人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究论文

　　人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究论文.freelethodofhumanumbilicalcordderivedmes-enchymalstemcells（UCMSC）.MethodsTheumbilicalcordsfromcesareannealstemcellsedigestmethodandculturedinDMEM/F12medium.SurfaceantigensofUCMSCethods.After12-14daysofprimaryculture，isolatedMSCsreached90%confluenceandthecellscouldexpandatleast20passages.FACSanalysisshobilicalcordderivedMSCshasstrongproliferationcapacity，bilicalcord;mesenchymalstemcell;biology;cellseparation间质干细胞（MSC）是最早由FRIEDENSTEIN发现，存在于骨髓中的一类成体干细胞，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞，是细胞工程重要的种子细胞之一［1］。近年来，国内外多个实验组报道了骨髓MSC（BMMSC）体外特定条件下能转化为神经元样细胞，使BMMSC受到了越来越多的关注［2］。但在临床上，骨髓取材较困难，供体有限，随年龄增长BMMSC增殖能力、多向分化能力下降，且有病毒污染的可能［3］。这些限制了BMMSC的进一步临床应用。寻找其他来源的MSC成为近年来的研究热点。新近有研究报道MSC不仅存在于骨髓，还存在于外周血，尤其是脐带血，更有研究报道从胎儿肝脏、肺脏、肾脏等部位提取到了MSC［4］，表明MSC不仅存在于血液系统，也存在于实质组织内。但脐带血MSC含量稀少，分离极其困难，胎儿MSC的应用则受到伦理学的限制。脐带血及胎儿内脏均存在MSC，脐带作为新生儿的一部分并且是分娩废弃物，其中是否也含有并能否提取到足量的MSC引起本研究室的关注。本文拟探讨从脐带获取MSC的方法及其基本生物学特性。1材料和方法1.1材料脐带组织取自天津市中心妇产医院剖宫产足月新生儿，均经父母授权同意。主要试剂和诱导剂:DMEM/F12培养液（Hyclone公司）、胎牛血清（Fe-talbovineserum，中国医学科学研究院血液病研究所）、碘化丙啶（BD公司）、胶原酶Ⅳ（Sigma公司）、BrdU（Sigma公司）、兔抗人BrdU抗体（北京中杉生物技术公司）、SP试剂盒（北京中杉生物技术公司）、流式抗体（除FITC-CD105购自Ancell公司，其余均购自美国BD公司）。RT-PCR试剂购自Invitro-gen公司，引物由上海博亚生物公司合成。1.2脐带MSC的分离采用了两种脐带MSC的分离方法，分别是组织块贴壁法和胶原酶消化法。1.2.1组织块贴壁法 将脐带从手术台上取下，无菌条件下浸入DMEM/F12培养液中，4℃保存，超净台内取出脐带，PBS冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存血。将脐带剪碎至1mm3大小组织块。组织块接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素，100mg/L链霉素）50mL的塑料培养皿中，放置于37℃、体积分数0.05的CO2饱和湿度的孵箱内培养。1周后，去掉组织块更换培养液。以后每3d换液1次。细胞长到80%融合时，用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L的EDTA混合液消化（在显微镜下控制消化时间），以8.0×103/cm2的密度接种于传代培养瓶（T-25）中进行扩增培养。1.2.2胶原酶消化法开始同组织块贴壁法，脐带剪碎至1mm3大小组织块后转移至1g/L胶原酶Ⅳ中，37℃持续搅拌消化30min，随即用1g/L胰酶37℃持续搅拌消化30min。细胞筛过滤，滤液离心，PBS洗2次。以1.0×106/cm2的密度接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素，100mg/L链霉素）的T-25塑料培养瓶中。