生物工程综合实验教程

生物工程综合实验教程冯惠勇周晓辉实验1土霉素摇瓶发酵实验（设计型实验） 一、实验目的1、熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论4、熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技术二、实验原理土霉素是四环类抗生素，其在结构上含有四并苯的基本母核，随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。其结构和命名如图。R1R2R3R4R5土霉素HOHCH3OHH四环素HOHCH3HH金霉素ClOHCH3HH去甲基金霉素ClOHHHH多西环素HHCH3OHH米诺环素N(CH3)2HHHH美他环素H=CH2-OHCH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2土霉素具有广谱抗菌性，能抑制多种细菌、较大的病毒及一部分原虫。土霉素能抑制细菌的生长，在浓度高的时候也具有杀菌的作用。它的作用机制是干扰蛋白质的合成。由于它的毒副作用小，所以其在医疗上用途广泛，主要是应用于呼吸道和肠道感染。土霉素是由龟裂链丝菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，它们具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.4～1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分，孢子丝再形成分生孢子。而龟裂链丝菌的菌落灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。 龟裂链丝菌的菌落形态显微镜观察的菌丝特征土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵pH值、溶氧、接种量、泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。三、仪器与材料（一）培养基1、斜面高氏一号培养基可溶性淀粉2%氯化钠0.05%硝酸钾0.1%三水磷酸氢二钾0.05%七水硫酸镁0.05%七水硫酸亚铁0.001%琼脂1.5%-2.0%pH：7.4-7.62、母瓶培养基淀粉3%黄豆饼粉0.3%硫酸铵0.4%碳酸钙0.5%玉米浆0.4%氯化钠0.5%磷酸二氢钾0.015%pH：7.0-7.23、发酵培养基淀粉15%黄豆饼粉2%硫酸铵1.4%碳酸钙1.4%氯化钠0.4%玉米浆0.4%磷酸二氢钾0.01%氯化钴10µg/ml消沫剂0.01%淀粉酶0.1%-0.2%pH：7.0-7.2（二）实验菌种：龟裂链丝菌，微生物实验室保藏（三）仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤等四、实验题目1、溶氧对土霉素发酵的影响2、培养基中磷量对土霉素发酵的影响3、接种量对土霉素发酵的影响4、碳源、氮源浓度对土霉素发酵的影响五、实验步骤1．斜面孢子的制备无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.5～37℃的恒温箱培养3天，再置30℃的恒温室培养1天。2．种子的制备（1）摇瓶种子培养基的配制 按母瓶培养基成分配比，配制培养基，并加淀粉酶液化后，再加入CaCO3，冷却后调pH值，分装，包装灭菌。（2）接种在超净工作台上，将长好的斜面孢子用无菌接种铲挖块约2cm2，接种于灭过菌的摇瓶种子培养基中。（3）培养将接种好的种子摇瓶于30℃恒温室摇床上，转速为230转/分，培养28小时左右。2．发酵（1）发酵瓶培养基的配制培养基配方以发酵培养基配方为基础，依据实验题目不同而设计。摇瓶装量依据实验题目而设计。制备方法同种子瓶。（2）接种在超净工作台上，将培养28小时的摇瓶种子接种于发酵瓶中，接种量一般为10%或依据实验题目而设计。（3）培养将接种后的发酵瓶于30℃恒温室摇床上摇6～7天，转速为230转/分。（4）发酵样的测定：发酵液状态观察：粘度、颜色、气味、菌丝形态发酵样品预处理：发酵瓶摇匀，将少量倒入小烧杯，测pH。用9mol/L的盐酸溶液酸化pH至1.7-2.0搅拌10分钟。取5ml酸化液至7ml离心管，6000转离心4分钟，取上清液，备测。发酵样品土霉素效价的测定：采用分光光度法测定其效价。土霉素标准曲线的绘制：用土霉素标准样配成1000u/ml的标准液，用2ml移液管分别取标准液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml于试管中，加0.01mol/L的盐酸共10ml，再加0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml，摇匀，静置20分钟，另取样同上，加0.01mol/L的盐酸使全量为20ml，摇匀，作为空白，在480nm的波长下测定吸光度值，以土霉素效价为纵坐标，以吸光度值为横坐标绘制作标准曲线。发酵液效价的测定：吸取滤液稀释适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），用移液管取1ml稀释液于试管中，准确加入0.01mol/L的盐酸，使全量为10ml，再加入0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml，使全量为20ml，另取1ml稀释液，加入0.01mol/L的盐酸19ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，作为空白，在480nm的波长下测两种液体的吸光度。六、实验报告1、写出所选实验题目的实验方案和具体实验方法。2、自己设计表格记录实验数据。 3、用图、表汇总实验结果。4、对实验结果作出分析和讨论。七、思考题1、写出土霉素发酵工艺流程图。2、通过查阅资料，试述次级代谢产物的发酵规律和代谢调节机制。实验2管碟法测定土霉素生物效价一、目的要求1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。