食品卫生微生物检验的基本程序

第四章食品卫生微生物检验的基本程序学习目标1了解取样前的准备工作，掌握样品的取样计划和取样方法2掌握样品的保存与制备要求3掌握实验设计、数据处理及结果报告等 一.食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告 第一节食品卫生微生物检验的取样方法样品的采集应遵循所采样品具有代表性的原则。必须采用正确的采样方法，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态采样要遵循无菌操作原则，严防样品污染 采样的要求1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。 一、取样准备工作对取样工具和一些试剂材料应提前准备和灭菌1开启容器的工具2样品移取工具3取样容器4温度计5消毒剂6标记工具7样品运输工具 8搅拌器和混合器9稀释液10防护用品 二、取样计划1食品卫生微生物学检验的取样点原料、生产线样品（半成品，环境）、成品、库存样品、零售商店或批发市场、进口或出口样品 取样方案有：ICMSF取样方案；美国FDA的取样方案；世界粮农组织（FAO）取样方案；我国的食品取样方案。2常用食品卫生微生物学取样计划 样品的采样和取、制样是食品微生物检验的重要组成部分。要得到准确的检测结果，必需正确掌握采样技术、样品传递、样品保存方法和样品的制备技术，保证样品在从采样到制样整个过程中的一致性。如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意义。对采样人员和制样人员提出了很高的专业要求，既要保证样品的代表性和一致性，又要保证整个微生物检验过程在无菌操作的条件下完成。 一、采样采样是指在一定质量或数量的产品中，取一个或多个代表性样品，用于微生物检验的过程。样品必须对采样的整个产品或批量具有代表性。样品的大小应能满足在需要时进行重复分析的需要。 一）采样准备工作1.采样工具采样工具要达到无菌的要求。对采样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌。1）开启容器的工具：剪刀、刀子、开罐器、钳子等。双层纸包裹灭菌（121℃，15min），干燥洁净的环境中保存2个月。2）样品采集工具：灭菌的铲子、勺子、取样器、镊子、锯子、刀子、剪子、压舌板、木（电）钻、打孔器、金属试管和试子等。3）取样容器：灭菌的广口瓶或细口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金属试管或类似的密封金属容器。最好不使用玻璃容器，运输中易碎。4）温度计：-20℃~100℃，温度间隔1℃。最好使用金属或电子温度计。使用前在70%~75%乙醇溶液或次氯酸钠（浓度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。 5)消毒剂：70%~75%乙醇溶液、中等浓度（100mg/L）次氯酸钠溶液等。6）标记工具：标签纸（不干胶标签纸）、油性或不可擦拭记号笔。7）样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。8）天平：最大量程为2000g，感量为0.1g。9）搅拌器和混合器：必要时配备带有灭菌灌的搅拌器或混合器。10）稀释液：灭菌的磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水、生理盐水以及其他稀释液如脑心浸液肉汤、M肉汤、LB肉汤等。11）防护用品：对样品的防护。即保护生产环境、原料和成品等不会在取样过程中被污染，同样也保护样品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒灭菌（或使用一次性无菌物品)。 应根据不同的样品特征和采样环境，对采样物品和试剂进行事先准备和灭菌等工作。实验室的工作人员进入车间采样时，必须更换工作服，避免将实验室的菌体带入加工环境，造成加工过程的污染。 2.采样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的采样方案，其次使用正确的采样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。一般说来，进出口贸易合同对食品采样量有明确规定的，按合同规定采样；进出口贸易合同没有具体采样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定采样方案。目前的采样方案多为ICMSF推荐的采样方案和随机采样方案。无论采取何种方法采样，每批货物的采样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，采样数量应适当增加，最低不少于8件。 1)采样的术语批量货物：数量确定的货物，品质必须均匀一致。抽检货物：从批量货中的一个位置取出的少量货物。混合货样：条件允许，从某一特定批量采样、混合，即为混合货样，亦即大样。样品单位：从监督总体中抽取用于检验的样品中的单位产品。样品量：样品中所包含的样品单位数。合格判定数：在计数采样检查中，对接收批的样品允许出现的缺陷数或不合格品数的上限值，合格判定数又称可接受数。批：一批产品中或特定阶段或时间内代表相同质量样品的单元数。 随机采样：在一批产品中，每个样品或单元都有同样被选择的机会。这种采样方法被称为随机采样。采样时常需要查阅随机数字表。代表性样品：广义上讲是指能够代表一个批的样品，而不是仅代表其中的一部分。要获得代表性样品需要以下四个条件：确定整批产品的采样点；建立能够代表整个产品特征的采样方法；选择样品大小；规定采样的频率。 2）采样原则(1)根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案;(2)应采用随机原则进行采样，确保所采集的样品具有代表性;(3)采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染；(4)样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原有状态。 