丙酮，则按公式7、8、9)分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度(mg/L)。(10)、（11）式相加即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：叶绿体色素的含量=（mg/g）【注意事项】(1)为了避免叶绿素光解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。(2)叶绿体色素提取液不能混浊。可在710nm或750nm波长下测量吸光度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时吸光度值的5%，否则应重新过滤。(3)用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正（表2-12-1）表2-12-1叶绿体色素含量测定记录表测定日期：材处重样提取液组织中各色素含测定仪料理复品总量／吸光度色素浓度／mg·L-1量／mg·g-1Ca／b器型号重mlA665A649A470CaCbCTCx.cCa′Cb′CT＇C＇x.c12312-35- （4）在使用低档型号分光光度计（如：722型、721型等）测定叶绿素a、b含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（±(5～7)nm），与高中档仪器如岛津UV-120、UV-240等测定结果相比，叶绿素a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，a/b比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正，具体校正步骤参照有关文献进行。【思考题】1.叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？2.为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？-35- 实验11聚合酶链反应聚合酶链式反应（PCR）：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成cDNA文库；(3)从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。一、试剂准备1.DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCRBuffer4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix（2mM）4μl　引物1（10pM）2μl　引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μlDNA模板（50ng-1μg/μl）　1μl加ddH2O至50μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93-35- ℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化　PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCRBuffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1．反应缓冲液：一般随TaqDNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室温），1.5mMMgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。2．dNTP：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。3．TaqDNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。⑸引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。5．-35- 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。-35-