第四章 生物产品萃取技术

第四章生物产品萃取技术4.1.4.2廉价双水相体系双水相萃取与传统方法相比有许多优点，具有技术可行性，但实用性如何还取决于其经济可行性。随着生产规模的加大，双水相萃取所耗的原料也成比增加，由于其原料成本占总成本的90%且高于一般的离心沉淀法，因此，规模加大之后，技术优势就逐渐减小。此外，生产的总成本除取决于操作费用之外，还取决于设备的投资费用。虽然传统的分离方法所需的设备投资比双水相萃取法大3～10倍，但随着批处理次数的增加，设备投资成本所占的比例将减小。所以，由于原料成本较高，当生产规模很大时，双水相萃取法在生产成本上并无太大的优势，因此，降低原料成本是发挥其技术优势的一个方向，这就使廉价双水相体系的开发成为必要。77 廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物来取代现用的昂贵高聚物。Krone（1981年）首先利用粗dextran取代dextran，Folke（1987年）用变性淀粉PPT取代dextran，Skuse（1992年）利用羟基纤维素取代PEG，都获得了一定的成功。目前已开发了几种成本较低的聚合物来代替葡聚糖。例如，牌号PPT的变性淀粉、牌号为RcPPa/PES的淀粉衍生物以及牌号为Pulluan的微生物多糖等。利用PPT代替dextran的亲和双水相已用于大规模地从肌肉中提取乳酸脱氢酶，回收率可达96%，从而使该工艺过程更为经济可行[7]。谭天伟等[7]人系统地研究了十几种水溶性高聚物的相图，结果表明，PEG/ReppalPES体系成本较低，只有PEG/dextran体系成本的1/8，因而有可能取代PEG/dextran体系，还利用PEG/ReppalPES体系从黄豆中分离纯化了磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。另外，葡聚糖还可以被糊精、麦芽糖糊精和乙基羟乙基纤维素（EHEC）等物质取代。聚乙烯醇（PVA）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）目前已作为PEG的替代品用于双水相萃取，而磷酸盐已被硫酸钠、硫酸镁和碳酸钾等所取代[8]。4.1.4.2新型功能双水相体系77 新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系。Alred采用乙烯基氧与丙烯基氧的共聚物和PEG形成温敏性双水相体系。Kula等人开发了一种表面活性剂和水形成的温敏性双水相体系。在双水相萃取技术的研究过程中，不断有新体系被开发出来，如双水相胶束体系，它更适合于分离纯化生物分子，并且易于放大，便于生产，组成更加简单、操作更加灵活，提取更加便捷。此外，还开发出由去污剂形成的双水相体系。最近，利用温度诱导相分离，实现聚合物的循环利用引起了学术界的普遍关注。11环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的无规则共聚物是通过热力学平衡进行分离的。当温度高于临界点时分成两相，形成几乎是纯水的上相和富集聚合物的下相（通常含EOPO40%～60%，即水-EOPO相）。利用这一点，可以对被萃取物进行分离纯化，并能实现聚合物的回收和利用。阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）和阳离子表面活性剂溴化十二烷基三乙铵（C12NE）的混合体系，在一定浓度和混合比范围内、无任何外加物质的条件下，可以形成互不相溶、平衡共存的两相，两相均为很稀的表面活性剂水溶液（其总质量浓度在1%以下），称为表面活性剂双水相体系。这是双水相分离技术的一个新的分支，其中阳离子表面活性剂过量的双水相体系，称为阳离子双水相。这些新体系不仅操作成本低、萃取效果好，还为活性物质提供了更温和的环境[10]。将这种双水相系统应用于牛血清蛋白和牛胰蛋白酶的萃取中，已初步显示了其用于生物大分子萃取分离的优越性[11]。77 非离子表面活性剂双水相萃取分离法适合于分离具有一定硫水特性的水溶性蛋白质。该系统属于温度依赖型的双水相体系。当温度高于某点（浊点）时，包含蛋白质的表面活性剂就会从水相中分离出来，同时，水相中还留有少量的表面活性剂和蛋白质。与其他的双水相体系相比，在表面活性剂的浓度很低（1%w/w左右）时就会产生相分离，而且不需要有机溶剂。Tritonx-114是一种常用的表面活性剂，它的浊点低，不会使蛋白质变性，而且分离细胞膜蛋白质的效率也比较高。在新型双水相体系的开发中，今后研究的焦点应该是进一步认识双水相萃取的基础理论，寻找更为廉价的成相物质，以提高萃取专一性。4.1.4.3双水相萃取与细胞破碎过程相结合在高速珠磨机内，将细胞破碎和双水相萃取过程结合，同时进行。由于珠磨机内具有良好的混合条件，使PEG、无机盐和水能够得到充分混合，形成均匀的双水相分散体系。细胞破碎释放出的产物很快被萃取到PEG富集相。经过珠磨机加工的匀浆直接用离心机分相，离心之后，细胞碎片分配在下相，胞内产物分配上相。这种方法不仅节省了萃取的设备和时间，而且由于双水相可以保持很多蛋白质的活性，因此，能避免胞内产物的额外损失[12]。124.1.4.3耦合双水相萃取技术4.1.4.3.1亲和双水相萃取77 近年来，为了提高双水相萃取的专一性，借鉴亲和层析的优点，发展了一种亲和双水相分配技术，该技术对成相聚合物进行修饰，即将亲和配基（如离子交换基团、疏水基团、染料配基，金属螯合物配基以及生物亲和配基等）通过化学交联或分配的方法结合到成相聚合物上，有选择性地将某种蛋白萃入该相中，而杂蛋白仍旧留在另一相中。亲和双水相不仅具有萃取系统处理量大，放大简单等优点，而且具有亲和吸附专一性强，分离效率高的特点。目前，利用亲和双水相萃取技术已成功地实现了β－干扰素，甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶等多种生物制品的大规模提取[12]。表3－6列出了一些应用亲和双水相分离纯化蛋白质的实例。表3－6亲和双水相分配应用于蛋白质纯化的例子纯化的蛋白质β－干扰素延胡索酸脱氢酶葡萄糖－6－磷酸化脱氢酶己糖激酶L－乳酸脱氢酶D-hydroxyisocaproatedehydrogenase羟基异己酸酯脱氢酶磷脂酸ProcionRedHE-3BProcionYellowHE-3GCibacronblueF3G-AProdonYellowHE-3GCu2+亲和配基其中，直接从细胞碎片中纯化延胡索酸脱氢酶及乳酸脱氢酶已达到中试规模。亲和分配与亲和层析相比，具有以下优点：亲和分配可以直接处理发酵液及细胞破碎液；亲和层析中的传质一般为扩散过程，而亲和分配一般是流体对流传质控制，因而传质阻力要小得多，传质速度比亲和层析快；亲和分配具有较高的处理容量，也易于放大。77 4.1.4.3.2双水相萃取与膜分离相结合利用中空纤维膜传质面积大的特点，将膜分离与双水相萃取相结合，可以大大加快萃取传质的速率。而且，利用膜将双水相体系隔开，还可以避免由于双水相体系的界面张力小而产生的乳化作用以及生物大分子在两相界面的吸附。因此，将膜分离同双水相萃取技术相结合，是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有效手段。134.1.4.3.3双水相萃取与电泳技术相结合近几年来，随着生物技术的迅速发展，制备型电泳技术的研究受到了广泛的重视。双水相电泳是传统的溶解技术与电泳的结合，是一种新型的分离技术。由于双水相具有生物相容性，所以，双水相电泳技术为生物分子的成功分离提供了很好的方法。利用葡聚糖－聚乙烯与乙二醇－水系统分离氨基酸，在间歇设备中对影响分离因素，如分离时间、浓度、初始溶解浓度和相界面作用力等进行了研究。实验结果表明，在氨基酸的分离中，双水相电泳是一种高效的分离技术[14]。4.1.4.3.4与生物转化过程相结合77 在生物转化过程中，转化产物量的增加，常会抑制系列化过程的进行。因此，及时移走产物是生化反应中的主要问题之一。如果酶催化的生物转化过程和微生物发酵过程在双水相萃取系统中的某一相中进行，而产物能够分配于另一相中，则可避免产物对生物转化过程的抑制，又可以减轻目标产物与反应物及生物体或酶混于一体难以分离的困难。Andersson等曾综述了双水相萃取系统中进行的生物转化过程（包括酶催化和微生物发酵）。其研究结果表明，在双水相萃取系统中进行的生物转化，其生产能力、收率及分离效率均优于单一水相中的结果。生物转化[15]随着生物技术的不断发展，双水相萃取体系必将不断完善。开发新型的萃取体系、优化萃取工艺，研究体系的分相技术、萃取设备以及基础理论可改进双水相萃取技术，使其实用化，并在生物物质的分离中发挥独特的优点。参考文献[1].AlbertssonP.A.,PartitionofCellParticlesandMacromolecules(1960),JohnWileyNewYork.[2][3]毛贵中主编.生物工业下游技术.中国轻工业出版社.1999.[4]K.H.Kroneetal.Extractionenzymerecovery：economicalconsideration.ProcessBiochemistry,1984,19:170~176.[5]Kulaetal.Purificationofenzymesbyliquid-liquidextraction.AdvancesinBiochemical1477 Engineering,1982,1(24):73-118.[6]谭天伟，沈忠耀.双水相分离技术的评价与展望.微生物学通报.1996,23(6):368-372.