二、基本原理衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种。本实验采用管碟法测定抗生素的效价。管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。三、实验材料1、培养基（供摊布平板用）蛋白胨6g酵母膏6g牛肉膏1.5g葡萄糖1g琼脂15—18g蒸馏水1000mlpH:6.81.05kg/cm²121.3ºC灭菌20分钟2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcinaflava）3、土霉素碱标准品4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml） 、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（500ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等四、实验方法1．标准曲线制作绘制1.1标准土霉素溶液的配制准确称取20mg土霉素碱标准品，每毫克含910单位（910u/mg），先用0.1mol/lHCL溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫克含1000单位（1000u/ml）溶液，此溶液在5℃以下保存。1.2黄色八叠球菌菌液的配制取用普通琼脂斜面保存的黄色八叠球菌菌种，在试验前一日，将细菌接种于含有培养基的试管斜面上，于30℃培养24h后，用无菌水约10ml将菌洗下，即可。1.3大平板的制备按照培养基配方配置培养基250ml于三角瓶中，灭菌待用。取280mm*280mm的大平板两个，放入无菌室内紫外线灭菌半小时以上。取上述培养基融化，待培养基冷却至45～50℃时，按0.5%的接种量接入上述黄色八叠球菌菌液，迅速摇匀，立即倒入大平板中，推拉一下使培养基均匀摊布，置于水平桌面。待凝固后，在大平板上以等距离放置小钢管64个，用玻璃盖覆盖备用。1.4标准曲线的绘制取50ml容量瓶8只编号，并向各瓶中加入不同量的每毫克含1000单位的标准品溶液。用磷酸缓冲稀释至刻度，使其每毫克含土霉素10、12、16、20、24、28、36单位8种浓度的标准品稀释液（见表2-1）。上述配好的8个浓度的标准溶液各300ml,分别滴入8个小钢管，然后按图2-1所示8*8正交拉丁方排列移至测定平板上（见图2-1），盖上玻璃板，放置37℃恒温室培养16小时左右，测量各浓度的抑菌圈直径，分别计算其平均值，以抑菌圈直径平均值为横坐标，以土霉素效价对数为纵坐标，绘制一条标准曲线（为直线），计算相关系数。表2-1标准溶液的配制编号标准品（1000u/ml）(ml)磷酸缓冲液(ml)最终土霉素单位（u/ml）10.549.51020.649.41230.849.21641.049.02051.248.82461.448.62871.648.432 81.848.2361234567823456781345678124567812356781234678123457812345681234567图2-1样品的拉丁方排列示意图1.5样品溶液抑菌圈直径的测定先将发酵液酸化、过滤（方法见实验3-3），将几个不同浓度的待测样品和20u/ml的标准样分别滴入8个小钢管中，每个钢管滴入300ul，如图2-2所示8*8正交拉丁方排列于检菌板上，置于37℃恒温室培养16小时左右，测量各抑菌圈直径。1234567标234567标134567标124567标123567标123467标123457标123456标1234567图2-2待测样与标准样拉丁方排列的示意图分别计算每个待测样和标准品抑菌圈直径的平均值，用20u/ml标准品抑菌圈直径的平方与标准曲线上该点抑菌圈直径的差值作为校正值，校正各待测样抑菌圈直径的平均值，由校正后的值据由标准曲线计算出待测样溶液的效价。五、实验报告内容 1、根据将所测量各浓度土霉素标准品和检测数据，以抑菌圈直径平均值的平方为横坐标，土霉素效价的对数值为纵坐标，用excel2000绘制标准曲线。2、发酵液样品抑菌圈直径记录于自己设计的表中。求出各发酵样抑菌圈直径总平均值和校正值。六、思考题1、制备平板时时为什么必须在水平桌面上?2、敏感指示菌的生长时间和菌液浓度对抑菌圈直径有何影响?3、为什么各钢管滴加量要一致? 实验6采用小型发酵罐实验3分批培养大肠杆菌及其动力学参数的检测一、目的要求1、了解小型发酵罐的基本结构。2、学习和掌握发酵罐的使用方法。3、了解大肠杆菌培养过程的代谢变化。4、掌握大肠杆菌培养过程动力学参数的测定和计算方法。二、基本原理发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的，基本结构是类似的。现以GUJS-7C、GUJS-10C型发酵罐为例，说明小型发酵罐的结构。GUJS-7C、GUJS-10C发酵系统由发酵罐、空气处理系统、蒸汽净化系统、电气控制系统、恒温系统及管道、阀门等组成。其工艺流程图如下：自来水电磁阀压缩空气分水过滤器加热器发酵液发酵罐绝对过滤器空气减压阀摇床菌种蒸汽源蒸汽过滤器工艺流程图具体操作方法见第一章，操作注意事项如下：1、必须确保所有单件设备能正常运行时使用本系统。2、在过滤器消毒时，流经空气过滤器（金属滤芯）的蒸汽压力不得超过0.17MPa，否则过滤器滤芯会被损坏，失去过滤能力。3、在操作过程中，罐压不得超过0.15MPa，防止引起设备的损坏。 1、注意：在空、实消升温过程中不要开加热、冷却开关（最好将控制器处于关机状态），否则当温度设定值设定在培养温度时，冷却水管中会自动通冷却水，不仅会影响升温速度，浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，造成培养液的浪费。2、在空、实消结束后冷却时，发酵罐内严禁产生负压，以免损坏设备或造成污染。3、在发酵过程中，罐压应维持在0.03-0.05MPa之间，以免引起污染。4、在各操作过程中，必须保持空气管道中的压力大于发酵罐的罐压，否则会引起发酵罐中的液体倒流到过滤器中，堵塞过滤器滤芯或失去过滤能力。