3～4d后更换培养液，去掉未贴壁细胞。以后每3d换液1次，至细胞融合传代。1.3细胞表面分子标志检测分别取第3、5、10代的脐带MSC，去掉培养液，PBS洗2次，用2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤后制成浓度为3.0×109/L的单细胞悬液，每个Ep-pendof管加100μL细胞悬液，共12个管。1号和2号管为阴性对照，分别加入5μL抗鼠的IgG1-FITC和IgG1-PE单克隆抗体（单抗）;其余10管分别加入抗人的CD13-PE、CD14-FITC、CD31-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD11a-PE、CD29-PE、CD105-FITC、CD106-PE以及Cy-chrome-HLA-DR单抗各5μL。4℃孵育30min，流式细胞仪检测。1.4细胞增殖能力测定1.4.1细胞生长曲线分别取原代及第2、6、12代脐带MSC，调整细胞密度至4×107/L，接种至24孔板。第2天起每天取3孔进行细胞计数，取平均值。连续测8d，绘制细胞生长曲线。1.4.2BrdU掺入实验BrdU可以随细胞分裂在S期进入细胞核DNA，并标记细胞，可以将其作为判断细胞增殖能力的指标。细胞传代后，将BrdU以200μmol/L加入培养液。48h后，行BrdU免疫组化染色检测其标记率。1.5克隆形成能力的测定取培养的第2代脐带MSC制成细胞悬液，计数后吸取适量接种于6孔板，调整孔内细胞密度为10/mm2，3d换液1次，7d后取出6孔板，PBS洗涤后用姬母萨染液染色，计数孔中的集落数，计数标准为50个细胞以上者计为1个集落。 1.6RT-PCR检测分别取3×106个第3代UCMSC，以Trizol提取总RNA，逆转录为cDNA，反应体系含2μg总RNA，25mg/L随机引物，0.5mmol/LdNTP，1.5mmol/LMgCl2，10mmol/LDTT，1×buffer和2μLM-MLV。PCR法检测OCT-4mRNA表达。引物序列Primer1:5′-GAGTCCCAGGA-CATCAAAGC-3′，Primer2:5′-CTTCCTCCAC-CCACTTCTGC-3′。PCR产物序列长度228bp。PCR反应条件为94℃45s，58℃1min，72℃45s，共30个循环。1.7细胞周期测定分别取第3代及第8代脐带MSC，消化后离心，PBS洗涤2次。50mg/L碘化丙啶标记细胞，100mg/L的RNA酶处理。行流式细胞术检测细胞周期。1.8透射电镜观察脐带MSC的形态和超微结构将生长良好的第3代脐带MSC用2.5g/L胰酶消化后，PBS清洗，2000r/min离心10min，以体积分数为0.02的戊二醛固定，透射电镜下观察。2结果2.1脐带MSC的分离、纯化及扩增用组织块贴壁法分离脐带MSC，1周后于组织块间隙已可见散在分布的长条索状纺锤形细胞（图1）。此时，去掉组织块，更换培养液。倒置显微镜下可见几个或十几个散在分布、贴壁生长的细胞集落。每个集落细胞数从十几到几十个不等，细胞形态与骨髓来源MSC相似，多为两个突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞，少量为多突起的星形样细胞。细胞折光度好，核仁明显，胞体较骨髓MSC稍宽大。2周后，每个细胞集落细胞数达到上百个或数百个。细胞形态渐变为均一的纺锤形。3周左右细胞达到80%融合。此时以2.5g/L胰酶消化，按1∶3的比例传代。传代后的细胞约每3d即可达到90%～95%融合，需再次传代或冻存。用胶原酶消化法分离脐带MSC，第2天即看见有少量形态各异的贴壁细胞，散在分布（图2）。1周左右时，贴壁细胞形成集落，占优势的是成纤维样细胞，此外还可见少量鹅卵石样细胞组成的集落，考虑为脐静脉内皮细胞。成纤维样细胞增殖能力旺盛，至2周左右可达到80%融合，脐静脉内皮细胞生长则受到明显抑制。2.5g/L胰酶消化，传代后可得到纯化的成纤维样细胞（图3）。传代后的细胞形态无明显变化，性质稳定。每根脐带经2周左右原代培养结束时可获得6.5×105个细胞，至少能体外培养4个月，传20代以上，扩增3×109倍。2.2免疫表型测定 分别对第3、5、10代脐带MSC行FACS检测。结果表明各代间免疫表型无明显差异，均强烈表达CD13、CD29、CD105、CD44，弱表达CD106，不表达CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。