[7]吕斌等.双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用.食品与发酵工业,2001,27(6):70-74.[8].陆强等.提取与分离天然产物中有效成分的新方法--双水相萃取技术.中成药,2000,22(9):655-659.[9]谭天伟,沈忠耀.用双水相萃取分离纯化磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶生物工程学报12(增刊),1996:168-170.[10]张珩等.双水相萃取技术应用在医药工业中的展望.医药工程设计杂志,2001,2(25):23.[11].童爱军等.阴阳粒子型表面活性剂双水相萃取色氨酸衍生物和牛血清白蛋白.分析化学,1998,26(5):535-539.[12].SuZhi-Guo.Fengxiao-li.Processintegrationofcelldisruptionandaqueoustwo-phaseextraction.Journalofchemicalandbiotechnology,1999,74(3):284-290.[13].姜伟等.微生物胞内产物分离的新方法-双水相萃取技术.工业微生物，1994,24(1):35-36.[14]S.L.Zhai,G.S.LuoandJ.G.Liu.Aqueoustwo-phaseelectrophoresisforseparationofaminoacids.SeparationandPurificationTechnology,2001,21(3):197-201.[15]77 4.2反胶团萃取随着基因工程和细胞工程的发展，传统的溶剂萃取技术难以应用于蛋白质的提取和分离。有两个主要原因：一是被分离对象——蛋白质等在40-50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数的蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。而新型萃取技术反胶团（ReverseMicelle）萃取有可能解决外源蛋白的降解，且可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。4.2.1原理表面活性剂是由亲水的极性头和疏水的非极性尾两部分组成的。当表面活性剂在溶剂中的浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就聚集，形成胶团。在有机溶剂中形成极性头向内，非极性尾朝外的含有水分子内核的聚集体，即反胶团。极性核溶入水后形成“水池”，当反胶团相与含有蛋白质的水相混合，蛋白质能增15百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!77 解度很大，表观分配系数增加，这时，分配系数与蛋白质的浓度有关。盐的浓度（离子强度）不仅影响蛋白质的表面疏水性，还会改变两相中成相物质的组成和相体积比。不同的蛋白质受离子强度的影响程度不同，因此，调节系统中盐的浓度，可以有效地萃取分离不同的蛋白质。4.1.2.3pH值pH值会影响蛋白质的解离度，改变蛋白质的表面电荷数，从而改变分配系数。此外，pH值还会影响系统中缓冲物质磷酸盐的解离程度，使H2PO4-和HPO42-之间的比例改变，影响相间电位差，从而影响分配系数。对某些蛋白质，pH值的微小变化会使分配系数改变2到3个数量级。理论上，在相间电位为零的双水相系统中，蛋白质的分配系数不受pH值的影响，而实际上对于许多的蛋白质而言，相间电位为零时的分配系数会随着pH值的变化而增减，这表明，蛋白质的结构和性质（如疏水性）会随pH值的变化而改变。4.1.2.4温度温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的活性。一般在临界点附近，温度对分配系数的影响比较大，远离临界点时，影响较小。1～2℃的温度变化不会影响萃取分离的效果。77 一般而言，大规模的双水相萃取操作不需要冷却，在室温下即可进行。这样可以节约操作成本。此外，由于PEG对蛋白质有稳定作用，因此常温下蛋白质不会失活变性；而且，相对于冷却状态下而言，常温下液体粘度较低，相分离容易进行。4.1.2.5细胞细胞破碎的程度以及细胞壁和细胞膜不同的化学结构会导致双水相体系上下相比例的改变，影响蛋白质的分配系数，K.pneumoniae在细胞浓度大于3%时，双水相体系中上下相体积的比例基本不变，但是随着细胞浓度的增加，细胞破碎后释放的内含物的分配系数会迅速下降[4]。4.1.3双水相萃取的应用4.1.3.1酶的分离提取双水相萃取技术目前较多的应用于胞内酶的提取和精制上。胞内酶提取的第一步是6细胞破碎，所得到的细胞匀浆液粘度很大，而且存在微小的细胞碎片。除去细胞碎片的传统方法是离心分离，但是该方法能耗大，并且细胞碎片不易完全去除。和传统的细胞碎片的分离方法（如过滤和离心法）相比，双水相体系具有一定的优点：双水相萃取具有较高的处理容量，时空产量及酶的回收率。一般来说，传统的处理方法达到相同的处理量时，需要比双水相萃取多3到10倍的设备。双水相萃取和其他分离方法的比较如表3－2所示[4]。表3－2不同方法除去细胞碎片时性能数据的比较77 方法双水相萃取碟式离心机连续分离碟式离心机间歇离心∑：7000m2转鼓式过滤器A：1.5m2中空纤维错流过滤A：10m2(a)20m2(b)细胞量Kg100体积L330浓度Kg/l0.3处理量时空产量l/hKg/lh1200.11收率%90浓缩倍数3-5时间h3成本$7.80010010000.11000.018511030.0001005000.2600.028518.346.0001001002004000.050.032004000.0050.00385851101025.00040.000注：表3－2中，(a)酶滞留比R＝0；（b）酶滞留比R＝0.7和传统的酶粗提方法（如盐析和沉淀法）相比，双水相萃取也具有一定的优越性。表3－3为在β－半乳糖苷酶纯化过程中，沉淀法及双水相萃取法的比较。结果表明，双水相萃取不但具有处理容量大，步骤少的优点，而且收率及纯化倍数均高于沉淀法。表3－3β－半乳糖苷酶纯化方法比较（根据总面积为734m2的碟式离心机间歇离心的数据计算）方法沉淀法双水相萃取法步骤数31流量（Kg/h）0.7710-15酶收率(%)6377纯化倍数3.512.8总纯度(%)234377 双水相萃取分离酶的例子非常之多。例如，Kula等人[5]采用PEG/盐（Salt）体系，用于除去胞内酶的细胞碎片及其他杂质如杂蛋白、核酸和多糖等。有关应用见表3－4。由表3－4可以看出，大多数酶的分配系数在3到20之间，一步萃取不但可以除去细胞7碎片，而且约有50～80%的杂蛋白也可同时除去，酶的收率为85～98%。双水相萃取应用到酶的纯化工艺时，一般应用一级或多级错流萃取。图3－2为二级萃取的实例。表3－4双水相萃取法从细胞破碎液中提取和纯化酶酶α－葡萄糖苷酶乙醇脱氢酶己糖激酶葡萄糖异构酶支链淀粉酶磷酸化酶异亮氨酰－TRNA合成酶延胡羧酸脱氢酶天门冬氨酸酶β－半乳糖苷酶亮氨酸脱氢酶乳酸脱氢酶L－2－羟异己酸脱氢酶亮氨酸脱氢酶甲醛脱氢酶甲酸脱氢酶异丙醇脱氢酶细胞来源SaccharomycescerevisiaeSaccharomycescerevisiaeSaccharomycescerevisiaeStreptomycesspeciesKlebsiellapneumoniaeKlebsiellapneumoniaeE．ColiE．ColiE．ColiE．ColiBacillusspaeriouslactibacillusspecieslactobacillusconfususBacilluscereusCandidaboidiniiCandidaboidiniiCandidaboidinii成相体系PEG／SaltPEG／SaltPEG／SaltPEG／SaltPEG／dextranPEG／dextranPEG／SaltPEG／SaltPEG／SaltPEG／SaltPEG／crudedextranPEG／SaltPEG／SaltPEG／SaltPEG／crudedextranPEG／crudedextranPEG／Salt分配系数2.58.23.03.01.43.63.25.777 629.54.86.520117.019收率95%96%92%86%91%85%93%93%96%87%98%95%93%98%94%91%98%纯化倍数3.22.51.62.5212.33.46.69.32.41.5171.3------2.68图3－2连续错流萃取纯化酶的工艺流程图当相界面不含有分配物时，某种蛋白在上相中的收率Y可用下式表示：100（3－4）Y＝（%）1＋（VB/VT）（1/KE）由（3－4）式可知，酶收率主要取决于下相与上相的体积之比，即相比（VB/VT）和分配系数KE，而与成相总体积无关。4.1.3.2其他应用4.1.3.2.1萃取细胞、细胞器、膜等粒子萃取细胞、细胞器、膜等粒子的主要目的有分离提纯、分级分离、探测体内反应或体外处理时颗粒表面的变化、研究颗粒表面结构与生物学功能的相互关系、研究细胞与细胞或细胞与生物大分子间相互作用以及探测种属关系十分接近的细胞表面细微的差别。萃取的产品如表3—5所示。77 表3—5双水相萃取细胞、细胞器、膜的种类94.1.3.2.2生物活性物质的分析检测双水相萃取分析技术已经成功的应用于免疫分析和细胞数的测定。在该方法分析生物分子的过程中，一般需要一种与待测分子定量复合的物质。