草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究

草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究许庆轩,王勇,刘志强,刘淑莹(中国科学院长春应用化学研究所新药研究实验室,长春130022)田成(满洲里检验检疫技术中心,满洲里021400)摘要利用电喷雾质谱技术对传统中药草乌中的二萜类生物碱进行直接分析鉴定.通过实验数据并对比文献发现,草乌中含有单酯型、双酯型、三酯型和脂类等共4种类型生物碱,其中三酯型和脂类生物碱在草乌中为首次发现.由于这些生物碱的结构相似,在电喷雾串联质谱中碎裂方式相同,因此根据电喷雾串联质谱结果确定了这些生物碱的结构.关键词草乌;二萜类生物碱;电喷雾串联质谱中图分类号O657文献标识码文章编号025120790(2005)0420638204A植物草乌(AconitumkusnezoffiiReichb.)的根部为传统中药,其中含有生物碱,具有镇痛、消炎、强心和抗癌等药理功效1～4.电喷雾电离(ESI)是近年来发展起来的软电离技术,具有高灵敏度、特异性强、操作简便快速等优点.生物碱一般具有较高的质子亲合势,在电喷雾质谱条件下容易电离.利用电喷雾质谱技术研究草乌生物碱,不仅可以从一级谱中得到分子量信息,还可以进行碰撞诱导解离获取生物碱碎片离子的信息,从而获取生物碱更多的结构信息.此外,在进行结构分析过程中,样品不需分离,可以避免植物中微量成分的丢失5.草乌中已知的生物碱主要是双酯型生物碱,分别为去氧乌头碱(deoxyaconitine)、次乌头碱(hypaconitine)、乌头碱(aconitine)、中乌头碱(mesaconitine)、102羟基乌头碱(aconifine)和北乌碱(beiwutine);另外,还含有少量的单酯型生物碱以及其它生物碱6;任玉林等7从草乌花中分离出了3种三酯型生物碱.由于乌头碱型二萜生物碱在电喷雾串联质谱中通常失去C8位取代基,生成相应的特征子离子.前文8根据这些特点用电喷雾质谱研究了草乌花中生物碱类化合物,在其中发现了脂类生物碱.本文用电喷雾串联质谱对中药草乌中的生物碱进行分析,首次发现了三酯型生物碱和脂类生物碱,这些化合物对于阐释草乌的药理活性将是十分重要的.1实验部分1.1试剂、药材与仪器乌头碱、次乌头碱和中乌头碱标准对照品购于中国药品生物制品检定所;无水乙醇和甲醇均为分析纯;草乌为植物草乌(AconitumkusnezoffiiReichb.)的根部,购于长春市吉林大药房.电喷雾串联质谱测定在美国FinnignLCQ电喷雾质谱仪上完成,仪器条件:毛细管温度180℃,喷雾电压418kV,离子透镜补偿电压15V,注射泵流速2uLƒmin.1.2样品处理碰撞能25%～43%,氮气流速60unit,毛细管电压38V,分别称取乌头碱、中乌头碱和次乌头碱标准对照品1100,1102和0191mg,溶解于50mL无水乙收稿日期:2004206210.基金项目:国家科技部重大基础研究前期研究专项(批准号:2003CCA03100)、中国科学院知识创新工程重要方向项目(KGCX22SW2213206)和国家自然科学基金(批准号:39930210,30271600)资助.联系人简介:刘淑莹(1943年出生),女,博士,研究员,博士生导师,从事有机质谱学研究.E2mail:mslab@ciac.jl.cn 639No.4许庆轩等:草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究醇中;将10g中药草乌粉末用40mL无水乙醇超声提取1h,分别取上述乙醇溶液用甲醇稀释100倍后,待电喷雾质谱分析用.2结果与讨论2.1草乌乙醇提取液的电喷雾质谱研究图1为草乌乙醇提取液的电喷雾质谱图.电喷雾质谱为软电离技术,在一级谱中不产生碎片,每个峰代表一种化学成分,因此从电喷雾质谱一级谱的数据可以获得各种生物碱类化合物的分子量信息.结合文献7,9可以推断,mƒz646,632,616,630,648和662离子分别对应双酯型生物碱乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、脱氧乌头碱、北乌碱和102羟基乌头碱;低质量区的mƒz590,574,604和588等弱峰分别对应单酯型生物碱苯甲酰中乌头原碱(benzoylmesaconine)、苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconine)、苯甲酰乌头原碱(benzoyl2aconine)和苯甲酰脱氧乌头碱Fig.1Full-scanESImassspectrumoftheethanolicextractofAconitumkusnezoffii(benzoyldeoxyaconine),它们分别与相应的双酯型生物碱的结构差别仅在于C8位的羟基6;另外,还发现了mƒz674,688,690和704等很弱的峰以及mƒz800～950等多个峰,对照文献7,8,初步推断可能分别是三酯型和脂类生物碱,因为这些化学成分在草乌根部首次发现,仅仅根据分子量确定是不够的,所以通过串联质谱获取它们的结构信息十分必要.1所示.AlkaloidsAconitineMesaconitineHypaconitineDeoxyaconitineBenzoylaconine上述生物碱类化合物的化学结构如SchemeM+H]+646632616630604590574588648662674688690704R1EtMeMeEtEtMeMeEtMeEtMeEtMeEtR2OHOHHHOHOHHHOHOHOacetylOacetylOacetylOacetylR3AcetylAcetylAcetylAcetylHHHHAcetylAcetylAcetylAcetylAcetylAcetylR4HHHHHHHHOHOHHHOHOHBenzoylmesaconineBenzoylhypaconineBenzoldeoxyaconitineBeiwutineAconifine32Acetylmesaconitine32Acetylaconitine32Acetylbeiwutine32AcetylaconifineScheme1ThestructuresofaconitumalkaloidsinAconitumkusnezoffii2.2草乌中二萜生物碱的电喷雾串联质谱研究为进一步确认草乌中的二萜生物碱,首先对乌头碱、中乌头碱和次乌头碱标准对照品的甲醇溶液进行了电喷雾串联质谱研究,主要质谱碎裂数据列于表1.实验结果表明,它们在二级串联质谱中均生成相对丰度较强的离子8.乌头碱、中乌头碱和次乌头碱在三级串联从C8位失去乙酸(分子量60),质谱中均能失去CH3OH,CO和C6H5COOH等中性分子.此外,乌头碱和中乌头碱还能失去H2O,而次乌头碱则没有失H2O反应.从Scheme1可知,次乌头碱与乌头碱和中乌头碱的结构差别是C3位不含羟基,表明乌头碱和中乌头碱在三级质谱中失去的水来自C3位的羟基,也说明C3与C13和C15位羟基断裂有明显的不同,C3位的羟基较易以脱水形式失去,而C15位的羟基以失去CO方式断裂.另外,C14位取代基仅在三级串联质谱才失去,说明C14取代基与环连接较紧密.图1中的mƒz616,632和 640高等学校化学学报Vol.26646离子的串联质谱图(图略)分别与次乌头碱、中乌头碱和乌头碱标准样品的串联质谱图完全相同,进一步说明它们分别对应这三种双酯型生物碱.脱氧乌头碱在二级串联质谱(图略)失去乙酸(分子量60),形成mƒz570离子,由于其结构与次乌头碱相似,所以其三级串联质谱(图略)与次乌头碱的三级串联质谱也相似.102羟基乌头碱和北乌碱的串联质谱(图略)分别与乌头碱和中乌头碱的串联质谱相似,说明C10位羟基对生物碱的串联质谱无影响.Table1MS2andMS3spectraof[M+H]+ionsforHA,MAandAC图1中,mƒz604和590离子分别对应苯甲酰乌头原碱和苯甲酰中乌头原碱6;mƒz574和588离子可能对应着新化合物,目前在生草乌中尚未见报道,根据质量数推断可能分别为苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰脱氧乌头原碱离子,它们是相应的双酯型生物碱通过C8位水解失去乙酰基的产物,属单酯型生物碱.为进一步确定其结构,分别对其进行电喷雾串联质谱研究.对比mƒz590离子的二级质谱(图略)与中乌头碱标准样品的二级质谱(Scheme1)可见,mƒz590离子在二级质谱中未失去乙酸(分子量60)生成相应的离子,但却观察到了失去水(分子量18)生成的mƒz572离子,三级串联质谱与中乌头碱标准对照品的三级串联质谱(表1)完全相同.表明在二级串联质谱中,mƒz590离子生成的mƒz572离子与中乌头碱标准对照品离子生成的mƒz572离子结构完全相同,说明mƒz590离子所对应的化合物是苯甲酰中乌头原碱.用相同的方法进一步确定了其它3种单酯型生物碱,其相应的化学结构示于Scheme1.在图1中,mƒz674,688,690和704处存在4个弱峰.图2为mƒz704离子的串联质谱,与草乌花中32乙酰基2102羟基2乌头碱的串联质谱8完全相同,由于生物碱的串联质谱与其结构密切相关,微小的结构差别也能被反映出来,同时考虑到生物碱的来源,可以确定该离子就是32乙酰基2102羟基2乌头碱离子.