5、当发酵罐长期不用时，必须进行过滤器的灭菌，且将过滤器吹干，否则过滤器表面可能会引起细菌的繁殖，而导致过滤器的失效。6、在安装、拆卸pH、DO电极时，发酵罐内的罐压必须为零。否则电极会因罐内压力而冲出，造成电极损坏或造成人员受伤。大肠杆菌是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。本实验学习用大肠杆菌在小型发酵罐内进行发酵的方法。通过控制合适的培养条件，可使大肠杆菌迅速持续地生长，获得所要求的高产培养物。发酵动力学是研究发酵过程变量在微生物细胞的作用下的变化规律，以及各发酵条件对菌体生长、基质消耗、产物生成的变化速度的影响。为了动态地了解发酵过程中过程变量的变化，需在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度、残留的还原糖及氨基氮等参数变化，根据实验结果，可通过动力学方程推算动力学参数。三、实验材料（一）菌种：大肠杆菌（二）培养基表2-3种子培养基组成单位：g葡萄糖5K2SO40.2(NH4)2HPO410微量金属溶液（I）0.4MgSO4·7H2O0.2蒸馏水1LNaCl0.3微量金属溶液（I）单位：gFeSO4·7H2O10CaCl2·2H2O2ZnSO4·7H2O2.25NaB4O7·10H2O0.023CuSO4·5H2O1(NH4)6Mo7O240.01MnSO4·4-5H2O0.5蒸馏水1L 表2-4发酵培养基组成葡萄糖15K2SO40.3(NH4)2HPO412.5gZnSO4·7H2O0.085gNaCl0.375gCaCl2·2H2O0.075gK2SO42.4g微量金属溶液25mlFeSO4·7H2O0.375g蒸馏水1.5L微金属溶液（II）CuSO4·5H2O7.5g(NH4)6Mo7O240.75gMnSO4·4-5H2O3.8g蒸馏水0.5LNaB4O7·10H2O1.7g（三）仪器设备MD300-5L发酵罐及其附属设备，722型分光光度计，旋转式摇床等。（四）试剂泡敌、氨水、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等；裴林试剂甲液、裴林试剂乙液、0.1%标准葡萄糖液；0.05%溴麝香草酚蓝溶液、0.5%酚酞溶液、标准0.lmol/LNaOH溶液、中性甲醛溶液。四、实验方法1．种子培养培养条件：500ml三角瓶装液量100ml，初始pH为7.0，周期12h，培养基组成见表-1培养基配制完成后分装三角瓶，在105℃下，杀菌10min。如果种子培养基所接是保存斜面种子，用接种环从保存斜面中接几环至三角瓶中，若由种子瓶直接接种至发酵罐，需由发酵液体积计算种子瓶的个数。2．发酵罐的准备3．接种与培养将酒精棉或酒精置接种口槽中，点燃，进行无菌接种，接入500ml种子。接种后立即进行第一次取样。4．发酵过程各发酵参数的测定发酵过程中，虽然自动控制温度和pH两个重要条件，但仍需专人负责照看。完成下列工作：（1）经常注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。（2）随着培养时间的延长，适当地调节进气量和搅拌转速，以维持一定的DO值。（3）自培养操作开始起，每2h取一次样。取样时，将取样管口流出的最初15ml 左右培养液作为废液，取随后流出的培养液10ml。样品在1000r/min条件下离心分离10min。上清液放入冰箱保存，以测定糖浓度。沉淀物经纯水洗涤后稀释到一定浓度，在OD505下测定吸光度。（4）用裴林快速定糖法测定培养液中还原糖的含量。测定步骤如下:①发酵液中糖含量小于4﹪时，直接取发酵液0.5mI于锥形瓶中，若糖含量大于4﹪时先稀释10倍后，取稀释液0.5ml于锥形瓶中。①向锥形瓶加入裴林试剂甲液和乙液各5mI，混匀，加热至沸腾。②用0.1﹪标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，记录消耗葡萄糖液的体积数(V)。③取0.5m1蒸馏水于锥形瓶中，同法进行滴定，记录消耗葡萄糖的体积数(V0)。④按下公式进行计算：葡萄糖﹪=（V0－V）×0.1/0.5×稀释倍数Vo为葡萄糖滴定空白时消耗的毫升数。V为葡萄糖滴定样品时消耗的毫升数。（5）通氨量的测定。每隔2小时，计量通入的氨水量。五、实验报告1．设计表格记录发酵过程每2小时的发酵温度、pH、DO及其测定数值，记录菌体浊度、葡萄糖浓度和通氨量的检测值。2．以时间为横坐标，以菌体浊度、葡萄糖浓度S(g/l)、pH、DO、通氨量等为纵坐标作图，观察各参数的变化。3．应用动力学关系计算各时间段的比生长速率[μ=dX/(X·dt)]和葡萄糖的比消耗速率[qs=dS/(X·dt)]，并以时间为横坐标，μ、qs为纵坐标作图。4．应用Monod方程，通过作图法求出最大比生长速率μmax和亲和常数ks。六、思考题如何控制发酵条件以提高发酵水平? 实验4麦芽汁制备一、实验原理与方法利用煮出糖化法制备麦芽汁，下面啤酒酵母进行下面啤酒发酵，产生淡色下面啤酒是我国啤酒工业普遍采用的方法。煮出糖化法是兼用生化作用和物理作用进行糖化的方法，其特点是将糖化醪液的一部分，分批地加热到沸点，然后与其余未加热煮沸的醪液混合，使全部醪液温度分批地升高到不同酶分解所要求的温度，最后达到糖化终了温度。煮出糖化法根据部分醪液煮沸的次数，分为一、二、三次煮出糖化法和快速糖化法。本实验采用双醪一次煮出糖化法。二、实验目的通过本实验，进一步巩固麦汁制备工艺理论；熟悉和掌握糖化工艺条件；培养理论联系实际和分析问题、解决问题的能力。三、实验内容制备麦芽汁四、实验仪器与设备1、电炉（1000W带石棉网和调压器）2、恒温水浴锅3、烧杯（1000ml两个、200ml一个）4、布氏漏斗（D=20cm）5、500g天平一台6、量筒（100ml、500ml各两个）7、玻璃棒、温度计各两支8、滤棉和纱布少许9、电源、粉碎机、糖度计10、点滴板一块，滴管两支五、实验原料和试剂0.2N碘液、10%HCl、芽或麦芽粉、大米粉、酒花或酒花粉六、实验步骤本实验原辅料配比为：麦芽粉90%，大米粉10%。⑴、称取180g麦芽粉放入1000ml烧杯中，加水720ml，用玻璃棒搅拌均匀，置于恒温水浴锅上保温糖化。