只要复合物和反应物之一在双水相体系中的分配系数不同，尤其是分配在不同的相中，就能进行分析。例如，可以用双水相萃取技术对黄毒苷进行免疫测定。具体方法是用I125标记的黄毒苷与含有黄毒苷的血清样品混合，再加入一定量的抗体，反应后加入双水相使其分相，抗体分配在下相，黄毒苷在上相，利用分配系数的不同，通过测定上相的放射性就可以测定免疫效果。4.1.4双水相萃取技术的新进展4.1.4.1新型双水相体系的开发77 新型双水相体系主要有两类：廉价高聚物/高聚物体系及新型功能双水相体系[5]。常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)体系和PEG/磷酸盐体系。成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品，价格很高，用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高，使分离难于进行。研究应用最多的PEG并不是双水相体系最适合的聚合物，而磷酸盐又会带来环境问题[8]，而且因为体系中盐浓度高，无法实现亲和分配，并会破坏某些生物物质的活性，而使其应用范围受到限制。目前用作成相的聚合物或盐类还很少，缺乏价格低廉、性能好且无毒的聚合物或盐。因此开发新型的双水相体系是该技术应用中急需解决的问题。10百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!溶于反胶团的“水池”中，由于水和表面活性剂在蛋白质表面形成一层“水壳”，使蛋白质不与有机相接触而得到有效保护[1]。蛋白质进入反胶团是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两界面形成含有蛋白质的反胶团，然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件（如pH值、离子种类或离子强度），又可使蛋白质从有机相中返回到水相中，实现反萃取过程。反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理[2]。如图所示77 含水量是反胶团的一重要参数，决定反胶团物理性质，决定其大小和每个胶团中所含表面活性剂的个数。含水量值与表面活性剂的种类，助表面活性剂，水相中盐的种类和浓度有关[4]。反胶团萃取的特点：（1）对生物活性分子变性较少，特别适合蛋白质的分离纯化（2）萃取效率高，选择性和收率高（3）成本低，容易放大，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。4.2.2反胶团体系分类、制备方法和影响因素4.2．2．1反胶团体系分类反胶团体系如见表2：表2反胶团体系分类及应用举例[1-3]类别表面活性剂特点应用16阴离子表面活性剂单一表面活性剂阳离子表面活性剂非离子型表面活性剂两种或两种以上表面活性剂构成少量亲和配基加入表面活性剂结构简单稳定，反胶团体积相对较大，适于等电点较高的较AOT，DOLPA小相对分子质量蛋白质，但对分子量大于30000的酶则不易分离CTAB，TOMACTritonXAOT/异辛烷/水体可用于分离核糖核酸酶、细胞色素C、溶菌酶TOMAC/异辛烷等电点较低的较大相对分子体系可用于α-淀质量蛋白质粉酶的浓缩能构成更大的反胶团，但这类体系容易乳化——混合表面活性剂反胶团一般来说，其对蛋白质有更高AOT/DEHPA77 的分离效率。非离子表面活性AOT/Tween85剂的加入可使反胶团变大，从AOT/DOLPA而可萃取相对分子质量更大的蛋白质。AOT/DEHPA体系可萃取牛血红蛋白亲和反胶团极少量三嗪蓝染具有亲和特性的助剂，往往极蓝染料为配基，料CB加入CTAB少量亲和配基的加入就会使加入到CTAB体系中可萃取原萃取蛋白质的选择性大大提中不被萃取的牛血高清白蛋白4.2.2.2反胶团制备反胶团制备方法主要包括以下几种[4]：（1）相转移法：一般把含有表面活性剂的有机相与含有蛋白质的水相接触，通过搅拌，蛋白质会缓慢地从水相转移到有机相中。形成的最终体系是稳定的，且可能在低含水量下得到高蛋白浓度。（2）注射法：最常用方法。蛋白质溶液直接注入含有表面活性剂的有机相中，搅拌成光学澄清的溶液。易控制水的含量和水核的尺寸。（3）溶解法：用反胶团溶液与固体蛋白质粉末接触来使蛋白质进入反胶团。适用于水不溶性蛋白质。4.2.2.3影响萃取的主要因素影响反胶团萃取生物分子的主要因素有水相的pH值、水相的离子强度、表面活性剂的种类和浓度、助表面活性剂、蛋白质的性质和浓度、有机溶剂的种类和温度等因素见表377 表3影响萃取蛋白质的主要因素[2]与反胶团有关因素与水相有关因素17与目标蛋白有关因素与环境有关因素表面活性剂种类PH值蛋白质的等电点系统的温度表面活性剂浓度离子的种类蛋白质的大小系统的压力有机溶剂种类离子的强度蛋白质的浓度助表面活性剂及其浓度蛋白质表面电荷生物分子溶解于AOT等离子型表面活性剂的反胶束相的主要推动力是表面活性剂与蛋白质的静电相互作用。此外，反胶束与生物分子之间的空间相互作用和疏水性相互作用对生物分子的溶解率(萃取率)也有重要影响。为增加反胶束萃取的选择性，带有亲和配体的助表面活性剂可以通过亲和作用协同反胶束萃取产品。蛋白质在反胶束内的溶解作用，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关。所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，均有助于蛋白质的萃取。影响反胶束萃取生物分子的主要因素有水相的pH值、水相的离子强度、表面活性剂的种类和浓度、助表面活性剂、蛋白质的性质和浓度、有机溶剂的种类和温度等因素。77 Kinugasa等人研究了水相离子种类对蛋白质萃取到反胶团溶液中的影响，使用碱金属和碱土金属离子对阳离子对蛋白质萃取到AOT/Isooctane反胶团溶液中的影响进行了考察。阳离子很大的影响了蛋白质的萃取速率，影响大小的顺序在单价离子中为K+Yang等人用反胶束萃取从猪血浆中分离纯化γ—球蛋白。实验结果表明水相的pH值和盐(NaCl)浓度和有机相表面活性剂(AOT)的浓度是影响萃取Y—球蛋白的最重要的因素。在400mmol／LNaCl，350mmol／LA()T和pH＝7.0时，保证产物纯度为85％的条件下，可获得97％的收获率。[6]Cardoso,M.M.的研究还记录了苯基丙氨酸在TOMAC/hexanol/n-heptane反胶束体系中使用纤维模组的萃取时萃取过程中随着不同的水力状况苯基丙氨酸随时间富集的演变。[7]4.2.3应用4.2．3．1蛋白质及酶的分离Soni,Krishnakant在有机溶剂中利用反胶束萃取体系对发酵肉汤中的胞外酸性磷酸酶进行了萃取。使用200mMAOT/异辛烷在25C将过程参数优化至最大萃取率。酸性磷酸酶的萃取受PH值，离子强度，表面活性剂浓度和水相/有机相体积速率的影响。在PH8.050mM77 KCl时得到了75%的酶转移活性的最大值。通过使用3：1水相/有机相的体积比率萃取和1：1的水相/有机相的体积比率进行最优化的反萃得到了酸性磷酸29%的最大收率。对所有参数进行最优化后，通过萃取和反萃从最初的发酵肉汤里得到高达29%的1.28特殊活性的酸性磷酸酶收率。发酵液中的蛋白质浓度是比较高的，这影响了传递过程。这可以通过改变产酶发酵介质的组成来克服。反胶束萃取提供了选择性溶解蛋白质的体系并且这些数据还暗示了溶解是通过带电蛋白质和利用系统的离子强度PH值和水相/有机相比率处理过的胶束内层之间的静电相互作用力来控制的。[8]Alves,J.R.S.等人研究了利用反胶束萃取青霉素酰基转移酶的最优化。青霉素酰基转移酶被成功的从粗提物中通过渗透冲击萃取到了AOT/异辛烷反胶束相中,并通过简单的盐浓度的改变(1M/LKCl)反萃出了几乎纯的水相产物。该研究描述了ph值，离子18强度和表面活性剂浓度对酶从两相直接接触的水相到有机相传递过程的影响。最好的结果在两相接触三分钟后获得(withanagitationof100rpm),0.10moll.1NaCl,pH5.5a和0.05moll.1AOT。在该状况下描述了平衡分配，对应于60%的酶活传递酶的失活减少至不到10%。NaCl的浓度被证明是一个关键因素，从其浓度增加至0.125mol/l使得萃取活性只有负载能力的10%。萃取最优化的pH处于一个比较小的间隔内(5.5±0.5)。因该值是低于酶的等电点的，故传递过程受控于酶表面活性剂静电相互作用。AOT0.05mol/l的浓度是在萃取收率和界面酶沉淀之间确定的一个折衷值。[9]77 Yan等利用一种新的表面活性剂大豆卵磷脂形成的反胶束体系，在引入亲和性配基后．成功地将溶菌酶、细胞色素c、清蛋白酶的混合物分离开来。由于配基具有极高的亲和专一性，大大提高了萃取率和纯化因子。[10]Sun等将CB—卵磷脂形成的反胶束溶液吸附于微孔聚丙烯中空纤维膜上，作为固定相，这种用色谱法分离蛋白质的方法称为中空纤维亲和色谱分离法(ho1Iow—fiberaffinitypartitioningchromatography，HFAPC)完全分离了牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶。[11]4.2.3.2氨基酸的分离翁连进等研究了以二(2—乙基己基)磷酸铵表面活性剂在磺化煤油中形成的反胶束对碱性氨基酸的萃取，分别测定了该反胶束萃取氯化铵浓度为1、5，2．5，3．5和4．5moI／L的水溶液中的碱性氨基酸的分配系数，结果表明该反胶束具有优良的萃取性能，可从无机盐浓度更高的氨基酸水溶液中萃取出氨基酸。