3）采样方案的类型依据GB4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》(1)类型采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。 n：同一批次产品应采集的样品件数；c：最大可允许超出m值的样品数；m：微生物指标可接受水平的限量值；M：微生物指标的最高安全限量值。注1：按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。注2：按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。 例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。含义是从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于或等于m值（≤100CFU/g），则这种情况是允许的；若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100CFU/g1000CFU/g），则这种情况也是不允许的。 （2）各类食品的采样方案按相应产品标准中的规定执行。（3）食源性疾病及食品安全事件中食品样品的采集由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集和判定原则按以上的（1）和（2）执行。同时，确保采集现场剩余食品样品。由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集按GB14938中卫生学检验的要求，以满足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原确证的要求。 4）ICMSF采样方案简介国际食品微生物标准委员会（ICMSF）所建议的采样计划是目前世界各国在食品微生物工作中常用的采样方案。ICMSF提出的采样基本原则根据：a)各种微生物本身对人的危害程度各有不同。b）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定采样方案并规定其不同采样数。 ICMSF的采样方法有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、с及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。 （1）二级采样方案自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。例如生食海产品鱼的副溶血性弧菌标准为n=5，c=0，m=102，n=5即采样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌落数超过m值的检样，此批货物为合格品。 （2）三级采样方案设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌总数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果允许≤3个检样的菌落数是在m和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或一个检样菌落数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。 （3）ICMSF对食品中微生物的危害度分类与采样方案说明为了强调采样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的采样方案与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级采样方案，对健康危害低的则建议使用三级采样方案。ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1加以说明。 表1、ICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类级别危害程度对象微生物食品经不同处理后的危害度减少（加热）无变化（冷冻品立刻进食）增加危害度（未加热吃到吃前还有一段时间）三级方案1.食品的保藏2.轻度间接指标菌3.中度程度局部传播菌落总数大肠菌群、大肠杆菌金黄色葡萄球菌（指标菌）金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌产气荚膜梭菌例1n=5c=3例4n=5c=3例7n=5c=2例2n=5c=2例5n=5c=2例8n=5c=1例3n=5c=1例6n=5c=1例9n=10c=1二级方案4.中度程度广泛传播5.严重程度沙门氏菌副溶血性弧菌致病性大肠杆菌肉毒梭菌、霍乱弧菌伤寒沙门氏菌副伤寒沙门氏菌例10n=5c=0例13n=15c=0例11n=10c=0例14n=30c=0例12n=20c=0例15n=60c=0注：1.表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。2.“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。3.“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。4.n：一批产品采样个数。c：该批产品的样品菌落数中，超过限量的检样数。 根据表1中15种情况的举例，1-3可用三级法，4-5可用二级法来判定是否合格。