⑵、另称取20g大米粉放入200ml烧杯中，加水100ml，用玻璃棒搅拌均匀，放在电炉上进行糊化、煮沸。然后，大米粉糊化醪与麦芽粉糖化醪合并，进行糖化至无碘反应。⑶ 、用布氏漏斗上面铺一层纱布，将糖化好的醪液倒入漏斗中保温过滤。若开始滤液不清，可回滤至清，再接受澄清麦汁于煮沸锅或大烧杯中。滤完时，测定原麦汁浓度。然后加请水洗糟，洗糟水温度为78℃左右，洗涤两次，洗糟水回收与原麦汁混合，最后测定麦汁浓度。控制在10°Bx左右。操作流程如下：20g大米粉加适量麦芽→200ml烧杯→45℃（20min）→68℃（30min）→100℃（20～30min）粉或酶制剂水100ml180g麦芽粉→1000ml烧杯→45℃（30min）→63℃（30～40min）水720ml68℃～70℃（至无碘反应）78℃保温过滤→麦糟麦汁收集在烧杯中七、实验报告要求写出实验目的、具体操作及实验过程中观察到的现象，具体的工艺条件等。 实验5仿真谷氨酸发酵实验系统使用说明一、系统说明1、“486”以上配置电脑。2、D盘留有250MB空间。3、具有多媒体功能。二、安装方法装入光盘，先双击Ferment(盘符)，再双击Disk1，在其菜单中双击Setup，即按顺序要求会自动将所有内容装入D盘。三、启用在任务栏中选中Ferment即可开始使用。本软件主要内容包括：（一）实验预习题（二）实验设备简介（三）实验演示（四）实验操作（五）实验结果：谷氨酸发酵标准曲线和实验曲线，实验成绩单。（一）实验预习题共十道有关谷氨酸发酵基本知识的选择题。（见光盘）（二）实验设备简介1、基本单元：可点击：（a）控制器，（b）罐体和罐盖，（c）外科系统，（d）空气系统。2、管路：可点击：（e）供气系统，（f）放料系统，（g）供水系统。可见气、水、料的流向。3、控制器①温度控制器：设定及控制方式，加热或冷却指示，酸碱流加指示。②pH控制器：设定及控制方式，酸碱流加指示。③溶解氧（DO）控制器：设定及控制方式，转速提高或下降指示。④搅拌转速控制器：设定及控制方式，搅拌快慢指示。4、空气系统：可调节（点击）流量计按钮“+”“—”进行空气流量的设定。5、补料系统：点击补料按钮可见料液的流向。6、 消毒系统：介绍电加热蒸气发生器的结构及控制面板的操作、压力表指示，可点击开关按钮观察压力指示。1、罐体：介绍整个罐体的部件。（二）实验演示演示整个过程，包括：①输入名字和学号②排序③pH电极校正④配制培养基⑤消毒⑥控制器设定⑦空气流量设定⑧接种⑨发酵（三）实验操作：按演示的操作方法进行仿真实验。（四）实验结果：显示演习者操作总成绩和各步操作所得成绩，以及正常与不正常发酵的实验曲线。附注：★本软件存有20种不同控制条件下的发酵结果数据及曲线。★操作中需退出系统时可按Ctrl+Alt+Del结束任务。操作数据一、预习题答案第一题：3、第二题：4、第三题：1、第四题：1、第五题2、第六题：3、第七题：3、第八题：1、3、第九题：1、3、第十题：1、2。二、排序（实验步骤）1、pH电极纠正2、配料3、消毒4、控制设定5、空气流量设定6、接种7、发酵三、消毒操作：灭菌温度121℃，计时10分钟。四、得分数分配：预习题13分、排序7分、配料15分、pH电极校正5分、控制设定20分、空气流量设定10分、消毒20分、接种10分。五、本软件数据库资料本实验按5升发酵罐3升装液量计算，设定以下标准值（N）1、配料：玉米浆（含0.8r/ml生物素）20——22ml水解糖（20%糖浓度）2050——2150ml磷酸二氢钾5.8——6.2g尿素4——10g硫酸镁0.2——1g2、发酵条件控制温度：32℃—37℃pH：长菌期：7.2—7.4产酸期：7.0—7.2风量：长菌期：2.8—3.5L/h产酸期：3.5—4.1L/h转速：500rpm接种量：34.5—35.5ml 以上为数据库中的“发酵过程一”的数据，以下为常见不常见发酵的数据发酵过程二：玉米浆（生物素）过量（>22ml）的结果。发酵过程三：玉米浆（生物素）不足（<22ml）的结果。发酵过程四：糖浓度过量（>2150ml）的结果。发酵过程五：糖浓度不足（<2150ml）的结果。发酵过程六：磷盐过量（>6.2g）的结果。发酵过程七：磷盐不足（<5.8g）的结果。发酵过程八：接种量过大（>35.5ml）的结果。发酵过程九：接种量过小（<34.5ml）的结果。发酵过程十：温度过高（>37℃）的结果。发酵过程十一：温度过低（<32℃）的结果。发酵过程十二：pH长菌期过高（>7.4）的结果。发酵过程十三：pH长菌期过低（<7.2）的结果。发酵过程十四：pH产酸期过高（>7.2）的结果。发酵过程十五：pH产酸期过低（<7.0）的结果。发酵过程十六：通风长菌期过高（>3.51）的结果。发酵过程十七：通风产酸期过低（<3.51）的结果。发酵过程十八：生物素过低（<20ml），糖浓度过低的结果。发酵过程十九：生物素高（>22ml），糖浓度高（>2150ml），磷盐高的结果。发酵过程二十：生物素高（>22ml），糖浓度高（>2150ml），磷盐高（>6.2g）通风高（>4.1L）属高糖发酵的结果。 实验6土霉素提取实验一、实验目的1、了解和掌握发酵产物的分离提取流程2、熟悉和掌握等电点法结晶的原理与方法3、熟悉和掌握树脂脱色的原理和操作技术4、掌握常用的比色分析方法的操作技术二、实验原理土霉素的提炼主要是根据其理化性质进行的。目前，土霉素的提炼工艺已经相当成熟，可采用沉淀法、溶媒萃取法、离子交换法和吸附法。目前工业生产上主要采用等电点沉淀法其原理是利用土霉素具有两性化合物的性质，在其等电点时溶解度最小，从水溶液中结晶出来，以直接获取土霉素碱产品。现在，工业上土霉素的提炼工艺的具体过程是：1、酸化：（1）酸化过程采用草酸酸化，使菌丝中的土霉素释放出来并生成溶于水的盐，并且能析出的草酸钙沉淀，从而去除发酵液中的钙离子，同时草酸钙能促进蛋白质的凝结，从而提高滤液的质量。另外，草酸属于弱酸，其对设备的腐蚀性要比盐酸、硫酸小。（2）pH的控制：加入草酸的目的是释放菌丝中的单位，同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。目前，工业提炼的pH控制在1.6-2.0范围内，pH值过高对单位的释放不利，pH值过低会影响产品的质量，同时会增加产品的成本。