此外还对pH值及氯化铵浓度对萃取的影响进行了讨论。[12]4.2.3.3抗生素的分离国内外关于反胶束应用在抗生素提纯的报道很少，李夏兰等以AOT/异辛烷反胶束系统提取乳糖酸红霉素为例，探讨了反胶束萃取抗生素的可能性。在室温240C、PH5.0，NaCl浓度为0.2mol/L，用异辛烷作萃取剂直接萃取红霉素时，萃取效率只有5.12％左右，而加入AOT77 0.05mol/L后萃取效率为94.4％，有显著增大，证明AOT/异辛烷系统萃取时不仅仅是异辛烷作萃取剂的有机溶剂萃取。将反胶束萃取剂循环使用3次，其萃取效率都在87％以上。萃取率变化都保持在较高水平，所以反胶束萃取剂能够循环使用。[13]Su等人将亲和配体胆兹醇D—丙氨酰D—丙氨酸酯固定于AOT／异辛烷反胶束溶液中，对万古霉素(pI＝8．1)的分离条件进行研究。结果发现，万古霉素可以在AOT反胶束中通过静电相互作用被萃取。在低于万古霉素pI值的pH范围内，在较低的pH和盐浓度的条件下可以增加其萃取效率。另外，当pH大于pI时反胶束萃取率相应增加。此外，万古霉素与胆舀醇D—丙氨酰—D—丙氨酸酯亲和作用，也可以增加萃取能力和分离效率。有亲和配体存在时万古霉素的萃取率从37％上升到80％，而反胶束萃取率保持不变，仍为95％。[16]4.2．4展望反胶团技术的研究仅仅二三十年，该技术在分离和纯化生物物质方面就有处理量大、可连续操作和活性损失低等特点。亲和配体的引入提高了目标物的萃取率及分离的选择性，以及近年来它与其他应用技术的结合等方面都显示了较大的应用潜力。许多研究工作已充分说明了反胶束萃取法分离、提取蛋白质的可行性和优越性；不仅是蛋白质和酶能够被提取，核酸、氨基酸和多肽也可以顺利地溶于反胶团中。77 但对反胶团体系的应用现在仅仅停留在研究阶段，至今仍无大规模的工业化应用，还存在许多技术上的问题有待解决。可以相信随着研究的深入反胶团萃取技术极有可能成为蛋白质等生物活性物质分离、提取的一种重要方法。19参考文献:[1][2]严希康《生化分离技术》华东理工大学出版社，1996：39-48[3][4][5]Kinugasa,Takumi;Kondo,Aki;Mouri,Emiko;Ichikawa,Sakiko;Nakagawa,Satomi;Nishii,Yasuhiro;et.al.Effectsofionspeciesinaqueousphaseonproteinextractionintoreversedmicellarsolution.SeparationandPurificationTechnology.Volume:31,Issue:3,June1,2003,pp.251-259[6]YangTH，YetMG，HsuCKeta1．JournalofBioscienceandBioengineering，2001，92(3)：214-220[7]Cardoso,M.M.;Viegas,R.M.C.;Crespo,J.P.S.G.Extractionandre-extractionofphenylalanineby77 cationicreversedmicellesinhollowfibrecontactors.JournalofMembraneScienceVolume:156,Issue:2,April30,1999,pp.303-319[8]Soni,Krishnakant;Madamwar,Datta.ReversedmicellarextractionofanextracellularacidphosphatasefromfermentationbrothProcessBiochemistryVolume:36,Issue:4,November,2000,pp.311–315[9]Alves,J.R.S.;Fonseca,L.P.;Ramalho,M.T.;Cabral,J.M.S.OptimisationofpenicillinacylaseextractionbyAOT/isooctanereversedmicellarsystemsBiochemicalEngineeringJournalVolume:15,Issue:2,August,2003,pp.81-86[10]Yan.s;lehikawa.s;Sugiura.sandFurusaki.s.BiotechnolBioeng.1998,58(1):58~64[11]SunY，ShiQ．SeparationScienceandTechnology，1999，34(16)：3255—3266[12]翁连进，王士斌等《二[2—乙基己基]磷酸铵反胶束萃取碱性氨基酸的研究》昆明理工大学学报第25卷第1期2000年2月pp：129-132[13]李夏兰，翁连进，陈培钦反胶束萃取乳糖酸红霉素的探讨药物生物技术2003，10(1)：29-3277 [14]SuWD，LeeCK．SeparationScienceandTechnology，1999，34(8)：1703—17154.3、凝胶萃取4.3．1凝胶萃取过程简介凝胶萃取过程是Cluster[1]在1984年在美国最先提出的一种新型分离技术。凝胶萃取的原理可用下图表示：首先凝胶与溶液接触，吸收其中的溶剂而溶胀，溶质则受凝胶网络的排斥，在溶液相得以浓缩；将浓缩液与凝胶分离后略改变凝胶的环境温度[14]或酸度使其释放出大部分吸收的溶剂；最后将凝胶与释放液分离，凝胶可重复使用。某些凝20百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!胶具有极强的吸收液体的能力，吸收液体的重量可超过自身网络重量的几十倍甚至几百倍，并可通过浓度对酸度的极小改变将吸收的液体释放，具有温敏或酸敏性。图77 凝胶萃取过程具有多种其他分离方法无法替代的优点，如高效性、经济性、可排除溶剂中的盐份等，这些特点预示了其在工程应用中将具有潜在的巨大的市场，也必将具有很高的应用价值。4.3．2凝胶萃取的热力学原理理想情况下，凝胶萃取中凝胶网络完全排斥被浓缩的溶质，并且其吸液量与在纯溶剂中时相同。但实际上因溶质浓度、分子量及溶质、溶剂及网络间化学亲和性等的不同，会有或多或少的溶质进入凝胶相，从而造成分离效率达不到理想值。而凝胶在溶液中的吸液量也一般小于其在纯溶剂中的吸液量，从而造成分离能力低于理想值。我们用分配系数K和滞涨度α分别表征溶质在溶液和凝胶相间的分配及凝胶吸液量相对在纯溶剂中吸液量的变化：其中，Cq，Cs分别为溶质在凝胶相和溶液相的浓度，q0，q分别为凝胶在纯溶剂和溶液中的溶涨度。为简化问题，这里考虑凝胶与单一线形聚合物溶液接触的情况。此三元两相物系中组元为（1）溶剂；（2）大分子溶质；（3）凝胶网络；（g）凝胶相（s）溶液相。相平衡的条件是溶剂和溶质在两相中的化学位μ分别相等：2177 其中Φ表示溶液相组分的体积分数，N2为溶质分子链节数；μ为已占体积参数；Φ2为纯溶剂中凝胶网络的体积分数。而U=-（μ1+μ2-μ3-0.5）。联立方程可求解分配系数K和滞涨度α。由上式可见，溶质分配和凝胶滞胀分别是影响凝胶萃取过程分离效率和能力的主要因素。我们应该从聚合物凝胶溶胀热力学的观点研究溶质分配和凝胶滞胀问题。4.3．3凝胶萃取的凝胶凝胶是一种吸收液体而溶胀的交联聚合物网络，具有介于固体和液体之间的物质形态。凝胶的性质很大程度上取决于聚合物网络和液体介质的相互作用。液体介质阻止聚合物网络皱缩成致密物质，而聚合物网络则阻止液体流失。当外部条件，如温度、]溶剂组成等发生变化时，凝胶则发生可逆的、非连续的溶胀和皱缩，吸收或释放出液体，其体积变化常达数百乃至数千倍。凝胶对所吸收的液体具有选择性，按各个组分的分子大小进行选择性吸收，即它只吸收小分子物质和无机盐类而不吸收如蛋白质等大分子物质。77 基于凝胶的这一特性，Flodin[2]于1960年首次提出用离心分离技术作为浓缩高分子溶液的方法。Deteman用Sephadex凝胶浓缩了血红蛋白等聚合物。1986年，Cluster较系统的阐述了凝胶萃取的概念，并设计了使凝胶可重复再生使用的凝胶萃取初步流程。用凝胶萃取法将凝胶作为固态除去氨基酸溶液中的无机盐，达到脱盐的目的。由于凝胶分离技术的设备简单、能耗低、再生容易，有着良好的应用前景。80年代以来人们对各种凝胶的物理化学性质以及其相变规律做了深入的研究，并探讨其在分离以及其它方面的应用，已取得了不小的成就。下面简要的介绍几种常见的凝胶类型。凝胶在外界条件下发生相变。根据外界条件的不同，可将凝胶分为温敏型、酸敏型和电敏型三种。224.3．3.1温敏型凝胶温敏型凝胶的特点是具有一个临界温度，即凝胶的温度上升或下降到此温度时，发生体积溶胀或皱缩。表1列出了几种凝胶的相变临界温度[3]。表1某些温敏型凝胶的相变临界温度由表格可以看出，不同的凝胶其相变临界温度不同，而且大部分凝胶具有温度依赖性。4.3．3.2pH敏型凝胶一般而言，当溶液的pH值或电解质组分浓度发生变化时，对离子型凝胶相变有很大的影响，但对非离子型凝胶影响很小。77 不论是含有阴离子或阳离子的凝胶，通常在pH范围的中值部分溶胀，含有阴阳两种离子的则相反，在中值范围皱缩。表2列出部分酸敏型凝胶的相变pH值[4]。表2部分凝胶的相变pH值4.3．3.3电敏型凝胶某些离子型凝胶处于电场中可引起非连续可逆的体积变化，Tanaka首先观察到丙烯酰胺凝胶在电场中的相变。Osada发现在凝胶中施加一稳定的电势，则凝胶中电流产生振荡。电流密度变化，振荡稳定，且与凝胶皱缩是相伴随的。藤木满雄对离子型聚丙烯酰胺类凝胶施加直流电，发现凝胶颗粒越小，收缩越快。10.2克凝胶，施加20V电压，8min体积皱缩7%；8.3g凝胶，施加50V电压，19min有1.1g水放出。