常见绞股蓝属植物鉴别问题的生物技术应用解决方案

常见绞股蓝属植物鉴别问题的生物技术应用解决方案【摘要】：随着现代生物技术的迅速发展，利用分子标记方法解决绞股蓝属植物易混淆，以致难以鉴别的问题已成为可能。ISSR(inter-simplesequencerepeat)标记技术是在SSR基础上发展起来的一项新的标记技术。即先用CTAB法提取绞股蓝属植物总DNA，以57条ISSR引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析，然后筛选出产物清晰稳定的14条引物，其中引物UBC-873与UBC-895具有较高的多态性条带比率，均可独立区分常见的几种绞股蓝属植物。因此，ISSR-PCR分析可有效区分鉴别常见绞股蓝属植物。【关键词】：绞股蓝属；ISSR；区分鉴别1绞股蓝属植物基本情况绞股蓝属GynostemmaBL.是葫芦科Cucurbitaceae的一个中小属[1]，植物为多年生攀援草本,包含16种2变种，隶属于2亚属2组，主要分布于热带亚洲至我国秦岭南坡、长江流域及以南广大地区和朝鲜及日本，生长在山地林中或山谷水沟旁，在石灰岩地带较为常见，其分布中心为我国西南地区。该属广布种绞股蓝(G.Pentaphyllum(Thunb.)Makion)，被誉为“南方人参”，为我国常用中草药，具有悠久的应用历史。早在明代的《救荒本草》、《农政全书》，清代的《植物名实图考》以及近代的各类中草药著作中，均有记载。现代药理学研究证明绞股蓝属植物含有与人参皂甙相似的成分，还含有多种维生素和黄酮甙，是一种具有人参作用，而无人参副作用的多功能保健药，被誉名为“世界四大保健品之冠”。具有抗肿瘤、抗疲劳、降血脂、益智健脑、提高免疫力、治疗白发症等多种功能，并且具有无毒、廉价等优点，广泛应用于医药保健领域。2绞股蓝属植物现存问题绞股蓝属为热带亚洲分布类型，在我国秦岭长江以南地区广泛分布[1]，地理环境变化复杂，在其种系发生发展过程中，为适应新的环境形成了一系列的生态变异，属内各分类群之间形态特征交叉、过渡现象严重，鉴定困难。近几年来，由于生态环境的不断破坏，野生绞股蓝资源日益减少，而市场需求的不断增加，导致国内绞股蓝药材资源来源复杂，药材质量差异显著。4 绞股蓝皂苷具有重要的生理活性，是评价绞股蓝品质的重要标志，绞股蓝属不同种间皂苷量差异显著，但由于其生长环境相似、植物形态学上难以区别，造成了市场上药材来源复杂，品质差异较大的情况[2]。目前采用的绞股蓝属植物分类系统，主要依据子房、果实形态进行划分[3]，由于属内种间形态特征交叉、过渡现象严重，为鉴定带来一定困难。因此，从形态学上难以区分，然而为有效利用绞股蓝属植物资源，对该属进行分类及正确鉴定显得尤为重要。更多的研究表明，绞股蓝属内不同种之间在蛋白质营养成分[4]、皂苷量[5]、黄酮量[6]等方面均存在差异，同时种子微结构[7]、染色体数目[8]、过氧化物酶同工酶谱[9]也有不同，因此绞股蓝属分类问题的研究具有重要的理论与应用价值。随着现代生物技术的快速发展，分子标记技术应用在药用植物上大大提高了区分鉴别的效率，应用ISSR技术将成为解决常见绞股蓝属植物不能区分鉴别的难题的良好途径。3ISSR技术途径近年来，随着分子标记技术的发展，中药鉴定逐步从形态组织学、化学水平提高到分子水平，各种DNA分子标记技术广泛应用于中药材的鉴定研究，DNA分子标记直接依据药材的遗传多样性特征，通过分析其特有的DNA片段对药材进行分类鉴别，具有准确快速、微量检测等特点。简单序列重复区间扩增多态(inter-simplesequencerepeat,ISSR)是Zietkiewicz等在1994年创建的一种DNA分子标记技术，它利用重复锚定引物扩增出SSR之间的片断，具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等优点，在种质鉴定、亲缘关系研究领域优势显著。ISSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术，它是根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物，对两侧具有反向排列的SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ISSR标记的多态性。ISSR引物通常为16～l8个碱基，其主体是2-4个碱基组成的串联重复序列，然后在其5’端和3’端加上l～4个锚定碱基，从而保证ISSR引物能够对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增[10]。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而ISSR可以检测到高的多态性。另外，ISSR不像SSR具有物种特异性，它可以和RAPD一样用于各类动植物的研究。只是引物设计要求不同，但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，而且比RAPD技术更加稳定可靠，实验重复性更好。