（3）发酵液的去杂：发酵中存在着许多有机和无机的物质，加入净化剂黄血盐和硫酸锌除去铁离子和蛋白质。去杂过程采用的净化剂是黄血盐和硫酸锌，利用二者的协同效应除去蛋白质，同时除去铁离子。2、稀释：将发酵液进行适当的稀释，一般稀释2-3倍，有利于过滤脱色过程。3、过滤：发酵液经过预处理后可用板框过滤机或真空抽滤瓶进行过滤，实现固液分离。工业上采用低单位滤液和草酸水洗顶洗滤饼以提高收率。4、脱色：采用122#树脂对滤液进行脱色，其原理利用122#树脂为阳离子交换树脂，处理为氢型树脂后，所带的氢离子与色素蛋白质中的氮、氧形成氢键，对过滤液中的色素有吸附作用，进行脱色。要求脱色液在500nm下的透光率达85%以上。（使用721型分光光度计测定脱色液的透光率）。5、沉淀结晶：土霉素脱色液加入碱化剂调pH值到等电点附近，使土霉素从脱色液中直接沉淀出来。 （1）碱化试剂的选择：碱化试剂一般有氢氧化钠、氨水、碳酸钠、亚硫酸钠。由于氢氧化钠碱性过强，单独使用会造成局部过碱，从而破坏土霉素，影响产品的质量，碳酸钠虽然有抗氧化性和脱色的作用，但是它的碱性较弱，调pH所用的量比较大，氨水的碱性比氢氧化钠弱比碳酸钠强，并且价格比较便宜，使用量适中，所以氨水是最好的碱化试剂。碱化过程中所用的氨水应当喊眼含有2%--3%的亚硫酸钠，这样既能调pH值，又能起稳定的作用，同时还能脱色。（2）pH值的控制：pH值的不同，对产品的质量和产量会造成不同的影响。土霉素的等电点是pH=5.4。在等电点附近沉淀结晶比较完全，并且收率也比较高，但杂质的含量比较高，会影响产品的色泽和质量。所以一般控制pH值在4.4-4.8的范围内。6、离心分离、干燥：经过沉淀结晶后，结晶液进入到离心机中，进行固液分离，离心后的晶体再经过正压干燥，即得到了土霉素碱产品。化学法测定土霉素的效价是利用土霉素能和三氯化铁反应呈现颜色的反应，符合比耳定律的性质进行的。由于土霉素中的酚基和三氯化铁反应呈褐色，在480nm下，用分光光度计，测定吸光度值，可定量土霉素的含量。三、仪器与材料使用的仪器：使用的试剂：JJ200型精密电子天平草酸pH7-4酸度计七水合硫酸铜气浴恒温振荡器六水合三氯化铁LG10-2.4A离心机黄血盐81-2型恒温磁力搅拌器氯化钾AP-9901s真空泵氨水BT01-100型蠕动泵亚硫酸钠721型分光光度计浓盐酸MAEO水分测定仪硫代硫酸钠土霉素碱标准品122#树脂试剂配制如下表试剂名称配置方法10%（g/ml）三氯化铁溶液称取三氯化铁500g（FeCl3H2o称830克）用少量蒸馏水溶解过滤，加浓盐酸30ml，加蒸馏水至4000毫升，根据初算结果用2mol/L的盐酸和蒸馏水调节酸度至2mol/L和浓度为10%。 0.05%(g/ml)三氯化铁溶液量取10%三氯化铁溶液50ml，2mol/L盐酸50ml，加蒸馏水至1000ml，摇匀9mol/L盐酸溶液量取蒸馏水500ml于2000ml试剂瓶中，加浓盐酸1500ml，摇匀2mol/L盐酸溶液量取浓盐酸16.7ml加蒸馏水至100ml，摇匀0.01mol/L盐酸溶液量取2mol/L的盐酸50ml加蒸馏水至1000ml，摇匀1000u/mg土霉素标准液在分析天平上称取已知u/ml（生物效价）土霉素标准品W克，加1mol/L盐酸4ml，溶解完全后（约5分钟），加蒸馏水至200ml,放冰箱备用四、实验方法1．发酵液预处理1.1取少量发酵液，按前述发酵液效价的测定方法测出其效价。1.2取一定体积发酵液，边搅拌，边加入黄血盐0.35%、硫酸锌0.2%，并加入草酸酸化发酵液pH至1.6-2.0，搅拌30分钟后，再将酸化液取出少许，按酸化液效价的测定方法测定其效价并计算酸化收率。2．过滤将酸化的发酵液稀释1倍，用真空抽滤瓶进行过滤，滤饼再用草酸水冲洗，测出滤液的体积。按滤液效价的测定方法测定其效价并计算过滤收率。3．脱色3.1树脂预处理：脱色采用122#树脂，使用前，要用1mol/L的盐酸和氢氧化钠交替处理树脂，最后将树脂转化为氢型后，蒸馏水洗至近中性。用抽滤瓶抽干，一般按每克树脂处理100000u的比例，根据滤液体积计算所用树脂，并称量待用。3.2树脂柱的装柱方法：将树脂柱的出口旋纽拧紧，往玻璃树脂柱中放入几个玻璃珠，以防脱色树脂漏出，再将称量好的树脂搅匀（树脂旋浮于水中）缓缓倒入树脂柱。注意装柱时树脂柱中不能有气泡，如有气泡应立即排出。脱色前后应注意不能使树脂处于干燥状态，否则树脂会失效。3.3脱色时要注意前一段时间的脱色液不要收集，待其效价达到2000u/ml以上时再收集。测定脱色液体积、效价和500nm下的透光率，并计算脱色收率。4．结晶：取一定量脱色液放入4个锥形瓶中，用氨水调pH值为4.6，恒温30℃用磁力搅拌器搅拌，结晶，搅拌转数为70rpm，结晶一小时。5．离心干燥：将结晶液离心，取上清液测定其在500nm 下透光率和效价，计算出结晶收率。湿晶体经过冲洗后,放入水分测定仪中进行干燥，测定干粉的质量，然后将干粉溶解于1000ml酸水中，测定其效价，计算干粉的效价及离心干燥收率。6．检测方法6.1pH的测定（1）测样品不宜在室温下放置时间过长，应当在取样2分钟之内测定完，不能直接测定的样品应收样放入冰箱，如需测定时提前从冰箱中取出放至室温测定。（2）打开酸度计，调节温度补偿旋钮至室温。（3）用pH=6.86和pH=4.0的缓冲液校准pH计。（4）校准后，纯净水冲洗电极，将电极放入被测样中，待读数稳定后读数。（5）测定样品后应该用纯净水冲洗电极，不用时应将电极放置在饱和氯化钾溶液中。6.2分光光度法测定土霉素效价6.2.1土霉素标准曲线的绘制：用土霉素标准样配成1000u/ml的标准液，用2ml移液管分别取标准液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml于试管中，加0.01mol/L的盐酸共10ml，再加0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml，摇匀，静置20分钟，另取样同上，加0.01mol/L的盐酸使全量为20ml，摇匀，作为空白，在480nm的波长下测定吸光度值，以土霉素效价为纵坐标，以吸光度值为横坐标绘制作标准曲线。6.2.2土霉素样品效价的测定（1）发酵液效价的测定：取样品加9mol/L的盐酸溶液，先酸化至pH=1.5-1.7,用酸度计测量，放置5分钟，过滤至5ml以上，吸取滤液稀释适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），用移液管取1ml稀释液于试管中，准确加入0.01mol/L的盐酸，使全量为20ml，再加入0.05%g/ml的三氯化铁溶液10ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，另取1ml稀释液，加入0.01mol/L的盐酸19ml，使全量为20ml，摇匀，放置20分钟，作为空白，在480nm的波长下测两种液体的吸光度。（2）提取过程中间样效价的测定：取中间样，稀释至适宜倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内），以下操作同发酵液效价的测定方法。（3）效价计算：将测定的吸光度值代入标准曲线方程，再乘以稀释倍数即得各步效价。五、实验报告1、将实验各步测量的及计算的结果汇总于自己设计的表中。2、计算总提取收率，并分析讨论收率高低的原因。六、思考题请写出土霉素提取工艺流程图。 第二部分基因工程育种基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。生物工程可以分为传统生物技术，工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。基因工程最突出的优点，是打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌中表达，细菌的基因可以转移到植物中表达。基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程为生物学、医药学、遗传学、农业科学、环境科学和某些工业研究开拓了广阔的、革命性的发展前景。基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。第一章计算机辅助基因工程实验第一节仿真DNA序列测定技术一、光盘安装说明：打开光盘双击“dna”文件，双击setup进入安装程序，安装结束由桌面程序目录中点击该名即进入该课件程序。（需170M空间）二、“仿真DNA序列测定技术”使用说明：主菜单为实验原理、实验操作、成绩管理、退出四部分。“实验原理”：又包括“原理”、“原理图示”、“操作指南”三部分。分别点击之即可进入各部分内容。点击上三角可使文件向上移动，点击下三角可使文件向下移动，点击中间方框可定格，点击“退出”回到主菜单,点击“返回”进入实验各步目录。再点击各步目录文字即可进入各步操作实验。点击“实验操作”框进入实验操作，先进入的是试剂部分，点击该页的“返回”框即进入实验操作的菜单，共七步实验目录及试剂目录。点击各步实验目录文字，就可进入该步的模拟操作。三、仿真DNA序列测定实验技术〈实验操作〉部分操作顺序1.噬菌体M13载体的制备 （1）取离心管。（2）加入噬菌体M13贮备液。（3）加入2´YT溶液。（4）振荡，得管（甲）。（5）另取空离心管（乙）。（6）从（甲）管中吸取液体加入（乙）管中，再往（乙）管中加入大肠杆菌菌悬液。（7）振荡。（8）往离心管中加入软琼脂。（9）加入10%X—Gal。（10）加入IPTG。（11）振荡。（12）取平皿。（13）管中液体倒平皿。凝固。（14）加盖，培养。（15）另取离心管，加入2´YT溶液。（16）从培养平板上挑菌落细胞接入离心管中，培养，得离心管（丙）。（17）取盛有大肠杆菌菌液的三角瓶。（18）将（丙）管中培养物倒入三角瓶中。（19）将三角瓶培养。（20）往三角瓶中加入氯霉素乙醇溶液。（21）振荡培养2小时。（22）将培养液离心，倾去液体。2.M13载体与待测DNA的连接（1）取离心管。（2）加入含双链M13mPDNA的溶液。（3）加入限制酶溶液。（4）加入SS—酚。（5）振荡。（6）加入氯仿。（7）振荡。（8）离心。（9）取空离心管。移液仪吸出水相移入离心管中。（10）往离心管中加入乙醇。（11）离心。 （12）用移液仪吸弃上层液体。（13）往离心管中加入70%乙醇洗沉淀。（14）离心。（15）用移液仪吸弃液体。（16）往离心管中加入TE溶液，得（乙）管。（17）取空离心管。用移液仪从（乙）管中吸取液体，移入新离心管中。（18）往新离心管中加入待测DNA片段。（19）加入10×连接酶缓冲液。（20）加入T4DNA连接酶。（21）加入重蒸馏水。（22）在14℃下放置15小时。3.利用核酸外切酶III建立DNA的连续亚克隆（1）取离心管。（2）加入含待测片段DNA的噬菌体M13RFmP的溶液。（3）加入含限制性内切酶的混合液。（4）在37℃下放置0.6小时。（5）加入SS—酚（6）加入氯仿。（7）离心。（8）用移液仪吸出水相加入一空离心管中，得（乙）管。（9）往（乙）管中加入乙醇。（10）离心。（11）用移液仪吸弃液体。（12）往沉淀中加入核酸外切酶III缓冲液。37℃下放置，得（丙）管，待用。（13）取离心管，加入含S1酶的混合液。（14）从（丙）管中吸出液体加入上述离心管中。（15）加入核酸外切酶III。每隔30秒从离心管中取出液体加入一系列离心管中。（16）往每个离心管中加入S1酶终止液。（17）往每个离心管中加入T4DNA连接酶混合液。4.重组M13DNA转化大肠杆菌JM109（1）取离心管。（2）加入噬菌体M13mP与待测DNA的连接产物。（3）加入大肠杆菌钙细胞悬液（4）在—4℃下放置30分钟。 （5）在42℃下放置2分钟。（6）取三角烧瓶。将上述离心管中液体倾入瓶中。（7）往瓶中加入48℃含培养基的琼脂。（8）往瓶中加入大肠杆菌钙细胞悬液。（9）取盛有培养基的平皿。将三角瓶中混合物倾入平皿。（10）加盖，凝固。（11）培养。5.单链M13DNA模板的制备（1）取离心管。（2）加入白色菌斑的2×YT培养液。（3）离心，得（甲）管。（4）取一空离心管（乙）。从（甲）中吸出上层液加入（乙）管中。（5）离心。（6）取一空离心管。从离心过的管中用移液仪吸出液体注入空管中，得（乙）管。（7）往（乙）管中加入20%PEG和氯化钠的混合液。在—4℃下放置20分钟。（8）离心。（9）用移液仪吸弃上层液。（10）加入酚一氯仿。（11）振荡。（12）离心。