；赖美治发现聚丙烯酰胺类凝胶的皱缩速度依赖于电场强度和溶液中电解质的浓度。杨云、张世诚对离子型聚丙烯酰胺类凝胶的电敏效应，其皱缩率较前人工作要大得多：施加10V直流23电，15min体积皱缩率达1.4。图1显示了凝胶的溶胀皱缩曲线[5]。图1酸碱型凝胶溶胀皱缩曲线4.3．4凝胶萃取的影响参数4.3．4.1合成水量对凝胶胀缩的影响77 在水中溶胀的凝胶所吸收的水以三种形态存在：与聚合物链上的亲水基团以氢键结合的“键合水”在亲水基团附近取向的“中间水”以及与自然水性质相同的“自由水”。前两种水主要取决于亲水基团的种类和数目，第三种则与凝胶的网络舒展程度和空间大小有关。合成时水量多，凝胶网络舒展，有利于容纳较多的“自由水”，使溶胀倍数增大，但机械性能较差。离子型、非离子型凝胶均有这种现象。4.3．4.2离子度对凝胶胀缩的影响离子度增大，凝胶聚合物链上带电荷急湍增加，使得“键合水”和“中间水”都增多，从而使溶胀倍数显著增大。Ilavsky对离子度的影响做了详尽的研究，发现温敏型凝胶相变温度和皱缩量都随凝胶的离子度增大而增大。Tanaka的研究也得出同样的结论。同时，他还指出，凝胶随温度增加发生皱缩的相变温度比温度降低时溶胀的相变温度高，离子度较大的凝胶，其皱缩相变温度增加，但溶胀相变温度对离子度不太敏感[6]。4.3．4.3凝胶颗粒大小分布对凝胶胀缩的影响Schosseler研究了聚丙烯酰胺凝胶颗粒的溶胀动力学[7]，结果表明颗粒集合的宏观溶胀性能与凝胶微观结构和颗粒大小分布有关。藤本满雄发现在电场中凝胶颗粒越小，皱缩越快[8]。Tanaka研究了直径为0.2~1μm的离子型聚丙烯酰胺凝胶球形颗粒相变过程，发现超细凝胶虽然响应时间较短，但与大颗粒凝胶有着显著的不同：离子型超细凝胶并不显示非连续相变，而大颗粒凝胶则是非连续相变。77 244.3．5凝胶萃取在分离中的应用凝胶对所吸收的液体介质具有大小选择性，外部条件的变化又可使凝胶释放出液体介质而得到再生。王世昌等利用酸敏型凝胶和温敏型凝胶浓缩了牛血清白蛋白，牛血清红蛋白、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、兰葡聚糖等生化制品，有较好的浓缩效果[9]。陈观文等提出将凝胶制成膜，用于膜分离技术，利用凝胶在电场中胀缩的性质，使膜分离的孔径可通过电场控制膜的胀缩而得到调节，从而成为可变孔径的膜。下表列出了凝胶萃取一些大分子的［１0］情况，由下表我们可以看出，凝胶对大分子量的物质的分离效率比较高。中国科学院化工冶金研究所利用酸敏型和电敏型聚丙烯酰胺类凝胶浓缩了α-淀粉酶和葡聚糖，得到了比较好的分离效果。凝胶萃取，不论其是温度、酸敏或电敏，均可能成为取代超滤或蒸发高分子溶液的新分离技术，尤其是电敏凝胶，具有快速、简便和无污染的特点，很有可能更快的获得工业应用。参考文献[1]王宇新，绍文策等.凝胶萃取分离生化制品理论和应用研究.化学工程.1994，22(2)：28.77 [2]姬宏深,范正.凝胶萃取分离技术研究进展.化工冶金.1995，16(4)：363-365[3]刘会洲,陈家镛.过程工业中重要分离技术的新进展.化工学报.2000,(1):31[4]苏延磊,刘会洲.包埋嵌段共聚物的水凝胶萃取低浓度有机物.化工学报.2000,(1):258[5][6][7][8]4.4．固相微萃取4．1固相微萃取固相微萃取（solid-phasemicroextraction,SPME）技术是90年代初新发展起来的集采样、萃取、浓缩、进样于一体的分析技术[7]。SPME焙融石英纤维涂布固定相与样品或其顶空充分接触，待测物在两相问分配达到25百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!平衡后，两相中待测物浓度关系如下式：Ns＝KVsVoCo／(KVs十Vo)(1)式中Ns为固定相中待测物的分子数；K为两相间待测物的分配系数，Vs为固定液体积；Vo为样品体积；Co为样品中待测物浓度。因为Vo>>Vs，故等式(1)可简化为：77 Ns=KVsCo(2)由等式(2)可知，固定液吸附待测物分子数与样品中待测物浓度呈线性关系，即样品中待测物浓度越高，SPME吸附萃取的分子数越多。当样品中待测物浓度一定时，萃取分子数主要取决于固定液体积和分配系数。同时，方法的灵敏度和线性范围的大小也取决于这两个参数。固定液厚度越大(即Vs越大)，萃取选择性越高(K越大)，则方法的灵敏度越高。由此可见，选择合适的固定液对于萃取结果是很重要的。目前，SPME装置已实现商品化。主要由两部分组成：一部分是作为支撑用的微量注射器底座；另一部分是类似于注射针头形状的熔融石英纤维，其半径一般为15mm左右，上面涂布着固定体积(厚度为10一100um)的聚合物固定液。操作时，只需将熔融石英纤维插入样品或样品上层气体(即顶空)中，平衡一段时间，使需萃取物富集于固定液后，即可取出直接进样至GC或HPLC仪中进行分析。4.4．2固相萃取的操作4.4．2．1萃取头操作萃取头操作参见表4表4SPME萃取头分类及应用范围非极性极性其他聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚丙烯酸酯(PARL)活性炭厚膜(100um)适于分折水溶液中低温点、低极性的物质适于分析极低适于分离酚等强极应用范围薄膜(7um)适于分析中等沸点和沸点的强亲脂性化合物77 高沸点的物质，如苯甲酸酷、多性物质环芳烃等类别举例4.3.2.2样品富集方式样品富集[7-9]见表5表5SPME样品富集方式富集方式优点直接法吸附量大顶空法较好的方法，可用于有大分子干扰的样品，广泛适用于多种类型的样品，包括固态样品、非匀质混悬液等26有大分子干扰时基线不吸附量小，当待测物具有较高沸点(约大于稳，有杂峰450℃)时，此法耗时长且灵敏度较低。不适用范围有大分子干扰的样品样品中待测物沸点较高缺憾SPME法不用或少用溶剂，熔融石英纤维可重复使用上百次，既降低成本又利于环境保护，操作简便，易于自动化和与其他技术在线联用。与其他常用技术相比，克服了许多缺点：如传统的液—液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长；以溶剂脱附的固相萃取法回收率低；热脱附的固相萃取法需要专用的加热装置，且固体吸附剂的孔隙易被堵塞的缺点；超临界流体萃取装置价格昂贵，不适于水样分析。SPME法与其他萃取方法的比较见表6。表6SPME法与其他萃取方法的比较[10]4.3.1.1.不同过程的影响因素见表777 表7不同过程影响因素萃取时间[9]解吸过程[7]分配系数、物质的扩散速度、影响搅拌，温度，顶进样口温度，解吸时间，样品基质、样品体积、萃取因素空体积大小起始柱温，待测物的性质头膜厚度提高萃取量的方法[11-13]：（1）萃取过程涉及涂层和基质对被萃物的竞争吸附，通过合适的手段增加涂层对样品的亲和性，减少基质对样品的亲和性，使萃取平衡向萃取方向移动，可以增大萃取量。（2）还可以在萃取涂层中加入衍生试剂，使极性化合物在萃取的同时，现场衍生成极性较小的物种，有利于萃取和随后的色谱分析。（3）调整液相样品的PH值或加入盐分，泥土样品加入适量水或表面活性物质，都可以有效地增加萃取量。（4）温度是对SPME影响较为复杂的因素，存在一个合适的操作温度。最理想的方法是在加热样品的同时，冷却涂层到室温，则使常温下无法萃取的物质都可得到定量萃取。（5）搅拌：促进样品均一化，尽快达到分配平衡。顶空取样[8]274.4.4固相萃取的应用77 SPME法最初只用于环境化学中易挥发化合物的提取分析，随着方法本身的不断完善，现已逐步发展到食品、医药卫生、临床化学、生物化学、法医学等领域[9,13-16]。最近已由挥发性物质的提取发展到不具挥发性的除草剂，日本把样品基质由污水发展到血和尿，成功地提取了尿中的烟碱[9]。固相微萃取已应用于牛血清清蛋白的分析中[17]。SPME应用于分析环境中挥发性有机物、杀虫剂、酚类等[13-14],农药残留[15]。SPME—GC联用不适于热不稳定化合物及表面活性剂、药物、蛋白质等半挥发和不挥发组分的分析，而SPME-HPLC联用可以解决其局限性，扩大SPME的应用范围。还有与分光光度计、红外光谱、电解分析、毛细管电泳、SPME-ICP-MS、SPME-微波辅助萃取-GC等多种联用方式[8，18]。用SPME—GC—MS检测半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的方法。Liao等人已实现了用SME-微量LC方法萃取和分离蛋白质,向我们展示了SPME分析蛋白质化合物的潜力[19]。今后努力的方向在发展更新更好的纤维涂层以获得更好的选择性，如微型吸附搅拌棒,与膜技术、抗体技术、传感器及分子标记聚合物等结合如笼形分子的萃取纤维层，研制各种专用纤维，促进其应用[7,19-20]。现已有内涂固定相的毛细管萃取柱和热解吸方式[20]，它对于难挥发性物质的分析，In-tube-SPME-HPLC的方法简单方便且灵敏准确，因此会在生化、药物、食品领域有很广阔的应用发展前景。77 4.5超临界萃取4.5．1超临界萃取的原理超临界流体萃取（SFE）技术应用领域相当广泛，特别对分离或生产高经济价值的产品，如药品、食品和精细化工产品等有着广阔的应用前景。特别适用于食品、中草药中某些热敏性物料的萃取。C02超临界流体萃取在在医药领域该技术广泛用于酶和维生素的精制，酵母、菌体生产物的萃取，医药品原料的浓缩、精制、脱溶剂，脂肪类混合物的分离精制及动植物体内药物成分的提取等各个方面。在生物工程中还可代替脂溶性的有机溶剂进行酶化反应。国内已在实验室开发了月桂酸丁酯、油酸油脂，淀粉水解制取葡萄糖等酯化反应技术。