同理,可以确定其它3种三酯型生物碱(串联质谱未列出)分别为32乙酰中乌头碱、32乙酰乌头碱和32乙酰基2102羟基2中乌头碱.它们在二级串联质谱中产生的子离子主要为[MH-CH3COOH]+离子,其次分别为[MH-92MH-120+和[MH-152+离子,分别为母离子通过失去CH3COOH+CH3OH,2CH3COOH或CH3COOH+CO+CH3OH,2CH3COOH+CH3OH或CH3COOH+CO++,2CH3OH而形成;在三级串联质谱中,失去的mƒz60可能对应CH3COOH或CH3OH+CO,另外还失278形成三酯型生物碱的特征峰8.去mƒzFig.2ESI-MS2(A)andESI-MS3(B)spectraoftheionatmƒz704fromtheESI-MSspectrumofAconitumkusnezoffii脂类生物碱的结构与双酯型和三酯型生物碱的结构相似,差别仅在于C8位被长链脂肪酸酯链取代,因此它们在二级串联质谱中失去C8位长链脂肪酸生成的子离子与相应的双酯型和三酯型生物碱AconitineHAMAACAconitineHAMAACMS2MH+616(18)632(24)646(42)MH+-60556(100)572(100)586(100)MS3MH+-60556(8)572(10)586(30)MH+-60-18554(5)568(4)MH+-60-32524(100)540(66)554(50)MH+-60-32-18522(28)536(16)MS3MH+-60-32-28496(80)512(100)526(100)MH+-60-3232492(8)508(8)522(3)MH+-60-3232-18490(6)504(2)MH+-60-3232-28464(6)480(6)494(5)MH+-60-3233-122338(18)354(16)368(18) 641No.4许庆轩等:草乌中二萜类生物碱的电喷雾串联质谱研究失去C8位乙酸形成的子离子完全相同,串联质谱也完全相同.它们的三级串联质谱与相应的双酯型和三酯型生物碱的三级通过在串联质谱中所失去的质量数以及生成的子离子的种类,可以确定脂类生物碱的结构,并且对于质量数相同的不同脂类生物碱,也可以通过串联质谱加以有效区分9.例如,在mƒz938离子的串联质谱中(图略)母离子失去mƒz294,310,352和366生成相应的mƒz644,628,586和572子离子,对这些子离子做串联质谱,所得谱图(图略)与32乙酰2102羟基乌头碱,32乙酰乌头碱,乌头碱和中乌头碱的三级串联质谱几乎完全相同,可以断定这4种子离子是由4种不同的母离子形成的,因此可以确定在mƒz938处存在4种离子,分别为32乙酰2102羟基282十九碳二烯酸酯2苯甲酰乌头原碱,32乙酰282二十碳烯酸酯2苯甲酰乌头原碱,82二十三碳烯酸酯2苯甲酰乌头原碱和82二十四碳烯酸酯2苯甲酰中乌头原碱.同理,列出).通过串联质谱在草乌中发现了大量的双酯型和三酯型生物碱骨架C8长链脂肪酸酯(结构未参考文献1234DesaiH.K.,HartB.P.,CaldwellR.W.etal..J.Nat.Prod.J,1998,61:743—748SuzukiY.,OyamaT.,IshigeA.etal..PlantaMed.J,1994,60:391—394AmeriA..J.Pharmacol.J,1998,342:183—191HUANGYuan(黄园),HOUShi2Xiang(侯世祥),XIERui2Xi(谢瑞犀).ChinaJournalofChineseMateriaMedica(中国中药杂志)[J,1997,22(11):667—671WANGYong(王勇),SONGFeng2Rui(宋凤瑞),JINDong2Ming(金东明)etal..Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)[J,2004,25(1):85—89LIZheng2Bang(李正邦),LUβGuang2Hua(吕光华),CHENDong2Lin(陈东林)etal..NaturalProductResearchand56Development(天然产物研究与开发)[J,1997,9(1):9—147RENYu2Lin(任玉林),HUANGZhao2Hong(黄兆宏),JIAShi2Shan(贾世山).ActaPharmaceuitcaSinica(药学学报)[J,1999,34(11):873—876WangY.,SongF.R.,XuQ.X..J.MassSpectrom.J,2003,38:962—970XuQ.X.,WangY.,LiuC.M.etal..Anal.Sci.J,2003,19:1599—1603AnalysisofNorditerpenoidAlkaloidsinRootsofAconitumkusnezoffiibyElectrosprayIonizationTandemMassSpectrometry89XUQing2Xuan,WANGYong,LIUZhi2Qiang,LIUShu2Ying3(LaboratoryofNewDrugResearch,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofScience,Changchun130022,China)TIANCheng(ManzhouliInspectionAndQuarantineTechnicalCentre,Manzhouli021400,China)AbstractElectrosprayionizationtandemmassspectrometry(ESI2MSn)wasappliedforsimultaneousdeterminationofnorditerpenoidalkaloidsintherootsofAconitumkusnezoffiiwithoutanychemicalisolation.Thestructureinformationofthealkaloidswasgottenbyelectrosprayionizationtandemmassspectrometry(ESI2MSn).Accordingly,fourkindsofnorditerpenoidalkaloids,suchasmonoesteralkaloids,diersteralkaloids,triesteralkaloidsandlipo2alkaloids,weresimultaneouslydeterminedintherootsofAconitumkusnezoffii.Also,triesteralkaloidsandlipo2alkaloidsarefirstlyfoundintherootsofAconitumkusnezoffii.KeywordsspectrometryAconitumkusnezoffii;Norditerpenoidalkaloid;Electrosprayionizationtandemmass(Ed.:K,G) K619SynthesisofMoS2ƒCarbonCompositeNanotubesSONGXu2Chun3,ZHENGYi2Fan,HANGui,YINHao2Yong,CAOGuang2ShengChem.J.ChineseUniv.,2005,26(4),617_619622OpticalPropertiesandSynthesisofCopperSulfideNanorodsbySolid-stateReactionatLowHeatingTemperatureZHOUJie,JIADian2Zeng3,LIULang2005,26(4),620_622Chem.J.ChineseUniv.,627PreparationofNano-ironNitridebyfromTemperature-programmedNano-ironOxidesReactionZHENGMing2Yuan,CHENGRui2Hua,CHENXiao2Wei,LINing,CONGYu,WANGXiao2Dong,ZHANGTao3Chem.J.ChineseUniv.,2005,26(4),623_627637StarchNanoparticleasTransgenicVehicleMediatedbyUltrasoundLIUJun,LIUXuan2Ming3,XIAOSu2Yao,TONGChun2Yi,TANGDong2Ying,ZHAOLi2Jian2005,26(4),634_637Chem.J.ChineseUniv.,641AnalysisofNorditerpenoidAlkaloidsinRootsofAconitumkusnezoffiibyElectrosprayIonizationTandemMassSpectrometryXUQing2Xuan,WANGYong,LIUZhi2Qiang,LIUShu2Ying3,TIANChengChem.J.ChineseUniv.,2005,26(4),638_641646MolecularImprinting-chemiluminescenceDeterminationofAnalginHEYun2Hua,LU¨Jiu2Ru3,ZHANGHong2Ge,DUJian2XiuChem.J.ChineseUniv.,2005,26(4),642_646