（13）用移液仪吸出上层液移入空离心管中。（14）加入酚一氯仿。（15）振荡。（16）离心。（17）用移液仪吸出上层液移入另一空离心管中。（18）加入氯仿一异戊醇。（19）振荡。（20）离心。（21）取一空离心管，吸出离心的上层液后加入空管中，得（丙）管。（22）往（丙）管中加入醋酸钠溶液。（23）加入无水乙醇。在—20℃下放置2分钟。（24）离心。（25）用移液仪吸弃上层液。（26）往沉淀中加入无水乙醇。 （27）用移液仪吸弃液体。（28）往沉淀中加入重蒸馏水。6.大片段DNA多聚酶法（1）取离心管。（2）加入含单链模板和引物的缓冲液。（3）在55℃下放置30分钟。（4）自然冷却，得（甲）管。（5）取4支空离心管。（6）将（甲）管液体分别注入4支空离心管。（7）往4支空离心管中加入dNTP工作液。（8）往4支空离心管中加入dATP、dGTP、dCTP和dTTP工作液。（9）往各管中加入α—32PdATP。（10）往各管中加入大肠杆菌聚合酶I大片段。（11）在室温下放置30分钟。7.待测DNA片段的核苷酸排列顺序测定（1）将凝胶板安装到电泳仪上。（2）用移液仪往电泳仪下槽注入1×TBE液。（3）用移液仪往电泳仪上槽注入1×TBE液。（4）用注射器使用TBE液清洗加样孔。。（5）预电泳。（6）关电源。 第一章计算机辅助基因工程实验第一节仿真DNA序列测定技术一、光盘安装说明：打开光盘双击“dna”文件，双击setup进入安装程序，安装结束由桌面程序目录中点击该名即进入该课件程序。（需170M空间）二、“仿真DNA序列测定技术”使用说明：主菜单为实验原理、实验操作、成绩管理、退出四部分。“实验原理”：又包括“原理”、“原理图示”、“操作指南”三部分。分别点击之即可进入各部分内容。点击上三角可使文件向上移动，点击下三角可使文件向下移动，点击中间方框可定格，点击“退出”回到主菜单,点击“返回”进入实验各步目录。再点击各步目录文字即可进入各步操作实验。点击“实验操作”框进入实验操作，先进入的是试剂部分，点击该页的“返回”框即进入实验操作的菜单，共七步实验目录及试剂目录。点击各步实验目录文字，就可进入该步的模拟操作。三、仿真DNA序列测定实验技术〈实验操作〉部分操作顺序1.噬菌体M13载体的制备（1）取离心管。（2）加入噬菌体M13贮备液。（3）加入2´YT溶液。（4）振荡，得管（甲）。（5）另取空离心管（乙）。（6）从（甲）管中吸取液体加入（乙）管中，再往（乙）管中加入大肠杆菌菌悬液。（7）振荡。（8）往离心管中加入软琼脂。（9）加入10%X—Gal。（10）加入IPTG。（11）振荡。（12）取平皿。（13）管中液体倒平皿。凝固。（14）加盖，培养。（15）另取离心管，加入2´YT溶液。（16）从培养平板上挑菌落细胞接入离心管中，培养，得离心管（丙）。（17）取盛有大肠杆菌菌液的三角瓶。 （18）将（丙）管中培养物倒入三角瓶中。（19）将三角瓶培养。（20）往三角瓶中加入氯霉素乙醇溶液。（21）振荡培养2小时。（22）将培养液离心，倾去液体。2.M13载体与待测DNA的连接（1）取离心管。（2）加入含双链M13mPDNA的溶液。（3）加入限制酶溶液。（4）加入SS—酚。（5）振荡。（6）加入氯仿。（7）振荡。（8）离心。（9）取空离心管。移液仪吸出水相移入离心管中。（10）往离心管中加入乙醇。（11）离心。（12）用移液仪吸弃上层液体。（13）往离心管中加入70%乙醇洗沉淀。（14）离心。（15）用移液仪吸弃液体。（16）往离心管中加入TE溶液，得（乙）管。（17）取空离心管。用移液仪从（乙）管中吸取液体，移入新离心管中。（18）往新离心管中加入待测DNA片段。（19）加入10×连接酶缓冲液。（20）加入T4DNA连接酶。（21）加入重蒸馏水。（22）在14℃下放置15小时。3.利用核酸外切酶III建立DNA的连续亚克隆（1）取离心管。（2）加入含待测片段DNA的噬菌体M13RFmP的溶液。（3）加入含限制性内切酶的混合液。（4）在37℃下放置0.6小时。（5）加入SS—酚 （6）加入氯仿。（7）离心。（8）用移液仪吸出水相加入一空离心管中，得（乙）管。（9）往（乙）管中加入乙醇。（10）离心。（11）用移液仪吸弃液体。（12）往沉淀中加入核酸外切酶III缓冲液。37℃下放置，得（丙）管，待用。（13）取离心管，加入含S1酶的混合液。（14）从（丙）管中吸出液体加入上述离心管中。（15）加入核酸外切酶III。每隔30秒从离心管中取出液体加入一系列离心管中。（16）往每个离心管中加入S1酶终止液。（17）往每个离心管中加入T4DNA连接酶混合液。4.重组M13DNA转化大肠杆菌JM109（1）取离心管。（2）加入噬菌体M13mP与待测DNA的连接产物。（3）加入大肠杆菌钙细胞悬液（4）在—4℃下放置30分钟。（5）在42℃下放置2分钟。（6）取三角烧瓶。将上述离心管中液体倾入瓶中。（7）往瓶中加入48℃含培养基的琼脂。（8）往瓶中加入大肠杆菌钙细胞悬液。（9）取盛有培养基的平皿。将三角瓶中混合物倾入平皿。（10）加盖，凝固。（11）培养。5.单链M13DNA模板的制备（1）取离心管。（2）加入白色菌斑的2×YT培养液。（3）离心，得（甲）管。（4）取一空离心管（乙）。从（甲）中吸出上层液加入（乙）管中。（5）离心。（6）取一空离心管。从离心过的管中用移液仪吸出液体注入空管中，得（乙）管。（7）往（乙）管中加入20%PEG和氯化钠的混合液。在—4℃下放置20分钟。（8）离心。（9）用移液仪吸弃上层液。 （10）加入酚一氯仿。（11）振荡。（12）离心。（13）用移液仪吸出上层液移入空离心管中。（14）加入酚一氯仿。（15）振荡。（16）离心。（17）用移液仪吸出上层液移入另一空离心管中。（18）加入氯仿一异戊醇。（19）振荡。（20）离心。（21）取一空离心管，吸出离心的上层液后加入空管中，得（丙）管。（22）往（丙）管中加入醋酸钠溶液。（23）加入无水乙醇。在—20℃下放置2分钟。（24）离心。（25）用移液仪吸弃上层液。（26）往沉淀中加入无水乙醇。（27）用移液仪吸弃液体。（28）往沉淀中加入重蒸馏水。6.大片段DNA多聚酶法（1）取离心管。（2）加入含单链模板和引物的缓冲液。（3）在55℃下放置30分钟。（4）自然冷却，得（甲）管。