也有利用该技术进行生物活性物质的提取，手性药物的制备。超临界流体具有萃取和精馏双重性，具有低温处理，不发生氧化变质，萃取效率高，没有溶剂残留和可选择性分离等优点。局限性：缺乏生物化合物在超临界CO2中的溶解度和相平衡数据，这就使工艺设2877 计不好把握，需经多次实验来获得必要的数据。较适合萃取脂溶性、分子量小的物质，对极性大、分子量太大的物质工业化生产有一定难度。目前国内设备装置投资大。开发超临界多元流体的分步选择性萃取、重组萃取及精馏萃取新工艺[28]；精确可靠的模拟、设计技术的需求以及热力学数据的进一步充实；利用整合剂与带电的离子生成的超临界流体整合物提高萃取率和生物兼容性[29]；将目前固定床的间歇式操作考虑采用移动床及流化床进行连续操作[23]是今后的发展方向。4.6．超声和微波萃取4.6．1超声萃取4.6.1．1超声波萃取的原理超声波在媒质中传播可使媒质质点在其传播空间内进入振动状态强化溶质扩散、传质,即超声波机制。超声波在媒质质点传播过程中其能量不断被媒质质点吸收变成热能,导致媒质质点温度升高,即超声波热学机制。同时当大量的超声波作用于提取介质,当振动处于稀释状态时,介质被撕裂成许多小空穴,这些小空穴瞬时闭合,闭合时产生高达几千大气压的瞬时压力,即空化现象。77 在超声场中由于被破碎物等所处的提取介质中含有大量的溶解气体及微小的杂质,它们包围在被破碎物等的胶质外膜周围,为超声波作用提供了必要条件。空气中产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂,而且整个破裂过程在瞬时完成,同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放扩散及溶解。超声波破碎过程是一个物理过程,浸提过程中无化学反应,被浸提的生物活性物质在短时间内保持不变,生物活性不减,同时提高了破碎速度,缩短了破碎时间,可极大地提高提取效率。除空化作用外,超声波还具有机械振动、乳化、扩散、击碎等多级效应,有利于使细胞中的目标分子的转移,并充分和溶剂混合,促进提取的进行。另外超声波的凝聚作用也不容忽视,超声波有使悬浮于气体或液体中的微粒聚集成较大颗粒而沉淀的作用。使用超声波作用时其效果不仅取决于超声波的强度和频率,而且与被破碎物的结构功能有一定的关系。计算表明:在水中当超声波辐射面上强度达3000W/m2时就会产生空化,气泡在瞬间就很快闭合,闭合时产生的压力脉冲形成瞬间的球形冲击波,从而导致被破碎生物体及细胞的完全破裂,从理论上确定被碎物所处介质中气泡大小后即可选择适宜的超声波频率。由于提取介质中气泡尺寸不是单一的,而是存在一个分布范围,所以超声波频率应有一定范围的变化,即有一个带宽。2977 超声提取法是一种利用外场介入强化提取过程，用溶媒进行天然药物中活性有机物成分提取的一种方法。超声能量与物质问有一种独特的作用方式——超声空化。空化作用产生局部的高温高压、能增强物质在溶剂中溶解能力，引起体系的宏观湍动和固体颗粒的高速碰撞，传质速率增大。超声提取时间短、条件温和[23]；与传统的BCR提取法相比也要高效得多[24]。在生化中超声波常被用于破壁，以使胞内产物得以释放。超声波技术应用于生物技术是一个较新的研究领域；超声波在高分子降解、有机合成、提取分离方面得到了广泛的研究和应用，如多糖的降解与提取。目前对超声波从陆地植物中提取药用有效成分进行了研究，都取得了较满意的效果，回收率大大提高，如用超声波技术提取青蒿素；超声波用于海藻破碎提取海洋生物活性物质亦取得了较好的效果[]。近年来,人们也用超声波技术提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆液的毒质等,超声波提取比常规提取法费时少、得率高,化学成分与常规法相比没有变化，而且具有能耗低、不破坏有效成分的特点[]。由于超声波其独特的优点，必将能在各个行业的分离纯化中得到广泛的应用，使这项技术越发成熟拥有广阔的应用前景。434.6．1．2超声波萃取的影响因素1超声波输出功率的影响输出功率反映了超声波能量的大小，与超声波破碎的效果密切相关。超声波的能量越大，空化作用就更强更有利于细胞的破碎2细胞浓度的影响77 细胞浓度影响液体的粘稠度。从而会影响超声波在液体中的空化效应。因为细胞浓度高，则液体的粘稠度大，这可能不利于空化泡的形成及其膨胀和爆炸的作用，使破碎效果差。但细胞浓度也不能太低，如低于12%，破碎率反而会降低。3超声波每次辐射时间的影响采用较短的辐射时间及多次超声波辐射的工作方式有利于细胞破碎，而延长每次超声波辐射时间、减少辐射次数的工作方式使破碎率明显降低。超声波通过空化效应破碎细胞的过程实际就是空化泡的形成、振动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程,这一过程需要一段极为短暂的时间来完成，短时多次的工作方式能使超声波产生的空化泡有足够的时间和更多的机会完成膨胀和爆炸的过程，因此有利于细胞破碎。不过，每次辐射时间低于2ｓ，破碎率反而会显著下降。30百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!4超声波总辐射时间的影响超声波对细胞的辐射时间也是影响破碎效果的重要因素，随超声波总辐射时间的增加，破碎率也随之提高，说明延长超声波总辐射时间有利于细胞破碎。4.6．1．3超声波萃取在分离纯化中的应用77 现在，超声波技术已经被广泛的用于植物有效成分的提取，比如青蒿素，杜仲叶，海藻油等。通过超声波技术的使用不但可以保证产品的质量，而且可以大大缩短提取时间，降低成本。超声波技术具有广阔的应用前景，必将推动我国的中药的发展。(1)超声波提取杜仲叶[]杜仲纯粉是杜仲多种有效成分的复合体,杜仲药物有效成分是其水溶物。用超声波提取的目的,就是寻求在较低温度下最大限度地提取杜仲叶中的有效成分。超声波的空化作用可加速植物中的有效成分进入溶剂,增加有效成分的提取率。除空化作用外,超声波还具有机械振动、乳化、扩散、击碎等多级效应,有利于使植物中有效成分的转移,并充分和溶剂混合,促进提取的进行点。工艺流程：称取一定量的杜仲叶，每次加相应量的水，采用超声提取或煎提2次合并滤液，再经超滤，测定固溶物(溶解于水的物质)含量，计算提取率；再浓缩、干燥得纯粉制品，准确称量，计算纯粉得率。在超声波提取进入工业化之前得弄清:①超声提取时间与纯粉得率的关系；②超声波频率与纯粉得率的关系；③超声提取温度与纯粉得率的关系；④超声提取料液比与纯粉得率的关系。从而掌握并通过控制最佳的提取条件以保证高的提取率。77 [11]4。利用超声波可以简化操作，缩短工艺时间，而且操作费用低的优(2)超声波提取银杏黄酮苷[]银杏是我国最古老的子遗物之一，银杏叶中提取的几十种黄酮类和银杏内酯类化合物具有很高的药用价值，广泛地应用于人体捕获游离基、抑制血小板活化因子、促进血液循环和调节新陈代谢等。因此，对银杏叶中有效成分的研究和利用，引起了人们极大的兴趣，从而带动和发展了我国的银杏种值业和银杏叶加工业，各种药用新产品不断问世[12]9。银杏叶中有效成分的提取常用酒精、水等溶剂。不同溶剂对银杏叶中有效成分的提取有较大影响[13]。如酒精提取效率高，但成本也较高，且产品成分较杂，安全性也较低，甚至可能造成环境污染；水浸提法成本较低，但提取效率也低。因此，寻找一条效率高、成3177 本低、污染小的银杏叶有效成分提取新工艺。超声波技术其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。超声技术应用于提取银杏叶中黄酮苷，是因为超声可以强化水浸提,达到省时、高效、节能的目的,具有广泛的应用前景。超声波提取的工艺流程:银杏叶→剪碎(0.5cm)→按一定料液比加水浸润→超声处理→抽滤→定容→取样检测提取率。超声提取：取一定量的银杏叶于容器中,按料液比加水、控制一定温度,调整超声的功率强度处理一定时间后抽滤、滤液定容,供以下检测。超声波能够提高水浸提黄酮效率，其值等于常规水浸提效率的3倍左右，达到省时、高效、节能的目的。而且随着时间的延长或温度的升高，提取率提高。[9][9](3)超声波提取海藻油[]海藻是海洋微型浮游植物，具有许多重要的药理功能，在食品和医药领域具有广阔的开发前景。其海藻油——多不饱和脂肪酸，不仅是高等动物细胞的重要成分，而且对心血管疾病有特殊的预防和治疗效果，具有抗动脉硬化，降血脂，抗血小板凝集，降低血压，抗炎症，调节免疫机能，抗变态反应以及抗肿瘤等作用，其中以十二碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）尤为突出。77 目前，利用超声波强化技术提取海藻油的工艺受到广泛的关注和研究，超声波可以强化溶剂提取过程，缩短溶剂提取时间，减少溶剂用量，提高提取率，是一种具有发展潜力的利用外场力强化提取的新技术。海藻油提取的工艺流程：10海藻超声浸取过滤浓缩干燥海藻油检测EPA含量溶剂滤渣溶剂回收在利用超声波提取海藻油时，提取溶剂的用量和提取的温度对海藻油的提取物的得率有显著影响；同时，超声波的作用方式，声波的功率和频率以及作用时间都对提取物的得率有显著影响。所以，必须通过实验对提取条件进行研究，以确定合理的操作参数从而获得高的得率。(4)超声波提取玉米醇溶蛋白[]玉米籽粒中的蛋白质含量一般为10%左右，根据玉米蛋白质的溶解性不同,可分为4种3277 2主要组分：白蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。其中玉米醇溶蛋白(zein)的含量最高，是玉米中主要贮藏蛋白，占玉米蛋白中的50%。