2.3增殖能力及细胞周期检测本实验选择原代培养及第2、6、12代脐带MSC的生长曲线进行观察比较，发现不同代数细胞具有以下共同特征:培养潜伏期12～24h，2d后进入对数生长期，对数增殖期持续4～5d，7～8d后长满瓶底，进入细胞生长平台期，生长停止，12代以内各代间增殖能力无明显差别（图4）。取对数生长期，按照以下公式计算细胞倍增时间:DT=t×log2/（logNt-logN0）。结果表明，第2、6、12代MSC倍增时间分别为33.1、34.4、34.6h。在BrdU掺入实验中，80%～90%细胞BrdU表达阳性，表明细胞有丝分裂旺盛，增殖能力强。流式细胞仪进行细胞周期检测表明，第3代和第8代脐带MSC细胞周期比较无明显差别，均为有80%～90%细胞处于G0～G1期，表明细胞增殖活跃。该结果与骨髓及脐血MSC结果一致。2.4脐带MSC克隆形成能力测定低密度接种到6孔板后，脐带MSC可形成散在分布的克隆，克隆大小形态各不相同。按以下公式计算克隆形成率，克隆形成率=平均克隆数/种入的单个细胞数×100%。本文结果表明，第2代脐带MSC克隆形成率为21.25%。2.5RT-PCR检测结果脐带MSC的OCT-4mRNA表达阳性（图5）。2.6超微结构观察透射电镜观察显示脐带MSC核大，不规则，核仁明显，常染色质多，异染色质少;胞浆少，有少量细胞器，以粗面内质网和线粒体为主，胞浆内有较多游离核糖体（图6）。3讨论干细胞是指一类具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞。依据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是全能干细胞，理论上能分化为各种成体细胞，但其研究受到伦理学及法理的限制，且因胚胎干细胞的原始特性，其存在潜在致瘤性的危险。近期研究表明，部分成体干细胞也具有跨系甚至跨胚层分化能力。如神经干细胞可转化为造血干细胞，骨髓基质细胞分化为神经样细胞［5，6］。这些研究为成体干细胞的细胞替代治疗及组织工程研究打下了基础。近年来，MSC的概念越来越引起人们的重视。MSC最初是特指骨髓基质细胞，后来研究发现，在胎儿肝脏、肺脏、心脏等实质脏器及脐带血中均提取到了与骨髓基质细胞生物学特性相似、免疫表型相同的干细胞。因此将间质组织来源的与骨髓MSC生物学性状相似，具有多向分化潜能的细胞统称为间质干细胞［7］。MSC因其扩增迅速，免疫原性低，易于转染外源基因等优点使其成为组织工程最理想的种子细胞。本研究在脐带中提取到的细胞增殖能力强，形态及生理学特征与骨髓MSC相似。RT-PCR检测示OCT-4 mRNA表达阳性，OCT-4是胚胎干细胞特异性基因，对维持干细胞未分化状态具有重要作用［8］，表明脐带MSC具有干细胞特性。流式细胞检测结果显示，脐带MSC强烈表达CD13、CD29、CD105、CD44，弱表达CD106，不表达CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。CD29属于整合素家族，CD105是间充质相关抗原，CD14是单核巨噬细胞表面标志，CD11a是淋巴细胞功能相关抗原1α链，CD34和CD45是造血干细胞阳性标记，CD31是内皮细胞特异性抗原标记。本实验结果表明，脐带MSC表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性抗原。这与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的MSC流式细胞检测结果一致。目前尚未明确间质干细胞的特异性抗原标志，通常以细胞形态、流式细胞检测结果、多向分化潜能作为判断标准。我们据此认为脐带分离到的贴壁细胞也属于MSC，表明除骨髓、胎儿脏器外，MSC还存在于新生儿脐带组织。脐带中分离出MSC的重要意义在于，脐带作为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理的限制。而本研究建立的分离培养方法更能高效、快速、大量地扩增MSC，这又是脐血源性干细胞所不能比拟的。已有研究证实，在脐带的连接组织SC的方法，有助于获得大量的MSC作为进行细胞治疗、基因治疗的靶细胞，以及组织工程研究的种子细胞，并为MSC最终应用于临床治疗奠定了理论基础。（本文图1～6见封二）（略）［