考虑到以上15种情况，分别设定不同的取样数及检样污染数，在1-9例中检样需采5个（n=5），而污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法则不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏菌按例11的二级法判定。对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中毒，适用例7和例8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵抗力，则易发生食物中毒，适用例9。加热盐腌的火腿，水分活性为0.86以下，金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例9。沙门氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，适用例11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。 ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表2。为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例3、6、9、12，对象微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌数限量是相同的，但情况有所不同，分别适用c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。 表2、ICMSF虾的微生物标准食品名称检查项目例级别nc菌数限量/gmM冷冻生虾冷冻烹调虾细菌数大肠菌群金黄色葡萄球菌副溶血性弧菌细菌数大肠菌群金黄色葡萄球菌副溶血性弧菌1441036912333233325555555533301110106410310210641031021074002×103—1074002×103—注：n：一批产品采样个数。c：该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。m：合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。M：附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。 5）随机采样方案在现场采样时，可利用随机采样表进行随机采样。随机采样表（SN0330-1994《出口食品中微生物检验通则》系用计算机随机编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下：a.先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批600包的产品编为1、2……600。b.随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第48行、第10列的数字上。c.根据单位产品编号的最大位数（如A1，最大为三位数），查出所在行的连续列数字（如A2所点数为第48行、第10、11和12列，其数字为245），则编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。d.继续查下一行的相同连续列数字（如按A3、即第49行的第10、11和12列的数字，为608）。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。e.依次按A4所述方法查下去。当遇到所查数超过最大编号数量（如第50行的第10、11和12列的数字为931、大于600）则舍去此数，继续查下一行相同列数，直到完成应抽样品件数为止。 1.2采样方法确定了采样方案以后，采样方法对采样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。采样必须遵循无菌操作程序，采样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。采样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。 各类食品的采样方法采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形状及大小适宜。1．即食类预包装食品：取相同批次的最小零售原包装，检验前要保持包装的完整，避免污染。2．非即食类预包装食品：原包装小于500g的固态食品或小于500mL的液态食品，取相同批次的最小零售原包装；大于500mL的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位的样品；大于500g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内,采样总量应满足微生物指标检验的要求。 3．散装食品或现场制作食品：根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内,采样总量应满足微生物指标检验的要求。4．食源性疾病及食品安全事件的食品样品采样量应满足食源性疾病诊断和食品安全事件病因判定的检验要求。 第二节样品的保存与制备应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。1样品的标记（1）所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。（2）当样品需要托运或由非专职采样人员运送时，必须封识样品容器。 2样品的保存和运送（1）采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。例如冷冻样品应存放在-15℃以下冰箱或冷藏库内；冷却和易腐食品存放在0-4℃冰箱或冷却库内；其他食品可放在常温冷暗处。