尽管玉米醇溶蛋白的氨基酸不平衡和难溶于水，不能直接为人体所利用，但由于它及它的树脂能形成有韧性的、光滑的、耐水、耐油、防腐膜,在特种食品、医药和生物降解塑料工业领域有着良好的潜在应用前景，因而具有很大的商业价值[14]。目前因生产成本太高，国际市场价格为＄10～40元/kg，限制了它的应用。玉米醇溶蛋白的生产要消耗大量的酒精，酒精的回收又消耗大量的热能，因此改变传统工艺、降低生产成本为当务之急。利用超声波技术来减少溶剂用量、提高得率、缩短生产时间、减少热能消耗等提取的工艺路线：[15]。采用超声波技术使zein的提取时间由原来的几个小时缩短到30min，大大提高了效率，增大了生产能力，而且不需加热溶剂，不消耗热能，节约了生产成本。(5)超声波提取青蒿素[]77 从植物中提取药用成分的首要条件是被提取物能够快速，高效地提取介质，如水溶液和有机溶剂等。由于青蒿素存在于细胞内，提取过程中一般学要将细胞破碎。采用化学破碎方法由于过程中有化学反应发生，容易造成被提取物结构性质等变化而失去；用机械方法有难以将细胞有效破碎。利用超声波提取，既可以获得较好的效果，而且可以缩短提取时间降低操作成本，提高产品质量。其工艺流程与超声波提取海藻盐的工艺路线大同小异，差的只是各自的操作条件和参数的不同。3(6)超声波应用于固液的分离[]超声波技术不仅可以应用于细胞的破碎，使细胞中的有效成分充分的溶解到提取剂中，336从而分离产品。而且可以用于固液的分离。超声分离的原理是利用液体中两个不同频率、振动方向相同、相对方向传播的两个平面声波,在传播过程中叠加,产生若干个振动速度为零的点,并且此点以一定速度向某一方向移动；而液体中的固体粒子在声波作用下总是在振动速度为零处聚集,并随此点运动而运动,最终聚集在装置的一侧,从而使固液分离得以实现。77 超声分离装置由两个在同一水平上相向对置的超声换能器组成，两换能器之间放置被处理的液体(如图1)。两个换能器的工作频率略有差别，在两个换能器工作时，两个平面声波在液体中传播并叠加会产生移动的驻波，而且有规则地横越两个换能器间的媒质，滞留在振动速度为零处的粒子被运动的驻波所带走，最终聚集在某一换能器的一侧，当液体流出声场区，亦即被处理之后，随即被分流。两个换能器的频率可以根据液体中固体粒子的粒度分布情况分别计算取定,但不宜相差太大。并且要使液体不产生空化现象,就必需限制声强。倘若声强足够大,在液体中产生的负压力亦足够强,那么分子间的平均距离就会增大到超过极限距离,导致液体产生空化，一般是取小于极限声强的某一声强值。这种超声分离装置可以用于各种悬浮液的固液分离，操作方便可以连续化操作。超声波促进萃取技术在提取天然产物中有很多应用，具有很多优点如提取效率高，时间短等。但主要问题是设备放大问题，由于超声波对人耳朵有刺激。在放大时，超声设备需要特殊的保护措施。参考文献：34[1]严希康生化分离技术华东理工大学出版社1996年12月第1次印（p1－3）[2]黄国平，温其标，杨晓泉，刘彬超声波法提取玉米醇溶蛋白的研究广东省“十五”攻关农产品加工重大专项资助项目(No.A20301)研究报告第28卷第10期（p1－5）[3]赵兵，王玉春等超声波用于强化石油醚提取青蒿素化工冶金77 2000年7月第21卷第3期（p310－313）[4]孙波，彭密军，杨晓燕超声波提取杜仲叶的工艺研究林产化学与工业1999年9月第19卷第3期（p67－70）[5]牛波,邱海霞,田景振,邹彪超声强化提取技术山东中医杂志2000年10月第19卷第10期（p629－630）[6]石秀东固液的超声分离过滤与分离1999年第3期（p19－21）[7]白晓清，赫冀成超声波作用下具有中性浮升力的微粒凝聚分离过滤与分离2001Vol.11No.1（p9－11）[8]吴克刚，杨连生，黄通旺超声波破碎Thraustochytrium提取脂质的研究郑州工程学院学报2001年12月第22卷第4期（p31－34）[9]郭国瑞，谢永荣，钟海山，刘红波超声波提取银杏黄酮苷的工艺研究赣南师范学院学报2001年6月第3期（p45－48）[10]卢群，丘泰球，胡爱军超声强化法提取海藻油的研究广东药学院学报2003年6月第19卷第2期（p104－105）[11]孙文基,等.[Ｊ].中成药研究,1986,5:8.[12]姚渭溪[Ｊ].中草药,1995,26(3):157.[13]王成章等[Ｊ].科技简报,1996(8):24.77 [14]LaiHM,PaduaGWCerealChem,1997,74:771～775[15]LaiHM，PaduaGW,WeiLSCerealChem,1997,74:83～904.6．2微波萃取4.6．2．1微波萃取的原理微波萃取的基本原理是微波直接与被分离的物质作用，微波的激活作用导致不同成分的响应差异使萃取物与基体的快速分离，而达到较高的分离产率。不同的基体使用的35百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!萃取溶剂也各不相同。微波萃取机理有2个方面：①高频电磁波穿透萃取介质，由于吸收微波能，细胞内部温度迅速上升，使细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，则细胞破裂，细胞内有效成分自由流出，在较低的温度条件下被萃取介质溶解，通过进一步过滤和分离，便获得萃取物质。②77 微波所产生的电磁波加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面的扩散速率。例如用水作溶剂时，在微波场下，水分子高速转动成为激发态，水分子汽化加强了萃取取组分扩散的驱动力，水分子回到基态所释放的能量传递给其他的物质分子，加速其热运动。从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃取温度．保证了萃取质量。也有理论认为：由于微波的频率与分子转动的频率相关连，所以微波能是一种由离子迁移和偶极子转动引起分子运动的非离子化辐射能。当它作用于分子上时，促进了分子的转动运动，分子若此时具有一定的极性，便在微波电磁场作用下产生瞬时极化，并以2.45亿次/秒的速度做极性变换运动，从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互摩擦、碰撞，促进分子活性部分（极性部分）更好地接触和反应，同时迅速生成大量的热能，促使细胞破裂，使细胞液溢出来并扩散到溶剂中。从用于微波萃取的设备分两类：一类为微波萃取罐，另一类为连续微波萃取线。两者主要区别一个是分批处理物料，类似多功能提取罐，另一个是以连续方式工作的萃取设备，具体参数一般由生产厂家根据使用厂家要求设计。使用的微波频率一般有两种：2450MHz,915MHz77 一般实验室用来作研究的设备为未经改着或是改造过的家用微波炉，其微波频率为2450MHZ。现在市场上已有成型的微波萃取设备，频率一般也有一定的选择范围。目前南京三乐微波技术发展有限公司已经研制出用于微波萃取的系列产品。微波功率从1KW～100KW，容积从0.1立方到3立方。萃取溶剂可以是水、甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、丙酮等强极性溶剂。根据不同物料与工艺也可以使用用弱极性溶剂。经多家食品生产厂家和制药厂家应用，效果良好。该系列产品性能稳定，自动化程度高，环境适应性强，操作简单，并符合GMP标准。该系列设备微波泄漏指标低于1mw/cm2欧美指标。6．2．2微波萃取的特点与传统萃取相比，微波萃取具有以下：质量高、产量大，对萃取物料具有较高选择性，反应或萃取快、省时，能耗低，安全、无污染，可以避免长时间的高温引起物质的分解,特别适合于处理热敏性组分或从天然物质中提取有效成分。与其他现有的萃取技术相比，微波萃取有明显的优势，如化学溶剂萃取法耗能大，耗时长，提取效益低，工业36污染大；超临界流体萃取，虽然在提取效率上有很大的提高，但其要求的装置复杂，溶剂选择范围窄，投资成本高，目前超临界流体萃取难以应用于极性较强的物质。微波的设备简单，高效成型的微波萃取设备也已出现，较少受被萃取的仪器物极性的限制。表一给出了从ArtemisiaannuaL中用不同方法萃取artemisinin的比较[22]。表一不同萃取方法的比较序号萃取方法萃取时间77 1常规萃取2h6#Extactionsolventoil350ml2索氏萃取3索氏萃取4CO2超临界萃取extractiongroup15CO2超临界萃取extractiongroup26微波萃取12min2h2.5h6h12h石油醚(30－60℃)350ml6#Extactionsolventoil350mlCO20.75kgCO20.6kg6＃Extractionsolventoil150ml77 66.792.1/33.2/30.870.960.455.775.2溶剂溶剂回收率(%)75.052.7萃取率（％）表二传统方法与微波辅助提取的回收率和时间的比较化合物回收率/%传统天然脂肪(食物)antinutritives杀虫剂(土壤)1004090微波98100100传统＞3h≥3h＜1.5h所需时间77 微波＜5min＜5min＜1min374.6．2．3微波萃取的影响因素影响微波萃取的主要工艺参数包括萃取溶剂、萃取功率和萃取时间。其中萃取溶剂的选择对萃取结果的影响至关重要。（1）溶剂溶剂的极性对于微波萃取的效率有很大的影响。利用微波萃取进行分离不仅要考虑溶剂的极性，而且还要求溶剂对于分离成分有较强的溶解能力和选择能力，要求对于后续的操作干扰小。常用于微波萃取的溶剂有：甲醇，乙醇，异丙醇，石油醚，丙酮等或者是几种萃取剂的混合。