（5）取4支空离心管。（6）将（甲）管液体分别注入4支空离心管。（7）往4支空离心管中加入dNTP工作液。（8）往4支空离心管中加入dATP、dGTP、dCTP和dTTP工作液。（9）往各管中加入α—32PdATP。（10）往各管中加入大肠杆菌聚合酶I大片段。（11）在室温下放置30分钟。7.待测DNA片段的核苷酸排列顺序测定（1）将凝胶板安装到电泳仪上。（2）用移液仪往电泳仪下槽注入1×TBE液。 （3）用移液仪往电泳仪上槽注入1×TBE液。（4）用注射器使用TBE液清洗加样孔。。（5）预电泳。（6）关电源。 第二节仿真cDNA文库实验技术一、光盘安装说明：打开光盘，双击“cDNA”文件，双击setup进入安装程序，如要安装到其他盘，需先创建一个目录然后指定安装途径进行安装（需330M空间）。安装结束，由桌面程序目录中点击“cDNA文库实验”名即进入该课件程序。二、“仿真cDNA文库实验技术”课件使用说明：在播放片头时随时可以双击页面结束播放进入主目录。主目录有五个部分：1实验原理。2实验演示。3操作指南。4实验练习。5退出。分别由不同颜色的六角形代表。用鼠标指向各图形，单击即可进入每一目录。实验操作结束，可单击“分数”框便知成绩。三、仿真cDNA文库实验技术《实验操作》部分操作顺序1.合成第一链（1）把离心管放入冰浴。（2）管中加入合成cDNA第一链使用的混合液。（3）加入经DEPC处理过的水。（4）加入M—MLV反转录酶。（5）振荡。（6）取一新离心管。（7）从老离心管中吸出一部分液体加入新离心管中。老离心管（甲）待用。（8）再往新管（乙）中加入a-32P-dATP。（9）振荡。在37℃下放置一小时。将（乙）试管移入冰浴。（10）加入EDTA。（11）再加入重蒸馏水。（12）用移液仪吸取液体分别在二张滤纸上点液。（13）室温下干燥。2.合成第二链（1）取盛有第一链合成产物的小离心管（甲）。（2）加入含噬菌体T4多聚核苷酸激酶和E.ColiDNA连接酶的混合液。（3）在室温下放置15分钟。（4）往离心管中加入EDTA。（5）加入酚—氯仿。（6）取一新离心管。从老离心管中吸出水相移入新离心管中。（7）往新离心管中加入酚，振摇。 （8）从含酚离心管中吸出水相加入另一空离心管（甲）中。（9）取一离心管（乙），从（甲）管中吸出部分液体移入（乙）管中。（甲）管待用（10）往（乙）管中加入重蒸馏水。（11）用移液仪从（乙）管取液体后在二张滤纸上点液。3.cDNA的甲基化（1）取盛有含双链cDNA溶液的离心管（甲）。（2）往离心管中加入无水乙醇。（3）离心。（4）用移液仪吸去液体。（5）往沉淀中加入TE缓冲液。（6）加入S-腺苷甲硫氨酸混合液。（7）加入重蒸馏水。（8）加入E.CORI甲基化酶。在37℃放置1小时。在68℃放置15分钟。（9）加入酚，振摇。（10）取一离心管（乙）。从含酚试管中吸出水相移入空离心管（乙）中。（11）往离心管（乙）中加入氯仿。振摇。（12）再取一空离心管（丙）。从（乙）管吸出水相移入（丙）管中。（13）往（丙）管中加入无水乙醇。在—20℃放置2小时。（14）离心。（15）吸出水相。（16）往沉淀中加入TE液。4.cDNA与接头的连接（1）取离心管。（2）加入含甲基化cDNA的溶液。（3）加入接头混合液。（4）在16℃下放置16小时。（5）在68℃下放置15分钟。（6）移入冰浴放置2分钟。（7）往试管中加入E.CORI酶混合液。（8）在37℃下放置2小时。（9）加入TE溶液。 5.cDNA的分级分离（1）取离心管。（2）加入含粘性末端cDNA溶液。（3）加入10´上样缓冲液。（4）取柱。用移液仪吸出溶液用于上柱。（5）加入洗脱剂。（6）往收集管中加入无水乙醇。（7）用移液仪吸去液体。（8）往沉淀中加入TE液，得cDNA溶液。6.cDNA克隆（1）取离心管。（2）加入cDNA溶液。（3）加入噬菌体臂溶液。（4）加入DNA连接酶缓冲液。（5）加入重蒸馏水。（6）加入T4DNA连接酶。在14℃下放置14小时。（7）加入包装蛋白。（8）在22℃下放置30分钟。（9）加入SM溶液。（10）加入氯仿。（11）离心。得管（甲）。7.cDNA的扩增（1）取上述离心后的离心管（甲）。（2）取空离心管。从（甲）管中吸出液体移入空离心管中（乙）。（3）往（乙）管中加入E.ColiC600菌悬液。在室温下放置15分钟。（4）往（乙）管中加入含明胶的LB培养基。（5）振荡。（6）取有培养基的平皿。（7）将离心管中液体倒入平皿。凝固。 第三节仿真多聚酶链反应（PCR）实验技术第一节光盘安装说明一、打开光盘，双击“PCR”文件二、双击“Pak”文件三、双击“Setup”,即进入安装程序四、本课件占用140M空间，按提示完成安装第二节使用说明一、安装完成后，在桌面和程序菜单中都会生成“PCR”启动标记二、双击PCR标记，即可进入本课件主页面。三、双击主页面，进入实验主菜单，可以分别点击观看。四、实验主菜单共包含六个目录：（一）PCR原理：是一个VCD方式的实验原理指导。（二）实验演示：是一个有关实验的VCD演示片段。（三）条件优化：分别讲述了几个条件优化的知识。（四）操作指南：指示本实验的12个步骤，可分别点击观看。（五）故障分析：指出实验操作错误和操作失败的原因。（六）实验练习：双击本目录后即可进入实验练习，输入群名、学号、进入实验练习。实验练习结束可查询得分。五、在“实验练习”中前半段有语音提示，帮助熟悉桌面操作方法，然后退出，进入正式实验。（正式实验操作顺序见下文）第三节仿真PCR扩增实验技术<实验操作>部分操作顺序：（1）取离心管（2）往离心管中加入10×PCR缓冲液（3）加入四种dNTP的混合溶液（4）加入靶DNA溶液（5）加入引物（6）加入重蒸馏水（7）取振荡器（8）取离心机离心（9）往离心管中加入液体石蜡（10）取恒温水浴。将离心管放入97℃水浴5分钟，热启动开始（11）加入Tag酶（12）将离心管放入70℃恒温水浴1分钟（13）将离心管放入94℃恒温水浴1分钟开始热变性（14）将离心管放入55℃恒温水浴30秒钟，复性（15）将离心管放入70℃水浴1分钟，开始延伸（16）将离心管放入94℃水浴1分钟进行热变性，第二次循环开始将离心管放入55℃水浴30秒钟，进行第二次循环的复性。在桌面同样循环操作三次，直至完成25—30次的循环操作。