（2）运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。（3）如不能由专人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和冷冻样品升温或融化。在包装上应注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字样。（4）作好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。3保存方法联合国粮农组织(FAO)推荐的样品保存方式可作参考。 4样品的制备1）样品检验实验室样品的制备是微生物检验的重要环节，是获得较高准确性和良好检验结果的基础。①样品处理1）实验室接到送检样品后，应认真核对登记，确保样品的相关信息完整并符合检验要求。2）实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验，应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。3）冷冻食品应在45℃以下不超过15min，或2℃~5℃不超过18h解冻后进行检验。 ②检验方法的选择GB4789.1-2010要求:1）应选择现行有效的国家标准方法。2）食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时，应以常规培养方法为基准方法。3）食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时，应以平板计数法为基准方法。 GB/T4789.17~25-2003中分别规定了肉与肉制品、乳与乳制品、蛋与蛋制品、水产食品、清凉饮料、调味品、冷食菜和豆制品、糖果和糕点及果脯、酒类的样品的制备方法。以上标准规定使用的稀释剂均为无菌蒸馏水或生理盐水，大多数产品标准也主要使用这两种稀释剂，而且对待检样品的制备方式相当单一。反映出我国相关标准比较滞后，缺乏先进性，微生物样品制备的方法在实际应用中针对性差，操作性不强。 由于食品种类繁多，在实际微生物检验中尽可能采用统一的样品制备方法。对于许多特殊产品，由于产品本身的物理状态（如干品、粘稠度高的产品等）、样品中抑制剂存在（如大蒜制品、洋葱制品、咸鱼等）或酸性等原因，需要采用特殊的样品制备方法。包括：1）调整食品稀释液的pH至中性；2）对于含高抑制物质（成分）的产品（如大蒜制品、洋葱制品等）或所含微生物受损的产品（如酸性食品、盐渍食品、干制食品等），使用缓冲蛋白胨水或其他稀释剂（如D/E中和肉汤、脑心浸液肉汤等）；3）对于低水分活度的食物，需要采取特殊复水程序； 4）调整适当温度和静置时间，以利于可可粉、明胶、奶粉等样品的悬浮；5）对于来自食物加工或贮存过程中的受损微生物，需要采取特殊复苏程序；6）某些产品（如谷物）和（或）目标菌（如酵母菌和霉菌）的特殊均质程序及均质时间；7）对于高脂肪食品，使用表面活性剂（如1g/L到10g/L聚山梨醇酯80），促进悬浮过程中的乳化作用。 2稀释液的选择1）常用和特殊稀释液常用稀释液包括：0.85%生理盐水、缓冲蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲溶液、无菌蒸馏水等。特殊稀释液包括：D/E中和肉汤、LB肉汤、M肉汤等。最合适的稀释液应该通过一系列的试验得到，所选择的稀释液应该具有最高的复苏率。 2厌氧微生物的稀释液应使用具有抗氧化作用的培养基作为稀释液。制备样品悬液时应尽量避免氧气进入，使用袋式拍击式均质器。配备一些特殊的样品防护措施，如厌氧工作站等。3嗜渗菌和嗜盐菌的稀释液20%的无菌蔗糖溶液适用于嗜渗菌计数；研究嗜盐菌时，可使用15%无菌的氯化钠溶液作为稀释液。 3不同类型样品的取、制样常用取样工具包括：均质器及均质杯、拍击器及拍击袋、试管、刻度吸管、微量移液器、玻璃珠、检测天平、水浴锅、玻璃棒、酒精灯、镊子、刀子、电锯、托盘等。3.1液体样品制备液体样品稀释液时。用无菌移液管取10mL完全混匀的样品到带盖的无菌玻璃瓶中。加稀释液至100mL配成体积比为1：10的稀释液。也可选择质量体积比，取10g完全混匀的样品加入玻璃瓶，用无菌稀释液配制成100mL，制成质量体积比为1：10的稀释液。实际操作中，等效于1：10的质量比。按常规方法做进一步的稀释，整个样品稀释过程在30min内完成。 2小颗粒固体样品面粉和奶粉等小颗粒固体样品的初识稀释液较容易配制。无菌称取10g样品加入到容积为100mL的无菌带盖玻璃瓶中，加入无菌稀释液至100mL刻度，配成质量体积比为1：10的稀释液。以30cm的幅度摇动25次。必要时按常规方法进一步稀释。对高溶解度样品计数时必须小心，计数结果取决于样品在稀释液中的均匀性，而均匀性又与样品的初识状态有关（常表述为个/g）。要得到准确的检测结果，第一个稀释液的体积是否准确达到100mL非常重要。除体积因素外，pH和水活度的变化也必须加以考虑。另外，稀释液中样品的转接应在30min内完成。 3粉末状样品检测表层下面样品中的细菌时，应至少取10g样品加入适量的无菌稀释液，并在适当的设备中均质。常用的均质方法是使用拍击式均质器。将样品和稀释液一起放入无菌、耐用、薄而软的聚乙烯袋中，不接触均质器。均质时不会引起样品温度升高，较好地保护了待测样品。即使是冷冻样品，均质效果也很好。这种方法可用于制备浓度很低的稀释液。 4表面样品表面样品取样后，先放到一定体积（如10mL）的稀释液中，妥善保存，使样品保持原始状态。检测时，用适当的稀释剂进行定量稀释（根据预测的污染程度稀释到所需稀释度）。检测后根据稀释的倍数进行换算。 第三节试验设计和数据处理一、试验设计根据样品的形状和检测要求选择合适的检测方法实验前的准备 二、菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 第四节原始记录和试验报告一、原始记录（详见P65）样品接收记录测试委托单实验室的原始记录培养基的配制记录 二、食品卫生微生物学检验报告P71