郝金玉等人[2]在分析对于微波萃取除虫菊酯的研究中比较了几种溶剂，发现三氯甲烷和二氯甲烷不是合适的溶剂,因为它们将许多杂质溶解,造成以后分离精制困难，正己烷是较好的溶剂。基体的不同对于萃取剂的选择也有可能不太一样。（2）温度和处理时间温度对于萃取速率的影响很大。在密闭的容器中由于内部压力可以达到十几个大气压，可以达到常压下同样溶剂不能达到的萃取温度，从而提高反应速度，而又不至于分解待分离组分。萃取回收率随温度的升高的趋势仅表现于不太高的温度范围内，且最佳的温度各不相同。77 微波萃取的时间与被测物样品量，溶剂体积和加热的功率有关，一般的情况下，萃取时间在10min-15min内。在萃取的过程中，一般加热开始1-2min即可以达到萃取温度。萃取时间的延长萃取回收率会有所提高，但是增长的幅度不大，可以忽略不计。（3）水分与湿度生物物料的含水量对回收率影响很大,正因为动植物物料组织中含有水分,才能有效吸收微波能产生温度差。若物料是经过干燥,不含水分的,就要采取物料再湿的方法,使其具有足够的水分。也可选用部分吸收微波能的半透明萃取剂,用此萃取剂浸渍物料,置于微波场中进行辐射加热的同时发生萃取作用。欧光南研究结果表明在用有机溶剂微波萃取鳗鱼油时，原料中的水分过高与过低都会会降低萃取的效率[3]。（4）基体物质的影响基体物质对微波萃取结果影响的原因可能是因为基体物质中含有对微波吸收较强的物质，或是几种物质的存在导致微波加热过程中发生化学反应。（5）微波强度和处理方式3877 微波的强度不同对于达到萃取温度加热时间和萃取的时间有很大的影响。连续或间隙加热方式的不同对于萃取的结果和萃取的速度都有很大的影响。许多研究都表明微波的强度越高其萃取速度越快；连续加热的方式的萃取速度较快，但是其温度上升太快不易控制，一般用间歇加热的方式，控制加热与冷却速度来得到较好的结果。采用封闭式萃取器和敞开式的萃取器的作用效果也有区别，封闭萃取器可以达到较高的气压，可以达到较高的萃取温度，提高萃取率，萃取剂有机溶剂的回收率也高；敞开式萃取器就比较适合于萃取热不稳定物质。4.6．2．4微波萃取在分离中的应用微波萃取大量应用于分析土壤、种子、食品、饲料中各类化合物，特别对于微量化学成分得分析效果更为明显。由于其高效快速的分离和选择性加热等优点，微波萃取也逐渐开始应用于生产制备之中。在天然产物的分离提取，矿物提炼等方面的应用备受关注。微波萃取技术已列入我国十一世纪食品加工和中药制药现代化的推广技术之一。4.6．2．4．1微波萃取在食品和生化分析中的应用77 天然食品和天然生物物质中微量成分的分析是微波萃取的一大应用领域。通过微波萃取快速准确的得到样品中待测成分，一般作为分析工作的前期工作，可以简时化分析处理过程。在分析检测农作物中的21种有机氯农药的残留量的研究中，Barrid等人用正己烷－丙酮（V:V＝1：1）为溶剂进行萃取，用正己烷－醋酸乙脂（80：20）为流动相作气相色谱分析，和索氏萃取同样效果下，微波萃取的时间和萃取得率均好于索氏萃取[14]。M.RamilCriado,[19]等人借助微波萃取分析了植物灰分中PCBs的含量，其萃取率可以达到70%。也有学者研究从土壤中分析微生物稀土元素利用效率，有机氯农药在水和水沉淀物中含量，土壤中N-methylcarbamates的含量，微波萃取结果比其他萃取方法的效果好[27]。4.6．2．4．2微波萃取在天然产物及生物活性成分提取中应用微波萃取法的萃取速度和萃取产物的质量使得该技术成为天然产物提取的有力工具，最早该技术成为天然产物提取的有力工具。最早利用微波萃取法从羽扇豆中提取了鹰爪豆生物碱。天然植物中有效成分的萃取是化学研究的重要内容，而微波萃取在植物成分分离中也显示了独特的优点。许多的文献已经对微波萃取植物有用成分做了分析。Joong-HoKwona等人利用微波萃取从高丽参中分离人参皂角苷，萃取时间由常规萃取的12h缩3977 短为5min,而且得到产品的稳定性也优于常规萃取方法[20]。其一些见于文献的微波萃取植物天然产物技术有：从茴香茶中萃取油类[29]，从烟草中萃取烟碱类物质[45]，从植物中萃取artemisia[22],从花生壳中萃取天然黄色素[37，40]，从甘草中萃取甘草酸[34]，从茶叶中萃取茶多酚[35]，从微波萃取印楝叶中的印楝素[33]等。微波萃取技术是食品和中药有效成分提取的一项新技术。目前微波萃取已经用于多项中药的萃取生产工艺中。国内外均有关于微波萃取中草药中有用成分的研究，得到的结果都优于常规萃取[39，43]。现在对从动物材料中萃取天然物质的研究工作也有见于报道。欧光南研究了从烤鳗的副产物鳗骨中以氯仿－丙酮（体积比2：1）为溶剂萃取鱼油[3]。国外也有人比较了不同萃取方法萃取羊毛洗刷的固体废物中的羊毛脂，采用丙酮/己烷（1：1）为萃取剂，微波萃取的时间从常规萃取的42小时降为8分钟[11]。4.6．2．5微波萃取设备77 近年来,微波萃取以其快速、低溶剂消耗、污染小、设备简单及萃取效率高等优点受到不同领域研究人员的重视。但到目前为止,它主要还是作为一种分析试样预处理的手段和一种提取精油等有用物质的方法,其研究处于初期阶段。萃取机理似乎更依赖于被提取的基体,许多提取过程的参数如物理形状及尺寸,自由水或结合水的含量等对提取率的影响,基础物化参数的收集,特殊微波辅助提取设备的研发等都有待于进一步的研究。鉴于微波能对萃取过程中传质传热的促进作用,将其应用于天然产物所含有效成分的提取和浓缩必会产生很好的效果。同时,如果能在仪器设计上实现突破,使微波萃取象超临界流体萃取那样与检测仪器实现在线联机,则该方法会获得更强大的生命力。参考文献[1][2][3][4]孙美琴,彭超英.微波萃取技术广州食品工业科技2003（02）pp96-97郝金玉,黄若华.,王平艳,邓修.微波萃取除虫菊酯2001（02）pp15-16欧光南.微波萃取鳗骨油的研究20016（3）2pp210-213Chen,Syr-Song;Chou,Shin-Shou;Hwang,Deng-Fwu.DeterminationofmethylmercuryinfishusingfocusedmicrowavedigestionfollowingbyCu2+addition,sodiumtetrapropylboratederivatization,n-heptaneextraction,andgaschromatography--mass.JournalofChromatographyAVolume:1024,Issue:1-2,January23,2004,pp.209-21540百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆![5]RamilCriado,M.;Pombo77 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表8新型耦合萃取技术特点及应用耦合萃取技术优点43应用、局限性与发展方向参考文献亲和层析与双水相萃取膜分离与液液萃取电泳技术与萃取分离技术发酵过程与萃取技术萃取结晶具有双水相处理量大的特点，而且具有新和层析专一性高的，可连续操作接触面积大，避免夹带现象和溶剂损失，避免返混，能耗低，萃取效果好，所需停留时间短，单位体积设备处理能力大克服返混的不利影响，又有利于被分离组分的移出。适用于稀溶液，低溶剂消耗的条件下，达到很高的回收率在发酵过程中利用有机溶剂连续萃取出发酵产物以消除产物抑制，能耗低，溶剂选择性好，无细菌污染可有效分离物性相近的组分特别是有机物同分异构体与热敏物料主要限制是葡聚糖的消耗。找替代物或衍生物。有效回收和循环利用聚合物为关键膜的稳定性、传质机理、溶胀和破乳是关键，需考虑降低生产成本[31][32][23][33][34]有效地应用于生物体系的分离[35]及染料水的处理十二烷醇、油醇是常用的萃取[36]剂。也可用双水相萃取分子印记提高选择性，分离效果主要由结与固相萃构不“完整”的识别位点控制。取MIP-SPE与LC联用，对许多化合物具有强的对映体选择性，如药物、氨基酸衍生物、多肽和抗体萃取与精可分离沸点相近的混合物采，用馏结合加盐萃取精馏法可分离恒沸有机水溶液体系的77 目前用于酚类、杂环碱的分离。考虑推广至络合反应、加合反应、整合反应、配合反应等用于生物分析和临床分析，环境分析，药学分析。模板分子渗露是MIP用于SPE的需要关注的一个主要问题，此外MIP的柱容量相对较低，选择性低于生物抗体，在亲水溶剂中的使用受限制药废液中回收四氢呋喃[37][38][39][40]结束语随着新型萃取技术的不断开发和改进，其在生物工程中的适用范围不断扩大，提取率得到提高，特异性增强，有着广阔的发展前景。萃取技术将沿着不断改进已有萃取技术，改进萃取装置、所用材料和溶剂，增加集成度几个方向发展。参考文献[3]谭平华，林金清，肖春妹等.双水相萃取技术研究进展及应用.化工生产与技术，2003，10（1）：19-23[4]LeonieA.Sarubbo,LucianaA.Oliveira,AnaLuciaF.Portoetal.PerformanceofaperforatedrotatingdisccontactorinthecontinuousextractionofaproteinusingthePEG-cashew-nuttreegumaqueoustwo-phasesystem.BiochemicalEngineeringJournal,442003,16:221-227[5]胡闻莉，刘文英一种新型固相萃取技术——固相微萃取药学进展，1999，23（5）：257-26077 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