4 因此，针对我国常见的7种绞股蓝属植物：绞股蓝G.pentaphyllum、五柱绞股蓝G.pentagynum、心籽绞股蓝G.cardiospermum、长梗绞股蓝G.longipes、喙果绞股蓝G.yixingense、疏花绞股蓝G.laxiflorum、广西绞股蓝G.guangxiense，通过对其进行ISSR鉴定，即可加以区分，从而为绞股蓝药材的分子鉴定提供依据。与其它基于PCR技术的分子标记方法一样，ISSR技术也主要包括DNA提取、PCR扩增、电泳检测、观察结果及统计分析等步骤[11]。首先，进行基因组DNA的提取：采用CTAB法提取绞股蓝属基因组DNA，对其略作改进。DNA一般不用纯化，但需对DNA样品进行电泳，检测其质量，并用分光光度计检测DNA浓度及其与蛋白质比值。新提取的DNA用一倍的TE溶液溶解，贮存在-20℃或-70℃冰箱中备用。用前稀释到l0～20ng/μL的浓度，置4℃冰箱中保存。其次，进行PCR扩增及电泳检测：选取2份材料进行预试验，从57条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、重复性好的14条ISSR引物用于全部材料的扩增。PCR反应体系包括Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶，1×PCR缓冲液。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，45～77℃退火45s，72℃延伸2min，进行40个循环；最后72℃延伸7min[2]。反应产物在含有EB的琼脂糖凝胶中电泳分离，在紫外光投射仪下检测，然后照相记录。最后，观察结果及统计分析：根据ISSR扩增条带的有无，获得二元数据矩阵，分析各居群的多态位点比率（PPB）[2]。从57条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、重复性好的14条引物，对7种野生绞股蓝属植物材料进行扩增，共得到151条带，平均每个引物扩增出10.79条，其中多态性条带148条，多态性比率达到98.01%，揭示了供试材料在种间水平上具有丰富的多态性，扩增条带的相对分子质量从200～2000bp不等[2]。14条ISSR引物中，引物UBC873和UBC895均可独立区分7种绞股蓝属植物。4展望4 将ISSR-PCR方法引入绞股蓝属种间鉴定，结果表明，ISSR技术具有操作简便、多态性高、稳定可靠的特点，引物UBC873与UBC895均可独立区分7种绞股蓝属植物，可用于该属植物的分类鉴定。该方法对样品质量要求较低，可以为新鲜或干燥绞股蓝茎叶[2]。ISSR标记技术试验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地进行基因文库构建、杂交和同位素显示等步骤；重复序列和锚定碱基的选择是随机的，无需知道任何靶标序列的SSR背景信息，从而降低了技术难度和实验成本；无需活材料，无组织器官特异性，能实现全基因组无编码取样；采用了较长的引物，退火温度较高，因此，引物具有更强的专一性，增强了实验的可重复性[12]。传统药用植物种质资源的鉴定评价方法依赖于宏观特征，如叶片形状等，但可用的形态性状少且受环境影响大，因此需要高效、准确、不受环境因素影响的鉴定技术。ISSR技术不会受到环境因素的影响，因此在中药材真假品种的鉴定和道地药材的鉴别上有很大的优势。但是任何分子标记方法都不是十全十美的，应该以发展的观点来看待这个问题，相信ISSR技术凭其多态性高、稳定性强、节省时间、物力和财力等优势，必将使其在更多物种和领域得到应用。【参考文献】[1]陈书坤.绞股蓝属植物的分类系统和分布.植物分类学报，1995，33（4）：403-410.[2]周天华，杨雪，郭晶，等.ISSR-PCR鉴别绞股蓝属7种植物.中草药，2008，39（4）：588-591.[3]郭志刚，赵桂仿.利用ISSR分析6种绞股蓝属植物的遗传多样性与亲缘关系.西北大学学报（自然科学版），2008，38（5）：767-770.[4]李纯，孟洁.安徽省绞股蓝资源调查及质量评价.安徽农学通报，1997，3（3）：22-24．[5]刘世彪，林如，胡正海.绞股蓝属5种植物的茎叶结构和总皂苷含量差异.福建农林大学学报（自然科学版），2006，35（5）：495-499．[6]蒋伟哲，周燕文，李锦椠，等.6种广西产绞股蓝中总黄酮的含量测定.中国药房，2006，17（1）：74-75．[7]孙航，陈书坤.绞股蓝属植物种皮微结构特征及其分类学意义.云南植物研究，1998，20（3）：309-311．4 [8]高信芬，陈书坤，顾志建，等.绞股蓝属的染色体研究.云南植物研究，1995，17（3）：312-316．[9]张智，谢中稳，李遥.安徽绞股蓝属植物资源分布及其过氧化物酶同工酶的研究.安徽农业大学学报，1993，20（4）：372-376．[10]孙洪，程静，詹克慧，等.ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用.分子植物育种，2005，3（1）：123-127.[11]罗海燕，陈亚渊.ISSR分子标记及其应用.安徽农学通报，2008，14（19）：45-46.[12]李婷，林文津，徐榕青，等.ISSR技术在药用植物种植研究中的应用.中国民族民间医药，2010：41-42.4